Theobroma grandiflorum) e do cupulate: Composição e ... ?· Determinação de umidade 30 ... Determinação…

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  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

    Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentos rea de Bromatologia

    Compostos fenlicos do cupuau

    (Theobroma grandiflorum) e do cupulate:

    Composio e possveis benefcios

    Alexandre Gruber Pugliese

    Dissertao para obteno do grau de

    MESTRE

    Orientadora:

    Prof. Dr. MARIA INS GENOVESE

    So Paulo

    2010

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  • ALEXANDRE GRUBER PUGLIESE

    Compostos fenlicos do cupuau

    (Theobroma grandiflorum) e do cupulate:

    Composio e possveis benefcios

    Comisso Julgadora

    da

    Dissertao para obteno do grau de Mestre

    __________________________________

    Prof. Dr. Maria Ins Genovese

    orientadora/presidente

    ____________________________

    1. examinador

    ____________________________

    2. examinador

    So Paulo, ___ de ________________ de 2010.

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  • Dedico este trabalho aos meus pais,

    Maria Matilde e Luciano,

    pelo apoio, amor e ensinamentos.

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  • AGRADECIMENTOS

    Aos professores e especialistas Antnio Salatino, Felipe Drr, Ian Castro-

    Gamboa, Ins Genovese, Massuo Kato e Raimundo Moror pela orientao, amizade e

    valiosas contribuies neste trabalho.

    Aos professores, alunos e tcnicos Alexandre Lobo, Alexandre Pimentel, Any

    Gonalvez, Beatriz Cordenunsi, Celia Coli, Dominique Fischer, Ernani Junior, Gledson

    Guimares, Inar Castro, Ivanir Pires, Katia Callou, Lena Ranilla, Lucia da Silva, Jorge

    Mancini, Jos Almeida, Marcela Alezandro, Marcia Moraes, Marilete Wolff, Neuza

    Hassimotto, Patrcia (Pat) Pcora, Ronaldo Pitombo, Rosngela Torres, Suzana Lannes,

    Tnia Shiga, Thiago (Belchior) de Oliveira e Wilson Junior pela amizade e colaborao

    neste trabalho, e s demais pessoas que por ventura tenham contribudo.

    Aos funcionrios Cleunice Cabral, Edilson (Dilsu) Santos, Elaine Eyshiko,

    Mnica Perucci e Jorge de Lima pelo suporte administrativo e colaborao.

    Aos amigos Andr (dos) Santos, Bruno Renn (zis), Igor Velecico (russo) e

    Leandro Foltran (leleco), pela amizade de tantos anos.

    A minha namorada Julyane Poltronieri, sempre to presente, amorosa e positiva.

    Aos meus pais, que sempre me deram apoio e suporte em minhas empreitadas, e

    minha irm Giselle (no me esqueci de voc, no!), companheira de vida e profisso.

    A CEPLAC e a Fazenda Riachuelo, pela receptividade, pela disponibilizao do

    local, equipamento e matria prima para confeco do cupulate e do chocolate.

    A CAPES, pelo suporte financeiro.

    A Universidade de So Paulo, local em que me graduei e agora me ps-graduo,

    com muito gosto pela possibilidade de aprendizado e pesquisa nesta renomada

    instituio. E a todas as instituies vinculadas ao ensino de Farmcia e Bioqumica

    brasileiras, na torcida de que haja cada vez mais interatividade com o setor privado, seja

    para conferir maior objetividade e financiamento pesquisa, seja para promover maior

    oportunidade aos alunos e profissionais.

    A todas essas pessoas e intituies, que tornaram possvel a realizao deste

    trabalho e de meu crescimento pessoal, muito obrigado!

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  • NDICE

    1. INTRODUO 01

    1.1. Cupuau e cupulate 01

    1.1.1. Produo de cupulate 06

    1.2. Compostos bioativos 11

    1.2.1. Flavonides 12

    1.2.2. cidos fenlicos 16

    1.2.3. Taninos, proantocianidinas e procianidinas 17

    1.2.3.1. Quantificao de proantocianidinas 21

    1.3. Atividade inibitria de -glicosidase e -amilase 23

    2. OBJETIVOS 25

    3. MATERIAIS E MTODOS 26

    3.1. Materiais 26

    3.2. Equipamentos 26

    3.2.1. Equipamentos utilizados na produo de cupulate/chocolate 26

    3.2.2. Equipamentos utilizados nas anlises 27

    3.3. Mtodos 28

    3.3.1. Amostragem 28

    3.3.2. Produo do cupulate e chocolate 28

    3.3.3. Composio centesimal 30

    3.3.3.1. Determinao de umidade 30

    3.3.3.2. Determinao de cinzas 30

    3.3.3.3. Determinao de protenas 30

    3.3.3.4. Determinao de lipdios 30

    3.3.3.5. Determinao de carboidratos 31

    3.3.4. Anlise de cidos graxos 31

    3.3.4.1. Extrao de Gordura 31

    3.3.4.2. Metilao (BF3) 32

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  • 3.3.4.3. Cromatografia a gs 32

    3.3.4.4. Quantificao de cidos graxos e da porcentagem de gordura 33

    3.3.5. Anlise de flavonides 33

    3.3.5.1. Extrao de flavonides 33

    3.3.5.2. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) 34

    3.3.5.3. Espectrometria de massas acoplada cromatografia lquida (LCMS/MS) 34

    3.3.6. Determinao do cido ascrbico (vitamina C) 35

    3.3.7. Determinao de fenlicos totais e capacidade antioxidante in vitro 35

    3.3.7.1. Extrao 35

    3.3.7.2. Reduo do reagente de Folin-Ciocalteu (Fenlicos Totais) 36

    3.3.7.3. Seqestro de radicais livres (DPPH) 36

    3.3.7.4. Capacidade de absoro do radical oxignio (ORAC) 37

    3.3.8. Determinao da atividade inibitria da -glicosidase 38

    3.3.8.1. Extrao 38

    3.3.8.2. Inibio de -glicosidase 38

    3.3.9. Determinao da atividade inibitria de -amilase 39

    3.3.9.1. Extrao 39

    3.3.9.2. Inibio da -amilase 39

    3.3.10. Quantificao das proantocianidinas 40

    3.3.10.1.Extrao 40

    3.3.10.2.Quantificao das proantocianidinas pelo mtodo da vanilina 41

    3.3.10.3.Quantificao das proantocianidinas pelo mtodo do butanol acidificado. 41

    3.3.11. Identificao de proantocianidinas 42

    3.3.11.1.Extrao 42

    3.3.11.2.Purificao em LH20 42

    3.3.11.3.Espectrometria de massas acoplada cromatografia lquida (LCMS/MS) 43

    3.4. Anlise dos resultados 43

    4. RESULTADOS E DISCUSSO 44

    4.1. Composio centesimal 44

    4.2. Perfil de cidos graxos da semente fresca e lquor 45

    4.3. Teores de cido ascrbico da polpa de cupuau 49

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  • 4.4. Capacidade inibitria de -amilase e -glicosidase 51

    4.5. Teores de compostos fenlicos e capacidade antioxidante 54

    4.5.1. Fenlicos totais, capacidade de seqestro do DPPH e ORAC 54

    4.5.2. Anlise de polifenlicos 59

    4.5.2.1. Identificao de proantocianidinas 59

    4.5.2.2. Quantificao de proantocianidinas 67

    4.5.2.3. Identificao de flavonides 72

    4.5.2.4. Quantificao de flavonides 90

    5. CONCLUSES 93

    6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 95

    7. ANEXOS 118

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  • LISTA DE FIGURAS

    Figura 1 A - Cupuauzeiro em consrcio. B Cupuaus.

    Figura 2 A Corte longitudinal do cupuau. B - Manteiga e torta de cupuau.

    Figura 3 - Fluxograma da fabricao do chocolate. Fonte: MOROR (2007).

    Figura 4 A - Despolpamento. B - Cochos de fermentao. C - Secagem.

    Figura 5 A - Forneamento. B - Descascamento. C - Moagem.

    Figura 6 A - Refinamento. B - Concheamento. C - Temperagem.

    Figura 7 - Estrutura bsica dos flavonides.

    Figura 8 - Estruturas das principais classes de flavonides.

    Figura 9 - Flavonides antioxidantes do cupuau: teograndina I (1), teograndina II (2)

    (+)-catequina (3), (-)-epicatequina (4), isocutelarina 8-O--D-glucurondeo (5),

    hipolaetina 8-O- glucurondeo (6), quercetina 3-O--D-glucurondeo (7), ster metlico

    6 de quercetina 3-O--D-glucurondeo (8), quercetina (9), caempferol (10), e ster

    metlico 6de isoscutelarina 8-O--D-glucurondeo (11).

    Figura 10 A - cido p-hidroxibenzico. B cido protocatecuico.

    Figura 11 A - cido p-hidroxicinmico. B cido cafico.

    Figura 12 A - cido glico. B cido hexahidroxidifnico.

    Figura 13 - Procianidina C, um tanino condensado.

    Figura 14 A - Cianidina (uma antocianidina). B - (-)-epicatequina. C - (+)-catequina.

    Figura 15 Procianidinas dimricas. A - Procianidina A1. B - Procianidina A2.

    Figura 16 Procianidinas dimricas. A - B1. B - B2. C - B3. D - B4.

    Figura 17 Perfil de eluio do LH20 dos taninos das sementes frescas, a 540 nm.

    Figura 18 Perfil de eluio da coluna de LH20 dos taninos do lquor, a 540 nm.

    Figura 19 - Cromatograma em 280 nm, usando coluna de polietilenoglicol (PEG), dos

    taninos das sementes frescas de cupuau.

    Figura 20 - Cromatograma em 280 nm, usando coluna de polietilenoglicol (PEG), dos

    taninos do lquor de cupuau.

    Figura 21 - Cromatograma de ons (EIC) dos taninos das sementes frescas de cupuau.

    A, B, C, D - monmero, dmero, trmero e tetrmero monocarga, E, F, G, H -pentmero,

    hexmero, heptmero e octmero duplacarga, I, J nonmero e decmero triplacarga.

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  • Figura 22 Espectros de massa dos taninos das sementes frescas de cupuau. A

    monmero monocarga (m/z = 289), B dmero monocarga (m/z = 577), C trmero

    monocarga (m/z = 865), D tetrmero duplacarga (m/z = 576), E tetrmero

    monocarga (m/z =1153), F pentmero duplacarga (m/z = 720).

    Figura 23 Espectros de massa dos taninos das sementes frescas de cupuau. A

    hexmero duplacarga (m/z = 864), B heptmero duplacarga (m/z =1008), C -

    octmero duplacarga (m/z =1152), D - octmero triplacarga (m/z = 768), E nonmero

    triplacarga (m/z =864), F decmero triplacarga (m/z = 960).

    Figura 24 - Cromatograma de ons (EIC) dos taninos das sementes frescas de cupuau.

    A, B, C - monmero, dmero e trmero monocarga, D tetrmero duplacarga.

    Figura 25 Espectros de massa dos taninos do liquor de cupuau. A monmero

    monocarga (m/z = 289), B dmero monocarga (m/z = 577), C trmero monocarga

    (m/z = 865), D tetrmero duplacarga (m/z = 576).

    Figura 26 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol do

    extrato de semente fresca de cupuau aps purificao em poliamida.

    Figura 27 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol :

    amnia do extrato de semente fresca de cupuau aps purificao em poliamida.

    Figura 28 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol do

    extrato de lquor de cupuau aps purificao em poliamida.

    Figura 29 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol :

    amnia do extrato de lquor de cupuau aps purificao em poliamida.

    Figura 30 - Grfico tridimensional mostrando a varredura da absoro da luz (eixo

    vertical) nos distintos comprimentos de onda (eixo a esquerda), variando com o tempo

    de corrida (eixo a direita) da frao metanol do extrato de semente de cupuau.

    Figura 31 - Grfico tridimensional mostrando a varredura da absoro da luz (eixo

    vertical) nos distintos comprimentos de onda (eixo a esquerda), variando com o tempo

    de corrida (eixo a direita) da frao metanol do extrato de semente de cupuau;

    seccionado no comprimento de onda de 270 nm.

    Figura 32 - Grfico tridimensional mostrando a varredura da absoro da luz (eixo

    vertical) nos distintos comprimentos de onda (eixo a esquerda), variando com o tempo

    de corrida (eixo a direita) da frao metanol-amnia do extrato de semente de cupuau.

    Figura 33 - Grfico tridimensional mostrando a varredura da absoro da luz (eixo

    vertical) nos distintos comprimentos de onda (eixo a esquerda), variando com o tempo

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  • de corrida (eixo a direita) da frao metanol-amnia do extrato de semente de cupuau;

    seccionado no comprimento de onda de 270 nm.

    Figura 34 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol do

    extrato de semente fresca de cupuau aps purificao em poliamida. Sobrepostos ao

    cromatograma encontram-se os espectros de absoro no UV de cada banda (linha

    azul), indicando o(s) comprimento(s) de onda mximo. A linha vermelha o espectro

    de absoro no UV dos distintos padres comerciais com o qual as bandas foram

    comparadas, so eles (da esquerda para direita): (+)-catequina, (+)-catequina, (-)-

    epicatequina, (+)-catequina, no comparado e rutina.

    Figura 35 - Cromatograma em 270 nm, usando coluna prodigy, da frao metanol :

    amnia do extrato de semente fresca de cupuau aps purificao em poliamida.

    Sobrepostos ao cromatograma encontram-se os espectros de absoro no UV de cada

    banda (linha azul), indicando o(s) comprimento(s) de onda mximo. A linha vermelha

    o espectro de absoro no UV dos distintos padres comerciais com o qual as bandas

    foram comparadas, so eles (da esquerda para direita): (+)-catequina, (-)-epicatequina,

    (+)-catequina, no comparado, homorientina, homorientina, homorientina,

    isovitexina, homorientina e isovitexina.

    Figura 36 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol do extrato de semente de

    cupuau (linha azul) e deste adicionado de Catequina (linha vermelha).

    Figura 37 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol do extrato de semente de

    cupuau (linha azul) e deste adicionado de Epicatequina (linha vermelha).

    Figura 38 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol do extrato de semente de

    cupuau (linha azul) e deste adicionado de Quercetina (linha vermelha).

    Figura 39 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol do extrato de semente de

    cupuau (linha azul) e deste adicionado de Rutina (linha vermelha).

    Figura 40 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol : amnia do extrato de

    semente de cupuau (linha azul) e deste adicionado de Epicatequina (linha vermelha).

    Figura 41 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol : amnia do extrato de

    semente de cupuau (linha azul) e deste adicionado de Homorientina (linha vermelha).

    Figura 42 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol : amnia do extrato de

    semente de cupuau (linha azul) e deste adicionado de Orientina (linha vermelha).

    Figura 43 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol : amnia do extrato de

    semente de cupuau (linha azul) e deste adicionado de Isovitexina (linha vermelha).

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  • Figura 44 - Cromatogramas em 270 nm da frao metanol : amnia do extrato de

    semente de cupuau (linha azul) e deste adicionado de Vitexina (linha vermelha).

    Figura 45 - Cromatograma em 270 nm (linha vermelha) e cromatograma TIC (linha

    azul) da frao CH3OH do extrato de semente de cupuau.

    Figura 46 - Cromatograma em 270 nm (linha vermelha) e cromatograma TIC (linha

    azul) da frao CH3OH : NH4 do extrato de semente de cupuau.

    Figura 47 Fragmentao proposta para o nion da catequina e da epicatequina.

    Figura 48 -...

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