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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS - UFSCar
CENTRO DE EDUCAÇÃO E CIÊNCIAS HUMANAS - CECH DEPARTAMENTO DE PSICOLOGIA - DPsi
AVALIAÇÃO DA ADMINISTRAÇÃO DO ANTAGONISTA E AGONISTA DOS RECEPTORES 5-HT2B/2C NA MATÉRIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
Aluna: Vanessa Nunes de Souza RA: 215830 Orientadora: Profa. Dra Azair Liane Matos do Canto de Souza
São Carlos Dezembro 2004
SP
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SUMÁRIO
Abreviaturas .................................... ................................................... 03
Resumo ........................................... ..................................................... 04
Introdução ....................................... .......................... ........................ 05
Material e Método ................................ ............................................... 11
- sujeitos ................................. .... .............................................. 11
- equipamento .................................... ....................................... 11
- cirurgia .......................... ....................................................... 12
- drogas .................................... .............................................. 12
- procedimento geral ................. .............................................. 13
- histologia .......................... ....................................................... 14
- análise estatística ................ ................................................. 15
Resultados ....................................... .................................. ................. 16
Discussão ........................................ .................................................... 20
Conclusão ........................................ .................................................... 22
Referências ...................................... ..................................... ........ ..... 23
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ABREVIATURAS
MCP - Matéria Cinzenta Periaquedutal
5-HT - Serotonina
LCE - Labirinto em Cruz Elevado
BA - Braço Aberto
BF - Braço Fechado
TP - Transtorno do Pânico
TAG - Transtorno de Ansiedade Generalizada
NDR - Núcleo Dorsal da Rafe
NMR - Núcleo Mediano da Rafe
NS - Não Significativo
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RESUMO
A neurotransmissão serotonérgica vem sendo objeto de vários estudos desde que seu envolvimento foi relacionado à ansiedade. Compostos que agiam como antagonistas dos receptores de serotonina (5-HT) resultavam em efeitos ansiolíticos similares aos dos benzodiazepínicos. A hipótese serotonérgica da ansiedade foi corroborada pelas observações de que ansiolíticos benzodiazepínicos diminuíam a atividade de neurônios serotonérgicos. Entretanto, esta hipótese vem sendo revista em função dos resultados obtidos a partir de modelos animais que envolvem microinjeções de drogas diretamente nos sítios cerebrais. Nesse sentido, alguns estudos procuraram relacionar a atividade dos diferentes receptores serotonérgicos à ação de drogas agonistas e antagonistas de 5-HT. A matéria cinzenta periaquedutal (MCP) caracteriza-se como uma estrutura que está envolvida na integração das manifestações comportamentais e neurovegetativas relacionadas à aversão. Ela recebe conexões aferentes e eferentes de estruturas que estão funcionalmente separadas, as quais possuem papéis distintos nas respostas defensivas. Foi proposto, assim, que a MCP desempenha um papel maior que o de uma via final comum para as respostas defensivas. A validação do labirinto em cruz elevado (LCE) como modelo animal de ansiedade tanto para ratos, quanto para camundongos, bem como a constatação de que este modelo mostra grande sensibilidade no que diz respeito à detecção de efeitos ansiolíticos e ansiogênicos de compostos serotonérgicos, justificam a escolha e a utilização desse modelo neste trabalho. O presente estudo avaliou a ação do antagonista ketanserina e agonista mCPP dos receptores 5-HT2B/2C através de microinjeção destas drogas na MCP de camundongos submetidos ao LCE. Foram utilizadas 3 doses do agonista (0,03, 0,1 e 0,3 nmol/0,1ul), obtendo-se efeito ansiolítico para a dose de 0,03 nmol/0,1ul, quando analisados os índices convencionais e etológicos de ansiedade no LCE. A administração do antagonista ketanserina (10 nmol/0,1ul) mostrou ausência de efeitos para os índices de ansiedade avaliados.
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INTRODUÇÃO
O papel da serotonina (5-HT) na ansiedade vem sendo objeto de numerosos
estudos desde as primeiras constatações de que antagonistas da
neurotransmissão serotonérgica resultavam em efeitos ansiolíticos similares aos
dos benzodiazepínicos em testes de conflito (Graeff e Schoenfeld, 1970). Estes
resultados apontavam para o fato da 5-HT provocar ansiedade agindo no
mesencéfalo e na matéria cinzenta periaquedutal (MCP) (Graeff e Schoenfeld,
1970, Graeff, 2002). Os ansiolíticos benzodiazepínicos clássicos (por exemplo,
diazepam) são, talvez, as drogas mais prescritas para o tratamento da ansiedade.
Estes compostos atuam como agonistas dos receptores benzodiazepínicos, os
quais, embora estejam abundantemente distribuídos no sistema nervoso central,
estão particularmente presentes em estruturas do sistema límbico como septo,
hipocampo e amígdala (Menard e Treit, 1999).
A proposição da teoria serotonérgica clássica da ansiedade, a qual atribui
um papel ansiogênico para a 5-HT foi favorecida também pelas observações de
que os ansiolíticos benzodiazepínicos diminuíam a atividade dos neurônios
serotonérgicos (Pinheiro et al., 2002).
Esta hipótese pode, ainda, ser fortalecida pela utilização de drogas
serotonérgicas com potencial ansiolítico como os antagonistas dos receptores 5-
HT2 (ritanserina, mianserina e ketanserina) e 5-HT3 (ondasetron, zacopride e BRL
46470) que resultaram em efeitos ansioliticos em vários modelos animais (para
revisões ver Handley e McBlane, 1993; Cruz, et al. 1997).
Entretanto, a hipótese serotonérgica clássica da ansiedade vem sendo
revista principalmente em função dos resultados obtidos de modelos animais que
envolvem microinjeções de drogas diretamente nos sítios cerebrais. Tem sido
constatado que, em geral, microinjeções de 5-HT na amígdala produzem efeitos
ansiogênicos (Pesold e Treit, 1995; Menard e Treit, 1999, Nunes-de-Souza, et al.
2000), o mesmo não ocorre com microinjeções de 5-HT na MCP, que resultam em
efeitos ansioliticos (Deakin e Graeff, 1991; Graeff et al.,1993; Graeff,1994;
Gonzalez et al.,1996; Guimarães et al., 2004).
Os receptores 5HT2 (B e C) do sistema nervoso central (córtex frontal,
gânglios da base e sistema límbico – hipotálamo, septo, amígdala, cerebelo e
6
MCP) são responsáveis pela regulação dos transtornos de humor e de ansiedade.
Algumas descobertas apontam para o fato da ativação destes receptores
promoverem efeito ansiolítico em algumas regiões do cérebro, como na amígdala
medial, e ansiogênico em outras, como no hipocampo dorsal (Menard e Treit, 1999)
e Hipocampo ventral (Fachinni,et al., 2004). Assim, tem sido sugerido que a 5-HT
possui um papel dual na regulação das respostas defensivas.
A neurotransmissão serotoninérgica é, realmente, muito complexa,
composta por sete classes de receptores (5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4 ,5-HT5, 5-HT6
e 5-HT7 , sendo estes ainda subdivididos em 5-HT1A, 5-HT1B , 5-HT1D ,5-HT1F , 5-
HT2A , 5-HT2B , 5-HT2C , 5-HT5A,5-HT5B ) (Zifa e Fillion, 1992).
Dentre esses subtipos, os receptores 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT3 constituem
aqueles que estão mais diretamente relacionados à ansiedade (Hoyer e Martin,
1997; Barnes e Sharp, 1999). Alguns estudos buscaram relacionar a atividade
desses receptores à ação de suas respectivas drogas agonistas e antagonistas
(Nogueira e Graeff, 1995; Hensler e Truett, 1998; Wallis e Lal, 1998; Setem et
al.,1999). Os principais agonistas serotonérgicos utilizados são a 2,5- dimetoxi-4-
iodoanfetamina (DOI) (Hensler e Truett, 1998) e a 1-(3-clorofenil) piperazina
(mCPP) (Wallis e Lal, 1998). O DOI caracteriza-se como um agonista dos
receptores 5-HT2A/2C, enquanto o mCPP atua principalmente sobre os receptores 5-
HT1B/2C e parcialmente sobre os 5-HT2A (Hensler e Truett, 1998; Wallis e Lal, 1998).
Entre os antagonistas serotoninérgicos mais empregados estão a
ketanserina (3 - [2 - [4 - (4 - fluorobenzoil) – 1 – piperdinil] etil] – 2,4 (1H, 3H) -4-
quinazolinedione tartrato) e a mianserina (Hensler e Truett, 1998). Ambas atuam
principalmente sobre os receptores 5-HT2 (Nogueira e Graeff, 1995; Hensler e
Truett, 1998).
Nogueira e Graeff (1995) estudaram o papel dos subtipos de receptores de
5-HT da matéria cinzenta periaquedutal (MCP) na modulação da aversão
generalizada em ratos, a partir da constatação de que esta estrutura está envolvida
na integração das manifestações comportamentais e neurovegetativas
relacionadas à aversão (para uma revisão ver Graeff, 1990). Entretanto, não
chegaram a uma conclusão a respeito da interação entre os receptores 5-HT1 e 5-
HT2 no que diz respeito à versão generalizada na MCP dorsal.
Vianna e Brandão (2003) concluíram que a organização anátomo-funcional
da MCP é consistente com a idéia de que ela recebe conexões aferentes e
7
eferentes de estruturas funcionalmente separadas e com papéis em diferentes
respostas defensivas. A partir disso, afirmaram que a MCP é mais que uma via final
comum para as respostas defensivas. Propuseram que diferentes subdivisões da
MCP podem mediar o congelamento dependendo ou não da presença de perigo
imediato.
A estimulação elétrica da região dorsal da MCP gera comportamentos
defensivos como, por exemplo, luta ou fuga, respostas que sugerem que o animal
esteja passando por uma acentuada experiência aversiva (Graeff et al., 1993). Em
pacientes humanos, a estimulação elétrica desta estrutura em neurocirurgias
estereotáxicas gera fortes sentimentos de medo, morte iminente ou dor não-
localizada e acentuadas mudanças autonômicas (Nashold et al., 1969; Amano et
al., 1978, citado por Zanoveli, et al., 2003).
Dada a impressionante semelhança entre os efeitos autonômicos e
comportamentais decorrentes da estimulação da MCP dorsal e os sintomas dos
ataques de pânico, tem sido sugerido que esta área esteja envolvida na gênese do
Transtorno de Pânico (TP) em humanos e que a estimulação desta região em
animais possa gerar ataques de pânico (Graeff, 1990; Jenk et al., 1995; Lovick,
2000; Schenberg et al., 2001, citado por Zanoveli et al., 2003).
Evidências de experimentos que utilizaram estimulação elétrica ou química
da MCP dorsal de ratos apontam que os receptores de 5-HT localizados nesta área
cerebral regulam comportamentos de fuga, considerados indícios de pânico
(Nogueira e Graeff, 1991, 1995).
As evidências clínicas também são contraditórias. Enquanto os efeitos
ansiolíticos dos benzodiazepínicos no tratamento do Transtorno de Ansiedade
Generalizada (TAG) podem envolver uma diminuição na liberação de 5-HT (Blier et
al., 1995, citado por Zangrossi et al., 2001), drogas que facilitam a
neurotransmissão de 5-HT, como os inibidores de recaptação de serotonina são
clinicamente utilizados no tratamento dos transtornos de ansiedade. A ritanserina,
um antagonista dos receptores 5-HT2A/2C tem mostrado bons resultados no
tratamento do TAG, assim como os ansiolíticos benzodiazepínicos, porém com
efeitos inconsistentes no tratamento do TP (Ceulemans et al., 1985, citado por
Zangrossi et al., 2001).
Dessa forma, as evidências indicam que a 5-HT pode ter tanto um efeito
ansiolítico, quanto ansiogênico dependendo da região cerebral considerada.
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Deakin e Graeff (1991) propuseram a existência de dois sistemas serotonérgicos
separados que regulariam o comportamento defensivo. A ativação da via
serotonérgica ascendente do núcleo dorsal da rafe (NDR), que envia projeções
para a amígdala e para o córtex frontal facilitaria os comportamentos defensivos
aprendidos em resposta a uma ameaça potencial ou indeterminada. A ativação da
via serotonérgica periventricular do NDR, a qual envia projeções para MCP dorsal
poderia inibir a fuga ou reações de luta em resposta a alguma ameaça próxima.
Esta concepção pode ser importante no sentido de que a MCP dorsal comanda a
defesa ativa, como as reações de luta ou fuga, típicas de circunstâncias de extremo
perigo, como a proximidade de um predador, por exemplo, (Zangrossi et al., 2001).
Canto-de-Souza et al. (2002) relataram efeitos ansiolíticos com infusões
intra-NMR (núcleo mediano da rafe) de WAY-100635, um antagonista seletivo dos
receptores 5-HT!A, em camundongos expostos ao LCE. Segundo esses autores,
tais efeitos poderiam estar associados ao aumento de disparos de neurônios
serotonérgicos (via bloqueio da ação da 5-HT nos autorreceptores inibitórios do tipo
5-HT1A), levando à atenuação da ansiedade pela 5-HT em sítios pós-sinápticos
(exemplos: amígdala, hipocampo, matéria cinzenta periaquedutal). Evidências de
que a atenuação da ansiedade não se deve à ação da serotonina nos receptores 5-
HT1A localizados na amígdala e hipocampo ventral são encontradas em estudos
com injeções locais de 8-OH-DPAT e WAY-100635, agonista e antagonista de
receptores 5-HT1A, respectivamente. Por exemplo, a microinjeção de 8-OH-DPAT
na amígdala provoca efeitos ansiogênicos (Nunes-de-Souza et al., 2000), enquanto
injeções de WAY-100635 no hipocampo ventral atenuam a ansiedade (Nunes-de-
Souza et al., 2002) de camundongos expostos ao LCE. Assim, é possível que os
efeitos ansiolíticos relatados por Canto-de-Souza et al., (2002) se devam ao
aumento da liberação de serotonina em outros sítios (exemplos: nos receptores 5-
HT1A e 5-HT2 da matéria cinzenta periaquedutal) ou à sua ação em outros
receptores serotonérgicos (exemplos: receptores 5-HT2 e 5-HT3 localizados na
amígdala e hipocampo.
Setem et al., (1999) estudaram os efeitos de injeções intraperitoniais de
agonistas e antagonistas dos receptores 5-HT1A, 5-HT2 e 5-HT3 em ratos expostos
ao labirinto em cruz elevado (LCE). Os resultados mostraram grande sensibilidade
desse modelo no que diz respeito à detecção de efeitos ansiolíticos e ansiogênicos
de compostos serotonérgicos, em especial os que atuam nos receptores 5-HT2.
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O LCE constitui um modelo animal de ansiedade validado primeiramente
para ratos (Pellow et al., 1985) baseado na aversão natural de roedores por
espaços abertos. Estes, normalmente, evitam os braços abertos do labirinto
restringindo suas atividades aos braços fechados. Os índices primários de
ansiedade neste modelo consistem de medidas relativas à freqüência de visitas
aos braços abertos (relativas ao total de entradas em ambos os braços) e o tempo
gasto pelos animais nestas áreas aversivas do aparato (relativas ao tempo de
duração do teste). Fernandes e File (1996) mostraram a importância de se
acrescentar beiradas ao longo dos braços abertos do LCE (0,5 cm para testes com
ratos), após constatarem que, em vários experimentos que utilizavam altas doses
de benzodiazepínicos, uma parcela significativa de animais caía do aparato.
Lister (1987) validou o uso do LCE para camundongos obtendo resultados
que se mostraram de acordo com os obtidos por Pellow et al., (1985). Demonstrou
as vantagens da utilização desse modelo animal de ansiedade sobre os outros
modelos, os quais envolvem privação de água e/ou comida ou que envolvem a
administração de choques elétricos. O LCE permite a visualização do
comportamento espontâneo do animal, além deste não necessitar de treinamento
prévio. O teste é rápido e se mostrou eficaz em detectar efeitos ansiogênicos e
ansiolíticos decorrentes da administração de drogas e outros compostos.
Rodgers e Jonhson (1995) ampliaram a análise dos índices de ansiedade no
LCE incluindo a observação de comportamentos etológicos como levantamentos,
mergulhos, esticadas, exploração do ambiente através do olfato, autolimpeza, além
de retornos aos braços fechados (saída do braço fechado com apenas um par de
patas, com posterior retorno ao mesmo braço). A área central e os braços fechados
do LCE foram considerados áreas protegidas do labirinto, enquanto os braços
abertos foram considerados áreas desprotegidas.
Setem et al., (1999) indicaram que a observação dos comportamentos
etológicos em ratos, juntamente com as medidas convencionais, pode ser mais
efetiva na avaliação dos efeitos de compostos serotonérgicos ou outras drogas no
LCE.
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OBJETIVO
Diante dos relatos da literatura, este projeto teve por objetivo avaliar a ação
do antagonista (ketanserina) e agonista (mCPP) dos receptores 5-HT2B/2C através
de microinjeção na MCP de camundongos submetidos ao LCE.
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MATERIAL E MÉTODO
Sujeitos
Foram utilizados camundongos ingênuos da cepa Suíço albino, (n=9-13)
machos, pesando aproximadamente 25g provenientes do Biotério Central da
Universidade Federal de São Carlos.
Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Psicologia da
Aprendizagem (LPA), acomodados em caixas apropriadas (medindo 45x28x13cm)
contendo comida e água à vontade. Um ciclo claro-escuro de 12h controlou o
ambiente onde a temperatura foi mantida constante (23° ± 1°C).
Equipamento
Labirinto em cruz elevado, construído em madeira e vidro transparente, o
qual compõe as paredes dos braços fechados que medem 30 x 5 x 15 cm. Os
braços abertos, por sua vez, medem 30 x 5 x 0,25 cm. O aparelho foi montado
sobre uma base de madeira e elevado a 38,5 cm do chão (Foto 1). O tempo de
teste no aparato foi de 5 minutos, registrado por meio de filmagem.
Foto 1. Labirinto em Cruz Elevado
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Cirurgia
Os animais eram pesados e em seguida, anestesiados com pentobarbital
sódico (60mg/kg, i.p.). Após a tricotomia, os sujeitos eram colocados no
estereotáxico (Insight ETX 3/99) e recebiam uma injeção subcutânea de cloridrato
de lidocaína na região cirúrgica.
Os animais receberam implantação craniana de cânula-guia (25- gauge) de
7 mm de comprimento. A cânula era fixada no crânio do animal com cimento
acrílico. As coordenadas estereotáxicas para implantação da cânula-guia (Antero-
posterior: -3,8; Dorso lateral:+0,3 e Ventro medial:-1,4) foram definidas pelo Atlas
de Franklin e Paxinos (1997). A ponta da cânula-guia era posicionada a
aproximadamente 1,0 mm dorsal à estrutura alvo. O mandril, que era removido
durante o procedimento de injeção, era inserido dentro da cânula-guia para evitar
problemas com obstrução e para reduzir contaminação.
Na ocasião dos testes, a agulha de injeção (33-gauge) foi inserida dentro da
cânula-guia para injeção das soluções dentro da MCP, sendo que o comprimento
da mesma ultrapassou em 1,0 mm a ponta da cânula-guia. A agulha de injeção foi
conectada, por meio de tubo de polietileno (PE-10), a uma microsseringa Hamilton
de 10 µl. Uma bomba de infusão (Insight Bi 2000) foi programada para injetar (na
MCP) 0,1µl de solução durante um período de 60 segundos.
O procedimento de microinjeção consistiu na remoção do mandril, inserção
da agulha de injeção, injeção da solução por 60 segundos, permanência da agulha
de injeção por 90 segundos após o término da injeção e inserção do mandril
enquanto o animal era contido manualmente pelo experimentador. O movimento
de uma pequena bolha de ar no tubo de polietileno antes, durante e depois da
injeção confirmou o fluxo da solução.
Drogas
Agonista mCPP – Tocris, PM: 233,147 gramas (0,03 ,0,1 e 0,3 nmol/0,1µl)
dissolvidas em veículo (salina com 2% de Tween-80).
Antagonista ketanserina – RBI, PM: 545,5 gramas (10nmol/0,1µl) dissolvida
em veículo (salina com 2% de Tween-80).
As doses basearam-se em estudos anteriores e/ou em estudos pilotos.
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Procedimento Geral
Antes de cada teste no LCE, os animais receberam microinjeção de veículo
(controles), mCPP (nas doses: 0,03, 0,1 e 0,3 nmol/0,1µl) ou ketanserina
(10nmol/0,1µl). Imediatamente após o tempo necessário para a ação das drogas
(3 minutos), cada sujeito foi colocado no centro do labirinto voltado para um dos
braços abertos. Cada teste tinha duração de 5 minutos, os quais eram registrados
por meio de filmagem. Foram avaliados os comportamentos convencionais e
etológicos. As medidas convencionais incluíram a porcentagem de tempo de
permanência do sujeito no centro do LCE, a porcentagem do número de entradas
e de tempo gasto nos braços abertos e fechados em relação ao tempo total do
teste. A entrada em um braço foi definida pelo cruzamento de todas as quatro
patas para dentro do braço.
Os comportamentos etológicos foram medidos em relação à freqüência e
duração, incluindo as seguintes categorias:
• Levantar: caracteriza-se pela freqüência de elevações do corpo sob as
patas traseiras.
• Mergulhar (”head-dipping”): refere-se à freqüência de movimentos
exploratórios da cabeça/ombros em direção ao solo.
• Esticar (“stretched attend postures” – SAP): relativo à freqüência de esticar
o corpo e retraí-lo à posição original, sem a ocorrência de locomoção.
• Autolimpeza: refere-se à duração de tempo das lambidas e esfregadas da
cabeça e corpo típicas da espécie, que normalmente começam pelo
focinho, progridem pelas orelhas e terminam nos flancos e traseira.
• Imobilidade: refere-se à quantidade de tempo em que o animal não executa
qualquer movimento.
Os comportamentos de mergulhar a cabeça e esticar o corpo foram
diferenciados quanto ao local de sua ocorrência (protegido ou desprotegido) no
labirinto. O aparato foi limpo com solução de álcool a 20% após cada sujeito ser
testado. O experimentador não permanecia na sala onde os testes foram
realizados e filmados e não tinha conhecimento do protocolo experimental em
relação às doses das drogas utilizadas, sendo empregado um código para cada
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dose e controle. Somente no final de todo o experimento, inclusive após a análise
das fitas, que este código foi revelado, para que, então, fosse realizada a análise
estatística.
Histologia
Após o término dos experimentos, todos os animais receberam injeção
central de 0,1µl de uma solução de 1% de azul de metileno, de acordo com
procedimento descrito para a injeção das drogas. Os animais foram, então,
decapitados e tinham seus cérebros removidos e acomodados em recipientes
contendo solução de formalina (10%) para, posteriormente, sofrerem secções
coronais ao longo do trajeto da cânula utilizando-se um micrótomo. As secções
foram inspecionadas com o uso de um microscópio e a visualização da dispersão
do azul de metileno indicou o local da injeção.
A figura 1 mostra alguns sítios de injeção dos animais em que a ponta da
agulha estava localizada dentro da MCP.
Figura 1. Localização dos sítios de microinjeção de acordo com o Atlas de Franklin e Paxinos (1997). A área preenchida de cinza indica os sítios de injeção
15
Análise estatística
Os resultados foram analisados pela análise de variância (ANOVA), e
quando pertinente, submetidos a testes de comparações múltiplas (Teste de
Duncan). Os valores de P < ou iguais a 0,05 foram considerados significativos .
16
RESULTADOS
A figura 2 mostra os efeitos das microinjeções de mCPP na MCP de
camundongos expostos ao LCE. A análise estatística mostrou efeitos significativos
para a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos (F(3,38) = 3,35, P < 0,05) e
a porcentagem de entradas nos braços abertos (F (3,38) = 3,93, P < 0,05), (ver
Fig. 2B), sem alterar a atividade locomotora (entradas nos braços fechados), (ver
Fig. 2A) (F(3,38) = 0,48, NS). Comparações múltiplas entre os grupos revelaram que
somente a dose mais baixa de mCPP (0,03 nmol/0,1µl) aumentou a porcentagem
de entradas nos braços abertos do LCE quando comparado com o grupo veículo.
.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Ent
rada
s B
raço
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A
0
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70
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0 0,03 0,1 0,3mCPP (nmol/0,1ul)
Entradas nos BAs Tempo nos BAs
*
* *
B
Figura 2. Efeitos da administração do mCPP (veículo, 0,03, 0,1 e 0,3 nmol/0,1µl) microinjetado na MCP de camundongos expostos ao LCE. As barras representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entradas nos braços fechados (A) e as percentagens de entradas e de tempo gasto nos braços abertos (BAs) (B). P < 0,05 comparado ao grupo veículo (0).
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A tabela 1 mostra os resultados obtidos para os comportamentos etológicos
nas diferentes doses de mCPP aplicadas.
A análise estatística revelou efeitos significativos para o total de esticadas
(F(3,38) =4,57, P <0,05), total de mergulhos (F(3,38) = 2,72, P < 0,05) e para a
porcentagem de mergulhos protegidos (F(3,38) = 3,71, P < 0,05). Nenhum efeito
significativo foi revelado para a porcentagem de esticadas protegidas (F(3,38) =
2,42, NS), total de levantamentos (F(3,38) = 1,0, NS), porcentagem de
levantamentos protegidos (F(3,38) = 2,11 NS), autolimpeza (F(3,38) = 1,95, NS) e
para a imobilidade (F(3,38) = 1,95 NS).
O teste de comparações múltiplas entre os grupos revelou que a dose mais
baixa de mCPP (0,03 nmol/0,1ul) aumentou o total de esticar e mergulhar,
enquanto diminuiu a porcentagem de esticar e mergulhar protegidos. Além disso,
a dose de 0,3 nmol/0,1ul (dose mais alta) também diminuiu a porcentagem de
mergulhos protegidos.
mCPP(nmol/0,1µl)Comportamentos 0 0,03 0,1 0,3 F(df 3,38)
Total esticar 15,9 ± 2,1 24,4 ± 2,7 * 19,2 ± 2,9 12,6 ± 2,0 4,57, P< 0,05% esticar protegido 72,0 ± 6,6 48,5 ± 5,6 * 58,6 ± 7,5 70,8 ± 7,8 2,42, P <0,05Total mergulhar 9,0 ± 1,8 14,4 ± 1,7 * 9,0 ± 1,3 8,8 ± 1,6 2,72, P< 0,05% mergulhar protegido 81,5 ± 7,8 56,9 ± 5,6 * 72,2 ± 7,6 48,4 ± 9,0 * 3,71, P< 0,05Total levantar 4,0 ± 1,1 6,0 ± 1,4 7,9 ± 2,4 5,5 ± 1,2 1,0, NS% levantar protegido 100 ± 0 80,0 ± 13,3 100 ± 0 96,9 ± 1,7 2,11, NSautolimpeza 19,7 ± 8,8 12,7 ± 8,4 17,0 ± 7,8 16,2 ± 5, 7 0,13, NSimobilidade 27,5 ± 10,7 8,0 ± 4,1 34,3 ± 14,8 51,8 ± 16,9 1,95, NS
A figura 3 mostra os efeitos da microinjeção de ketanserina ou veículo na
MCP de camundongos expostos ao LCE. A análise estatística não revelou efeitos
significativos para a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos (t (19) = 0,60,
NS), porcentagem de entradas nos braços abertos (t (19) = 0,70, NS) (ver Fig. 3B) e
para a atividade locomotora nos braços fechados (t (19) = - 0,78, NS) (ver Fig. 3A).
Tabela 1. Efeitos do mCPP (0,03, 0,1 e 0,3nmol/0,1µl) microinjetado na MCP, sobre os comportamentos etológicos de camundongos avaliados no LCE.
* P < 0,05 comparado ao grupo veículo (0). NS: Não Significativo
18
0
2
4
6
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50
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empo
gas
to n
os
Bra
ços
Abe
rtos
Entradas nos BA Tempo nos BA
0 10 ketanserina(nmol/0,1ul)
B
A tabela 2 mostra a ausência de efeitos da ketanserina microinjetada na
MCP de camundongos expostos ao LCE. A análise estatística não revelou efeitos
significativos para nenhum dos comportamentos etológicos, que incluem o total de
esticadas (t (19) = 0,26 NS), a porcentagem de esticadas protegidas (t (19) = - 1,45
NS), total de mergulhos (t (19) = -0,80 NS), porcentagem de mergulhos protegidos (t
(19) = -1,39 NS), total de levantamentos (t (19) = 0,60 NS), porcentagem de
levantamentos protegidos (t (19) = 1,84 NS), autolimpeza (t (19) = -0,07 NS) e
imobilidade (t (19) = 0,49 NS) no labirinto em cruz elevado.
Figura 3. Ausência de efeitos da ketanserina (veículo e 10 nmol/0,1µl) microinjetados na MCP de camundongos expostos ao LCE. As barras representam as médias e o erro padrão do número de entradas nos braços fechados e das porcentagens de entrada e do tempo gasto nos braços abertos (BA) no LCE.
19
ketanserina (nmol/0,1µl)Comportamentos veículo 10 t (df 19)Total esticar 17,7 ± 2,88 16,73 ± 2,19 0,26, NS% esticar protegido 81,63 ± 6,97 81,64 ± 6,7 -1,45, NSTotal mergulhar 8,8 ± 0,89 10,18 ± 1,43 - 0,80, NS% mergulhar protegido 53,8 ± 10,67 72,94 ± 8,77 -1,39, NSTotal levantar 7,20 ± 1,96 5,63 ± 1,51 0,60, NS%levantar protegido 100 ± 0 72,73 ± 14,08 1,84, NSautolimpeza 7,17 ± 1,80 7,36 ± 1,99 -0,07, NSimobilidade 18,43 ± 4,55 15,12 ± 4,87 0,49, NS
Tabela 2. Ausência de efeitos da Ketanserina (10nmol/0,1ul) microinjetada na MCP, sobre os comportamentos etológicos avaliados no LCE.
20
DISCUSSÃO
O nosso trabalho mostrou que o mCPP, agonista dos receptores 5-HT2B/2C ,
resultou em um efeito ansiolítico quando administrado na MCP de camundongos
expostos ao LCE. A porcentagem de tempo gasto nos braços abertos foi
significativamente maior para as doses de 0,03 e 0,1nmol/0,1ul, enquanto a
porcentagem do número de entradas nesses mesmos braços foi significativamente
maior para a dose de 0,03 nmol/0,1ul. A atividade locomotora dos animais não foi
afetada com nenhuma das doses utilizadas.
O LCE constitui um modelo animal de ansiedade validado primeiramente
para ratos (Pellow et al., 1985) e posteriormente para camundongos (Lister, 1987),
baseado na aversão natural de roedores por espaços abertos. Estes,
normalmente, evitam os braços abertos do labirinto restringindo suas atividades
aos braços fechados. Os índices primários de ansiedade neste modelo consistem
de medidas relativas à freqüência de visitas aos braços abertos (relativas ao total
de entradas em ambos os braços) e o tempo gasto pelos animais nestas áreas
aversivas do aparato (relativas ao tempo de duração do teste). Neste estudo
houve um aumento da porcentagem de entradas e de tempo gasto nos braços
abertos, indicando um efeito ansiolítico resultante da administração do mCPP,
principalmente para a dose mais baixa do agonista.
Com relação aos comportamentos etológicos medidos no LCE, a análise
dos resultados revelou efeitos significativos para o total de esticadas, total de
mergulhos, e para a porcentagem de esticadas e mergulhos protegidos. A
diminuição na porcentagem de esticadas protegidas significa um aumento na
porcentagem de esticadas desprotegidas (em relação ao total de esticadas). O
mesmo pôde ser observado com relação à porcentagem de mergulhos protegidos.
Estes resultados, portanto, sustentam o efeito ansiolítico obtido na avaliação dos
comportamentos convencionais.
Trabalhos como o de Setem et al., (1999) que investigou os efeitos de
agonistas e antagonistas serotonérgicos em ratos submetidos ao LCE indicaram
que a observação dos comportamentos etológicos, juntamente com as medidas
convencionais, pode ser mais efetiva na avaliação dos efeitos destes compostos
ou outras drogas no LCE.
21
Consistente com os resultados obtidos neste estudo, Dhonnchadha et
al.,2003 também obteve efeito ansiolítico após a administração sistêmica de
mCPP , em ratos avaliados no LCE. Outros trabalhos, entretanto, mostram
resultados diferentes no que diz respeito à utilização deste agonista, como por
exemplo, o de Zanoveli et al., 2003, que obteve efeito ansiogênico com
microinjeções de mCPP na MCP dorsal de ratos avaliados no Labirinto em T
Elevado. Nogueira e Graeff (1995) obtiveram ausência de efeitos na avaliação do
comportamento aversivo induzido por estimulação elétrica da MCP dorsal de ratos
após microinjeções de mCPP nesta mesma região.
Estas variações podem ser atribuídas aos diferentes métodos utilizados,
bem como aos diversos modelos animais empregados.
Resultados obtidos com modelos animais que envolvem microinjeções de
drogas diretamente nos sítios cerebrais vem fazendo com que a hipótese
serotonérgica clássica da ansiedade, a qual atribui um papel ansiogênico para a 5-
HT, seja revista.Tem sido constatado que, em geral, microinjeções de 5-HT na
amígdala produzem efeitos ansiogênicos (Pesold e Treit, 1995; Menard e Treit,
1999, Nunes-de-Souza et al., 2000), e o mesmo não ocorre com microinjeções de
5-HT na MCP, que resultam em efeitos ansiolíticos (Deakin e Graeff, 1991; Graeff
et al., 1993; Graeff, 1994; Gonzalez et al.,1996; Guimarães et al., 2004). Segundo
teoria de Deakin e Graeff (1991), a serotonina possui um papel dual no sistema de
defesa, podendo atuar como ansiolítica ou ansiogênica, dependendo das
características do estimulo aversivo. Os nossos resultados corroboram esta teoria,
já que a administração de mCPP na MCP produziu efeito ansiolítico em
camundongos submetidos ao LCE.
A administração do antagonista 5-HT2, ketanserina, na MCP de
camundongos não provocou nenhum efeito significativo nos níveis de ansiedade
(comportamentos convencionais e etológicos) medidos no LCE. Resultados
semelhantes foram observados com a administração sistêmica deste composto
em ratos expostos ao LCE (Griebel et al., 1997). A mesma ausência de efeitos foi
observada por Soares e Zangrossi (2004), após microinjeções de ketanserina na
MCP dorsal de ratos submetidos ao Labirinto em T Elevado. Este estudo mostrou,
ainda, que a ketanserina foi capaz de bloquear o efeito ansiogênico decorrente de
microinjeções de 5-HT na MCP dorsal.
22
CONCLUSÃO
Podemos concluir que o antagonista dos receptores 5-HT2, ketanserina, não
produziu nenhum efeito significativo quando microinjetado na MCP de
camundongos submetidos ao LCE. Esta ausência de efeitos é corroborada por
dados da literatura.
A administração do mCPP, agonista dos receptores 5-HT2B/2C , na MCP
atenuou a ansiedade de camundongos expostos ao LCE. A dose mais baixa da
droga (0,03 nmol/0,1ul) produziu efeitos significativos para um dos principais
índices de ansiedade avaliado no LCE, a porcentagem de tempo gasto nos braços
abertos, e a porcentagem de entradas nestes braços. A análise dos
comportamentos etológicos reforça este resultado, que também é consistente com
dados da literatura.
23
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