análise dos efeitos terapêuticos dos electrões de …tavares/downloads/publications/...trabalhos...

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em

Culturas de Células

Porto, 17 de Julho de 2008

Trabalhos Práticos 2

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

Disciplina: Trabalhos PráticosCurso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do PortoAluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares

Orientador:João Manuel R. S. TavaresProfessor Auxiliar do Departamento de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP

Co-Orientador:Luís F. MetelloProfessor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear da ESTSP


Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

• Conteúdos da Apresentação:

– Culturas de Células;– Ciclo Celular;– Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas;– Apoptose ou Morte Celular Programada – Principais Vias para Início;

• Apoptose e Necrose;– Radiofármaco;

• Radiofármaco Ideal para Terapêutica com Electrões de Auger;– Citometria de Fluxo;– Procedimento de Irradiação;– Estudos de Influxo e Efluxo;– Análise da Apoptose Radioinduzida;– Conclusões Finais;– Perspectivas Futuras.


Cultura de Células

• Cultura células – o que são?

– Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas quepermitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo deorigem.

– Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura,com concomitante separação das células vizinhas.


Tipos de Cultura de Células

• Culturas Primárias

– Obtidas por recolha cirúrgica de pequenas peças de tecido;

– Culturas inicialmente heterogéneas, com o tempo tornam-se dominadas por fibroblastos;

– Tempo de sobrevivência in vitroreduzido;

– Propícia a desenvolvimento de contaminações.

• Linhas Celulares

– Crescimento rápido e contínuo;– Proliferação limitada (cerca de 30

divisões celulares) ou ilimitada (ex: células tumorais);

– Mais homogéneas, estáveis e reprodutíveis que culturas primárias;

– Ampla disponibilidade.


Ciclo Celular

• Definição: conjunto de transformações dinâmicas e contínuas quedecorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria,por divisão, origina duas células-filhas carácter cíclico, com períodos decrescimento e de divisão.


Ciclo Celular• Células de mamíferos

em cultura

• Fase G1 1 a 8 horas;• Fase S 6 a 8 horas;• Fase G2 2 a 4 horas; • Fase M < 1 hora.

• Total ≈ 10 a 20 horas A célula prepara-se para se dividir

Mitose

A célula divide-se

Início ciclo celular

A célula aumenta de tamanho, biossíntese

Célula retida

A célula decide se prossegue ou não no ciclo

celularA célula replica o seu ADN


Possíveis Destinos Finais de CélulasIrradiadas

• Ausência de efeito;• Atraso na divisão;• Apoptose;• Falha reprodutiva;• Instabilidade genómica;• Mutação;• Transformação;• Efeito bystander;• Respostas adaptativas.


Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Vias para Início

Apoptose

Iniciada via receptores demorte

Iniciada por estímulos agentesexternos (ex: radiação)


Apoptose e Necrose

Normal

Normal

Edema reversível Edema Irreversível Desintegração

Condensação Fragmentação Corpos Apoptóticos


Radiofármaco

• Dois componentes:

– Radionuclídeo emissões energéticas corresponder aosobjectivos esperados e ao detector de radiação utilizado.

– Fármaco seleccionado, com base na sua localizaçãopreferencial num dado tecido ou órgão ou na participaçãofisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores.


Citometria de Fluxo

• Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicassuspensas num meio líquido em fluxo.

• Através de um aparelho de detecção óptico-eletrónico é possível analisarcaracterísticas físicas e/ou químicas de uma simples célula.

Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica

Microscopia Clássica Citometria de FluxoDetecção visual Detecção electrónica

Centenas de células analisadas Milhares e milhões de células analisadas

Análise qualitativa Análise quantitativa Células imobilizadas na lâmina e contadas

manualmenteCélulas em suspensão, passam individualmente

em frente ao laser do citómetro de fluxo


Procedimento de Irradiação

• Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml) de 99mTc;

• Concluído o processo de irradiação determinar quais as doses ideaisde irradiação;

• Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas,que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy.


Estudos de Influxo e Efluxo

• Estudo de influxo

• Quantidade de 99mTc-Pertecnetato deSódio que penetrou a membranacelular.

• Estudo de efluxo

• Quantidade de 99mTc- Pertecnetatode Sódio que entrou na célula, masfoi de seguida expulso para o seuexterior.

Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membranacelular e sua consequente captação por parte da célula.

Centrifugação amostras cultura de células.


Análise da Apoptose Radioinduzida

• Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio.

Reagente

Diagnóstico Celular Anexina V Iodeto de Propídio

Células Viáveis

Início de Apoptose

Final Apoptose e Necrose


Conclusões Finais

• Linhas celulares grande disponibilidade e elevada capacidade dereprodutibilidade.

• Radiação apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis.

• Crescente interesse da comunidade científica relativamente aosradionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99mTc fazparte.

Pertinência e relevância da presente Dissertação


Perspectivas Futuras

1. Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado ecompleto sobre o tema da Dissertação;

2. Melhorar o conhecimento actual do papel do 99mTc enquanto agenteirradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitosradiobiológicos em culturas de células seleccionadas;

3. Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitosda radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose;

4. Estudo de efluxo e influxo do 99mTc-Pertecnetato de Sódio em culturasde células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agenteterapêutico com a sua dinâmica celular.


Referências• Anazetti, M. C. (2007). "Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e molecular." Metrocamp Pesquisa 1(1): 37-58.• Baatout (2004). "Cytometric methods to analyze radiation effects." Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 18(2): 101-105.• BD, B. (2007). "Annexin V - Introduction." Annexin V Retrieved 26 June 2008, from http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48.• Besta, I. N. N. C. (2004). Detection of Contaminants in Human Cell Culture. L. P. f. H. C. Culture. Marina Mora, EuroBio Bank.• Caprioglio, D. (2008). "Fluorescence in Biology." Retrieved 26 June 2008, from http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html.• Coder, D. (1997). Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons.• Coimbra, U. (2008). "Noções básicas de cultura de células." Retrieved Maio 2008, from https://woc.uc.pt/bioquimica/getFile.do?tipo=2&id=523.• Dash, P. (2008). "Apoptosis." Reproductive and Cardiovascular Research Group Retrieved Maio 2008, from http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/.• Freshney, I. (2006). Basic Principles of Cell Culture. Culture of Cells for Tissue Engineering. G. V.-N. e. I. Freshney, Jon Wiley and Sons.• Hanon E., V. A., Pastoret P. (1996). "The Use of Flow Cytometry for Concomitant Detection of Apoptosis and Cell Cycle Analysis." Biochemica 2(Technical Tips): 25-27.• Hartung, T. (2002). "Good Cell Culture Practice." ATLA 30: 407-414.• Howell, R. (1992). "Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report No.2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6." Medical Physics 19(6):

1371-1383.• Humm, J. (1989). "A New Calculational Method to Assess the Therapeutic Potential of Auger Electron Emission." International Journal of Radiation Oncology Biology

Physics 17(2): 351-360.• Humm, J. (1994). "Dosimetry of Auger-Electron-Emitting Radionuclides." Medical Physics 21(12): 1901-1915.• Marques, F. (2001). "Alguns Aspectos Sobre Geradores e Radiofármacos de Tecnécio-99m e seus Controles de Qualidade." Radiologia Brasileira 34(4): 233-239.• Mather, J. (1998). Introduction to Cell and Tissue Culture. New York and London, Plenum Press.• Nolla, H. (2008). Basic Principles in Flow Cytometry. U. o. California. Berkeley.• Riley, R. (2005). "Principles and Applications of Flow Cytometry." Retrieved 26 June 2008, from http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf.• Ryan, J. (2008). Introduction to Aninmal Cell Culture. Technical Bulletin.• Saha, G. (1998). Radiopharmaceuticals and Methods of Radiolabeling. Fundamentals of Nuclear Pharmacy. Springer.• SIGMA (2008). Fundamental Techniques in Cell Culture... A Laboratory Handbook, SIGMA Laborartories.• Silva, A. (2000). Terra, Universo de Vida. Porto, Porto Editora.• Silva, T. R., Alberto; Hewitt, Christopher; Roseiro, Jose (2004). "Citometria de fluxo - Funcionalidade celular on-line em bioprocessos." Boletim de Biotecnologia

77(Métodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II): 32-40.• Suntharalingam, N. (2002). "Basic Radiobiology." Chapter 14 Retrieved 30 May 2008, from http://www-naweb.iaea.org/nahu/dmrp/pdf_files/Chapter14.pdf.• Unak, P. (2002). "Targeted Tumor Radiotherapy." Brazilian Archives of Biology and Technology 45: 97-110.• Wikipedia. (2008). "Centríolos." Retrieved 30 Maio 2008, from http://pt.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADolo.

http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48

http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html

http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/

http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf

http://www-naweb.iaea.org/nahu/dmrp/pdf_files/Chapter14.pdf

http://pt.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADolo

FIM

Obrigada pela vossa atenção!

análise dos efeitos terapêuticos dos electrões de …tavares/downloads/publications/...trabalhos...

Documents