análise dos efeitos terapêuticos dos electrões de auger em...

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em

Culturas de Células

Adriana Alexandre dos Santos Tavares

Julho de 2008

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

Trabalhos Práticos do Curso de Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do Porto

Adriana Alexandre dos Santos Tavares Licenciada em Medicina Nuclear pela Escola Superior de Tecnologia da

Saúde do Porto (2007)

Orientador: João Manuel R. S. Tavares

Professor Auxiliar do Departamento de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Co-Orientador: Luís F. Metello

Professor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear na Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto

i

Agradecimentos Ao Professor João Manuel R. S. Tavares pelo apoio fornecido ao longo deste trabalho,

particularmente pela orientação, disponibilidade e apoio, fundamentais para a correcta e construtiva elaboração do mesmo.

Ao Professor Luís F. Metello pelo apoio prestado a este trabalho, bem como, pelo auxílio e motivação fornecidos para a realização do mesmo.

Aos meus pais e irmão por terem demonstrado, como sempre, um apoio incondicional. A todos os que possibilitaram o desenvolvimento deste trabalho.

Sumário O objectivo principal do presente trabalho (Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células) é determinar o eventual impacto dos electrões de Auger produzidos aquando do decaimento do 99mTc em diferentes culturas de células.

Sabe-se que um agente ideal para radioterapia tumoral dirigida deve apresentar, entre outras características, electrões de Auger com energias inferiores a 40 keV, semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias, nuclideo filho estável (semi-vida superior a 60 dias) e química adequada aos processos de marcação. O 99mTc preenche alguns dos requisitos enumerados, sendo por isso cada vez mais considerado um potencial agente terapêutico com electrões de Auger.

Para elaboração desta Dissertação é necessário realizar uma recolha de estudos científicos prévios desenvolvidos na área dos electrões de Auger, bem como, da informação sobre algumas técnicas a utilizar para a execução prática do trabalho envolvido, das quais se destaca a citometria de fluxo. Uma vez finalizada essa pesquisa, realiza-se a definição do projecto a desenvolver; nomeadamente, pela abordagem ao protocolo a utilizar, os equipamentos mais importantes para a realização do projecto e os materiais a experimentar. Serve o presente documento como planificação dos Trabalhos Práticos a realizar no âmbito desta Dissertação.

ii

Índice

Capítulo I. Introdução ao Tema e à Estrutura do Relatório ............................................................ 1 1.1. Introdução ............................................................................................................................... 3 1.2. Principais Objectivos ............................................................................................................... 3 1.3. Estrutura Organizativa ............................................................................................................ 4 1.4. Contribuições Principais.......................................................................................................... 6 Capítulo II. Cultura de Células – Princípios Gerais ........................................................................ 7 2.1 Introdução ................................................................................................................................ 9 2.2 Tipos de Culturas ................................................................................................................... 10 2.3 Morfologia e Características Funcionais ................................................................................ 12 2.4 Meios de Cultura .................................................................................................................... 14 2.5 Avaliação e Contaminação da Cultura ................................................................................... 16 2.6 Sumário ................................................................................................................................. 21 Capítulo III. Ciclo Celular e Apoptose .......................................................................................... 23 3.1 Introdução .............................................................................................................................. 25 3.2 Ciclo Celular – Princípios Gerais ........................................................................................... 26 3.3 Apoptose ................................................................................................................................ 30

3.3.1 Processo Apoptótico ....................................................................................................... 31 3.3.2 Regulação da Apoptose e Relação com Ciclo Celular ................................................... 34 3.3.3 Necrose e Apoptose ....................................................................................................... 37

3.4 Sumário ................................................................................................................................. 38 Capítulo IV. Principais Características do 99mTc .......................................................................... 39 4.1 Introdução .............................................................................................................................. 41 4.2 Radiofármaco Ideal para Terapia com Electrões de Auger .................................................... 41 4.3 Principais Características Físicas do 99mTc ............................................................................ 43 4.4 Sumário ................................................................................................................................. 44 Capítulo V. Citometria de Fluxo ................................................................................................... 47 5.1 Introdução .............................................................................................................................. 49 5.2 Citómetro de Fluxo – Principais Características .................................................................... 50 5.3 Vantagens e Desvantagens da Citometria de Fluxo .............................................................. 52 5.4 Citometria de Fluxo para Avaliação dos Efeitos da Radiação em Culturas de Células .......... 54 5.5 Sumário ................................................................................................................................. 57 Capítulo VI. Materiais e Métodos ................................................................................................. 59 6.1 Introdução .............................................................................................................................. 61 6.2 Culturas Celulares e Procedimento de Irradiação .................................................................. 61 6.3 Estudos de Efluxo/Influxo Celular .......................................................................................... 62 6.4 Análise da Apoptose Radioinduzida ...................................................................................... 62 6.5 Sumário ................................................................................................................................. 63 Capítulo VII. Conclusões Finais e Perspectivas Futuras ............................................................. 65 7.1 Conclusões Finais .................................................................................................................. 67 7.2 Perspectivas Futuras ............................................................................................................. 68 Referências .................................................................................................................................. 69

iii

Capítulo I. Introdução ao Tema e à Estrutura do Relatório


1.1. Introdução A Terapia Metabólica com utilização de isótopos radioactivos é cada vez mais encarada com maior atenção, dado o reconhecimento do seu inegável interesse e potencial, particularmente pela elevada especificidade que a caracteriza, podendo ser considerada como uma “cirurgia” com radiação. Dos múltiplos isótopos disponíveis e utilizados para terapêutica pela radiação, salientam-se os emissores beta, para destruição tecidular (“beta knife”), os emissores alfa, que funcionam como cirurgia celular (“alfa knife”) e finalmente os emissores de electrões de Auger, os quais visam a destruição molecular, nomeadamente a nível do ADN (“Auger knife”). É neste cenário que se insere este estudo dos efeitos terapêuticos dos electrões de Auger em culturas de células. Actualmente o conhecimento dos efeitos terapêuticos dos electrões de Auger emitidos pelo Tecnécio-99m (99mTc) é relativamente escasso, pois trata-se de um novo campo de investigação, dado que, durante muitos anos este agente foi utilizado, continuando ainda hoje a ser utilizado, como agente diagnóstico. Esta nova perspectiva sobre um agente sobretudo utilizado no campo de diagnóstico tem despertado atenções na comunidade científica à medida que mais peso e importância é dada aos electrões de Auger, até agora apontados como partículas de baixa eficiência biológica, ou seja, baixa capacidade de induzir danos biológicos nas células. O presente trabalho realizado no âmbito da disciplina de Trabalhos Práticos, do Curso de Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do Porto, visa explanar os principais métodos e técnicas a utilizar para o desenvolvimento experimental da Dissertação com o tema “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”. Pretende-se assim, realizar uma descrição introdutória de alguns conceitos e equipamentos essenciais para a compreensão dos planos de trabalho/protocolos a utilizar aquando da investigação prática, nomeadamente, pela explicação de conceitos de ciclo celular, apoptose, culturas de células e citometria de fluxo.

1.2. Principais Objectivos

Estudos recentes documentam o interesse da terapêutica por radiação, com aplicação

em múltiplas patologias oncológicas, constituindo um tema cada vez mais actual. Neste sentido,

Trabalhos Práticos de Adriana Alexandre dos Santos Tavares 3

Capítulo I. Introdução ao Tema e Estrutura do Trabalho

os estudos radiobiológicos, como os que se pretendem realizar, são absolutamente pertinentes e necessários para caracterizar melhor a natureza dos efeitos produzidos pelos electrões de Auger em culturas de células e ainda a obtenção de dados necessários à caracterização do potencial do 99mTc enquanto agente terapêutico, isto é, em contexto de (Rádio) Terapia Metabólica. Assim, uma vez concluída esta Dissertação com o tema “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”, espera-se contribuir para um maior conhecimento científico sobre:

• O eventual potencial do 99mTc enquanto agente terapêutico, nomeadamente através da análise dos efeitos radiobiológicos dos electrões de Auger emitidos por este radionuclídeo;

• A avaliação dos efeitos radiobiológicos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas celulares, durante diferentes períodos de tempo e com uso de múltiplas doses de irradiação.

Por outro lado, após a conclusão dos Trabalhos Práticos, espera-se conseguir abordar

de forma correcta e global o plano de trabalhos a empreender, no que toca ao uso de electrões de Auger em culturas de células, pela recolha de informação científica que funciona como explicação introdutória de alguns dos métodos utilizados, seguida de esclarecimento dos procedimentos a levar a cabo para realização da presente Dissertação.

1.3. Estrutura Organizativa Pretende-se organizar o presente documento de uma forma autónoma e independente, para facilitar o acesso aos diversos temas estruturados em sete capítulos. Assim, descreve-se de seguida muito sucintamente o que será tratado em cada capítulo:

• Capítulo II. Cultura de Células – Princípios Gerais

Neste capítulo realiza-se uma descrição dos principais conceitos a conhecer aquando do uso de culturas de células, nomeadamente o conceito de culturas de células primárias e linhas contínuas, principais formas de avaliação e quantificação da cultura de células e principais grupos de células, conforme a sua morfologia.



• Capítulo III. Ciclo Celular e Apoptose

Neste terceiro capítulo são abordados, de forma global, os princípios do ciclo celular, com concomitante relação deste com a morte celular programa, isto é, a apoptose. Este capítulo reveste-se de particular importância pois para o desenvolvimento desta Dissertação é fundamental o conhecimento das diferentes fases do ciclo celular e, em particular, as suas relações com o processo apoptótico.

• Capítulo IV. Principais Características do 99mTc

Neste quarto capítulo são explicados os conceitos básicos associados ao uso do 99mTc, enquanto agente irradiante do trabalho, esclarecendo-se conceitos como radiofármaco, radiofármaco ideal para terapia com electrões de Auger e principais características físicas do 99mTc.

• Capítulo V. Citometria de Fluxo

Neste capítulo explica-se as principais características de um citómetro de fluxo, compara-se a técnica de citometria de fluxo com outras técnicas, através da análise das vantagens e desvantagens da citometria de fluxo e, finalmente, expõe-se o seu princípio de funcionamento e a sua aplicabilidade na detecção de efeitos da radiação em cultura de células.

• Capítulo VI. Materiais e Métodos

Neste capítulo são enumerados os materiais e métodos que se prevê utilizar para a realização desta Dissertação, explicando-se como se pretende realizar a irradiação das células, que culturas e técnicas se perspectiva utilizar para compreender melhor os efeitos da radiação nas culturas de células.

• Capítulo VII. Conclusões Finais e Perspectivas Futuras

No último capítulo (capítulo VII) são apresentadas algumas conclusões finais sobre o trabalho desenvolvido, indicando igualmente quais as perspectivas futuras da continuação do desenvolvimento deste trabalho para posterior apresentação como dissertação.


Capítulo I. Introdução ao Tema e Estrutura do Trabalho


1.4. Contribuições Principais Como principais contribuições dos Trabalhos Práticos, enquanto trabalho guia para a execução prática dos procedimentos para finalização desta Dissertação, salientam-se o estudo de técnicas de citometria de fluxo, processo apoptótico e ciclo celular, a revisão bibliográfica, mas também a descrição dos métodos e materiais que se pretende utilizar durante um projecto deste tipo. No que respeita à Dissertação espera-se que esta contribua, como já referido, para aumentar/melhorar o conhecimento científico face a este tema em particular, pois é um campo de intensa pesquisa e interesse crescente. As contribuições exactas do trabalho só serão conhecidas, com maior profundidade, uma vez finalizado o processo de investigação e redigida a respectiva Dissertação.

Capítulo II. Cultura de Células – Princípios Gerais


2.1 Introdução Cultura de células tem vindo a afirmar-se como uma ferramenta muito útil em múltiplas

áreas de investigação das ciências da saúde. O termo cultura tecidular refere-se ao processo de extracção de tecidos ou órgãos de um

animal ou planta, com consequente colocação num ambiente artificial capaz de sustentar e proporcionar o crescimento destes. Este ambiente é, geralmente, criado num vaso de plástico ou vidro com um meio de cultura líquido ou semi-sólido capaz de fornecer nutrientes essenciais para a sobrevivência e crescimento do tecido ou órgão. Quando se removem células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura, com concomitante separação das células vizinhas, diz-se que se está a realizar uma cultura de células.

Apesar das culturas de células animais terem sido realizadas com sucesso por Ross Harrison em 1907, só na década de 40 e 50 do século XX, e após vários desenvolvimentos, é que ocorrem as primeiras culturas de células amplamente disponíveis como ferramenta de pesquisa para os cientistas, (Ryan 2008). As principias razões para isso incluem: primeiro, o desenvolvimento de antibióticos, que facilitaram o processo de cultura celular e evitaram muitos dos problemas inerentes a contaminações da cultura celular; segundo, verificou-se a melhoria das técnicas, nomeadamente, aquelas relacionadas com o uso de tripsina para remoção de células dos vasos de cultura e fundamentais para a obtenção de linhas celulares em crescimento contínuo (tais como, células HeLa); finalmente, como terceira razão, surgem as linhas de culturas de células padronizadas, com meios de cultura quimicamente definidos, o que facilitou o trabalho padronizado entre diferentes grupos de cientistas, bem como, facilitou o processo de cultura celular, tornando-o mais ágil, (Ryan 2008).

O presente capítulo tem como principais objectivos abordar conceitos de culturas de células necessário para a compreensão do restante trabalho, nomeadamente o conceito de linha celular, meio de cultura, avaliação da cultura e da morfologia celular. Para tal estruturou-se o presente capítulo da seguinte forma: primeiro, aborda-se os principais tipos de células; de seguida, algumas das características funcionais e morfológicas das culturas; posteriormente, expõe-se técnicas para avaliação da cultura; e, finalmente, apresenta-se o sumário do mesmo.



2.2 Tipos de Culturas As culturas primárias derivam directamente de tecido animal normal exisado, o qual é

posteriormente transplantado para uma cultura ou, após dissociação por enzimas digestivas, é colocado sob a forma de células únicas em suspensão. Estas culturas são inicialmente heterogéneas, contudo com o passar do tempo tornam-se dominadas por fibroblastos. A preparação destas culturas ditas primárias é um processo que requer trabalho minucioso e demorado, apresentando como principal desvantagem um tempo de sobrevivência in vitro limitado. Apesar desta desvantagem, durante o seu curto período de vida, estas células têm como vantagem a capacidade de reter muitas das características de diferenciação observáveis em células in vivo, (SIGMA 2008). As culturas primárias obtidas pelo método de explantação são obtidas pela recolha cirúrgica de pequenas peças de tecido, que são posteriormente colocadas no vaso de cultura (de plástico ou vidro) emergido num meio de cultura. Alguns dias após, as células individuais são movidas do tecido explantado e colocadas num outro vaso de cultura com substracto, onde se dividirão e crescerão. O segundo método para realização de culturas de células primárias, que é o mais amplamente utilizado, acelera o processo pela adição de enzimas digestivas (enzimas proteolíticas), como é o caso da tripsina e da colagenase, que vão fragmentar o tecido e clivar as ligações entre as células. Desta forma, cria-se uma suspensão de células únicas que é depois colocada num vaso de cultura com meio de cultura adequado para crescimento e divisão celular. Este método é denominado dissociação enzimática, Figura 2.1. Figura 2.1. Reprsentação do processo de dissociação enzimática para cultura primária de células (adaptado de (Ryan 2008)).

Remover tecidos

Separar tecidos

Digestão com enzimas

proteolíticas

Colocar no meio cultura



Quando as células resultantes de culturas primárias crescem e utilizam todo o substracto disponível na cultura, estas devem ser subculturadas para que possam continuar a crescer. Este processo é geralmente realizado com recurso a enzimas que gentilmente separam as células do substrato da cultura. Estas enzimas são similares às utilizadas durante o processo de dissociação enzimática a que as culturas primárias são submetidas e, uma vez, terminado o processo, a suspensão de células pode ser subdividida e colocada em novos vasos de cultura, (Ryan 2008). Dado que as culturas primárias de células são isoladas de seres humanos ou de animais, estas apresentam populações heterogéneas, por exemplo, apresentam diferentes populações celulares e diferentes estados de diferenciação celular. Cada amostra removida do dador é, por isso mesmo, única e impossível de reproduzir exactamente. O processo de diferenciação deste tipo de células inicia-se no momento em que estas células são removidas do dador, pelo que tais culturas são dinâmicas e estão em constante alteração. Assim, as culturas primárias de células requerem comummente meios de cultura complexos e são sistemas extremamente difíceis de padronizar, (Hartung 2002). Culturas de células contínuas são constituídas por um único tipo de células que se propagam em série durante um número limitado de divisões celulares (geralmente cerca de trinta) ou, em alguns casos, de forma ilimitada. O primeiro grupo (divisões celulares limitadas) usa, geralmente, células diplóides e mantém, habitualmente, um certo grau de diferenciação. O facto destas linhas celulares apresentarem senescência ao fim de trinta divisões celulares significa que práticas rigorosas de trabalho devem ser empregues para que estas consigam sobreviver períodos de tempo tão longos. Por outro lado, o grupo das células que se propagam indefinidamente possui, frequentemente, esta capacidade devido ao facto de terem sido transformadas em células tumorais. As linhas de células tumorais derivam, frequentemente, de tumores reais, contudo, podem ser criadas por indução, utilizando oncogenes virais ou tratamentos químicos. Estas linhas apresentam como vantagem a disponibilidade quase ilimitada, contudo, retêm muito poucas características das células originais in vivo, (SIGMA 2008). Para além disso, as linhas celulares contínuas, por serem mais homogéneas e mais estáveis são, portanto, mais reprodutíveis que as populações de células primárias. Estas características advêm do facto de ocorrerem alterações fundamentais no fenotipo das células, logo após o isolamento do tecido animal do dador, (Hartung 2002). Em suma, pode-se definir cultura de células como um tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas que permitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo de origem. Existem basicamente dois grandes grupos de culturas celulares: culturas



primárias, as quais são obtidas directamente de tecidos, são heterogéneas, mantém-se pouco tempo em cultura e são mais propícias ao desenvolvimento de contaminações; e linhas celulares, que são obtidas a partir de culturas primárias, podem ser células imortalizadas (devido a alterações genéticas), apresentam crescimento rápido e contínuo e proliferação ilimitada ou limitada a um número elevado de divisões celulares, Figura 2.2, (Coimbra 2008).

Figura 2.2. Células de culturas primárias (à esquerda) e linhas celulares (à direita) (retirado de (Coimbra 2008)).

As principais vantagens do uso de culturas de células incluem o controlo de condições ambientais, a análise independente de parâmetros, elevado número de testes num reduzido intervalo de tempo, redução dos ensaios com animais e técnica menos dispendiosa que a experimentação animal. Por outro lado, as principais desvantagens incluem: perda de características fenotípicas, sistema biológico fora do ambiente natural e ausência de sinais importantes, (Coimbra 2008). O processo de criação de uma cultura de células in vitro envolve, de forma sucinta, o dador, as células ou tecido, o meio de cultura e o substrato. Estes componentes interagem e as propriedades do sistema na sua totalidade, bem como as suas variações, são o resultado indubitável de tais interações, (Hartung 2002).

2.3 Morfologia e Características Funcionais As culturas de células podem apresentar-se em duas formas: em suspensão e em monocamada aderente. A forma como esta se dispõem refelecte o tecido no qual tiveram origem, pelo que, culturas de células derivadas do sangue tendem a crescer em suspensão,



enquanto que células derivadas de tecidos sólidos (como por exemplo: pulmão e rim) tendem a crescer em monocamadas aderantes, (SIGMA 2008). As culturas celulares podem ser descritas com base na sua morfologia (forma e aspecto) ou com base nas suas características funcionais. Assim, podem ser dividias em três grandes grupos, (Ryan 2008):

Epiteliais: células que aderem ao substrato e apresentam forma achatada e poligonal;

Linfoblásticas: células que, normalmente, não aderem ao substrato, permanecendo em suspensão com uma forma esférica;

Fibroblásticas: células que estão aderidas ao substrato e apresentam-se alongadas, bipolares e frequentemente formam “remoinhos”.

O uso de técnicas de fusão tornou possível o desenvolvimento de células híbridas pela junção de dois tipos de células diferente. Estas podem exibir características de uma das células mãe ou das duas. Esta técnica foi utilizada em 1975 para criar células capazes de produzir anticorpos monoclonais específicos, (Ryan 2008). As referidas células, denominadas hibridomas, são formadas pelo uso de duas células diferentes, mas relacionadas entre si. A primeira é um linfócito derivado do baço com capacidades de produzir o anticorpo desejado; enquanto, a segunda é uma célula de melanoma com grande capacidade de proliferação, a qual é programada para produzir grandes quantidades de anticorpos, mas não para produzir o anticorpo. As características das culturas de células resultam da relação entre a sua origem e a forma de adaptação destas às condições da cultura celular. Marcadores bioquímicos podem ser utilizados para determinar se as células continuam a desempenhar funções especializadas, da mesma forma que enquanto presentes nos tecidos in vivo. Marcadores morfológicos e ultraestruturais podem também ser examinados. Frequentemente, estas características são perdidas ou alteradas como resultado do processo de colocação no ambiente artificial da cultura de células. Algumas linhas celulares podem, eventualmente, parar a sua divisão celular, demonstrando sinais de envelhecimento contínuos. Estas células são denominadas finitas. Outras linhas, ditas “imortais” continuam a dividir indefinidamente, sendo denominadas linhas celulares contínuas. Quando uma linha celular dita “normal” se transforma numa linha imortal, realizando deste modo, uma alteração irreversível ou transformação, quer intencionalmente (pela utilização de fármacos, radiação ou vírus) quer de forma espontânea, diz-se que são células transformadas. Como características principais, estas células apresentam um crescimento,



geralmente, mais fácil e rápido; contudo, apresentam, frequentemente, cromossomas anormais e extranumerários. As células que apresentam número normal de cromossomas são denominadas células diplóides, enquanto que aquelas que apresentam número alterado de cromossomas são denominadas aneuplóides, (Ryan 2008).

2.4 Meios de Cultura Um meio de cultura consiste numa solução base definida, normalmente constituída por sais, açúcares e aminoácidos, bem como, alguns suplementos misturados, dependendo do tipo de células, (Hartung 2002). Para muitos cientistas, um ambiente saudável para a sobrevivência das células em cultura deve ser aquele que permita, pelo menos, um aumento do número de células devido à divisão celular (mitose). Adicionalmente, quando as condições do meio de cultura são as ideais, as células podem apresentar funções fisiológicas e bioquímicas similares às que apresentam in

vivo, tais como, contracção muscular ou secreção de enzimas ou hormonas. Para alcançar este meio de cultura ideal é importante considerar a temperatura, o substrato para adesão da camada de células e o meio de cultura. A temperatura do meio é, geralmente, colocada à temperatura corporal do dador de onde foram retiradas as células; atendendo a que, vertebrados de sangue frio apresentam temperaturas entre 18 e 25ºC, enquanto que os mamíferos exibem uma temperatura entre 36 e 37ºC. A manutenção da temperatura na cultura de células é conseguida pelo uso de incubadoras bem calibradas e ajustadas. Para células que necessitam de um substrato para suporte este deve ser capaz de fornecer capacidade de suporte, mas também crescimento. Os substratos mais comuns são o vidro e alguns tipos de plástico tratados. Para além disso, devem ser adicionados factores de adesão, tais como, o colagénio, gelatina, fibronectina e laminina, que melhorarão o crescimento e função normal de células derivadas do cérebro, vasos sanguíneos, rins, fígado, pele e muitos outros. Muitas vezes, as células que aderem podem funcionar melhor quando a superfície de adesão é permeável ou porosa, pois deste modo podem polarizar de forma similar ao que sucede no interior do corpo. Como referido, o meio de cultura é um factor importante e complexo em termos de controlo para alcançar um meio de cultura desejado pois, para além dos requisitos nutricionais, o meio de cultura necessita de factores de crescimento, regulação do pH e osmolalidade e



fornecimento de gases essenciais (como oxigénio e dióxido de carbono). Os nutrientes fornecidos possibilitam às células a produção de proteínas e outros componentes essenciais para o crescimento e funcionamento, bem como, a produção de energia necessária para o metabolismo. Por outro lado, os factores de crescimento e as hormonas auxiliam na regulação e controlo da taxa de crescimento celular e das características funcionais. É comum, em vez de se adicionarem estes componentes directamente ao meio de cultura, adicionar-se 5 a 20% de soro animal ao meio. Contudo, tal procedimento acrescenta variabilidade, dado que, os soros são fornecidos por diferentes produtores e dentro do mesmo produtor por diferentes animais, pelo que muitas vezes surgem problemas em controlar o crescimento e função celular. Quando as células normais funcionais estão em crescimento, o soro é geralmente substituído por factores de crescimento específicos. No meio deve-se também controlar o pH, para evitar alterações abruptas deste. Usualmente um buffer (solução tampão) de CO2-bicarbonato ou um buffer orgânico são utilizados para manter o pH do meio num intervalo de 7.0 a 7.4, dependendo do tipo de células. Quando se utiliza o buffer CO2-bicarbonato é necessário controlar e regular a quantidade de CO2 dissolvida no meio. Tal procedimento é, geralmente, realizado pelo incubador com controlos de CO2 e deve fornecer uma atmosfera com cerca de 2 a 10% de CO2. Por outro lado, alguns meios com CO2-bicarbonato não necessitam de CO2 adicional; contudo, nestes casos deve-se utilizar um vaso de cultura selado, (Ryan 2008). A maioria dos meios de cultura disponíveis comercialmente inclui fenol vermelho como indicador de pH, cuja função é monitorizar constantemente o estado do pH em culturas celulares pela mudança de cor. Geralmente, o meio de cultura deve ser mudado quando a cor muda para amarelo (meio ácido) ou púrpura (meio alcalino), (SIGMA 2008). Por último, a osmolalidade (pressão osmótica) do meio de cultura é importante, pois auxilia a regular o fluxo de substâncias do interior para o exterior das células. Assim, a evaporação observada em meios de cultura em vasos abertos vai diminuir rapidamente a osmolalidade resultando em células danificadas, mortas ou em stress. Nestes casos os incubadores com altos níveis de humidade podem reduzir a evaporação ao estritamente essencial, (Ryan 2008). Os constituintes básicos de um meio de cultura incluem: sais inorgânicos, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas, ácidos gordos e lípidos, proteínas e péptidos e soro. As principias funções destes constituintes serão descritas em seguida. Os sais inorgânicos ajudam a manter o equilíbrio osmótico entre células e regulam o potencial de membrana pelo fornecimento de iões cálcio, sódio e potássio. Todos estes iões são igualmente requeridos pela matriz de adesão celular, assim como co-factores enzimáticos.



Os carbohidratos, geralmente na forma de açúcares, são a maior fonte de energia das culturas de células. Os açúcares mais utilizados em culturas celulares incluem a glucose e a galactose, contudo alguns meios podem necessitar de maltose ou frutose. A concentração de açúcares no meio basal varia entre 1 e 4.5 g/L em meios mais complexos. Um meio com elevadas concentrações de açúcares é capaz de sustentar o crescimento de um vasto espectro de tipos de células. O soro da cultura de células é frequentemente a fonte de vitaminas para a cultura de células; contudo, muitos meios podem ser enriquecidos com vitaminas de forma a tornarem-se mais capazes de suportar um vasto número de células. As vitaminas são precursoras de inúmeros co-factores, sendo que muitas vitaminas, particularmente as do grupo B, são essenciais para o crescimento e proliferação celular e, nalguns tipos de células, a vitamina B12 é primordial. Alguns meios de cultura apresentam também níveis aumentados de vitamina A e E, mas as vitaminas mais utilizadas num meio de cultura são a riboflavina, tiamina e biotina. As proteínas e os péptidos são utilizados para repor aqueles que estavam normalmente presentes no ambiente celular normal, pela adição de soro ao meio. As proteínas e péptidos mais comuns incluem a albumina, a transferrina, a fibronectina e a fetuína. À semelhança das proteínas e péptidos, os ácidos gordos e lípidos são importantes constituintes do soro e os mais comuns incluem o colesterol e os esteróides essenciais para células especializadas. Alguns elementos vestigiais podem ser encontrados no soro, tais como, zinco, cobre, selénio e ácido tricarboxílico, que apresentam as mais variadas funções. O selénio, por exemplo, é um desintoxicante que ajuda na remoção dos radicais livres do oxigénio. O soro é uma mistura complexa de albumina, factores de crescimento e inibidores de crescimento, sendo muito provavelmente um dos componentes mais importantes nos meios de cultura celulares. O mais comummente utilizado é o soro fetal bovino. Como principais funções apresenta: protecção mecânica, capacidade tampão em culturas com taxas de proliferação reduzidas e ligação e neutralização de toxinas, (SIGMA 2008).

2.5 Avaliação e Contaminação da Cultura A avaliação do desempenho da cultura de células é geralmente baseada em quatro características celulares importantes: morfologia, crescimento celular, eficácia da cultura e expressão de funções especiais, (Ryan 2008).



A morfologia ou forma da célula é o mais fácil de determinar, contudo é frequentemente pouco útil. Apesar de alterações da morfologia celular serem muitas vezes observadas em culturas de células, é contudo difícil relacionar essas observações com as condições que as causaram. Por outro lado é, igualmente, difícil quantificar ou medir precisamente essa alteração. O primeiro sinal de que algo não está bem na cultura de células ocorre, quando, ao serem examinadas ao microscópio, as células apresentam padrões de adesão ou crescimento pobres ou pouco usuais. Quando existem suspeitas de problemas, pulverizar o vaso de cultura com violeta cristal ou outro corante histológico demonstra qual o padrão de crescimento e, deste modo, indica o problema. A contagem de células ou qualquer outro método para estimar o número de células permite determinar a taxa de crescimento celular. Esta determinação possibilita um desenho da experiência mais detalhado para determinar quais as condições (meio de cultura, soro, substrato, entre outras características) são melhores para as células; isto é, as condições que produzem uma maior taxa de crescimento. Esta técnica de contagem de células pode também ser utilizada para medir a sobrevida celular ou a morte celular, sendo frequentemente utilizada nos ensaios citotóxicos in vitro, (Ryan 2008). De forma a analisar as características de crescimento celular de um tipo particular de células, pode-se traçar uma curva de crescimento a partir da qual se pode obter o tempo de duplicação da população, o tempo em lag fase e a densidade de saturação. Esta curva de crescimento demonstra a lag fase, que representa o tempo que a célula demora a recuperar da subcultura, juntamente com o tempo de aderência e de disseminação celular (cerca de 48 horas, embora por volta das 12-24 horas as células já recuperaram da tripina e reconstruíram o seu citoesqueleto, segregaram matriz para adesão e espalharam-se pelo substrato); a log fase é o momento do gráfico em que o número de células começa a aumentar exponencialmente; e finalmente, a fase de plateau, na qual a cultura se torna mais densa e diminui ou interrompe a sua taxa de crescimento. Apesar das curvas de crescimento, Figura 2.3, apresentarem muita informação, estas são muito morosas e trabalhosas para serem utilizadas na monitorização da cultura de células. Assim, o uso de um hemocitómetro ou um contador de partículas electrónico fornece uma medição mais directa e simples do número de células e, portanto, do crescimento celular. As células podem ser contadas antes, durante e após a experiência para, de uma forma eficaz e precisa, quantificar e padronizar as condições experimentais. Adicionalmente, o uso de azul tripano quando se utiliza do hemocitómetro, Figura 2.4, fornece ao investigador uma avaliação quantitativa da viabilidade celular pelo cálculo das contagens diferenciais das células que excluem o azul tripano (células doentes ou normais) das que captam (células




indubitavelmente mortas). Este método é o menos dispendioso, mas exige trabalho para a aplicação do método completo; contudo, fornece informação fiável do número total de células e ainda o número de células viáveis, (Mather 1998; Freshney 2006).

Figura 2.3. Curvas de crescimento celular: (a) Aumento do número de células numa escala logarítmica em função dos dias decorridas após subcultura; (b) Parâmetros cinéticos que podem ser derivados da curva (a) (adaptado de (Freshney 2006)).

a) b)

Figura 2.4. Hemocitómetro e determinação do número de células ((a) adaptado de (Mather 1998; Coimbra 2008) e (b) de (Mather 1998)).

Célul

as/m

l Cé

lulas

/ml

Dias após subcultura

Tempo Duplicação

Densidade de Saturação

Subcultura e

Mudança meio

Próxima Subcultura

Células/cm-2


A eficácia da cultura é um método de teste no qual um reduzido número de células (entre 20 e 200) é colocado num vaso de cultura, medindo-se o número de colónias que se formam. A percentagem de colónias que se formam constitui uma medida de sobrevivência celular, enquanto que o tamanho das colónias representa a taxa de crescimento. Este método de teste é similar ao aplicado na análise da taxa de crescimento celular; contudo, é mais sensível a pequenas variações em condições de cultura celular, (Ryan 2008). No método de determinação da eficácia da cultura, dado que a razão volume do meio/volume de células é muito elevada, existe um impacto mínimo das células sobre o ambiente; por isso, a possibilidade das células metabolizarem e converterem os aminoácidos em compostos tóxicos ou secretarem factores de crescimento autócrinos é muito reduzida. Assim, este parâmetro é considerado muito útil na avaliação dos requisitos nutricionais das células, para comparação dos lotes de soro e avaliação dos componentes tóxicos a testar. Existem ainda muitos investigadores que preferem este método ao método de determinação da taxa de crescimento na avaliação dos efeitos dos factores de crescimento. Apesar disto, as concentrações óptimas de nutrientes e factores de crescimento obtidas por este teste, podem não ser adequadas para suportar elevadas densidades celulares. A eficácia da cultura é determina pelo quociente entre as colónias formadas e as colónias cultivadas, (Mather 1998). A última característica a avaliar é a expressão de funções especializadas. Este é geralmente mais difícil de medir e de observar, pelo que, testes bioquímicos e imunológicos podem ser utilizados para a sua determinação. Apesar de algumas culturas de células poderem crescer em condições subóptimas, funções altamente especializadas requerem, frequentemente, condições de cultura quase perfeitas. A contaminação de culturas de células divide-se em dois grandes grupos: químicas e biológicas. Os contaminantes químicos são os mais difíceis de detectar, dado que, são causados por agentes como as toxinas, iões metálicos e vestígios de desinfectantes químicos. Os contaminantes biológicos na forma de bactérias ou fungos apresentam, frequentemente, efeitos visíveis sobre a cultura de células (alterações de pH, por exemplo), sendo por isso mais fáceis de detectar, principalmente quando os antibióticos são omitidos do meio de cultura. Contudo, duas formas de contaminação biológica, por micoplasmas e vírus, não são facilmente detectados visualmente e requerem métodos especiais de detecção. As principais regras para evitar contaminação de cultura de células são: treino adequado e técnicas assépticas por parte do investigador e equipamento esterilizado e correctamente monitorizado, (Ryan 2008).



As contaminações biológicas detectáveis a olho nu podem, por isso, ser controlada com rigor através de uma observação diária da cultura de células ao microscópio; contudo, no caso de infecção da cultura de células por micoplasmas ou vírus, as alterações podem passar despercebidas, mas podem por outro lado incluir: redução da taxa de crescimento, alterações morfológicas, aberrações dos cromossomas e alterações do metabolismo dos aminoácidos e ácidos nucleicos, (SIGMA 2008). A investigação utilizando culturas de células ou os bancos de células devem apresentar-se livres de contaminações e em estado saudável. O uso continuado de antibióticos e agentes anti-fungicos pode, por vezes, mascarar a presença destes organismos, conduzindo ao desenvolvimento de estirpes mais resistentes e, portanto, mais difíceis de eliminar. Por este motivo, é importante avaliar periodicamente a presença de contaminação da cultura de células. O primeiro passo para detectar contaminação bacteriana ou fúngica consiste na observação macroscópica e microscópica. Uma vez detectada a contaminação, todos os reagentes e soros utilizados na cultura de células, bem como, a própria cultura têm que ser destruídos com hipoclorito de sódio e, posteriormente, descartados. Dado que se utiliza soro e tripsina natural como suplementos aos meios de cultura, bem como, para a realização de subculturas, o risco de contaminação por estes agentes deve ser sempre considerada. Para além disso, a contaminação por vírus pode surgir de outras fontes, tais como, o tecido ou órgão do dador ou factores de crescimento contaminados por outras culturas infectadas. A eliminação das contaminações por vírus é difícil e não existe um teste universal para identificação deste tipo de contaminantes, pelo que, os vírus podem ser identificados utilizando um vasto leque de testes moleculares e imunológicos. Estes testes incluem, usualmente, os patogenes potencialmente perigosos para os humanos, como por exemplo, o HIV. A monitorização de vírus deve ser realizada cada 3 a 4 meses. O micoplasma é um organismo sub-microscópico que atravessa os filtros de 0.22 µm utilizados para a filtração estéril dos reagentes e soros utilizados nas culturas celulares. Ao contrário das infecções por bactérias comuns, as provocadas pelo micoplasma não resultam em alterações visíveis da cultura. Actualmente, têm surgido testes dedicados ao teste de micoplasma em culturas de células, sendo que, estes devem ser realizados cada dois meses, (Besta 2004).




2.6 Sumário Pretende-se, uma vez finalizada a leitura do presente capítulo, que se compreenda e

retenha os conceitos básicos de culturas de células, com particular importância aqueles relacionados com os diferentes tipos de culturas de células, a morfologia de diferentes células e os principais processos de avaliação da cultura de células.

Os conceitos abordados neste capítulo visaram principalmente orientar e facilitar a compreensão do capítulo VI, que versa sobre os materiais de métodos utilizados no estudo dos efeitos dos electrões de Auger em culturas de células.

Do capítulo verificou-se que o uso de linhas celulares face às culturas primárias apresenta algumas vantagens, nomeadamente a sua maior padronização e facilidade de manipulação e desenvolvimento em meio laboratorial. Verificou-se ainda que existem diferentes morfologias de células, que podem ser, geralmente, classificadas em três grupos, que são: epiteliais, linfoblásticas e fibroblásticas. Adicionalmente, observou-se que o meio de cultura é um componente muito importante na cultura de células e que uma avaliação de contaminações, bem como a monitorização da cultura devem ser realizadas periodicamente.

Capítulo III. Ciclo Celular e Apoptose


3.1 Introdução

De um modo geral, as células crescem, aumentam o seu conteúdo e depois dividem-se. Cada célula origina duas células-filhas que, se tudo se processar conforme esperado, serão geneticamente iguais à célula-mãe. As células-filhas, por sua vez, podem tornar-se células-mães de uma outra geração celular. Assim, a vida de uma célula começa quando ela surge a partir da célula-mãe e acaba, quando ela própria se divide para originar duas células-filhas.

A multiplicação das células segue assim o interessante carácter cíclico da vida, intercalando períodos de crescimento com períodos de divisão. O conjunto de transformação que decorre desde a formação da célula até ao momento em que ela própria, por divisão, origina duas células-filhas constitui um processo dinâmico e contínuo, denominado ciclo celular.

Durante a divisão celular, os organelos, as enzimas e outros constituintes que fazem parte das células são distribuídos pelas células-filhas. O ADN é exactamente auto-duplicado e as cópias rigorosamente distribuídas. É esta fidelidade na duplicação e na distribuição de material genético pelas células-filhas que assegura a continuidade genética da vida.

A unidade básica de um cromossoma eucariótico é uma longa molécula de ADN que se encontra ligada a proteínas. Em alguns períodos da vida celular, cada cromossoma contém, para além das proteínas, apenas uma molécula de ADN. Noutros períodos, contudo, esta molécula duplica e o cromossoma fica constituído por dois cromatídios, isto é, duas moléculas de ADN associadas a proteínas. Dois cromatídeos apresentam-se ligados por uma estrutura sólida e resistente chamada centrómero (que significa corpo central), (Silva 2000).

A irradiação de uma célula pode resultar em nove possíveis destinos finais:

• Ausência de efeito;

• Atraso na divisão: a célula atrasa a entrada no processo de divisão (estádio G0);

• Apoptose: a célula morre antes de se dividir ou após divisão por fragmentação em pequenos corpos, que são posteriormente absorvidos pelas células vizinhas;

• Falha reprodutiva: a célula morre na tentativa de executar mitose pela primeira ou subsequentes vezes;

• Instabilidade genómica: caracteriza-se por um atraso da falha reprodutiva como resultado da introdução de instabilidade genómica;

• Mutação: a célula sobrevive, mas está mutada;

• Transformação: a célula sobrevive, mas a mutação leva a alterações de fenotipo e possibilidade de carcinogénese;



• Efeito bystander: uma célula irradiada envia sinais às células vizinhas não irradiadas, induzindo nestas danos genéticos;

• Respostas adaptativas: a célula irradiada é estimulada para reagir e torna-se mais resistente à radiação subsequente, (Suntharalingam 2002). Dos destinos finais explicados anteriormente, aquele que é mais interessante do ponto

de vista de radioterapia metabólica dirigida, nomeadamente pelo uso de electrões de Auger, é a apoptose, pois este destino induz menos danos às células vizinhas, sendo um processo sem resposta inflamatória e, adicionalmente, impede a propagação de aberrações cromossómicas radioinduzidas. Por estes motivos, será abordado com maior detalhe neste capítulo, e após explicação do ciclo celular, a apoptose, ou morte celular programada.

Para exposição dos princípios gerais do ciclo celular e da apoptose, organizou-se este capítulo em dois grandes temas, sendo abordado, em primeiro lugar, o ciclo celular e depois a apoptose. No tema da apoptose referem-se aspectos como a regulação da apoptose e sua relação com o ciclo celular e ainda comparação da apoptose com a necrose.

3.2 Ciclo Celular – Princípios Gerais

Baseando-se na actividade das células que é visível no microscópio óptico, consideram-se, num ciclo celular duas fases: interfase e fase mitótica ou periódo de divisão celular. A primeira (interfase) corresponde ao período compreendido entre o fim de uma divisão celular e o início da divisão seguinte; enquanto que, a fase mitótica diz respeito ao período durante o qual ocorre divisão celular, (Silva 2000; Suntharalingam 2002).

Na interfase os cromossomas não são visíveis ao microscópio óptico. Os complexos ADN-Proteínas que constituem a cromatina estão pouco condensados e dispersos pelo núcleo, por isso, a fase mitótica constituiu, durante muitos anos, o principal ponto de interesse e a interfase foi considerada uma fase de repouso.

Na interfase existem um ou mais nucléolos em cada núcleo. A replicação de ADN de uma célula ocorre durante uma parte limitada da interfase, denominada fase S ou fase de síntese, que é precedida e seguida por dois intervalos, respectivamente, G1 e G2 (G de gap, que significa intervalo). Assim:

• Intervalo G1 ou pós-mitótico – corresponde ao período que decorre entre o fim da mitose e o início da síntese de ADN. Caracteriza-se por uma intensa actividade



biossintética, nomeadamente, de proteínas, enzimas e ARN, ocorrendo ainda formação de organismos celulares e consequentemente um notório crescimento da célula.

• Fase S – ocorre a autoreplicação de cada uma das moléculas de ADN (processo explicado previamente). Estas novas moléculas associam-se às respectivas proteínas e a partir desse momento cada cromossoma passa a ser constituído por dois cromatídeos ligados pelo centrómero. Nas células animais, ao nível do citoplasma, dá-se ainda a duplicação dos centríolos (feixes curtos de microtúbulos localizados no citoplasma das células eucariontes – Figura 3.1).

Figura 3.1. Representação gráfica 3D de um centríolo (retirado de (Wikipedia 2008)).

• Intervalo G2 ou pré-mitótico – ocorre entre a final da síntese de ADN e o início da mitose. Neste período dá-se sobretudo a síntese de biomoléculas necessárias à divisão celular.

Na fase final da etapa G1 as células fazem uma avaliação interna relativamente ao prosseguimento do ciclo celular. Se a avaliação é negativa, as células não se dividem, permanecendo num estádio denominado G0. O tempo de permanência em G0 depende não só do tipo de célula, mas também das circunstâncias que a rodeiam. As células que não voltam a dividir-se permanecem num estádio G0 semanas ou mesmo anos até que morrem (por exemplo, os neurónios e fibras musculares de um indivíduo adulto). Se, pelo contrário, a avaliação efectuada pelas células é positiva, estas iniciam a síntese de ADN, completando o ciclo celular de uma forma irreversível.

A duração das subfases G1, S e G2 varia com as espécies, com o tipo de tecido e com o estádio de desenvolvimento do organismo, Figura 3.2. Num mesmo tecido, a variabilidade da duração do ciclo celular depende sobretudo do tempo de permanência em G1. Por exemplo, nas células de um embrião, o período G1 é muito curto, contudo, nas células de um indivíduo adulto o período G1 é muito mais longo, (Silva 2000). Geralmente, para células de mamíferos em cultura a fase S tem uma duração de sensivelmente 6 a 8 horas, a fase M tem duração inferior a uma


http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Centriole3D.png�

http://pt.wikipedia.org/wiki/Microt%C3%BAbulo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Citoplasma

http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

http://pt.wikipedia.org/wiki/Eukaryota


hora, G2 varia entre 2 a 4 horas e G1 entre 1 e 8 horas, o que perfaz um ciclo celular com duração normal de 10 a 20 horas. Para além disso, tem-se verificado que o ciclo celular em células malignas ou danificadas é mais acelerado que nas células normais, (Suntharalingam 2002).

Figura 3.2. Duração de ciclos celulares de diferentes espécies (adaptado de (Silva 2000)).

Relativamente à fase mitótica esta pode ser dividida em duas etapas principais, que

embora possam apresentar alguma variabilidade para diferentes espécies, globalmente seguem um processo similar que inclui: a mitose, a qual corresponde à divisão do núcleo e a citocinese (divisão do citoplasma). A primeira (mitose), embora seja um processo contínuo, apresenta convencionalmente quatro estádios: a profase, a metafase, a anafase e a telofase, Figura 3.3.

A profase é, de um modo geral, a etapa mais longa da mitose. Nesta fase, os cromossomas enrolam-se, tornando-se cada vez mais espessos, curtos e com grande afinidade para alguns corantes; cada cromossoma é constituído por dois cromatídeos unidos pelo centrómero; os dois pares de centríolos começam a afastar-se em sentidos opostos, formando-se entre eles o fuso acromático ou fuso mitótico, constituído por um sistema de microtúbulos proteicos que se agregam para formar fibrilas. Adicionalmente, algumas fibrilas dispõem-se radialmente nos pólos da célula, constituindo o áster e, quando os centríolos atingem os pólos, a membrana nuclear fragmenta-se e os nucléolos desaparecem.

Na metafase os cromossomas atingem o máximo de encurtamento devido a uma elevada condensação; os pares de centríolos estão nos pólos da célula; o fuso acromático completa o seu desenvolvimento, notando-se que, algumas das suas fibrilas se ligam aos cromossomas (fibrilas cromossómicas), enquanto que outras vão de pólo a pólo (fibrilas contínuas). Para além disso, os cromossomas dispõem-se com os centrómeros no plano equatorial (plano equidistante entre os dois pólos celulares), voltados para o centro desse plano e com os “braços” para fora. Os cromossomas assim imobilizados constituem a chamada placa equatorial e estão prontos para se dividir.



A anafase caracteriza-se pela clivagem de cada um dos centrómeros, separando-se os dois cromatídeos que passam a constituir dois cromossomas independentes. Ainda nesta fase da mitose, as fibrilas ligadas aos cromossomas encurtam e estes começam a afastar-se, migrando para pólos opostos da célula – ascensão dos cromossomas filhos. No final da anafase os dois pólos da célula têm colecções completas e equivalentes de cromossomas e, portanto, de ADN.

Durante a telofase a membrana nuclear reorganiza-se em torno dos cromossomas de cada célula-filha; os nucléolos reaparecem; dissolve-se o fuso mitótico; os cromossomas descondensam e alongam-se, tornando-se menos visíveis; a célula fica constituída por dois núcleos, terminado assim a mitose.

Figura 3.3. Células nas diferentes fases da mitose. Da esquerda para a direita: profase, metafase, anafase e telofase (adaptado de (Silva 2000)).

A citocinese caracteriza-se pela divisão do citoplasma e consequente individualização

das duas células-filhas. Geralmente, nos dois últimos estádios da mitose (fim da anafase e telofase), forma-se na zona do plano equatorial um anel contráctil de filamentos proteicos, Figura 3.4. Estes contraem-se e puxam a membrana para dentro, causado um sulco de clivagem, que vai lentamente estrangulando o citoplasma até separar as duas células filhas, (Silva 2000).

Figura 3.4. Citocinese numa célula animal, aspecto ao microscópio (retirado de (Silva 2000)).

Para além da divisão das células somáticas, isto é a mitose, existe outro processo de

propagação e divisão celular denominado meiose, que ocorre aquando da fecundação; contudo,



tal processo não será explicado no presente trabalho, pois não é fundamental para a compreensão do tema principal do mesmo, (Suntharalingam 2002).

3.3 Apoptose Apoptose, ou morte celular programada, foi reconhecida morfologicamente como um processo distinto de outros tipos de morte celular há mais de 30 anos por Kerr, Wyllie e Durrie (1972), (Anazetti 2007). Basicamente, esta caracteriza-se por ocorrer de forma individual, não infligindo, por isso, morte às células vizinhas. A morte celular por apoptose participa em múltiplas situações fisiológicas, tais como, o colapso endometrial durante a menstruação, a depleção de células nas criptas intestinais e a embriogénese, (Anazetti 2007). A combinação da apoptose com a proliferação celular é responsável pelo delineamento de tecidos e órgãos nos embriões, por exemplo, a apoptose regula a separação entre os dedos dos fetos. Problemas com a regulação da apoptose podem conduzir ao aparecimento de inúmeras patologias, nomeadamente cancro. Por estes motivos, a apoptose é um mecanismo rigidamente controlado por expressões genéticas decorrentes da interacção célula/meio externo, levando à produção de várias moléculas com actividades específicas que conduzem a alterações celulares funcionais expressas morfologicamente pela condensação e fragmentação da cromatina e formação de protuberâncias na superfície celular, (Dash 2008).

Após o reconhecimento do processo apoptótico como um mecanismo celular fundamental, a biologia da apoptose continuou a ser investigada avaliando-se as alterações morfológicas e bioquímicas características, a natureza das vias intracelulares, a complexa biologia molecular de genes e elementos efectores, a sua relação no desenvolvimento embrionário, o seu papel na homeostasia celular e o seu envolvimento na patogénese de várias doenças; tais como, doenças auto-imunes, infecções por parasitas, doenças neurodegenerativas, lesões isquémicas e cancro.

Com o aparecimento de novos conhecimentos na biologia associada ao cancro e, consequentemente, na indução química da apoptose, os tratamentos tornam-se mais eficazes face às terapêuticas tradicionais, (Anazetti 2007).



3.3.1 Processo Apoptótico As células, após receberem o sinal para entrarem em apoptose, realizam um vasto conjunto de alterações. Uma família de proteínas denominada caspase, é tipicamente activada nas fases inicias da apoptose, sendo responsável pela quebra de componentes celulares importantes que são fundamentais para o funcionamento celular normal, incluindo proteínas nucleares, tais como as enzimas responsáveis pela reparação do ADN. Por outro lado, as caspases podem activar enzimas destruidoras, tais como, ADNases, que iniciam a quebra do ADN nuclear. Kerr, Wyllie e Durrie, já em 1972, caracterizaram as caspases como enzimas com um resíduo de cisteína activo, sendo capazes de clivar substratos que possuem resíduos de ácido aspártico em sequências específicas. A especificidade pelos seus respectivos substratos é determinada por quatro resíduos amino-terminal no local de clivagem, (Anazetti 2007; Dash 2008). A célula em apoptose apresenta uma morfologia distinta, Figura 3.5, que se caracteriza por, (Dash 2008):

• Encurtamento celular devido a destruição dos filamentos de actina e lâminas do citoesqueleto (caso A da Figura 3.5);

• Quebra da cromatina no núcleo que conduz frequentemente a condensação nuclear e, muitas vezes, o núcleo celular toma uma aparência em “ferradura” (situação B da Figura 3.5);

• Contínuo encurtamento celular para permitir posterior remoção pelos macrófagos (caso C da Figura 3.5);

• Na fase final da apoptose surgem pequenas “esferas membranadas”, que formam pequenas vesículas, denominadas corpos apoptóticos (exemplo D da Figura 3.5).

Figura 3.5. Alterações morfológicas observadas num trofoblasto em apoptose. Imagem recolhida com microscópio durante um período de 6 horas (retirado de (Dash 2008)).

Estas alterações são comuns a todas as células em apoptose explícita,

independentemente do agente indutor do processo. Quer isto dizer que a acção das caspases




representa uma via final comum, que opera em todas as células programadas para morrer, (Anazetti 2007).

Existe um vasto número de mecanismos que induzem apoptose nas células, sendo que a sensibilidade da célula face a um dado estímulo depende de um número de factores como a expressão de proteínas pró e anti-apoptóticas (por exemplo, o Bcl-2 e as proteínas inibidoras de apoptose), a severidade do estímulo e o estádio do ciclo celular. Alguns dos estímulos que podem induzir a apoptose incluem: infecções com vírus, stress celular e danos ao ADN. Na Figura 3.6 apresenta-se um esquema representativo do processo de apoptose no global.

Nalguns casos, o estímulo para o processo apoptótico inclui sinais extrínsecos, tais como, a ligação de indutores de apoptose a receptores da membrana da célula, denominados receptores de morte. Estes ligandos podem ser factores solúveis ou podem ser expressos à superfície da membrana celular, como é o caso dos linfócitos T. Este segundo processo ocorre quando a célula T reconhece células infectadas com vírus ou danificadas, sendo iniciado o processo apoptótico para impedir que os danos das células se tornem neoplásicos ou ocorra a dispersão da infecção. Adicionalmente, a apoptose induzida por linfócitos T citocóxicos pode ser conseguida pelo uso de enzimas. Para além dos processos supracitados, a apoptose pode ser induzida por sinais intrínsecos que produzem stress celular, devido à exposição à radiação, a químicos ou vírus. Pode igualmente resultar de uma privação de factor de crescimento ou stress oxidativo induzido pela formação de radicais livres. Em geral os sinais intrínsecos capazes de iniciar a apoptose envolvem a mitocôndria. As razões relativas de várias proteínas bcl-2 são geralmente capazes de quantificar o stress celular necessário para induzir apoptose, (Dash 2008).

Figura 3.6. Representação esquemática de algumas das vias de indução de apoptose e transmissão do sinal apoptótico (adaptado de (Dash 2008)).

Stress Celular (exemplo: radicais livres e depleção

factor crescimento)

Infecção virús

Receptores de Morte Celular

Receptores de Morte Celular

Radiação ionizante

Célula T


Apesar de existirem várias rotas distintas para a activação de caspases (como exemplificado da Figura 3.6), dependendo do estímulo que desencadeia a morte celular, a evidência científica parece apontar para, essencialmente, duas vias distintas activas para o início da apoptose, (Anazetti 2007):

A apoptose iniciada via receptores de morte, Figura 3.7, tais como Fas, também chamado de CD95 ou Apo-1 e TNF-R1 (receptor/factor de necrose tumoral), requerem pró-caspase-8 ou –10 no complexo;

Apoptose iniciada devido a estímulos induzidos por agentes externos, nomeadamente, quimioterapêuticos ou radiação.

Figura 3.7. Representação das duas principais vias de activação das caspases num processo de apoptose celular (retirado de (Anazetti 2007)).

De seguida aborda-se com maior detalhe a segunda via de activação das caspases num processo apoptótico; isto é, a via mitocôndial iniciada por estímulos externos, pois esta é a via que se reveste de maior interesse para compreensão do restante trabalho.

A via mitocondrial é activada predominantemente, com envolvimento de alterações de permeabilidade de membrana mitocondrial e liberação do Citocromo C para o citoplasma, que se liga ao dATP, Apaf-1 e pró-caspase-9, formando o complexo apoptossomo. A caspase-9 activa (iniciadora) pode então clivar as caspases efectoras subsequentes (-2, -3, -6, -7, -8, -9, e -10). Portanto, a activação da caspase-9 mediada pelo Citocromo C serve como um mecanismo de amplificação de sinais durante o processo apoptótico. Membros pró-apoptóticos e antiapoptóticos da família Bcl-2 regulam a liberação de Citocromo C a partir da membrana mitocondrial interna. A via mitocondrial é, frequentemente, activada em resposta a danos no ADN, envolvendo a activação de um membro pró-apoptótico da família Bcl-2 (Bax, Bid). Por outro lado, os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2 inibem a morte celular por apoptose



impedindo a formação de poros na membrana mitocondrial, com consequente inibição da libertação do Citocromo C para o citoplasma.

Uma vez iniciada a cascata das caspases, o processo apoptótico culmina na clivagem

de substratos específicos e, finalmente, na morte celular, Figura 3.8, (Anazetti 2007).

Sinais Apoptóticos

Desfosforilação

Libertação Bad

Citocromo C Formação do Apoptossomo

Cascata de Caspases

Poros

Figura 3.8. Representação da via mitocôncrial presente num processo apoptótico (adaptado de (Dash 2008)).

Um dos principias objectivos da apoptose é fragmentar o ADN em pequenas unidades nucleossomáticas. As caspases são fundamentais para este processo, realizando-o de três possíveis formas: activação das ADNases, inibição das enzimas de reparação do ADN e quebra das proteínas estruturais no núcleo celular, (Dash 2008).

3.3.2 Regulação da Apoptose e Relação com Ciclo Celular

A homeostasia tecidular depende do balanço entre proliferação e morte celular, que são eventos intimamente acoplados. Alguns reguladores do ciclo celular participam em ambos os processos, morte celular programada e divisão celular. A relação entre ciclo celular e apoptose é reconhecida pelos genes que codificam as proteínas c-Myc, p53, pRb, Ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-κB, CDK, ciclinas e CKI. Após estimulação, estas proteínas podem induzir proliferação



celular, interrupção do ciclo celular ou morte celular. O background genético, o micro-ambiente celular, a extensão de danos ao ADN e o nível presente de diferentes proteínas são factores importantes e interligados na resposta celular.

Como descrito anteriormente, algumas das proteínas da família Bcl-2 apresentam uma importante função anti-apoptótica, que é regulada por fosforilação envolvendo interacções entre várias proteínas da família; contudo, se níveis elevados de proteínas dessa família de genes bloqueiam a apoptose (Bcl-2 e Bcl-x), outras promovem-na (Bax, Bad e Bak). Os genes anti-apoptóticos da família Bcl-2 são promotores da sobrevivência celular, porque inibem a ocorrência da apoptose. A proteína Bcl-2 está localizada na membrana mitocondrial externa de diferentes tipos celulares, como por exemplo, epitélios capazes de proliferação e morfogénese. As suas funções incluem o bloqueio da liberação de Citocromo C pela mitocôndria após estímulo apoptótico, impedindo assim, a activação de caspases. A proteína Bax pode produzir heterodímeros com a Bcl-2 (Bax/Bcl-2) ou homodímeros (Bax/Bax), suprimindo, desta forma, a morte celular quando heterodimerizada com Bax; e promovendo a apoptose enquanto homodímero Bax/Bax. O mecanismo de controlo da apoptose pelos genes da família Bcl-2 envolve a formação de poros na membrana mitocondrial, permitindo a interacção de várias proteínas envolvidas na regulação da morte celular.

A proteína c-Myc é uma fosfoproteína nuclear que funciona como um factor de transcrição, estimulando a progressão do ciclo celular e a apoptose. A expressão de c-Myc é regulada por fosforilação e interacção com outras proteínas celulares. É um gene de resposta inicial, ou seja, responde directamente a sinais de mitose, estimulando o avanço das células da fase G1 do ciclo celular. Além disso, pode exercer seu efeito na progressão do ciclo celular pela transcrição de genes importantes no controle do ciclo celular, tais como ciclinas, quinases e outros factores de transcrição. Simultaneamente, funciona como regulador negativo da interrupção do ciclo celular, suprimindo a transcrição de alguns genes envolvidos. Além do seu papel no ciclo celular, c-Myc também apresenta um papel chave na regulação do processo apoptótico. Apesar dos eventos moleculares envolvidos no processo de apoptose induzida por c-Myc não serem bem compreendidos, tem-se observado que, tanto a super-expressão quanto a diminuição da expressão de c-Myc pode levar a morte celular. Em geral, a indução de apoptose por c-Myc parece ocorrer quando há privação de factores de sobrevivência celular. Também se considera a possibilidade do c-Myc poder estar envolvido em vias independentes ou dependentes do p53, bem como, na liberação de Citocromo C envolvendo proteínas Bax (pró-apotóticas) funcionalmente activas e ainda, na expressão de Fas ligante e de receptor Fas.



Um outro importante gene envolvido no processo de morte e proliferação celular é o supressor tumoral p53. Este gene é o mais frequentemente mutado em todos os tipos de cancro humano e é um sensor universal de stress genotóxico. A frequência de mutações do gene p53 varia dependendo do tipo de tumor mas, em média, 50% dos tumores apresentam uma lesão no locus p53. A proteína p53, cujo nome se refere à massa molecular, é amplamente conhecida como indutora da interrupção do ciclo celular e de apoptose. Esses processos são regulados por transactivação de genes envolvidos em diferentes funções celulares, mas também pela activação de mecanismos independentes de transcrição genética. Normalmente, a proteína p53 é encontrada nas células em níveis reduzidos, sugerindo que, esta proteína é requerida, ocasionalmente, pelas células em circunstâncias especiais.

A indução de aumento nos níveis da proteína p53 em culturas celulares inibe a proliferação celular. Assim, a célula permanece na fase G1 do ciclo celular, o chamado ponto de “verificação” da integridade do material genético, impedindo sua passagem para a fase S. As células expostas a irradiação e que não codificam a proteína p53 continuam dividindo-se e replicando o DNA sem qualquer interrupção para realizar reparações de lesões no ADN, propagando deste modo, o erro.

O gene p53 foi inicialmente identificado em estudos de células tumorais, pois o cancro surge quando as células recém-fomadas apresentam mutações simultâneas em genes que controlam o crescimento e a sobrevivência celular. Estes defeitos, se pouco extensos, podem ser corrigidos por enzimas especializadas. Em geral, se a mutação é irreparável, ocorre o desencadeamento do processo de morte celular por apoptose. Ao contrário do gene Bcl-2, o p53 pára o ciclo celular e desencadeia a apoptose. Contudo, em células mutantes (como é o caso das células tumorais), que não codificam este gene, a apoptose não ocorre, pelo que, estas células sobrevivem por mais tempo, acumulam mais mutações e multiplicam-se sem controlo, gerando tumores. Por impedir a proliferação de células mutadas, protegendo o organismo de células cancerosas, o p53 é denominado gene supressor tumoral.

A proteína retinoblastoma (Rb) inibe a progressão do ciclo celular pela interacção com factores de transcrição, como por exemplo, o E2F. Quando a pRb se torna fosforilada, o factor E2F é liberado, estimulando a proliferação celular. Por outro lado, esta proteína pode actuar também na regulação negativa do processo apoptótico. O factor E2F induz a expressão do factor pró-apoptótico Apaf-1 e evidências sugerem um papel para o factor E2F em apoptose após ocorrência de dano no ADN.

O p53 e pRb/E2F podem estar directamente ligados na proliferação celular e apoptose, porque, a proteína p53 activada causa interrupção do ciclo celular na fase G1, o que implica que,



nestas condições, a proteína Rb não seja fosforilada e as células não possam progredir no ciclo celular. Por outro lado, o pRb fosforilado libera o factor E2F, que induz directamente a transcrição do gene que codifica a p53. Portanto, a via apoptótica dependente de p53 está intimamente relacionada com o par pRb/E2F, pelo que, cada um dos supressores tumorais (p53 e pRb) podem ser capazes de compensar a perda do outro, (Anazetti 2007).

3.3.3 Necrose e Apoptose

O padrão de alterações morfológicas e bioquímicas celulares associadas à programação normal de morte celular em certos processos patológicos in vivo inclui: formação de vacúolos citoplasmáticos, encolhimento e diminuição do contacto entre células vizinhas, fragmentação da membrana nuclear e condensação cromatínica, despolarização de membrana mitocondrial, fragmentação internucleossomal do ADN e alterações na assimetria de fosfolípidos da membrana plasmática. Por outro lado, a morte celular por necrose ocorre, geralmente, em resposta à injúria severa às células e é caracterizada, morfologicamente, por um aumento do volume citoplasmático e mitocondrial, ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo extracelular. Consequentemente, gera-se uma resposta inflamatória, que pode causar injúria e até morte de células vizinhas, Figura 3.9; ou seja, nesta condição um grande número de células são afectadas e lesadas ao mesmo tempo e devido ao desencadeamento do processo inflamatório há alterações irreversíveis no tecido e/ou órgão afectado.

Normal

Normal

Edema reversível Edema Irreversível Desintegração

Condensação Fragmentação Corpos Apoptóticos

Figura 3.9. Esquema da morfologia celular em processos de necrose (em cima) e apoptose (em baixo) (adaptado de (Anazetti 2007)).




No processo de morte celular por necrose ocorrem alterações da função mitocondrial, diminuindo drasticamente a produção de ATP e interferindo na função da bomba Na+/K+, o que conduz à tumefação (ou edema) celular devido ao aumento de Na+ presente no citoplasma. O aumento do Ca2+ no citoplasma provoca a activação de fosfolipases e de proteases que, juntamente com o aumento de espécies reactivas de oxigénio, induzem ruptura da membrana plasmática, activam as proteases, com consequente indução do extravasamento do conteúdo celular, sinalizando, deste modo, a migração de macrófagos e activando uma resposta inflamatória do sistema imunitário. Ao contrário da retracção celular observada em células apoptóticas, na necrose observa-se um edema celular devido às lesões no citoesqueleto e inibição da bomba de Na+/K+, o que origina a perda da permeabilidade selectiva da membrana. Em contraste, o processo apoptótico envolve a participação activa das células afectadas na cascata de autodestruição que culmina em degradação do ADN via activação de endonucleases, desintegração nuclear e formação de corpos apoptóticos. Estes são rapidamente retirados do tecido por macrófagos, esta sinalização ocorre devido a translocação da fosfotidilserina do lado interno para o lado externo da membrana “assinalando” as células que deverão ser fagocitadas, (Anazetti 2007).

Em suma, na apoptose, ou morte celular programada, as células morrem como resultado de um grande variedade de estímulos, contudo o processo é controlado e regulado, sendo comummente denominado por “suicídio” celular. Contrariamente à apoptose, a necrose, que corresponde à morte celular descontrolada, conduz ao aparecimento de lise celular e concomitante resposta inflamatórias, (Dash 2008).

3.4 Sumário

Deste capítulo concluiu-se que a célula começa a sua vida quando resulta da divisão da célula-mãe e termina quando ela própria se divide em duas células-filhas, daí que se denomine esta existência cíclica das células por ciclo celular. O ciclo celular desempenha um papel fundamental na resposta celular à irradiação, pois aquando de um dano pode repará-lo, pode ordenar a morte celular (apoptose) ou pode retirar essas células do ciclo celular, colocando-as num estádio de paragem (denominado G0). A apoptose é o processo de morte celular que menos danos causa às células vizinhas, sendo o processo ideal de fim celular aquando da irradiação.

Capítulo IV. Principais Características do 99mTc


4.1 Introdução Os radiofármacos marcados com tecnécio-99m (99mTc) tornaram-se, nos últimos 30 anos, importantes ferramentas para o diagnóstico de várias doenças ou disfunções de órgãos e sistemas que compõem o corpo humano. Actualmente, existem aproximadamente 30 compostos utilizados na Medicina Nuclear, criando um volume de exames correspondente a 80% da rotina clínica de um serviço de Medicina Nuclear. O elevado índice de utilização deste radionulcídeo resulta das propriedades físicas e químicas ideais que este apresenta, tais como: semi-vida física de aproximadamente 6 horas; decaimento por emissão de radiação gama, com fotões de 140 keV; a facilidade da obtenção a partir de um sistema gerador de molibdénio-99/tecnécio-99m (99Mo/99mTc); a possibilidade do metal atingir vários estados de oxidação e de coordenação, dando origem a diferentes radiofármacos, a partir da simples reconstituição de conjuntos de reactivos liofilizados (“kits”), (Marques 2001). A utilidade indubitável do 99mTc no contexto diagnóstico já tem sido provada nestes últimos 30 anos, contudo a sua eventual utilidade enquanto agente terapêutico começa agora a colocar-se, devido, muito em parte, ao crescente interesse nos emissores de electrões de Auger, dois quais o 99mTc faz parte. Assim, neste capítulo aborda-se as principais características dos radiofármacos ideais para terapia com electrões de Auger, focando mais atenção nas características do 99mTc nesse contexto. Para melhor compreensão dos temas a tratar no presente capítulo organizou-se este do seguinte modo: primeiro aborda-se as principais características de um radiofármaco, definindo-se o que se entende por radiofármaco, de seguida, expõe-se as principais características de um radiofármaco para terapia com electrões de Auger, para que, depois se possa interligar estas com as características do 99mTc.

4.2 Radiofármaco Ideal para Terapia com Electrões de Auger Um radiofármaco é um composto radioactivo utilizado no diagnóstico e tratamento de múltiplas patologias humanas. À excepção dos utilizados em terapia, os radiofármacos não apresentam efeito farmacológico, pois são administrados em quantidades reduzidas. Outras designações podem ser dadas aos radiofármacos, nomeadamente, radiotraçador ou simplesmente traçador.



O radiofármaco é constituído por dois componentes: um radionuclídeo e um fármaco, sendo as características e utilidade deste determinadas com base nestes dois componentes. Aquando do desenho de um radiofármaco novo, um fármaco deve ser seleccionado, com base na sua localização preferencial num dado tecido ou órgão ou na participação fisiológica que terá sobre dadas células, receptores, tecidos ou órgãos. De seguida, um radionuclídeo é adicionado ao fármaco, devendo as suas emissões energéticas corresponder aos objectivos esperados e ao detector de radiação utilizado. Considerando estas premissas, compreende-se que, a avaliação da função fisiológica e da estrutura morfológica de um dado sistema, órgão ou tecido, seja alcançada.

De uma forma geral, um radiofármaco ideal deve possuir várias características, das quais se destaca: elevada disponibilidade, ou seja, deve ser facilmente produzido, deve ter um custo reduzido e apresentar-se rapidamente disponível, nomeadamente pela existência de um gerador de radionuclídeos in situ; deve ainda apresentar uma semi-vida efectiva reduzida; emissão de partículas em caso de terapia e elevada relação alvo-não alvo, isto é, elevada especificidade para um dado local de ligação, (Saha 1998). No caso particular da radioterapia tumoral dirigida, algumas das características acrescem às referidas e incluem (Humm 1994):

• Electrões emitidos pelos radionuclídeos com menos de 40 keV;

• Razão entre a emissão fotónica/electrão inferior a 2;

• Semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias;

• Nuclídeo-filho estável e com semi-vida física superior a 60 dias;

• Química adequada aos processos de radiomarcação. Por outro lado, dentro dos radiofármacos emissores de electrões de Auger, os que

apresentam potencial terapêutico incluem, (Unak 2002):

• O radionuclideo que o compõe dispõe de um perfil de decaimento radioactivo adequado (descrito anteriormente);

• O radionuclídeo é economicamente preparado com elevada actividade específica;

• O radionuclídeo deve ser eficientemente incorporado numa molécula transportadora;

• A molécula transportadora deve apresentar uma biodistribuição selectiva para o tecido alvo;



• No tecido alvo, o agente deve associar-se com o complexo do ADN durante um determinado período de tempo consistente com a semi-vida física do radionuclídeo.

4.3 Principais Características Físicas do 99mTc

O 99mTc – Tecnécio-99 metastável, é um metal de transição do Grupo VIIB da Tabela Periódica, com o número de massa 99 e o número atómico 43 que, tratando-se de um emissor gama puro, com a

emissão principal de energia a 140 keV e uma semi-vida física de 6.02 horas, decai para 99Tc através de uma transição por conversão interna seguida de outra transição por conversão interna em 10% das desintegrações, ou seguida de emissão de um fotão gama de 140 keV em 90%, (Humm 1989). As principais características do espectro de radiação do 99mTc foram apresentadas no relatório número 2 da AAPM, de 1992, e encontram-se na Tabela 4.1, (Howell 1992).

Tabela 4.1. Espectro de Energia do 99mTc (Continua) (adaptado de: (Howell 1992)).

Energia Média (MeV) Rendimento/Decaimento Alcance (microns)

Gama 2 1.41×10-1 8.89×10-1 IC 1 M,N … 1.82×10-3 9.91×10-1 1.65×10-1

IC 2 K 1.19×10-1 8.43×10-2 1.93×102

IC 2 L 1.37×10-1 1.36×10-2 2.44×102

IC 2 M,N… 1.40×10-1 3.70×10-3 2.51×102

IC 3 K 1.22×10-1 5.90×10-3 1.99×102

IC 3 L 1.40×10-1 2.50×10-3 2.50×102

Auger KLL 1.53×10-2 1.26×10-2 5.57

Auger KLX 1.78×10-2 4.70×10-3 7.25

CK LLX 4.29×10-5 1.93×10-2 2.83×10-3

Auger LMM 2.05×10-3 8.68×10-2 1.99×10-1

Auger LMX 2.32×10-3 1.37×10-2 2.41×10-1

Auger LXY 2.66×10-3 1.20×10-3 3.00×10-1

CK MMX 1.16×10-4 7.47×10-1 5.89×10-3

Auger MXY 2.26×10-4 1.10 1.05×10-2

CK NNX 3.34×10-5 1.98 2.05×10-3

Raios X Kα1 1.84×10-2 3.89×10-2 Raios X Kα2 1.83×10-2 2.17×10-2



Tabela 4.1. Espectro de Energia do 99mTc (Conclusão) (adaptado de: (Howell 1992)).

Energia Média (MeV) Rendimento/Decaimento Alcance (microns)

Raios X Kβ1 2.06×10-2 7.60×10-3 Raios X Kβ2 2.10×10-2 1.50×10-3 Raios X Kβ3 2.06×10-2 2.70×10-3 Raios X L 2.45×10-3 4.90×10-3 Raios X M 2.36×10-4 1.20×10-3

Rendimento Total de Auger e electrões CK por decaimento = 4.0 Rendimento Total de electrões de Conversão Interna por decaimento = 1.1

Rendimento Total de raios X por decaimento = 0.079 Rendimento Total de raios gama por decaimento = 0.89

Energia Total Libertada por decaimento = 142646 eV Energia dos electrões de Auger e CK libertada por decaimento = 899 eV

Energia dos electrões de conversão interna libertada por decaimento = 15383 eV Energia de raios X libertada por decaimento = 1367 eV

Energia de raios gama libertada por decaimento = 124997 eV Legenda: Gama 2 – emissão de raios gama da transição nuclear número 2; IC – b K, IC – b L, IC – b M,N… - Conversão interna, em que a letra b denota o número da transição nuclear. A notação K, L e M,N… indicam que o electrão foi ejectado das orbitais K, L e M,N… respectivamente; Auger KLL – Transição Auger da orbital K com duas lacunas na orbital L; Auger KLX – Transição Auger da orbital K onde uma das duas lacunas se situa na orbital L; CK LLX – Transições de Coster-Kroning e Super-Coster-Kroning na orbital L; Auger LMM – Transições de Auger em que ambas as lacunas são na orbital M; Auger LMX - Transição Auger da orbital L onde uma das duas lacunas se situa na orbital M; Auger LXY - Transição Auger da orbital L onde nenhuma das duas lacunas se situa na orbital M; CK MMX – Transições Coster-Kroning e Super-Coster-Kroning na orbital M; Auger MXY – Transições de Auger na orbital M; CK NNX - Transições Coster-Kroning e Super-Coster-Kroning na orbital N.

4.4 Sumário

Neste quarto capítulo foram explicados os conceitos básicos associados ao uso do 99mTc, enquanto agente irradiante do trabalho, sendo de salientar as suas características físicas. Sabendo que um radiofáramaco emissor de electrões de Auger apresenta potencial terapêutico quando o radionuclídeo que o compõe possui um perfil de decaimento radioactivo adequado, isto é, electrões emitidos com menos de 40 keV, razão emissão fotónica/electrão inferior a 2, semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias e nuclídeo-filho estável e com semi-vida física superior a 60 dias. Assim, compreende-se porque o 99mTc se perfila como um agente com eventual potencial terapêutico, pois apresenta electrões emitidos com energias compreendidas entre 0.9 e




15.4 keV, a sua semi-vida física é de 6 horas (incluída no intervalo de 30 minutos a 10 dias) e o nuclídeo-filho resultante do seu decaimento é estável.

Por outro lado, um radionuclídeo emissor de electrões de Auger deve ser economicamente preparado com uma elevada actividade específica, sendo que, mais uma vez o 99mTc preenche com sucesso este requisito, apresentando, também neste ponto, potencial interesse enquanto emissor de Auger para radioterapia metabólica.

As outras características que um radiofármaco emissor de electrões de Auger deve possuir, para ser considerado promissor enquanto agente terapêutico, incluem: radionuclídeo eficientemente incorporado numa molécula transportadora, a qual deverá apresentar uma biobistribuição selectiva do tecido alvo e ligar-se ao ADN durante um período de tempo consistente com a semi-vida física do radionuclídeo; e vão depender, como referido, da biodistribuição da molécula transportadora (fármaco), pois, diferentes moléculas expressarão diferentes biodistribuições e, consequentemente, diferentes capacidades de penetrar a membrana celular.

Capítulo V. Citometria de Fluxo


5.1 Introdução Dois modelos distintos de morte celular, necrose e apoptose, distinguem-se com base nas diferenças morfológicas, bioquímicas e alterações moleculares que ocorrem nas células aquando do seu processo de morte, (Hanon E. 1996). A necessidade de obter informação dos processos biológicos, nomeadamente processos de morte celular, tem conduzido ao aparecimento e utilização de múltiplos equipamentos e técnicas para o efeito, (Silva 2004). Uma das técnicas utilizadas para avaliar os processos biológicos é a citometria de fluxo. Sabe-se que, a radiação ionizante é um agente potencialmente danificador do ADN, quer seja por efeitos directos, quer seja por efeitos indirectos sobre as células irradiadas. A indução de aberrações cromossómicas, bem como, de alterações no ciclo celular, mitose aberrante ou morte celular podem aumentar com o aumento da dose de irradiação, (Baatout 2004).

Assim, para que se possam estudar os efeitos da radiação em termos de biologia celular, nomeadamente, indução de apoptose, a citometria de fluxo apresenta-se como uma ferramenta muito útil, de fácil utilização, sendo capaz de fornecer informações sobre células em fases iniciais de apoptose, células em fase final de apoptose, células necróticas, entre outras informações.

A citometria de fluxo é uma técnica quantitativa de análise celular, tendo-se desenvolvido o primeiro citómetro de fluxo em 1970 e, a partir daí, este tem-se tornado um instrumento essencial nas ciências biológicas. De entre as suas mútliplas aplicações salientam-se aquelas relacionadas com hematologia, enumeração reticulócita, análise da função celular, cinética do ciclo celular, genética, biologia molecular e microbiologia, (Riley 2005; Nolla 2008).

No presente capítulo pretende-se expor alguns dos conceitos chave para a compreensão da citometria de fluxo; nomeadamente, pela enumeração de algumas características do citómetro de fluxo e pela comparação desta técnica com a microscopia tradicional. Para além disso, pretende-se ainda expor a utilidade da citometria de fluxo na avaliação dos efeitos da radiação em culturas de células. Assim, o presente capítulo foi organizado começando pelo citómetro de fluxo, posteriormente vantagens e desvantagens da citometria de fluxo e a sua utilidade na avaliação dos efeitos da radiação em células.




5.2 Citómetro de Fluxo – Principais Características Um citómetro de fluxo é um sistema constituído por 5 elementos: fonte de radiação, (lâmpada de mercúrio ou laser), uma câmara de fluxo, unidades de filtros ópticos para selecção de um intervalo de comprimento de onda específico, a partir duma gama espectral mais vasta, fotodíodos ou fotomultiplicadores para a detecção sensível e processamento dos sinais com interesse e uma unidade que processa os dados recolhidos, Figura 5.1.

A suspensão celular é injectada e atravessa a câmara onde se dá a passagem célula a célula através do feixe de radiação, perpendicular ao fluxo. A passagem individual das células é obtida através da focagem hidrodinâmica do fluxo de amostra, sendo esta injectada no seio de uma solução salina (sheath fluid) que também atravessa a câmara, Figura 5.2. A diferença de velocidades entre os dois fluidos faz com que o fluxo se processe em regime laminar. A velocidade de escoamento da solução de revestimento (sheath fluid) é superior à da amostra, e ajustável, o que permite reduzir e controlar a espessura da solução da amostra para que possa passar uma célula de cada vez. Desta forma, podem detectar-se até 10000 células (eventos) por segundo. O feixe de radiação de excitação ao interceptar a célula na câmara, sofre dispersão quer na direcção frontal (forward scattering), quer lateral (side scattering). A radiação assim dispersa é detectada directamente por fotodíodos (dispersão frontal) ou pode ser desviada a 90º por lentes, espelhos dicróicos e filtros ópticos e focada em fotomultiplicadores.

Figura 5.1. Esquema da constituição interna de um citómetro de fluxo; de notar o sistema de lentes (adaptado de (Caprioglio 2008)).

Fluxo Células

Filtros Dicróticos

Tubos Fotomultiplicadores


Amostra células

Sheat Fluid

Câmara de Fluxo

Lente do Laser

Figura 5.2. Representação de uma câmara de fluxo. A passagem individual das células (eventos) é conseguida pela focagem hidrodinâmica do fluxo de amostra no seio da solução salina (sheat fluid) (adaptado de (Nolla 2008)).

A combinação dos dois tipos de radiação dispersa revela informações importantes,

nomeadamente, a dimensão celular, a granularidade/complexidade e a morfologia. Compostos intracelulares com fluorescência intrínseca (ex: clorofilas, ficobiliproteínas,

NAD(P)H, etc.) ou passíveis de se ligarem a corantes fluorescentes (fluorocromos), permitem a diferenciação selectiva de subpopulações com base na combinação de vários fluorocromos. A fluorescência destes compostos é também detectada por fotomultiplicadores, através de um sistema de lentes, espelhos dicróticos e filtros ópticos, Figura 5.1.

Os citómetros actuais mais sofisticados podem possuir até 16 detectores em simultâneo (radiação dispersa e fluorescente), o que permite analisar múltiplas possibilidades de características celulares e/ou componentes celulares de um elevado número de células de forma individual. Esta versatilidade designa-se por análise multiparamétrica, (Silva 2004). Em suma, a preparação de suspensões e células é necessária para a realização da análise por citometria de fluxo. Vários corantes imunoflurescentes ou anticorpos são adiconados aos antigenes ou às proteínas de interesse. A suspensão de células é “aspirada” para um fluxo de células, o qual se encontra envolvido numa corrente de fluído, e vai passando ao longo de um feixe laser. A luz pode ser absorvida ou desviada assim que embate na célula, sendo que, aquela que é absorvida, quando apresenta o comprimento de onda apropriado, é re-emitida como fluorescência, caso a célula apresente substância fluorescente ou mais do que um anticorpo marcado com fluorocromo na superfície da célula ou no seu interior. Por sua vez, a



dispersão da luz depende da estrutura interna da célula, do seu tamanho e forma. As substância fluorescentes absorvem luz com um dado comprimento de onda e re-emitem diferentes comprimentos de onda. Finalmente, a luz e/ou sinais desviados fluorescentes são detectados por uma série de fotodíodos, sendo posteriormente amplificados. Alguns filtros ópticos presentes são essenciais para bloquear radiação indesejada, permitindo que apenas a radiação com o comprimento de onda desejado atinja o fotodetector, (Riley 2005).

5.3 Vantagens e Desvantagens da Citometria de Fluxo A informação que se pode retirar dos ensaios de viabilidade clássicos, sobre os estados fisiológicos das células, é limitada a dois níveis extremos de actividade metabólica: o saudável, presente em células viáveis com capacidade para se dividirem, e o correspondente à morte celular. Contudo, por vezes, as células encontram-se num estado fisiológico intermédio entre o metabolicamente activo e a morte celular, sendo que, o método tradicional não contabiliza as células. A vantagem da citometria de fluxo em analisar células individualmente consiste na detecção de uma variedade de estados fisiológicos celulares intermédios que realmente existem numa determinada população, descobrindo assim uma heterogeneidade nunca antes revelada. Para além disso, os dados obtidos através das técnicas clássicas são relativos à cultura como um todo, ou seja, uma amostra representativa da cultura apresenta um único valor, referente à média dos valores de um determinado parâmetro, de todas as células. Contudo, numa população celular, as células não se encontram todas no mesmo estado metabólico e fisiológico, pelo que se torna necessário detectar e descrever as várias subpopulações de forma diferenciada. Mais uma vez, a citometria de fluxo permite a avaliação da heterogeneidade de culturas, à escala da célula individual. Desta forma, dados “discretos” representando subpopulações diferentes podem fornecer uma “imagem” mais detalhada e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre num determinado bioprocesso. Por estes motivos, a citometria de fluxo tem tido, cada vez mais, impacto na comunidade científica.

A combinação de vários fluorocromos em citometria de fluxo permite a diferenciação de diferentes subpopulações numa determinada população, correspondentes a diferentes níveis de funcionalidade das células. Esta diferenciação levou à introdução do termo “viável, mas não culturável”, aplicado a células que não estando metabolicamente activas, também não estão mortas e, evidentemente, não são reveladas através dos ensaios de viabilidade celular. A



utilização de critérios do funcionamento celular tais como o potencial da membrana citoplasmática e a integridade da mesma, permitem caracterizar estes estados metabólicos.

De forma geral, a utilização da mistura de diversos corantes permite a diferenciação dos seguintes estados metabólicos funcionais: células saudáveis (com capacidade para se dividirem), “vitais”, intactas e permeabilizadas. Pensa-se que quando uma célula se encontra sob stress, alguns dos sistemas de transporte activo são afectados (células “vitais”), seguindo-se a despolarização da membrana citoplasmática (células intactas) e, mais tarde, a sua permeabilização (células mortas). Células sem a membrana citoplasmática intacta não conseguem manter ou gerar o gradiente de potencial electroquímico que origina o potencial de membrana. Além disso, a sua estrutura interna, não estando protegida por uma membrana citoplasmática intacta, encontra-se livremente exposta ao meio ambiente, pelo que estas células acabarão por se decompor. Todas estas etapas conduzem à morte celular.

Assim, é possível diferenciar o estado fisiológico de uma célula individual, para além do clássico e estrito conceito de viabilidade, baseado no funcionamento de alguns sistemas de transporte activo, ou na presença ou ausência da membrana citoplasmática intacta e polarizada. A citometria de fluxo surge assim como uma técnica consistente e fiável na detecção das verdadeiras percentagens de células viáveis e mortas, numa determinada população de células.

Uma comparação entre a microscopia pelo método clássico e a citometria de fluxo permite distinguir estas duas técnicas em seis pontos fundamentais. Em primeiro lugar, na microscopia são utilizadas células imobilizadas, realizando-se uma contagem manual; por outro lado, na citometria de fluxo, as células são analisadas em suspensão e vão passando em fila única pela frente do laser. A detecção, no método clássico, é visual, enquanto que, na citometria de fluxo é realizada uma detecção electrónica. No método clássico detectam-se centenas de células, com uma taxa de análise de 100 células por minuto, enquanto que, na citometria de fluxo se detectam milhares a milhões de células, com uma taxa de 2000-5000 células por segundo. A sensibilidade do método clássico é reduzida, detectando-se apenas expressões proteicas marcadas, o que contrasta com a sensibilidade do método por citometria de fluxo, que apresenta elevada sensibilidade, mesmo para expressões proteicas diminuídas. Finalmente, no método clássico a avaliação é quantitativa, mas descreve apenas duas possibilidades, célula viva ou célula morta; o que apresenta desvantagens, como explicado anteriormente. A citometria de fluxo, por sua vez, é um método quantitativo, mas a fluorescência de cada célula é classificada, (Silva 2004).




5.4 Citometria de Fluxo para Avaliação dos Efeitos da Radiação em Culturas de Células Para além das múltiplas vantagens da citometria de fluxo previamente explicadas, esta permite ainda, uma rápida análise do ADN, da expressão fenotípica e da função celular. A avaliação quantitativa desta técnica tem sido muito utilizada na avaliação do transporte de fármacos, fluxo do cálcio, proliferação e apoptose celular. Sabendo destas potencialidades da citometria de fluxo, e de muitas outras, alguns investigadores passaram a utilizar a citometria de fluxo para monitorizar os efeitos da radiação na distribuição de ADN pelo ciclo celular em células de mamíferos. O conteúdo de ADN de cada célula pode ser medido, podendo ser utilizado para estimar a distribuição celular no ciclo celular. Como explicado no capítulo III, o ciclo celular divide-se em várias fases: fase G1/G0, fase S (síntese ADN), fase G2 e fase M (mitose). O conteúdo de distrbuição de ADN numa população celular típica em crescimento celular caracteriza-se por dois picos em G1/G0 e G2/M e um vale na fase S. As células na fase G2/M

apresentam o dobro da quantidade de ADN que a fase G1/G0, sendo que a fase S apresenta variações da quantidade de ADN entre as fases G1 e G2, Figura 5.3. A monitorização do ciclo celular, bem como a sua regulação, é fundamental para compreensão dos efeitos da radiação na célula.

Figura 5.3. Representação do ciclo celular medido por citometria de fluxo com uso de iodeto de propídio (adaptado de (Baatout 2004)).

Nas células eucarióticas, a radiação ionizante causa atrasos na divisão, nomeadamente no período G2, sendo este atraso proporcional ao tipo de célula, posição da célula no ciclo celular e dose absorvida. Este atraso, serve frequentemente para que a célula repare os danos ao ADN, Figura 5.4.

Conteúdo de ADN

G2/M

Nº cé

lulas

G1/G0

Fase S



Figura 5.4. Representação gráfica obtida com citometria de fluxo em células controlo e células irradiadas, de notar o atraso na fase G2; resultados obtidos com uso de iodeto de propídio (adaptado de (Baatout 2004)).

A apoptose caracteriza-se, basicamente, como referido no capítulo III, por alterações morfológicas, que incluem aumento da granularidade citoplasmática, retracção celular, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos. Esta morte celular programada pode surgir espontaneamente ou por agressões de estímulos externos, nomeadamente, pela radiação ionizante. A citometria de fluxo permite também detectar apoptose radioinduzida pelo uso de iodeto de propídio e anexina V, Figuras 5.5 e 5.6, (Baatout 2004).

Figura 5.5. Detecção de apoptose em linfócitos humanos irradiados, utilizando o iodeto de propídio (adaptado de (Baatout 2004)).

Células Controlo Células Irradiadas com 2.5Gy

Conteúdo de ADN

Núm

ero

de C

élulas

Conteúdo de ADN

Células Controlo Células Irradiadas

Núm

ero

de C

élulas

Pico G0/G1

Sub-pico G0/G1

Células apotóticas


Células vivas Células apoptóticas

Células mortas

Figura 5.6. Avaliação da integridade da membrana de leucócitos com anexina V; verifica-se um aumento do número de células apoptótica com o aumento da dose (adaptado de (Baatout 2004)).

A anexina V é utilizada para reconhecer fosfatidilserina translocada e, uma vez associada ao iodeto de propídio, que funciona como corante de exclusão de viabilidade celular, permite detectar células apoptóticas e discriminar entre apoptose (precoce e tardia) e necrose, (Baatout 2004). A viabilidade celular pode ser avaliada com base em alterações morfológicas ou alterações na permeabilidade da membrana e/ou estado fisiológico inferido a partir da exclusão de certos corantes ou a retenção de outros. As células vivas apresentam membranas intactas e podem ser avaliadas pela sua capacidade de excluir corantes que rapidamente entram para células mortas ou danificadas. O uso de iodeto de propídio tem sido utilizado na maioria das culturas celulares para a avaliação de células não viáveis. A sua vasta aplicação tem por base o facto do seu procedimento de realizar ser simples, pois as células danificadas coram de vermelho vivo, sendo por isso facilmente identificadas, (Coder 1997). Em suma, o idodeto de propídio não atravessa a barreira da membrana celular em situações normais; contudo, quando penetra na célula significa que a membrana está danificada, o que implicará a presença de uma célula danificada ou morta.

Um dos sinais mais precoces de apoptose é a translocação de fosfolípidos da membrana celular, a fosfatidilserina, da camada interna da membrana celular para a camada externa. Uma vez exposta ao ambiente extracelular, os locais de ligação da fosfatidilserina translocada tornam-se disponíveis para a anexina V, a qual apresenta dependência do ião cálcio (Ca2+), Figura 5.7.




Figura 5.7. Representação esquemática da ligação da anexina V à membrana plasmática em células apoptóticas (à direita) e a ausência de ligação em células normais (à esquerda) (adaptado de (BD 2007)).

Uma vez que a translocação da fosfatidilserina também ocorre em situações de necrose,

a anexina V não é um marcador absoluto de apoptose, pelo que, deve ser utilizada em conjunto com corantes essenciais, nomeadamente o iodeto de propídio, os quais penetram na células quando a integridade membrana plasmática está afectada, o que ocorre apenas nos estádios finais da apoptose ou em casos de necrose celular. Assim, células que sejam negativas à anexina V e, simultaneamente, ao iodeto de propídio, são células sem indícios de apoptose, verificando-se ainda que não correu translocação da fosfatidilserina e a membrana plasmática ainda está intacta. Por outro lado, se as células forem positivas à anexina V, mas negativas ao iodeto de propídio, estas encontram-se em estádios inicias de apoptose, pois já ocorreu translocação da fosfatidilserina, mas a membrana plasmática ainda está intacta. Finalmente, se as células forem positivas a ambos (anexina V e iodeto de propídio), então assume-se que as células estão em estádios tardios de apoptose ou em morte celular confirmada; nestes casos, quer a translocação da fosfatidilserina, quer a perda de integridade da membrana plasmática já ocorreram, (BD 2007).

5.5 Sumário Do presente capítulo conclui-se que a citometria de fluxo é uma técnica superior à microscopia clássica, particularmente no que respeita à determinação de células apoptóticas, necróticas e viáveis, pois apresenta como principais vantagens a possibilidade de analisar

Anexina V

Membrana Plasmática

Citoplasma

Apoptose Externalização da

fosfatidilserina

Citoplasma



milhares a milhões de células, com uma taxa de 2000 a 5000 células por segundo, o que se traduz numa elevada sensibilidade de detecção e ainda a possibilidade de avaliar individualmente cada célula. Por estes motivos, se seleccionou esta técnica para a realização da investigação inerente à presente Dissertação. Como método a utilizar para detecção de apoptose e viabilidade celular seleccionou-se a citometria de fluxo com iodeto de propídio e anexina V.

Capítulo VI. Materiais e Métodos


6.1 Introdução Actualmente várias linhas celulares encontram-se disponíveis e são utilizadas como valiosas ferramentas no estudo de múltiplas patologias, mas também no estudo da resposta celular a agentes químicos e físicos. Pretende-se, uma vez finalizada esta Dissertação, compreender melhor qual a resposta celular à radiação. Prevê-se que os efeitos a estudar se centrem nos efeitos dos electrões de Auger emitidos pelo radionuclídeo 99mTc em diferentes culturas de células, de forma a melhor compreender a resposta radiobiológica da célula. Neste capítulo abordam-se os procedimentos e técnicas que se pretendem aplicar para a realização desta Dissertação, bem como os materiais essenciais para a sua realização, tendo-se organizado da seguinte maneira: primeiro, culturas celulares e procedimentos de irradiação, seguida de estudos de efluxo e influxo e, finalmente, a técnica prevista para análise da apoptose radioinduzida.

6.2 Culturas Celulares e Procedimento de Irradiação Para a realização do presente trabalho, cujo tema central é análise dos efeitos dos electrões de Auger em culturas de células pretende-se utilizar culturas de células humanas que serão submetidas a irradiação com 99mTc. As culturas a utilizar deverão ser linhas de fibroblastos, pois este tipo de células apresenta grande resistência e sobrevivência em meio de cultura, pelo que, permitirá, à partida, interpretar os resultados obtidos como efeitos da irradiação. O 99mTc será obtido pela eluição de um gerador de radionuclídeos, neste caso um gerador 99Mo-99mTc, sob a forma de 99mTc-Pertecnetato de sódio e de seguida adicionado aos meios de cultura celular em estudo de forma a se obter diferentes concentrações finais. As culturas de fibroblastos serão expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e 3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml). Uma vez concluído o processo de irradiação e depois de determinar quais as doses ideais de irradiação; isto é, eliminado as doses que destroem todas as culturas celulares ou as que não causam quaisquer alterações às células, pretende-se irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas, que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy. A actividade a adicionar ao meio de cultura será determinada em calibrador de doses ou em contador de poço.


Capítulo VI. Materiais e Métodos

6.3 Estudos de Efluxo/Influxo Celular A avaliação da dinâmica do 99mTc-Pertecnetato de Sódio será levada a cabo pela análise do influxo e efluxo deste as células em cultura. Para tal, proceder-se-á a uma centrifugação de uma amostra da cultura de células, de forma a separar as células do meio de cultura, medindo-se de seguida a radioactividade de cada porção (células e meio cultura) num contador de poço e determinando-se a presença de 99mTc-Pertecnetato de Sódio no interior das células; ou seja, a quantidade que penetrou a membrana celular - estudo do influxo. O estudo do efluxo, por outro lado, pretenderá avaliar a quantidade de 99mTc- Pertecnetato de Sódio que entrou na célula, mas foi de seguida expulso para o seu exterior. Esta avaliação reveste-se da maior importância, pois só depois de se compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membrana celular e sua consequente captação por parte da célula é que se consegue analisar e concluir os resultados obtidos, nomeadamente aqueles referentes à dimensão dos fenómenos de apoptose.

6.4 Análise da Apoptose Radioinduzida Conforme descrito nos pressupostos teóricos no capítulo anterior, a citometria de fluxo assume um papel crucial na determinação de apoptose. Para a avaliação desse fenómeno de morte celular e sua distinção de necrose celular e células viáveis, utilizar-se-á a citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio. Se por um lado, a anexina V é utilizada para reconhecer fosfatidilserina translocada, que constitui um dos sinais precoces de apoptose, por outro lado, o iodeto de propídio funciona como corante de exclusão de viabilidade celular, pela análise de alterações na permeabilidade da membrana e/ou estado fisiológico inferido a partir da exclusão de certos corantes ou a retenção de outros.

Uma vez que a translocação da fosfatidilserina também ocorre em situações de necrose, a anexina V não é um marcador absoluto de apoptose, pelo que, deve ser utilizada em conjunto com o iodeto de propídio, o qual tem sido utilizado na maioria das culturas celulares para a avaliação de células não viáveis, porque é um procedimento simples, que se caracteriza pela impossibilidade de atravessar a barreira da membrana celular em situações normais. A Tabela 6.1 expõe os possíveis resultados a obter pelo uso desta técnica de dupla marcação, (Coder 1997; BD 2007).




Tabela 6.1. Representação dos possíveis resultados a obter pela aplicação da técnica de dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio, utilizada em citometria de fluxo.

Reagente

Diagnóstico Celular Anexina V Iodeto de Propídio

Células Viáveis

Início de Apoptose

Final Apoptose e Necrose Legenda: - Positivo; - Negativo

6.5 Sumário

Neste capítulo realizou-se a planificação do projecto que se pretende executar, abordando quais os principais materiais a utilizar para a realização da investigação, nomeadamente o agente irradiante e os tipos de culturas celulares que se prevê utilizar; tendo-se ainda apontado quais os métodos e técnicas a aplicar para a quantificação e análise dos efeitos dos electrões de Auger em culturas de células. De entre as múltiplas técnicas disponíveis para análise de culturas de células, seleccionou-se aquelas que permitem avaliar de forma mais circunstanciada e direccionada os efeitos da radiação em culturas de células, das quais se destaca a citometria de fluxo.

Capítulo VII. Conclusões Finais e Perspectivas Futuras


7.1 Conclusões Finais

O mecanismo ideal de morte celular é, como explicado no capítulo III, a apoptose. Este não invoca o processo inflamatório, o que constitui uma enorme vantagem face à necrose, pois permite a morte selectiva de células e não a morte generalizada em torno da célula danificada; pelo que, a terapia tumoral procura cada vez mais induzir apoptose de células danificadas (nomeadamente as cancerosas), evitando o dano das células vizinhas. Nesta perspectiva, uma radioterapia dirigida com electrões de Auger pode invocar a apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis, pois quando colocados perto do ADN comportam-se como radiação de alto LET, activando deste modo os processos apoptóticos, conforme explicado no capítulo III.

Para estudar os efeitos da radiação no ADN utiliza-se muitas vezes culturas de células, particularmente linhas celulares, pela sua grande disponibilidade e elevada capacidade de reprodutibilidade, conseguida pela padronização das células (capitulo II). Se a esta informação se adicionar o crescente interesse da comunidade científica relativamente aos radionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99mTc faz parte (capítulo IV), então, facilmente se depreende a relevância e pertinência do presente trabalho e, em particular, da Dissertação que será construída com base neste.

A citometria de fluxo, na perspectiva da presente Dissertação, afigura-se como uma técnica superior à microscopia clássica, pois apresenta como principais vantagens a possibilidade de analisar milhares a milhões de células, com uma taxa de 2000 a 5000 células por segundo, o que se traduz numa elevada sensibilidade de detecção e ainda a possibilidade de avaliar individualmente cada célula, para além disso, possibilita a avaliação do fenómeno de apoptose. Aproveitando estas características vantajosas que a técnica de citometria de fluxo possui e utilizando o iodeto de propídio em conjunto com a anexina V, consegue-se determinar de forma rápida e correcta o número de células viáveis, o número de células em estádios inicias de apoptose e as células em estádios finais de apoptose ou em necrose presentes numa cultura de células. Assim, espera-se que este seja o principal método a utilizar para a avaliação dos efeitos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas de células seleccionadas.

De forma sucinta, as técnicas que se pretende utilizar para a execução prática deste tema de Dissertação serão a citometria de fluxo e a avaliação do efluxo e influxo do radiofármaco nas células em cultura. Pretende-se, por um lado, avaliar qual o grau de difusão do radiofármaco a utilizar (99mTc-Pertecnetato de Sódio) a nível celular, ou seja, se o radiofármaco consegue penetrar a membrana celular e ficar retido no interior das células e, portanto, mais perto do ADN.


Capítulo VII. Conclusões Finais e Perspectivas Futuras


Este estudo é importante, pois sabe-se, de estudos prévios, que a colocação de um emissor de electrões de Auger no interior da célula, próximo do núcleo celular e do ADN, irá, consequentemente, originar efeitos a nível celular típicos de radiação de elevado LET, e portanto, maior será a probabilidade de indução de apoptose. Assim, os estudos de efluxo e influxo permitirão determinar o nível de captação celular do radiofármaco. Por outro lado, o uso da citometria de fluxo para quantificar a apoptose, necrose e células viáveis, em conjunto com os estudos de efluxo/influxo permitirá estabelecer relações entre a proximidade ao AND e a indução de apoptose, e deste modo, conhecer melhor qual o efeito de diferentes doses e períodos de incubação do 99mTc em culturas de células, clarificando um pouco mais, de uma forma dirigida, os efeitos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas de células e eventualmente sugerir qual o possível papel deste no contexto de radioterapia metabólica.

7.2 Perspectivas Futuras

O presente documento traça o esquema do projecto que se prevê colocar em prática para a respectiva Dissertação, pois expõe informação sobre o agente irradiante a utilizar, o 99mTc, informação sobre culturas de células e apoptose, processos essenciais para a finalização da mesma.

Como perspectivas futuras que se pretendem alcançar com a realização desta Dissertação destacam-se: contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado e completo sobre o estado da arte dos electrões de Auger no contexto de radioterapia metabólica, com particular incidência os relativos ao 99mTc; melhorar o conhecimento actual do papel do 99mTc enquanto agente irradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitos radiobiológicos em culturas de células seleccionadas; utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitos da radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose; estudo do efluxo e influxo do 99mTc-Pertecnetato de Sódio em culturas de células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agente terapêutico com a sua dinâmica celular.

Assim, espera-se que, com este estudo, se clarifique um pouco mais os efeitos radiobiológicos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas celulares, o que poderá constituir um caminho inicial para avaliação deste enquanto agente terapêutico.

Adicionalmente perspectiva-se a realização de um trabalho de investigação com interesse científico, pois versa sobre uma temática ainda pouco aprofundada e onde se registam dúvidas e lacunas por explicar.

Referências


Referências

Anazetti, M. C. (2007). "Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e molecular." Metrocamp Pesquisa 1(1): 37-58.

Baatout (2004). "Cytometric methods to analyze radiation effects." Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 18(2): 101-105.

BD, B. (2007). "Annexin V - Introduction." Annexin V Retrieved 26 June 2008, from http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48.

Besta, I. N. N. C. (2004). Detection of Contaminants in Human Cell Culture. L. P. f. H. C. Culture. Marina Mora, EuroBio Bank.

Caprioglio, D. (2008). "Fluorescence in Biology." Retrieved 26 June 2008, from http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html.

Coder, D. (1997). Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons.

Coimbra, U. (2008). "Noções básicas de cultura de células." Retrieved Maio 2008, from https://woc.uc.pt/bioquimica/getFile.do?tipo=2&id=523.

Dash, P. (2008). "Apoptosis." Reproductive and Cardiovascular Research Group Retrieved Maio 2008, from http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/.

Freshney, I. (2006). Basic Principles of Cell Culture. Culture of Cells for Tissue Engineering. G. V.-N. e. I. Freshney, Jon Wiley and Sons.

Hanon E., V. A., Pastoret P. (1996). "The Use of Flow Cytometry for Concomitant Detection of Apoptosis and Cell Cycle Analysis." Biochemica 2(Technical Tips): 25-27.

Hartung, T. (2002). "Good Cell Culture Practice." ATLA 30: 407-414. Howell, R. (1992). "Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report No.2 of

AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6." Medical Physics 19(6): 1371-1383. Humm, J. (1989). "A New Calculational Method to Assess the Therapeutic Potential of Auger

Electron Emission." International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 17(2): 351-360.

Humm, J. (1994). "Dosimetry of Auger-Electron-Emitting Radionuclides." Medical Physics 21(12): 1901-1915.

Marques, F. (2001). "Alguns Aspectos Sobre Geradores e Radiofármacos de Tecnécio-99m e seus Controles de Qualidade." Radiologia Brasileira 34(4): 233-239.

Mather, J. (1998). Introduction to Cell and Tissue Culture. New York and London, Plenum Press. Nolla, H. (2008). Basic Principles in Flow Cytometry. U. o. California. Berkeley.


http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48

http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html

http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/%7Edash/apoptosis/

Referências


Riley, R. (2005). "Principles and Applications of Flow Cytometry." Retrieved 26 June 2008, from http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf.

Ryan, J. (2008). Introduction to Aninmal Cell Culture. Technical Bulletin. Saha, G. (1998). Radiopharmaceuticals and Methods of Radiolabeling. Fundamentals of Nuclear

Pharmacy. Springer. SIGMA (2008). Fundamental Techniques in Cell Culture... A Laboratory Handbook, SIGMA

Laborartories. Silva, A. (2000). Terra, Universo de Vida. Porto, Porto Editora. Silva, T. R., Alberto; Hewitt, Christopher; Roseiro, Jose (2004). "Citometria de fluxo -

Funcionalidade celular on-line em bioprocessos." Boletim de Biotecnologia 77(Métodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II): 32-40.

Suntharalingam, N. (2002). "Basic Radiobiology." Chapter 14 Retrieved 30 May 2008, from http://www-naweb.iaea.org/nahu/dmrp/pdf_files/Chapter14.pdf.

Unak, P. (2002). "Targeted Tumor Radiotherapy." Brazilian Archives of Biology and Technology 45: 97-110.

Wikipedia. (2008). "Centríolos." Retrieved 30 Maio 2008, from http://pt.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADolo.

http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf

http://www-naweb.iaea.org/nahu/dmrp/pdf_files/Chapter14.pdf

http://pt.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADolo

análise dos efeitos terapêuticos dos electrões de auger em...

Documents