produção e controle de antibioticos
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Universidade Federal de Juiz de ForaFaculdade de Farmácia
Departamento Farmacêutico
Garantia de QualidadeProfessora Célia Hitomi
Produção e Controle de Qualidade de Antibióticos
Alexandre PóvoaFelipe Vargas
Israel FortunatoJordana Abreu
INTRODUÇÃO
Até antes do século passado, o homem se depara com minúsculos
indivíduos os quais, até então,consideravam-se um tanto quanto invencíveis,
sem passível poder de cura. Estes indivíduos , conhecidos hoje em dia como
Microorganismos, acompanham nossa evolução durante toda a história da
humanidade.
Com o desenvolvimento da sociedade, de iniciativas sociais e de
saneamento e de combate à alta taxa de mortalidade relacionado ao período
da evolução histórica, o homem passa a se interessar e tentar combater o
agente causador dessas enfermidades. Neste breve trabalho, abordaremos um
dos principais agente causadores de calamidades e complicações hospitalares
observadas nos dias de hoje, as Bactérias.
A Descoberta.
Alexander Fleming nasceu em Lochfield, no sudoeste da Escócia, e
estudou medicina na Universidade de Londres. Concluindo o curso em 1906,
começa a pesquisar, em seguida, substâncias com potencial bactericida que
não fossem tóxicas ao organismo humano. Trabalhou como médico
microbiologista no Hospital de St. Mary, Londres, até o começo da Primeira
Guerra Mundial. Durante a guerra foi médico militar nas frentes de batalha da
França e ficou impressionado pela grande mortalidade nos hospitais de
campanha causada pelas feridas de arma de fogo que resultavam em
gangrena gasosa. Finalizada a guerra, regressou ao Hospital St. Mary onde
buscou intensamente um novo anti-séptico que evitasse a dura agonia
provocada pelas infecções durante a guerra
Os dois descobrimentos de Fleming ocorreram nos anos 20 e ainda que
tenham sido acidentais demonstram a grande capacidade de observação e
intuição deste médico britânico. O descobrimento da lisozima ocorreu depois
que o muco de seu nariz, procedente de um espirro, caísse sobre uma placa de
cultura onde cresciam colônias bacterianas. Alguns dias mais tarde notou que
as bactérias haviam sido destruídas no local onde se havia depositado o fluido
nasal.
Ele chegou à descoberta da penicilina e de suas propriedades antibióticas
em 1928, ao observar uma cultura de bactérias do tipo estafilococo e o
desenvolvimento do mofo a seu redor, onde as bactérias circulam livres. O
laboratório de Fleming estava habitualmente bagunçado, o que resultou em
uma grande vantagem para sua segunda importante descoberta.
Em Setembro de 1928, Fleming estava realizando vários experimentos
em seu laboratório e ao inspecionar suas culturas antigas antes de destruí-las
notou que a colônia de um fungo havia crescido espontaneamente, como um
contaminante, numa das placas de Petri semeadas com Staphylococcus
aureus. Fleming observou outras placas e comprovou que as colônias
bacterianas que se encontravam ao redor do fungo (mais tarde identificado
como Penicillium notatum) eram transparentes devido a uma lise bacteriana. A
lise significava a morte das bactérias, e no caso, das bactérias patogênicas
(Staphylococcus aureus) crescidas na placa.
A produção industrial começou nos Estados Unidos (EUA) no início da II
Guerra Mundial. Fleming, Florey e Chain recebem junto o Nobel de
Fisiologia/Medicina de 1945.
Os Antibióticos
Antibiótico é nome genérico dado a uma substância que tem capacidade de
interagir com micro-organismos unicelulares ou com seres pluricelulares que
causam infeções no organismo. Os antibióticos interferem com os micro-
organismos, matando-os ou inibindo seu metabolismo e/ou sua reprodução,
permitindo ao sistema imunológico combatê-los com maior eficácia.
O termo antibiótico tem sido utilizado de modo mais restrito para indicar
substâncias que atingem bactérias, embora possa ser utilizado em sentido
mais amplo (contra fungos, por exemplo). Ele pode ser bactericida, quando tem
efeito letal sobre a bactéria ou bacteriostático, se interrompe a sua reprodução
ou inibe seu metabolismo
Desde sua descoberta, os antibióticos foram amplamente utilizados,
reduzindo gradativamente a mortalidade global por infecções bacterianas
propriamente ditas, complicações cirúrgicas, ferimentos abertos e outras
enfermidades. Suas aplicações são variadas e seu universo muito extenso.
As principais classes de antibióticos estão resumidas no Esquema abaixo:
Inibidores Síntese da Parede Celular Bacteriana
A parede celular é um envoltório de proteção que reveste a membrana
celular bacteriana. Os antibióticos que agem sobre a síntese da parede celular
atuam produzindo uma parede com defeitos estruturais atuando sobre o
processo de replicação celular, e mostram-se seletivos, isto é, atuam apenas
sobre a bactéria e não sobre o hospedeiro pois as células dos mamíferos
nãopossuem parede celular.Neste grupo incluem-se as penicilinas e todos os
membros do grupo que possuam anel penicilâmico ou núcleos semelhante as
este, como o cefalosporínico (cefalosporinas, vancomicinas, ciclosserinas,
bacitracinas e ristocitina). As penicilinas e cefalosporinas, em sua maioria, são
mais ativas sobre Gram negativos que em Gram positivos, pois existem
diferenças químicas significativas na composição química da parede celular
destes germes, contudo existem exceções.Inclui também a vancomicina.
Afetam a Membrana Celular Bacteriana
A membrana possui a função de formar a parede celular, obstáculo à
entrada d’água, contém lipídios e proteínas carreadores de substâncias
necessárias à célula, além de possuir enzimas importantes ao metabolismo
celular. Qualquer interrupção destas funções da membrana causará danos à
célula.Estes antibióticos intervém no processo de respiração celular, inibindo a
fosforilação oxida-tiva e causam desorganização da membrana celular.
Bloqueiam a Síntese Protéica (translação)
Para que haja reprodução bacteriana é indispensável que ocorra, de modo
repetitivo, a união de aminoácidos que constituirão as inúmeras moléculas de
proteínas microbianas. Estas proteínas microbianas têm função estrutural e
enzimática.
A bactéria contém, no seu cromossomo, toda a informação genética
necessária à produção de enzimas que atuam na síntese de RNA (síntese
protéica). A interrupção, em qualquer ponto desta cadeia por bloqueio de
alguma função, susta o crescimento. Haverá, portanto, detenção do
crescimento e eliminação da célula bacteriana. Incluem: cloranfenicol,
tetraciclinas, macrolídeos (eritromicina, claritromicina e azitromicina) e
clindamicina.
Impedem a Replicação Cromossômica
Algumas drogas atuam inibindo a síntese (metabolismo) dos ácidos
nucléicos.Podem atuar no DNA parasitário, inibir a síntese do RNA, inibir o
ácido tetrahidrofólico ,alterar a estrutura do ácidos nucléicos parasitários, ou
reduzir a formação de nucleotídeos.
Enfoque acadêmico:
Neste estudo, para fins didáticos, iremos abordar com mais detalhes
apenas os Antibióticos chamados Beta Lactâmicos (Penicilinas e
Cefalosporinas), pois seus métodos de produção são bem descritos e de fácil
produção e acesso.
Penicilinas são antimicrobianos betalactâmicos, de origem natural ou
sintética, que, em conjunto, cobrem o tratamento específico da maioria das
infecções correntes. São bactericidas. Distribuem-se amplamente no
organismo, exceto no sistema nervoso central, exceto quando as meninges
estão inflamadas. Apresentam baixa toxicidade em doses terapêuticas e têm
possibilidade de uso em gravidez e lactação. Sua desvantagem é a indução de
reações de hipersensibilidade. No Brasil, investigar a história de alergia prévia
às Penicilinas é a forma mais eficaz para se prevenir a ocorrência de graves
reações de hipersensibilidade. Incluíram-se na Rename representantes de
quase todos os subgrupos das Penicilinas. Os principais antibióticos comerciais
desta classe são:
Amoxicilina é aminopenicilina de amplo espectro, com rápida absorção
digestiva, atingindo pico sérico mais alto e com menor latência. Ao contrário da
ampicilina, a absorção não é afetada pela presença de alimentos no estômago.
Além do tratamento de inúmeras infecções causadas por microorganismos
suscetíveis, também é o medicamento de escolha para profilaxia oral de
endocardite bacteriana.
Amoxicilina + clavulanato de potássio é associação que aumenta o
espectro, porque o ácido clavulânico inibe a betalactamase, enzima bacteriana
que cinde o anel betalactâmico, inativando a penicilina. A associação reduz a
resistência microbiana, ampliando o espectro de ação. Para não ser usada
abusivamente e por ter maior custo, ficou restrita para combate a infecções
causadas por bactérias resistentes a amoxicilina, especialmente Haemophilus
influenzae e Moraxella catarrhalis.
Ampicilina é aminopenicilina de amplo espectro, selecionada em forma
injetável para constituir uma alternativa ao uso de cefalosporinas de terceira
geração em infecções hospitalares por bacilos Gram-negativos aeróbios
multirresistentes. Não há sentido em usar a forma oral porque amoxicilina tem
absorção oral muito mais completa, atingindo mais rapidamente o pico sérico.
Benzilpenicilina ou penicilina G aparece em forma cristalina (sal
potássico) que é uma solução pura para uso intravenoso. Sua associação com
procaína e benzatina apresenta-se como suspensão para uso intramuscular,
tendo duração de ação de 18-24 horas e 28 dias, respectivamente. A penicilina
G é suscetível à inativação causada por betalactamases bacterianas. Também
sofre inativação por ácido gástrico, o que determina o uso injetável.
Oxacilina sódica, sendo uma isoxazolilpenicilina, é resistente à
penicilinase, podendo ser usada em infecções por estafilococos a ela
sensíveis. Mesmo a ela pode surgir resistência adquirida, especialmente com
estafilococos meticilina (MRSA) ou oxacilina (ORSA) resistentes. Infecções por
S. aureus ou S. epidermidis com essa característica têm que ser tratadas com
outras alternativas.
Cefalosporinas constituem outro grupo de antibióticos beta lactâmicos,
usualmente classificado em gerações, de acordo com o momento em que
foram sintetizados, apresentando diferenças de espectro decorrentes de
modificações nas cadeias laterais da estrutura básica que contém o anel 7-
amino-cefalosporânico. São agentes bactericidas, com o mesmo mecanismo
de ação das penicilinas. Apresentam baixa toxicidade, podendo ser usadas em
gravidez e lactação. Reações alérgicas são similares às das penicilinas, porém
ocorrem com menor freqüência (5% dos casos). Por isso, são substitutivos
destas em pacientes com reações de hipersensibilidade tardias. Ao contrário,
devem ser evitadas nos que têm história de reações imediatas graves, como
angioedema e anafilaxia. Outra característica consiste em serem ativas contra
S. aureus produtores de penicilinase (MRSA).
Cada categoria de Cefalosporinas apresenta predominante atividade
antimicrobiana contra determinadas bactérias. Assim, as de primeira geração
são as mais ativas contra cocos aeróbios Gram positivos (estreptococos do
grupo B, S. viridans) e atuam contra Staphylococcus aureus oxacilina-
resistentes. Não têm atividade anaerobicida significativa.
Dentre elas selecionaram-se cefalexina (oral), cefalotina (injetável) e
cefazolina (injetável) com a finalidade de limitar o abuso de Cefalosporinas de
largo espectro em infecções que podem ser debeladas com os representantes
de primeira geração. Vantagens adicionais são baixo custo e retardo no
desenvolvimento de resistência bacteriana. As de segunda geração têm maior
eficácia contra Microorganismos aeróbios Gram negativos e anaeróbios. No
entanto, são fortes indutoras de betalactamases e já sofrem resistência de
Bacteroides fragilis. Por essa razão, não precisam ser selecionadas, pois
metronidazol e gentamicina são alternativas cabíveis.
Os agentes de terceira geração apresentam maior atividade contra
aeróbios Gram negativos multirresistentes e pseudomonas. Ceftriaxona tem a
vantagem de duração mais longa que permite uma administração diária.
Cefotaxima é indicada em lactentes porque tem excreção extra-hepática que
prescinde da maturidade do fígado. Ceftazidima é considerada agente
pseudomonicida. Cefepima, agente de terceira ou quarta geração conforme
diferentes autores têm espectro similar ao de Cefalosporinas de terceira
geração e a mesma eficácia clínica de ceftazidima contra Pseudomonas
aeruginosa, por isso não sendo selecionada. O uso desmedido de cefepima e
ceftazidima em hospitais induz resistência bacteriana e seleciona
enterorococos resistentes à vancomicina, não responsivos à terapia em curso.
Cefalexina é usada no tratamento de infecções de pele e tecidos moles
causadas por Microorganismos sensíveis em pacientes ambulatoriais que
desejam a comodidade da via oral, ou naqueles que apresentam
hipersensibilidade tardia às penicilinas. Embora outras Cefalosporinas orais
tenham igual eficácia, cefalexina tem menor custo. Também é recomendada
para profilaxia oral de endocardite bacteriana em pacientes hipersensíveis às
penicilinas. Em revisão sistemática de 20 estudos (n = 2.042), encontraram-se
dois em que cefalexina foi comparada a cefdinir no tratamento de infecção de
pele, sendo os resultados similares. Em 10 estudos (n = 1.052), cefalexina
mostrou eficácia consistente em todos eles. Em 3 ensaios (n = 197), cefalexina
foi superior a outros fármacos e, em 5 (n = 608), teve menos taxa de sucesso
do que outros antibióticos. Em profilaxia, dois estudos mostraram menores
taxas de infecção após cefalexina, em comparação a placebo e ausência de
uso. Em um estudo (n = 50), cefalexina não foi significativamente diferente do
não-uso profilático.
Cefazolina é usada na profilaxia de infecções após cirurgias limpas ou
limpocontaminadas (cesarianas histerectomias e correção de fraturas
fechadas, por exemplo). Quando comparada a outros antibacterianos
(levofloxacino, ciprofloxacino, ceftriaxona, teicoplanina etc.), não mostra
diferença significativa na maioria das comparações. Como tem meia-vida mais
longa que a da cefalotina, permite uma só administração intra-operatória em
procedimentos que duram até 4 horas. Apresenta eficácia microbiológica,
segurança e custo adequado, fazendo com que seja o fármaco de escolha em
50% dos protocolos americanos. Deve ser reservada para a quimioprofilaxia
para diminuir a possibilidade de resistência microbiana a ela. Assim, as
infecções hospitalares sensíveis a Cefalosporinas de primeira geração devem
ser tratadas com cefalotina, estratégia que se justifica pela minimização da
seleção de organismos resistentes.
Cefalotina serve para tratamento das infecções de pele e de tecidos
moles causadas por bactérias Gram positivas e negativas. Seu uso ficou
restrito ao tratamento de infecções hospitalares por microorganismos
susceptíveis para preservar o emprego de cefazolina para quimioprofilaxia
cirúrgica.
Cefotaxima é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para
tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes em neonatos,
porque não interfere com o metabolismo da bilirrubina, mesmo numa fase de
imaturidade dos sistemas hepáticos de biotransformação.
Ceftazidima é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para
tratamento de infecções causadas por pseudomonas e enterobacteriáceas
multirresistentes. Como pseudomonicida foi selecionada em função de menor
custo em comparação com piperacilina/tazobactam e igual eficácia em relação
à cefepima. Quando se associam ceftazidima e um aminoglicosídeo, a eficácia
é similar à de piperacilina/tazobactam.
Ceftriaxona é cefalosporina de terceira geração, com uso restrito para
tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes e (ou)
tratamento empírico de meningites. Uso restrito para tratamento em dose única
de infecções por Neisseria gonorrhoeae.
PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS
Produção de penicilinas
As penicilinas são produzidas por muitos fungos, particularmente espécies de
Penicillium e Apergillus, mostrando-se eficazes contra numerosas bactérias gram-positivas.
Os antibióticos β-lactâmicos causam rompimento gradativo das células bacterianas,
pois são inibidores específicos da síntese da parede celular. Um ponto adicional de ataque
dos antibióticos β–lactâmicos parece envolver a síntese de fosfolipídios, a nível molecular.
A) Estrutura química
A estrutura básica das penicilinas é o ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), que consiste
em um anel tiazolidínico com um anel -lactâmico condensado.
Se a fermentação da penicilina é conduzida sem a adição de precursores da cadeia
lateral, produzem-se as penicilinas naturais. Adicionado-se como precursor o ácido
fenoxiacético conduziremos à formação de penicilina V. Utilizando ácido fenilacético, será
produzida penicilina G. Estes dois últimos tipos constituem a escolha para a síntese
comercial.
B) Desenvolvimento de cepas
O uso da tecnologia do DNA recombinante para aumentar a formação de enzimas que
sejam passos limitantes, mediante a amplificação gênica ou melhora da transcrição, pode
contribuir para a otimização da síntese.
Para este fim, é necessário construir um banco de genes para P.chrysogenum
através de screening para o conhecimento de dados precisos acerca de biossíntese e
sistemas vetor-hóspede
C) Processos de fermentação
A penicilina G e a penicilina V são produzidas utilizando processos submersos em
fermentadores de 40.000 - 200.000 litros, a fim de garantir uma aeração efetiva. A faixa de
temperatura ótima é de 25 - 27ºC, e o pH é mantido a 6,5. O meio deve ainda conter fontes
de carbono como a lactose, nutrientes e precursores.
Os esporos são inoculados na concentração de 5.103/m3. Na fermentação típica de
penicilina há uma fase de crescimento de aproximadamente 40 horas, com um tempo de
duplicação de 6 horas, durante o qual se forma a maior parte da massa celular.
Alimentando o meio com diferentes componentes, a fase de produção pode estender-
se até 120-160 horas. O sistema de “enche e retira” pode ser utilizado para aumentar a
eficiência do processo. Nesse processo, 20-40% do conteúdo da fermentação é retirado e
alimentado novamente com solução fresca de nutrientes. Recomenda-se repetir no máximo
dez vezes.
Produção de cefalosporinas
As cefalosporinas são extraídas de culturas de Cephalosporium acremonium. São
avaliadas não só devido à sua baixa toxidade, mas também devido ao fato de que são
antibióticos de amplo espectro, comparáveis em ação à ampicilina.
A)Desenvolvimento de cepas
O desenvolvimento de cepas tem sido realizado com a cepa original de Brotzu,
C.acremonium, utilizando mutação, seleção e técnicas parassexuais. Tem-se isolado
mutantes com metabolismo resistente ao enxofre, por possuírem maior produção.
As técnicas de fusão de protoplastos têm sido combinadas com reprodução
parassexual para desenvolver um mapa completo dos genes de biossíntese de
cefalosporina.
B)Processos de produção
A fermentação das cefalospirinas é similar à da pelicilina. Seus meios de cultivo são
mais complexos, podendo constituir-se de líquido de maceração de milho, extrato de carne,
sacarose, glicose e acetato de amônio
Sua produção requer maior velocidade de aeração, e sua fase de produção dura entre
48 e 160 horas. Pode ser produzida também por expansão do anel da penicilina.
CONTROLE DE QUALIDADE
1.Ensaio microbiológico de antibióticos pelo método de difusão em Agar,
utilizando cilindros
Determinase a potência ou atividade de um produto contendo antibiótico
comparando a dose que inibe o crescimento de um microorganismo susceptível em rela-
ção à dose de uma substância padrão ou preparação biológica de referencia do
antibiótico que produz inibição similar.
2.Unidade internacional e preparação padrão
Unidade Internacional é a atividade específica contida em uma quantidade (massa) de
Padrão Biológico Internacional ou Preparação de Referência Biológica Internacional. A
quantidade equivalente de unidades para uso internacional é estabelecida, sempre que
necessário, pela Organização Mundial da Saúde.
Substâncias Químicas de Referência Internacional não apresentam unidades de
atividade biológica definidas. Quando são necessários ensaios biológicos, a potência desses
produtos é em termos de massa equivalente à da substância pura.
O número de unidades, ou a massa equivalente da substância pura, em microgramas,
contidos em 1 mg de substância antibiótica, está indicado na monografia de cada um dos
produtos inscritos na Farmacopeia.
Para os ensaios microbiológicos registrados na Farmacopeia, Preparações Padrão
(Padrões Primários) são os Padrões Internacionais e Preparações de Referência
estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde e pela Farmacopeia Europeia ou os
Padrões e Preparações de Referência brasileiros. Outras preparações adequadas, de uso
internacional corrente, nas quais a potência tenha sido determinada em relação às
preparações padrão da Organização Mundial da Saúde, possuem valor legal idêntico.
Recomenda-se que sejam preparados e empregados padrões de trabalho
(secundários); todavia, é imprescindível que a potência tenha sido determinada por número
adequado de ensaios comparativos em relação a um padrão primário ou farmacopeico,
validados por análise estatística apropriada e que os dados e resultados sejam arquivados à
disposição da fiscalização competente por prazo idêntico ao da validade dos produtos
ensaiados.
Para o ensaio de lotes de substâncias antibióticas para as quais existam Preparações
Padrão nacionais, referendadas por organizações internacionais, é obrigatório o uso dessas
preparações.
3.Soluções
Solução 1 (tampão fosfato de potássio a 1%, estéril. pH 6,0)
Solução 2 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 8,0)
Solução 3 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 4,5)
Solução 4 (tampão fosfato de potássio a 10%, estéril, pH 6,0)
Solução 5 (tampão fosfato de potássio 0,2 M, estéril, pH 10,5)
Solução 6 (ácido clorídrico metanólico 0,1 M)
Solução 7 (solução de álcool isopropílico a 80%)
Solução 8 (tampão fosfato de potássio 0,1 M, estéril, pH 7,0)
4.Meios de cultura
Podem ser empregados meios de cultura desidratados, disponíveis no comércio que, ao
serem reconstituídos com água purificada, conforme as especificações do fabricante,
possuem a mesma composição que o meio produzido com os ingredientes individualmente
indicados para sua obtenção.
5.Preparação do inoculo
Micro-organismos recomendados
• Staphylococcus aureus (ATCC 6538p) • Micrococcus luteus (ATCC 7468) • Kocuria
rhizophila (ATCC 9341) • Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) • Saccharomyces
cerevisiae (ATCC 9763)
• Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617) • Bacilius cereus var. mycoides (ATCC 11778)
• Bacillus subtilis (ATCC 6633) • Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) • Escherichia coli
(ATCC 10536) • Enterococcus hirae (ATCC 10541) • Micrococcus luteus (ATCC 10240) •
Microsporum gypseum (ATCC 14683) • Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601) •
Micrococcus luteus (ATCC 14452) • Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619) •
Mycobacterium smegmatis (ATCC 607)
Com a finalidade de indicação, foram listados os micro- organismos disponíveis na
ATCC. Os mesmos micro- organismos podem, também, ser obtidos de outras fontes: INCQS,
CIP, NBRC, NCIMB, NCPF, NCTC, NCYC, IMI e IP. A correspondência entre os micro-
organismos e os endereços das entidades que os fornecem encontram-se indicadas em
Micro-organismos empregados em testes e ensaios
6.Dessecação de substâncias antibióticas
Utilizar para dessecação dos padrões, os procedimentos indicados na Farmacopeia
5ed., e recomendados de acordo com as informações descritas nas Tabelas 2 em 5.5.3.3.1 e
5.5.3.3.2 da mesma Farmacopeia
7.Procedimento
Para cada antibiótico relacionado na Tabela 1, verificar o meio de cultura (conforme a
relação dos meios de cultura), a quantidade de meio a ser usada na camada base e na
camada inoculada e o micro-organismo de ensaio. O volume de inóculo a ser adicionado a
cada 100 mL de meio de cultura deve ser determinado experimentalmente.
Entretanto, como referência inicial, sugere-se quantidade de inóculo a ser adicionada
por 100 mL de meio.
Preparar a camada base por meio da adição de quantidade apropriada de ágar fundido
nas placas de Petri as quais devem ser, especialmente selecionadas, ter fundo plano, possuir
dimensões de 20 x 100 mm e tampa de material apropriado. Distribuir o ágar uniformemente
nas placas, que devem ser colocadas em superfície nivelada para que a camada de meio
tenha profundidade uniforme. Colocar a tampa de cada placa ao lado dessa; se for utilizada
tampa não porosa, deixá-la levemente entreaberta para evitar o acúmulo de umidade
condensada a partir da camada de ágar quente. Após o endurecimento do ágar, tampar as
placas. Para preparar a camada inoculada - superfície, adicionar o volume de inóculo
determinado para a quantidade apropriada de meio de cultura que tenha sido fundido e
resfriado entre 46 oC e 48 oC. Agitar o frasco, por rotação, para obter suspensão homogênea
e adicionar a quantidade indicada do meio inoculado em cada placa de Petri, contendo a
camada base não inoculada. Espalhar uniformemente a camada, tampar as placas e permitir
o seu endurecimento sobre superfície plana. Após o endurecimento do meio, colocar seis
cilindros de aço inoxidável, com diâmetro externo de 8 mm ± 0,1 mm, diâmetro interno de 6
mm ± 0,1 mm e comprimento de 10 mm ± 0,1 mm, sobre a superfície do ágar inoculado, de
maneira que formem entre si ângulo de 60o e com raio de 2,8 cm. Também, podem ser
utilizados cilindros confeccionados em vidro, porcelana ou alumínio e esterilizados nas
condições já descritas. Em lugar dos cilindros, podem ser perfurados, no meio, com furador
estéril, poços de 5 a 8 mm de diâmetro. Podem, ainda, ser usados discos de papel,
confeccionados com papel de qualidade apropriada ou moldes de aço inoxidável. Quando
são usados discos de papel, estes devem ser estéreis.
8.Preparação da solução padrão, da amostra e da curva padrão
A preparação das amostras dos antibióticos está indicada na respectiva monografia.
As concentrações do antibiótico utilizadas no ensaio devem estar em progressão
geométrica; por exemplo, pela preparação de séries de diluição na razão 2:1 ou outra
determinada experimentalmente desde que seja comprovada a relação linear entre o
logaritmo da concentração do antibiótico e o diâmetro do halo de inibição.
Na Tabela 2 está indicada para cada antibiótico, a preparação da solução padrão de
trabalho e da curva padrão, compreendendo:
a) condições de dessecação, conforme descrito no item Dessecação de substâncias
antibióticas (5.5.3.3);
b) solvente inicial para dissolução do antibiótico, caso seja necessário, e até qual
concentração é usado;
c) solução para diluição até a concentração de trabalho, conforme descrito em
Soluções;
d)concentração da solução de trabalho, expressa em peso, ou Unidades Internacionais
por mL de solução;
e) prazo de validade da solução padrão de trabalho sob refrigeração;
f) solução empregada para diluição da solução de trabalho, por ocasião da preparação
da curva padrão, conforme Soluções;
g) faixasdeconcentraçãosugeridas,empesoouUnidades Internacionais por mL, dentro
das quais podem ser encontradas as concentrações adequadas para a curva padrão.
9.Procedimento para delineaento de retas (3x3 ou 2x2)
Empregar, no ensaio, pelo menos seis placas de Petri. Dispor as soluções do padrão e
amostra, em cada placa, com 3 concentrações para ensaio 3 x 3 (baixa, média e alta) ou 2
concentrações para ensaio 2 x 2 (baixa e alta). As soluções devem ser distribuídas de tal
forma que as soluções da preparação padrão e amostra estejam alternadas na camada
inoculada (concentração alta e baixa) para evitar a sobreposição dos halos de inibição.
10.Procedmento para delineamento 5x1
Para a curva padrão, utilizar um total de 12 placas, 3 para a concentração média da
curva (P3) que é incluída em todas as placas. Em cada conjunto de 3 placas, utilizar 3
cilindros para a concentração média (P3) e alternar 3 cilindros para a concentração baixa
(P1) e assim sucessivamente com as demais soluções do padrão. Dessa maneira, obtém-se
36 halos de inibição para a concentração (P3) e 9 halos de inibição para cada uma das
outras quatro concentrações da curva.
Para cada amostra, empregar 3 placas, onde serão colocados 3 cilindros para a
concentração média do padrão (P3) e 3 com a solução da amostra preparada na mesma
concentração do padrão (A3).
Aplicar 0,2 mL das soluções nos cilindros ou nos moldes de aço inoxidável por meio de
pipeta ou outro instrumento calibrado. Quando for usado o sistema de poços, o volume de
líquido aplicado deve ser suficiente para enchê-los completamente.
Após realizar os procedimentos adequados para o delineamento escolhido, incubar as
placas na temperatura indicada, cuja variação não deverá exceder ± 0,5 °C, durante um
período de 16 a 18 horas. Em seguida, medir o diâmetro dos halos de inibição empregando
dispositivo adequado para medida, como paquímetro, ou projetor óptico que tenha precisão
de 0,1 mm ou menos.
Para alguns micro-organismos, o procedimento pode ser melhorado se as placas
preparadas permanecerem à temperatura ambiente por período de 30 minutos a 2 horas
antes da incubação, período em que ocorre a difusão do antibiótico para o meio.
Tabelas referidas presente em Farmacopeia Brasileira 5ed., 2010, pag 266 – 269.
(Tabelas 1 e 2).
11.Ensaio iodométrico de antibióticos
Este ensaio iodométrico de antibiótico destina-se ao doseamento de fármacos
antibióticos penicilâmicos e de seus produtos farmacêuticos elaborados, para os quais a
titulação iodométrica é particularmente adequada.
12.Preparação da amostra
Dissolver quantidade adequada, exatamente pesada, da substância química de
referência (SQR), previamente dessecada, especificada na monografia individual, utilizando o
solvente descrito na Tabela 1 ou conforme descrito na monografia. Diluir, quantitativamente,
com o mesmo solvente, de modo a obter solução com concentração final conhecida,
especificada na Tabela 1 ou conforme descrito na monografia. Transferir 2,0 mL desta
solução para erlenmeyer de 250 mL com tampa.
13.Preparação da amostra
A menos que especificado de outra forma na monografia individual, dissolver
quantidade adequada, exatamente pesada, da amostra, utilizando o solvente descrito na
Tabela 1. Diluir, quantitativamente, com o mesmo solvente, de modo a obter solução com
concentração final conhecida, especificada na Tabela 1. Transferir 2,0 mL desta solução para
erlenmeyer de 250 mL com tampa.
14.Procedimento
Inativação e titulação
A cada erlenmeyer contendo, respectivamente, 2,0 mL das preparações padrão e
amostra, adicionar 2 mL de hidróxido de sódio 1,0 M, homogeneizar com movimentos
circulares e deixar em repouso por 15 minutos. Adicionar 2 mL de ácido clorídrico 1,2 M, 20,0
mL de iodo 0,005 M SV, tampar imediatamente e deixar em repouso por 15 minutos. Titular
com tiossulfato de sódio 0,01 M SV. Próximo ao ponto final da titulação, adicionar 3 gotas de
amido SI e prosseguir com a titulação até desaparecimento da cor azul.
15.Ensaio em branco
Adicionar 20,0 mL de iodo 0,005 M SV a cada erlenmeyer contendo 2,0 mL da
preparação padrão. Se a preparação padrão contiver amoxilina ou ampicilina, adicionar
imediatamente 0,1 mL de ácido clorídrico 1,2 M. Titular com tiossulfato de sódio 0,01 M SV.
Próximo ao ponto final da titulação, adicionar 3 gotas de amido SI e prosseguir com a
titulação até desaparecimento da cor azul. Proceder de forma similar para erlenmeyer
contendo 2,0 mL da preparação amostra.
16.Cálculos
Calcular o fator de equivalência (F), em microgramas ou Unidade, para cada mililitro de
tiossulfato de sódio 0,01 M SV consumido pela preparação padrão segundo a equação:
Em que:
Cp = concentração, em mg/mL, da substância química de referência na preparação
padrão; Pp = potência, em μg/mg ou Unidades/mg, da substância química de referência;
Vb = volume do titulante, em mL, consumido em Ensaio em branco; Vi = volume do
titulante, em mL, consumido em Inativação e titulação.
CONCLUSÃO
O controle de qualidade de medicamentos contendo antibióticos é de suma importância,
não apenas para aperfeiçoar e avaliar os processos de produção, mas principalmente para
assegurar os padrões de qualidade que garantem a eficácia e a segurança dos
medicamentos à população. Desta forma, a disponibilidade de metodologias analíticas
confiáveis, rápidas, e baixo custo são extremamente importantes. Para tanto, órgãos oficiais
como Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Farmacopéias (de diferentes
países) e o Food and Drug Administration (FDA - USA) determinam e orientam parâmetros a
serem adotados pelas indústrias farmacêuticas, principalmente, aqueles relacionados aos
métodos de análise necessários para o controle de qualidade das diferentes formulações.
REFERÊNCIAS
MORELL, V. "Resistência aos antibióticos: Estrada de Não Retorno." Science 278
(24 de outubro de 1997): 575-576.)
SUZANA, D. B. MALUHY, C. V.; COIMBRA, M. C.; Paulo Cilas Rubio - Biotecnologia -
Editora: Do Brasil
LIMA, U. A.; AQUARONE, E. BORZANI W. SCHMIDELL, W. -Biotecnologia
industrial, volume 3 –editora Edgard Blucher – 1ªedição – 2001 - São Paulo.
PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A. Controle biológico de qualidade de
produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 2a. Ed. São Paulo: Atheneu
Editora São Paulo, 2010.
Farmacopéia Brasileira. 5a ed., Brasilia: Anvisa, 2010.
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