1

1º - Padrões externos

É a forma mais utilizada de calibração. São utilizadas soluções contendo concentrações conhecidas do analito.

Formas de calibração

Os padrões são considerados “externos” pois são preparados e analisados separadamente das amostras.

Normalmente são utilizados soluções com concentrações crescentes do padrão do analito e correlacionando-se a resposta instrumental com a concentração, se obtêm uma curva de calibração.

2

Formas de calibração

• A curva de calibração pode ser linear (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função linear) ou polinomial (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função polinomial).

Curva de calibração Curva de calibração

linear não linear

3

Formas de calibração• A curva linear é mais adequada pois apresenta a mesma sensibilidade para toda a faixa de calibração. Nas curvas não lineares, a sensibilidade é função da concentração.

• Um método espectrofotometrico para a determinação quantitativa de Pb2+ em sangue forneceu uma curva de calibração linear com a seguinte equação:

Y = 0.296 X + 0.003

Sabendo que a curva foi construída na faixa de ug/L, qual a concentração de Pb em uma amostra que apresentou uma absorbância de 0.397?

Exemplo

4

Formas de calibraçãoLimitação da curva de calibração normal

• A relação entre a resposta instrumental (Spadrão e Cpadrão) é

determinada quando o analito está presente na matriz da solução padrão que pode ser diferente da matriz da amostra.

• Quando se utiliza a curva de calibração normal, assumimos que qualquer diferença entre a matriz dos padrões e a matriz da amostra não afeta a inclinação da curva (sensibilidade).

• Um erro proporcional determinado é introduzido quando as diferenças entre as duas matrizes afetam a sensibilidade, como ilustrado na figura.

5

Formas de calibração

Para se avaliar se as diferenças entre as inclinações das curvas são significativas, pode se aplicar os testes estatísticos F e t.

6

Formas de calibração

• Quando o efeito de matriz é esperado e a matriz da amostra é conhecida, pode-se realizar uma curva por ajuste de matriz (matrix matching).

• Neste método de calibração, a matriz da amostra é adicionada nos padrões de calibração de modo a se compatibilizar a matriz e minimizar os erros.

Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste de matriz, pois muitas vezes é difícil obter a matriz sem o analito.

7

Formas de calibração

2º - Adição de padrão

• É uma forma de calibração muito utilizada quando se tem efeito de matriz e não é possível realizar o ajuste de matriz.

• Neste método de calibração, quantidades conhecidas do analito são adicionadas a balões contendo volumes fixos da amostra. Posteriormente, o volume do balão é completado com um diluente adequado (água, ácidos diluídos, solventes orgânicos, etc.)

• As respostas instrumentais são obtidas para cada uma das soluções e se obtém a relação linear entre a quantidade de analito adicionada e a resposta instrumental.

8

Formas de calibração

2º - Adição de padrão

Exemplo do preparode uma curva de

calibração por adições de padrão

9

Formas de calibração

2º - Adição de padrão

• Cuidados

• Deve-se ter uma idéia da concentração do analito na amostra para se definir a alíquota da amostra a ser tomada e as adições do padrão que serão realizadas.

• A faixa linear da técnica de medida deve ser respeitada, ou seja, a soma da concentração do analito na amostra e da adição do padrão no último ponto deve ser menor que limite da faixa linear.

10

Formas de calibração2º - Adição de padrão

• Cálculo

Extrapolação no gráfico

ouUtilizar a equação linear e calcular x

quando y = 0

11

Formas de calibração

2º - Adição de padrão

• Como a curva de calibração por adição de padrão é construída na amostra, ela não pode ser estendida para a análise de outras amostras. Desta forma, para cada amostra deve-se construir uma curva de calibração. Este fato dificulta a aplicação deste método de calibração para análises de rotina, onde um grande número de amostras precisa ser analisado.

• O método de adições de padrão pode ser utilizado para checar a validade da curva de calibração por padrões externos (avaliação do efeito de matriz).

12

Formas de calibração3º - Padrão Interno O sucesso da utilização dos métodos de calibração com padrões internos e de adições de padrão depende da habilidade do analista manusear amostras e padrões reprodutivelmente e da estabilidade do equipamento.

• Quando o procedimento não pode ser controlado de forma que todas as amostras e padrões são tratados igualmente, a exatidão e precisão do método podem ser comprometidos.

• Nos casos onde o processo analítico não é reprodutível, a padronização é possível se o sinal do analito for referenciado ao sinal gerado por outra espécie que foi adicionada em concentração fixa e conhecida em todos os padrões e amostras.

• A espécie adicionada é chamada de padrão interno e deve ser essencialmente diferente do analito.

13

Formas de calibração

3º - Padrão Interno

14

Formas de calibração3º - Padrão Interno• Desde que o analito e o padrão interno em qualquer amostra ou

padrão recebem o mesmo tratamento e estão sujeitos as mesmas variações, a razão dos sinais não será afetada.

• Se uma solução contem um analito de concentração CA e um padrão

interno de concentração CPI, então o sinal devido ao analito, SA, e ao

padrão interno, SPI, são: SA = kACA e SPI = kPICPI

Sendo kA e kPI, as sensibilidades do analito e do padrão internoPara se facilitar a aplicação do padrão interno, plota-se a curva de calibração relacionando-se a razão sinal do analito (SA)/sinal do padrão interno (SPI) X a concentração do analito (CA)

Para se obter a concentração do analito na amostra, basta utilizar a razão sinal do analito na amostra/sinal do padrão interno e jogar na equação da curva de calibração.

15

Formas de calibração

3º - Padrão InternoCaracterísticas desejáveis:

• Ter comportamento semelhante ao do analito de interesse, de forma a estar sujeito as mesmas interferências e flutuações que o analito.

• Ser detectado simultaneamente ao analito (técnicas multielementares) e ter sinal distinto do sinal do analito. • Idealmente não estar presente na amostra (adiciona-se uma quantidade conhecida e constante) em todas as soluções (brancos, padrões, amostras).

16

Exemplo

• Na determinação de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina foi utilizada como padrão interno. Os dois compostos apresentam tempos de retenção distintos. Os resultados obtidos para a curva de calibração, branco e amostra são apresentados abaixo:

Amostra Conc. Analito (mg/L)

Área Conc. PI (mg/L) Área

Branco 0 216 1,0 50289 Padrão 1 0,05 4529 1,0 48370 Padrão 2 0,10 11312 1,0 52360 Padrão 3 0,25 18659 1,0 42390 Padrão 4 0,50 43269 1,0 46350 Padrão 5 1,0 98562 1,0 53240

Branco amostra - 515 1,0 47235 Amostra - 63917 1,0 56759

17

Métodos espectrométricos e cromatográficosFormas de calibração

1º - Padrões externos

Concentração (crescente) x Resposta Instrumental

2º - Padrões internos

C

R I

Curva de calibração

Curva de calibração com adição de matriz

Curva com ajuste de matriz

Inclinações das curvas avaliadas pelos testes estatísticos F e t.

Tcalc < Ttab as médias não diferem

Tcalc > Ttab as média diferem

Adição de Padrão

Quando não existir matriz sem o analito

Estratégia para melhorar a exatidão e precisão

PI adicionado em todas as soluções (brancos, padrões, amostras)

Resumo

18

Parâmetros para calibração• Coeficiente de correlação – utilizado para

estimar o ajuste dos pontos experimentais à linha que é utilizada para estabelecer a relação linear.

i iii

ii

i

yyxx

yyxxr

2/122 ])(][)({[

)])([(

-1 ≤ r +1

19

Exemplos

R = 1

0

2

4

6

8

10

12

14

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Concentração

Res

po

sta

inst

rum

enta

l R = -1

0

2

4

6

8

10

12

14

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

concentração

Res

po

sta

inst

rum

enta

l

R = 0.3865

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6

Concentração

Resp

osta

in

str

um

en

tal

Em química analítica normalmente se trabalha com valores de r > que 0,99 (em módulo)

20

Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados

• Modelo simplificado:– Assume-se que as quantidades ou concentrações das

amostras de calibração são tomadas como “verdadeiras” e isentas de erro, ou então admite-se que os erros aleatórios de x são desprezíveis em relação aos de y. Nessas condições, deve-se usar a função de calibração:

y = Bx + Axx + ey

- Assume-se que os erros (s) são constantes em todos os pontos da calibração (Homoscedasticidade)

21

22

Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados

Calcula-se:

• A inclinação: A = Qxy/Qxx

• O intercepto: B = y – Ax• O desvio padrão da regressão (desvio

dos resíduos):

2/)( 2 NQAQS xxyyr

23

Calculando os termos:

N

xxxxiQ iixx

222 )(

)(

N

yyyyiQ iiyy

222 )(

)(

N

yxyxyyixxiQ iiiixy ))((

24

• Desvio padrão da inclinação:

• Desvio padrão do intercepto:

xx

rA

Q

sS

222 )(/)( iiirB xxNxsS

Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados

25

Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados

• Os desvios padrão podem ser utilizados para estabelecer o intervalo de confiança que contem a verdadeira inclinação e o verdadeiro intercepto:

βA = A ± tsA

βB = B ± tsB

Podem ser utilizados também para comparar curvas no estudo de efeito de matriz.

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Calculando...xi yi yi

2 xyi xi2

0 2,1 4,410 0

2 5 2510 4

4 9 8136 16

6 12,6 158,875,6 36

8 17,3 299,3138,4 64

10 21 441210 100

12 24,7 610,1296,4 144

xi = 42 yi = 91,7 yi2

=1619,6xiyi =

766,4

(xi2) = 364

28

Calculando....

N

yxyxyyixxiQ iiiixy ))((

N

xxxxiQ iixx

222 )(

)(

N

yyyyiQ iiyy

222 )(

)(

i iii

ii

i

yyxx

yyxxr

2/122 ])(][)({[

)])([(

29

Pelo Excel....

y = 1,9304x + 1,5179

R2 = 0,9978

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14

Série1

Linear (Série1)