calibraÇÃo pipeta

Gerente-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e ProdutosAntnio Carlos da Costa Bezerra

Coordenao de Inspeo em Centros de BioequivalnciaCludia Franklin de Oliveira

E-mail: [email protected]

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Manual de Boas Prticas emBiodisponibilidade

Bioequivalncia

Volume II

Braslia2002

Direitos reservados da Agncia Nacional de Vigilncia SanitriaSEPN 515, Edifcio mega, Bloco B, Braslia (DF), CEP 70770-502.Internet: www.anvisa.gov.br

Copyright 2002. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.Permitida a reproduo total ou parcial desta obra, desde que citada a fonte.

1 edio - 2002

ISBN: 85-88233-06-1

Agncia Nacional de Vigilncia SanitriaRealizao: Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia - Gerncia-Geral deInspeo e Controle de Medicamentos e ProdutosCoordenao Geral: Cludia Franklin de Oliveira / Coordenao de Inspeo em Centros deBioequivalnciaReviso: Karla de Arajo Ferreira / Coordenao de Inspeo em Centros de BioequivalnciaDivulgao: Unidade de DivulgaoCapas: Joo Carlos de Souza Machado / Gerncia de Comunicao Multimdia

Diagramao, composio e impresso: Dupligrfica Editora Ltda./DF

Impresso no Brasil

Manual de boas prticas em biodisponibilidade: bioequivalncia/AgnciaNacional de Vigilncia Sanitria. Gerncia-Geral de Inspeo eControle de Medicamentos e Produtos. Braslia: ANVISA, 2002.

2 v.QV38

1. Equivalncia teraputica. 2. Bioequivalncia. 3. Disponibilidadebiolgica. 4 . Medicamentos. I. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.Gerncia-Geral de Inspeo e Controle de Medicamentos e Produtos.

PREFCIO

Atualmente se acham em execuo no Brasil inmeros estudos clnicos com o objetivo de avaliar aBiodisponibilidade/Bioequivalncia de produtos farmacuticos. A partir de junho de 2001, a Anvisa,por meio da Coordenao de Inspeo em Centros de Bioequivalncia ligada Gerncia-geral deInspeo e Controle de Medicamentos e Produtos , passou a avaliar estes centros em inspeesperidicas, a fim de garantir a qualidade dos estudos.

No decorrer das atividades de inspeo, que a princpio tinham carter orientativo, a coordenaoobservou a necessidade de esclarecer alguns pontos que restavam como dvidas tcnicas para oscentros, em especial a relativa padronizao de mtodos analticos, anlise estatstica dos estudos,armazenamento de amostras biolgicas, confinamento de voluntrios e estudos de estabilidade defrmacos, entre outros.

A partir da identificao desta necessidade, e buscando prevenir o comprometimento da qualidadedos trabalhos realizados, surgiu a iniciativa da criao pela coordenao de ncleos de discusso,com o objetivo de esgotar o esclarecimento de todos os aspectos relevantes conduo dos estudose integrao de suas fases. Esses ncleos contaram com a participao de 40 especialistas das reasde Farmcia, Medicina, Estatstica e Qumica.

neste contexto que surge este Manual de Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia,composto por seis grandes tpicos apresentados de maneira didtica, buscando transpor asdificuldades dos centros, e, por conseguinte, complementar as diretrizes j previstas na legislaosanitria brasileira para a realizao dos estudos.

Os ncleos de trabalho iniciaram as discusses em setembro de 2001, cada um deles cuidando deuma das trs etapas do processo Clnica, Analtica e Estatstica , sob a coordenao da Dra.Cludia Franklin de Oliveira e inestimvel colaborao da professora Slvia Storpirts. Nos mesessubseqentes, foram realizadas diversas reunies, de modo a promover debates tcnicos e a alcanarconsenso nas questes. Desta forma, cada grupo elaborou um conjunto de tpicos relevantes quedevessem constar no manual. Posteriormente, todos foram objeto de cuidadosa pesquisa e osresultados relatados de modo a propiciar um bom entendimento por parte do pblico-alvo.O manual completo levou 11 meses para ser concludo. Este processo envolveu a participao, nototal, de cerca de 50 profissionais de diversas reas do conhecimento, entre pesquisadores deuniversidades pblicas, tcnicos da Anvisa e fabricantes de instrumentao laboratorial eequipamentos. A todos estes colaboradores a Anvisa registra sua gratido pela contribuio impar aum trabalho to singular.

A estrutura final consta de dois volumes e cada qual possui trs mdulos. O primeiro volume trazdetalhadas tecnicamente cada uma das etapas dos estudos de Biodisponibilidade/Bioequivalnciana seqncia natural de sua conduo: Mdulo 1: Etapa Clnica, Mdulo 2: Etapa Analtica eMdulo 3: Etapa Estatstica. O segundo volume abrange aspectos importantes no que diz respeito instrumentao laboratorial e equipamentos utilizados na execuo da etapa analtica, consideradoscrticos no processo. Neste volume, o Mdulo 1 refere-se Fundamentos e Operao de Micropipetas,

o Mdulo 2 aborda a gua para Anlises Qumicas Instrumentais e o Mdulo 3 possui contedorelacionado Espectrofotometria de Ultra Violeta Visvel, Cromatografia em Fase Lquida (LC),Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Sistemas de Cromatografia Acoplados a Detectores de Massae Verificao de Desempenho de Instrumentos Analticos.

importante ressaltar o ineditismo, mesmo em nvel internacional, da reunio de informaesprovenientes de diversas disciplinas em um nico compndio, buscando a sintetizao de todos osaspectos que envolvem as Boas Prticas em Biodisponibilidade/Bioequivalncia.

Claro fica que o objetivo maior deste trabalho o de aperfeioar a qualidade dos ensaios deBiodisponibilidade/Bioequivalncia realizados no Brasil, e, por conseguinte, contribuir em partecom a qualidade dos medicamentos genricos disponveis no mercado, por meio do fornecimentode subsdios tcnicos amplamente estudados e minuciosamente elaborados. Neste sentido, esperamoscontribuir para a capacitao dos Centros de Biodisponibiliade/Bioequivalncia, alm de promovera formao de monitores de estudos para a indstria farmacutica nacional e ajudar a formar agentesmultiplicadores de conhecimento nas universidades brasileiras.

A realizao deste manual s foi possvel graas ao importante trabalho de inmeras pessoas eantecipadamente peo desculpas por eventual esquecimento de algum nome. Foram fundamentaisos editores Jos Pedrazzoli Jnior (USF/Unifag) e Joo Antnio Saraiva Fittipaldi (Pfizer), e oscolaboradores Fernanda Maria Villaa Boueri (Anvisa), Eliana Regina Marques Zlochevsky (Anvisa),Cludia Simone Costa da Cunha (Ministrio da Sade) e Beatriz Helena Carvalho Tess (Ministrioda Sade), no mdulo Etapa Clnica; os editores Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa),Rui Oliveira Macedo (UFPA), Flvio Leite (T&E Analtica) e Pedro Eduardo Froehlich (UFRGS), eos colaboradores Pedro de Lima Filho (GGMEG/SP), Davi Pereira de Santana (UFPE), RafaelEliseo Barrientos Astigarraga (Cartesius), Silvana Calafatti de Castro (Unifag), Thas Reis Machado,Jaime Oliveira Ilha (Cartesius), Itapuan Abimael Silva (Anvisa), Karen Noffs Brisolla (Anvisa),Marcelo Cludio Pereira (Anvisa), no mdulo Etapa Analtica; os editores Arminda Lucia Siqueira(UFMG), Chang Chiann (GGMEG/SP), Cicilia Yuko Wada (Unicamp), Karla de Arajo Ferreira(Anvisa) e Gilberto Bernasconi (USF/Unifag), e os colaboradores Reinaldo Charnet (Unicamp) eRenato Almeida Lopes (Anvisa), no mdulo Etapa Estattica; os editores Melissa M. Silva (NovaAnaltica) e Walter Pereira (Nova Analtica), Fundamentos e Operao de Micropipetas; o editorJos Muradian Filho (Millipore), gua para Anlises Clnicas; os editores Ivan Jonaitis (Agilent),Renato Garcia Peres (Flowscience), Ricardo Lira (Flowscience), Renato Gouveia, Jos AparecidoSoares (Varian), Josu D.M. Neto (Sync Brasil) Juarez Arajo Filho (Sync Brasil), Alexandre Rosolia(Waters), Adauto Silva (Varian) e Reinaldo Castanheira (Agilent), Instrumentao Analtica; e aequipe de coordenao formada por Cludia Franklin de Oliveira (GGIMP/Anvisa), Marcelo CludioPereira (GGIMP/Anvisa), Max Weber Marques Pereira (GGIMP/Anvisa), Karla de Arajo Ferreira(GGIMP/Anvisa), Karen Noffs Brisolla (GGIMP/Anvisa), Itapuan Abimael da Silva (GGIMP/Anvisa) e Renato Almeida Lopes (GGIMP/Anvisa).

Dr. Gonzalo Vecina Neto

FICHA TCNICA

Volume II Mdulo 1 Micropipetas: Fundamentos e Operao

Editores: Melissa M. Silva Nova Analtica Valter A. Pereira - Nova Analtica

Coordenao: Cludia Franklin de Oliveira ANVISA Itapuan Abimael da Silva - ANVISA Karen de Aquino Noffs Brisolla - ANVISA Karla de Arajo Ferreira - ANVISA Marcelo Cludio Pereira - ANVISA Max Weber Marques Pereira - ANVISA Renato Almeida Lopes ANVISA

SUMRIO

1. DEFINIO ...................................................................................................................................... 51.1. Tipos de pipetas .......................................................................................................................... 5

2. PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO .................................................................................... 62.1. Pipetas de deslocamento de ar .................................................................................................. 62.2. Pipetas de deslocamento positivo ............................................................................................. 8

3. TCNICA DE OPERAO ....................................................................................................... 113.1. Como guardar a pipeta ............................................................................................................ 113.2. Ajuste do volume ...................................................................................................................... 113.3. Encaixe da ponteira .................................................................................................................. 123.4. Pr-rinsagem da ponteira ......................................................................................................... 133.5. Aspirao .................................................................................................................................... 133.6. Dispensa ..................................................................................................................................... 143.7. Ejeo de ponteiras ................................................................................................................... 14

4. PONTEIRAS .................................................................................................................................... 154.1. Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar ...................................................................... 154.2. Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo ................................................................. 15

5. MANUTENO ............................................................................................................................. 165.1. Limpeza ...................................................................................................................................... 165.2. Troca de peas ........................................................................................................................... 175.3. Verificao da performance ..................................................................................................... 20

6. SUGESTES DE PROCEDIMENTOS .................................................................................. 21

7. ANEXO I: EXEMPLO DE PROCEDIMENTO DE LIMPEZA .................................... 227.1. Desmontagem ........................................................................................................................... 227.2. Limpeza ...................................................................................................................................... 237.3. Montagem .................................................................................................................................. 23

8. ANEXO II: VERIFICAO PADRO DA PERFORMANCE ....................................... 248.1. Consideraes gerais ................................................................................................................. 248.2. Condies ambientais da sala de teste ................................................................................... 248.3. Operador .................................................................................................................................... 258.4. Ponteiras ..................................................................................................................................... 258.5. Equipamentos utilizados no teste ........................................................................................... 258.6. O procedimento de verificao ............................................................................................... 27

9. ANEXO III: PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINAO .................................... 389.1. Qumica ...................................................................................................................................... 399.2. Microbiologia e cultura celular ................................................................................................ 409.3. Biologia molecular .................................................................................................................... 419.4. Espectro de ao dos mtodos ............................................................................................... 449.5. Vantagens e desvantagens ........................................................................................................ 459.6. Autoclavagem ............................................................................................................................ 469.7. Irradiao UV ............................................................................................................................ 469.8. Solues qumicas ..................................................................................................................... 46

10. ANEXO IV: DEFINIES ......................................................................................................... 50

11. GLOSSRIO E ABREVIAES ............................................................................................... 51

12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................................... 52

1. DEFINIO

Pipetas operadas por pisto so equipamentos para aspirar e dispensar volumes especficos de lquidos.As pipetas de um nico canal possuem apenas um pisto. J as pipetas de mltiplos canais possuemuma srie de receptculos simultaneamente. As pipetas podem ser ajustadas na fbrica para dispensarum dado volume ou dispensar volumes selecionados pelo usurio dentro de uma faixa de volumeespecfica, por exemplo, entre 10 L e 100 L. As pipetas operadas por pisto podem ser de doistipos: deslocamento de ar e deslocamento positivo.

1.1. Tipos de pipetas

As pipetas podem ser projetadas das seguintes maneiras:

Em relao ao volume:

Volume fixo, projetadas pelo fabricante para dispensar apenas seu volume nominal, como porexemplo 100L.

Volume varivel, projetadas pelo fabricante para dispensar volumes selecionados pelo usuriodentro de uma faixa especfica de volume.

Em relao ao pisto:

Pode haver uma camada de ar entre o pisto e a superfcie do lquido (pipetas de deslocamentode ar).

O pisto est em contato direto com o lquido (pipetas de deslocamento positivo ou deslocamentodireto). O capilar e o pisto podem ser reutilizveis ou descartveis.

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Volume II / Mdulo 1 - Micropipetas: Fundamentos e Operao

2. PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO

Acopla-se a ponteira de plstico ou de vidro na pipeta. Com o pisto no limite inferior (posio deaspirao inferior), mergulha-se a ponteira no lquido que se deseja transferir. Quando o pistosobe para a posio de aspirao superior, o lquido aspirado. O volume do lquido dispensadoquando o pisto impulsionado novamente para a posio inferior.

O princpio de funcionamento est detalhado abaixo de acordo com o tipo de pipeta (deslocamentode ar ou deslocamento positivo).

2.1. Pipetas de deslocamento de ar

Quando o boto de uma pipeta de deslocamento de ar pressionado, o pisto localizado dentro doequipamento se move para baixo, deslocando o ar em contato com ele para fora da pipeta (o volumede ar expulso igual ao volume ajustado na pipeta). O volume de ar que permanece dentro dapipeta inversamente proporcional ao volume da amostra: quanto menor o volume de ar dentro dapipeta, maior o volume do lquido que ser aspirado.

a) Ajuste do volume (vlido somente para as pipetas de volume varivel)

O usurio ajusta o volume desejado. O pisto se move para a posio apropriada.

P.S.: nas pipetas de volume fixo, este posicionamento feito na fbrica.

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b) Preparo para aspirao

Pressiona-se o boto. O pisto se desloca para baixo e expele um volume de ar igual ao volumeselecionado (nas pipetas de volume fixo o volume de ar expelido igual ao volume nominal dapipeta).

c) Aspirao do lquido

Mergulha-se a ponteira no lquido at que o orifcio fique submerso. Ao se liberar o boto, o pistoretorna para a posio inicial e forma-se no interior da pipeta um vcuo parcial. A presso atmosfricafora a entrada do lquido pelo orifcio da ponteira.

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d) Dispensa do lquido

Pressiona-se novamente o boto. O pisto se move para baixo deslocando o ar e aumentando apresso interna da pipeta. O ar comprimido expulsa o lquido para fora da ponteira.

e) Segundo estgio

Em algumas pipetas de deslocamento de ar o pisto pode se deslocar um pouco abaixo do limiteinferior (conseqentemente deslocando uma quantidade adicional de ar) o que permite a expulsodas ltimas gotas do lquido. O termo mais conhecido pelos usurios para este deslocamento adicional segundo estgio.

2.2. Pipetas de deslocamento positivo

As pipetas de deslocamento positivo funcionam como uma seringa. No h volume de ar entre opisto e lquido. Como no h ar para contrair ou expandir, a fora de aspirao sempre constantee inalterada pelas propriedades fsicas do lquido a ser manipulado. Este tipo de equipamento idealpara a manipulao de lquidos viscosos ou de alta densidade.

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b) Preparo para aspirao

Pressiona-se o boto. O pisto desce at o final do capilar.

a) Ajuste do volume

O usurio ajusta o volume desejado. O pisto se move para baixo at a posio de incio.

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c) Aspirao do lquido

O orifcio do capilar imerso abaixo da superfcie do lquido. Ao se liberar o boto, o pisto se movepara cima e a presso do ambiente fora a entrada do lquido pelo orifcio do capilar.

d) Dispensa do lquido

Pressiona-se novamente o boto. O pisto se move para baixo e expulsa o lquido para fora docapilar.

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3. TCNICA DE OPERAO

Uma boa tcnica de pipetagem fundamental para garantir bons resultados. A seguir, um roteirosobre alguns aspectos da tcnica que devem ser considerados durante a operao.

3.1. Como guardar a pipeta

A pipeta deve ser guardada na posio vertical por dois motivos:

Evita-se que ela entre em contato com superfcies que podem estar contaminadas, como porexemplo a bancada de trabalho (ao se deitar a pipeta sobre a bancada ou no interior de umagaveta pode-se transferir para o corpo do instrumento contaminantes que estejam neste local eestes podem ser transferidos ao experimento, posteriormente).

Se no for feita a ejeo da(s) ponteira(s) e houver sobrado uma quantidade residual do lquidono interior da(s) ponteira(s), ao se deitar a pipeta este lquido pode escorrer para o interior doinstrumento contaminando e danificando as peas internas e/ou o porta-cone.

Exemplos de suportes:

3.2. Ajuste do volume

Para evitar o erro de paralaxe, o ajuste do volume deve ser feito ou com a pipeta na posiohorizontal. Caso o operador prefira ajustar o volume com a pipeta na posio vertical deve estarcom um dos olhos fechado.

Quando diminuir o volume, cuidadosamente chegue ao valor desejado e no ultrapasse a marca. Quando aumentar o volume, ultrapasse o valor desejado 1/3 de volta e depois, cuidadosamente,

diminua o volume at chegar ao desejado, no ultrapassando a marca.

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3.3. Encaixe da ponteira

O encaixe da ponteira deve ser feito de acordo com as instrues do fabricante, garantindo aformao de um selo adequado entre a ponteira e o porta-cone da pipeta.

P.S: Entenda-se por selo um anel opaco que se forma ao redor de todo o colar da ponteira, indicandoperfeita conexo entre o porta-cone e a ponteira. Um selo incompleto levar a resultados poucoprecisos.

Abaixo, sugestes para o encaixe das ponteiras:

Ponteiras soltas:

Segure a ponteira pelo colar (com cuidado para no tocar na ponta) e encaixe-a no porta-cone ea pressione contra ele com um movimento rotacional, como indicado na figura abaixo. Istogarante uma conexo perfeita entre a ponteira e o porta-cone (observe a formao do selocitado acima).

Ponteiras em racks:

Encaixe o porta-cone na ponteira e pressione a pipeta para baixo com um movimento rotacional,como indicado na figura.

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Encaixe em multi-canal:

Para encaixar simultaneamente em todos os canais, posicione os porta-cones nos colares dasponteiras. Faa um movimento de vai e vem, como ilustrado na figura, o que assegura conexoadequada de todas as ponteiras em todos os canais.

3.4. Pr-rinsagem da ponteira

Quando uma nova ponteira colocada (ou aumenta-se o volume a ser aspirado), necessrio sefazer uma pr-rinsagem da ponteira. Para isso, basta aspirar e dispensar o lquido algumas vezes.

A ao de pr-rinsar a nova ponteira garante a exatido e preciso do volume a ser posteriormentetransferido. Isto porque, quando se aspira um lquido , forma-se um filme na parede interna daponteira . A natureza desse filme, que o causador de erro na primeira medida, depende dolquido que est sendo transferido. Entretanto, este filme se mantm relativamente constanteaps algumas pipetagens com a mesma ponteira. preciso pr- rinsar a ponteira para maximizaro desempenho da pipeta.

3.5. Aspirao

A aspirao deve ser feita de modo lento e constante, mantendo-se sempre a mesma profundidade deimerso da ponteira (durante a aspirao e entre uma amostra e outra). Recomenda-se que a profundidadede imerso seja em torno de 2 a 3 mm abaixo da superfcie do lquido. Alguns fabricantes sugerem quea profundidade de imerso deve variar de acordo com o volume de trabalho, como discriminado natabela abaixo:

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A pipeta deve ser mantida na posio vertical durante toda a aspirao. Aguarde de 1 a 2 segun-dos antes de retirar a ponteira do lquido. Se do lado de fora da ponteira restarem gotculas dolquido, limpe-as usando papel macio (se a metodologia permitir). Cuidado para no encostarno orifcio da ponteira.

3.6. Dispensa

Encoste a ponta da ponteira na parede interna do recipiente e incline a pipeta aproximadamente30 a 45;

Pressione o boto continuamente at o final do primeiro estgio. Aguarde alguns segundos (de1 a 3 dependendo da viscosidade do lquido) ento pressione o boto at o segundo estgio(purga) para eliminar gotculas que possam ter permanecido na ponteira;

Mantenha o boto pressionado at o final. Retire a pipeta de dentro do recipiente mantendo aponteira em contato com a parede interna do recipiente (arranhe a ponta da ponteira naparede interna do recipiente).

3.7. Ejeo de ponteiras

Descarte a ponteira pressionando o boto do ejetor de ponteiras; Deve-se tomar todas as precaues necessrias quando se trabalha com materiais contaminados

e/ou radioativos. O procedimento adequado deve ser estabelecido pelo prprio laboratrio deacordo com o tipo de material pipetado, considerando os aspectos de segurana do usurio e dolocal de trabalho.

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4. PONTEIRAS

A qualidade dos resultados diretamente influenciada pela qualidade da ponteira utilizada. Bonsresultados exigem no s ponteiras de boa qualidade, mas tambm a mais adequada ao modelo emarca de pipeta utilizada.

4.1. Ponteiras para pipetas de deslocamento de ar

O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usurio deve utilizar para alcanar asespecificaes indicadas no manual de operao da pipeta.

As ponteiras de plstico para pipetas de deslocamento de ar devem ser utilizadas uma nica vez.No se deve limpar ou reutilizar estas ponteiras, pois suas caractersticas metrolgicasno podem ser garantidas.

4.2. Ponteiras para pipetas de deslocamento positivo

O fabricante deve indicar qual marca de ponteira o usurio deve utilizar para alcanar asespecificaes indicadas no manual de operao da pipeta.

O encaixe entre o pisto e o capilar deve ser ideal (selo perfeito entre capilar e pisto) assimcomo o deslocamento do pisto no interior do capilar o que garante dispensa por igual dolquido aspirado.

Estas ponteiras podem ser reutilizadas ou descartveis (ao se trocar a ponteira deve-se trocarsimultaneamente o capilar e o pisto).

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5. MANUTENO

Neste captulo estaremos abordando trs etapas fundamentais do procedimento de manuteno:limpeza, troca de peas e verificao da performance.

OBSERVAO

necessrio fazer uma adequao entre as informaes presentes neste captulo e o manual deinstrues do fabricante. Em particular devem ser observados os seguintes pontos:

Verificar se as peas aqui relacionadas podem ser submetidas lavagem; Procedimento de montagem e desmontagem da pipeta; Como trocar as peas danificadas; Verificar se qualquer um destes procedimentos altera a calibrao da pipeta.

Se alterarem, necessrio realizar a verificao da performance do instrumento (vide anexo II) eeventual ajuste do equipamento (segundo instrues do fabricante).

5.1. Limpeza

necessrio criar uma rotina de limpeza e inspeo das peas da pipeta. Para que se possa obtersempre os melhores resultados, necessrio que as peas da pipeta estejam em boas condies defuncionamento. Existem duas situaes distintas que exigem procedimentos de limpeza diferentes:

a) Limpeza padro

Os aerossis formados durante a pipetagem se depositam dentro da pipeta, prejudicando seufuncionamento normal. Este depsito pode, alm de obstruir o orifcio do porta-cone, prejudicandoo deslocamento do ar dentro da pipeta, danificar as peas internas, como por exemplo o pisto(risc-lo, corro-lo). Nas duas situaes, a pipeta vai operar fora das especificaes.

Para evitar esta situao deve-se limpar as peas internas da pipeta (porta-cone, ejetor, pisto, selo eoring). Seguir o procedimento recomendado pelo fabricante. Um exemplo de procedimento delimpeza est descrito no anexo I.

A limpeza a principal ferramenta do usurio para prolongar a vida til da pipeta e garantirresultados confiveis. No existe uma previso da frequncia de limpeza que deve ser adotadapelo laboratrio (isto depende do tipo de material manuseado, rotina a que a pipeta submetida, nmero de usurios para a mesma pipeta e erros admissveis para o procedimento).Para garantir resultados confiveis, a pipeta alm de limpa freqentemente deve ser submetidaa testes de performance (anexo II).

b) Pipeta utilizada na manipulao de materiais cidos ou corrosivos

O estado do pisto interfere diretamente nas especificaes da pipeta. Uma pipeta com pisto riscadoou corrodo no atinge os padres estabelecidos para exatido e preciso. Materiais cidos (como

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por exemplo, cido sulfrico, cido clordrico, cido ntrico, fenol) ou corrosivos (como por exemplohidrxido de sdio, solventes clorados) podem danificar o pisto. Pisto danificado leva a resultadosno confiveis.

Para se evitar danos ao pisto recomenda-se limpar as peas da pipeta logo aps a manipulaodeste tipo de lquido.

Ao contrrio do procedimento descrito no item a, para esta limpeza no necessrio a utilizaode um agente qumico, basta utilizar gua destilada.

Desmonte a pipeta de acordo com as instrues do fabricante. Jogue gua destilada sobre as seguintes peas: ejetor, porta-cone, pisto, selos do pisto. Deixe secar temperatura ambiente ou em estufa at 40. Monte a pipeta de acordo com instrues do fabricante.

OBSERVAES

Confirme se as peas em questo podem ser lavadas e se o procedimento afetar sua calibrao(ou seja, se necessrio executar o procedimento de verificao da performance logo aps alimpeza).

O procedimento descrito no item b acima particularmente indicado para pipetas com pistometlico. Para pistes de outros materiais (vidro, plstico, cermica) usual a presena de graxade silicone para vedao do pisto, desta forma se recomenda verificar e seguir os procedimentosespecficos contidos no manual.

5.2. Troca de peas

Algumas peas da pipeta tm que ser trocadas periodicamente, pois sofrem desgaste e influenciamdiretamente a performance da pipeta.

5.2.1. Selo(s) de vedao do pisto

Esta(s) pea(s) faz(em) a vedao entre o pisto e o porta-cone (na parte superior). Devido ao uso,se formam microvilosidades na superfcie destas peas e a vedao deixa de ser perfeita, levando aperda de preciso do instrumento. Esta(s) pea(s) deve(m) ser trocada(s) uma vez ao ano (consulteo procedimento para troca no manual do fabricante).

5.2.2. Porta-cone

Outro ponto de vedao importante a regio de contato entre o porta-cone e a ponteira. Devidoao uso, ocorre desgaste da superfcie do porta-cone na regio de encaixe com a ponteira e o contatoentre eles se torna deficiente, o que prejudica a medida (perda de preciso). A troca deve ser feita

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sempre que se observar desgaste da regio de encaixe com a ponteira ou danos na pea (quebra,lasca). Consultar o manual do fabricante para verificar se o procedimento afeta ou no a calibraodo instrumento.

5.2.3. Outras peas

Outras peas influenciam na performance da pipeta. Abaixo, descrevemos um procedimento deverificao bastante simples que auxilia no reconhecimento de peas danificadas. Algunsprocedimentos devero ser realizados com base no manual do fabricante (por exemplo: desmontagem,montagem). Ressaltamos mais uma vez, a importncia de se certificar se ou no necessrio recalibrara pipeta aps qualquer um destes procedimentos (esta informao se encontra no manual dofabricante).

1 ETAPA: APARNCIA GERAL

Verifique se no h nenhum defeito aparente.

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2 ETAPA: TESTAR AS FUNES

Gire o volmetro totalmente, percorrendo toda a faixa volumtrica da pipeta. Verifique se omnimo e o mximo volumes ajustveis correspondem real faixa volumtrica da pipeta.

Problemas e causas:

* Algumas pipetas podem ser autoclavadas e outras no. Consulte o manual do fabricante.

Com o volmetro ajustado no valor mximo especificado para o modelo da pipeta, pressione oboto por todo o curso, para verificar a facilidade do movimento, sentindo eventuais obstculosou variaes na frico, o que pode revelar danos como corroso no pisto ou barra de operaestorta. Oua o barulho da mola, o que pode indicar seu posicionamento incorreto.

Problemas e causas:

Encaixe uma ponteira na pipeta e pressione o boto do ejetor de ponteiras, para verificar aeficcia da ejeo.

3 ETAPA: TESTE DO VAZAMENTO

Para pipetas que tenham um volume mximo maior do que 200 l acerte seu volume no valormximo e aspire gua para encher a ponteira da pipeta. Observe a ponteira por 20 segundos. Seaparecer uma gota na ponta da ponteira, significa que h vazamento. Isto tambm verdadeiro parapipetas com faixas de volume abaixo de 200L, mas para esta faixa de volume se deve adotar oseguinte procedimento: aps observar 20 segundos se h ou no formao de gota, mergulhe aponta da ponteira no recipiente com gua. O nvel de gua dentro da ponteira no deve ser alterado.Caso ele diminua, significa que h vazamentos.

A causa do vazamento pode ser:

Selos do pisto danificados; Pisto riscado ou corrodo;

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Danos qumicos ou mecnicos no porta-cone, na regio onde se encaixa a ponteira; Uso de ponteiras no recomendadas pelo fabricante (ver captulo 4).

4 ETAPA: DESMONTAGEM

Este processo deve ser adotado caso tenha ocorrido vazamento na etapa 3. Ao desmontar a pipetapode-se avaliar as peas internas e chegar a uma concluso sobre a causa do problema (pistodanificado, selos de vedao ausentes ou comprometidos, etc.) e definir quais peas devem sertrocadas. Abaixo, segue um exemplo de roteiro de desmontagem adotado para determinados modelosde pipetas. No deixe de seguir as instrues do fabricante para desmontar a pipeta.

Puxe para baixo e retire o ejetor de ponteiras (em alguns modelos o ejetor no destacvel); Retire a porca de conexo; Remova o pisto cuidadosamente; Verifique a superfcie do pisto (se est corroda e/ou riscada) e os selos de vedao.

5 ETAPA: MONTAGEM

Monte a pipeta segundo instrues do fabricante.

OBSERVAO

Recomendamos que as etapas de 1 a 3 sejam feitas diariamente antes do incio dos trabalhos eregistrados para controle do laboratrio. Se forem constatadas anormalidades, se deve realizar asetapas 4 e 5.

Algumas peas podem ser trocadas pelo prprio usurio, sem comprometer a calibrao doinstrumento. Outras, aps troca, exigem a verificao da calibrao do instrumento e eventualmenteajust-lo. Esta informao consta no manual de instrues da pipeta.

5.3. Verificao da performance

Para garantir medidas confiveis, alm dos procedimentos de limpeza e trocas de peas, o usurionecessita verificar a performance da pipeta. Esta verificao analisa tanto a exatido (erro sistemtico)como a preciso (erro aleatrio).

A verificao da performance, na realidade, avalia o conjunto pipeta + ponteira + operador (tcnicade pipetagem). Para obtermos resultados confiveis no teste, o operador deve ser treinado e qualificado(tcnica de pipetagem descrita no captulo 3) e as ponteiras devem ser as recomendadas pelo fabricanteda pipeta.

O usurio deve estabelecer uma freqncia de teste para suas pipetas, com base em: necessidadesem termos de exatido e preciso, frequncia de uso, nmero de usurios para uma mesma pipeta,nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a natureza dos lquidos pipetados. No anexo IIdescrevemos o mtodo gravimtrico para avaliao da performance das pipetas (referncia: normaISO/ FDIS 8655- Piston-operated volumetric apparatus - Part 6 - Gravimetric test methods).

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6. SUGESTES DE PROCEDIMENTOS

Pipetas operadas por pisto so equipamentos para aspirar e dispensar volumes especficos delquidos.

Para se assegurar a confiabilidade dos resultados, necessrio implantar a seguinte rotina:

Verificao da aparncia geral, teste das funes e o teste do vazamento (etapas 1, 2 e 3)descritos no item 5.2.3. deste documento. Se forem constatadas anormalidades, realizar asetapas 4 e 5 do mesmo procedimento.

Limpeza peridica das peas da pipetaA peridiocidade da limpeza deve ser estabelecida de acordo com freqncia de uso, nmero deusurios para uma mesma pipeta, nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a naturezados lquidos pipetados. Recomendamos aos laboratrios que realizem a limpeza a cadatrs meses (se houve acmulo de sujeira nestes trs meses reduzir os intervalos entre umalimpeza e outra). muito importante que o laboratrio mantenha registros das limpezasrealizadas o qual deve conter o nmero de srie da pipeta, data da limpeza e o procedimentoutilizado.

Troca de peasOs selos do pisto devem ser trocados anualmente (se o nmero de pipetagens ultrapassarem100.000, os selos devem ser trocados em um perodo de tempo menor que deve ser estimadoa partir da rotina do laboratrio). O porta-cone deve ser trocado a cada 2 anos ou quandoa regio de encaixe com a ponteira estiver desgastada. Estas trocas devem ser registradas (oregistro deve conter o nmero de srie da pipeta, a data da troca e os dados sobre a novapea - lote ou nmero da nota fiscal de compra). Peas que afetem a performance da pipeta(por exemplo: pisto, volmetro, haste) quando necessitarem de troca ou reparo, devem serenviadas para assistncia tcnica especializada e este reparo deve ser devidamente registrado,alm do registro da nova calibrao da pipeta.

Verificar periodicamente a performance da pipeta (exatido e preciso), conforme descritono anexo II. Esta verificao deve ser feita a cada 3 meses e ser devidamente registrada(exemplo de registro no anexo II item 8.6.5. deste documento). Os erros mximos encontradospodem ser at 2 vezes maior do que os erros estabelecidos nas tabelas 1 e 2 deste documento(anexo II, item 8.6.4.). quando houver troca de peas que afetem a calibrao da pipeta, oprocedimento de verificao deve ser executado (veja item acima troca de peas).

Teste do operadorComo a tcnica de operao fundamental na obteno de bons resultados, necessriotestar e registrar a tcnica de pipetagem do operador. Para isso, com um equipamento queesteja operando dentro das especificaes do fabricante, realize 10 medidas no volume mximoe mnimo especificado para aquele modelo de pipeta. Faa a anlise da exatido e precisodas medidas obtidas. Os erros mximos encontrados devem ser at 2 vezes os valoresespecificados nas tabelas 1 e 2 deste documento (anexo II, item 8.6.4.). Registre os dados emum relatrio (exemplo no anexo II item 8.6.5.) identificando o operador que foi testado.

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7. ANEXO I: EXEMPLO DE PROCEDIMENTO DE LIMPEZA

O exemplo a seguir pode ser utilizado por vrios modelos de pipetas, em particular aquelas com opisto metlico sem graxa; j para outros modelos ser necessrio adapt-lo. Siga as instrues dofabricante contidas no manual do usurio. No deixe de confirmar se as etapas descritas aqui nocomprometem a calibrao da pipeta.

Ateno! No misture as peas de uma pipeta com as peas de outra pipeta

7.1.Desmontagem

necessrio que se desmonte a pipeta para fazer a limpeza (deve-se utilizar luvas quando houverrisco de contaminao). Segue um esquema geral das peas das pipetas:

RELAO DAS PEASFiguras 1 e 2

P.S. este esquema pode sofrer variaes de acordo com o modelo e marca da pipeta. Para maiores detalhes consulte omanual do fabricante.

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Retire o ejetor de ponteiras (D) puxando-o; Desconecte a porca de conexo (F) separando assim o corpo da pipeta (B) do porta-cone (C); Remova o conjunto do pisto cuidadosamente e separe os selos do pisto (G e H), mantendo o

porta-cone com a parte mais fina para baixo.

Freqentemente os selos do pisto ficam presos dentro do porta-cone. Para retir-los deve-se recolocaro pisto, pression-lo contra o porta-cone, como se fosse fazer uma pipetagem. Retire o pisto quedever trazer preso a ele, os selos.

7.2.Limpeza

Coloque o porta-cone, o conjunto do pisto, ejetor de ponteiras, os selos (no colocar o handle)em um bquer, completando seu volume com soluo de detergente neutro de 4% a 8% emgua morna ( 50C);

Coloque o bquer no banho de ultra-som e deixe aproximadamente 15 minutos (caso no tenhaultra-som, deixar na soluo por 40 minutos);

Descarte a soluo de detergente utilizada; Lave cada pea com gua corrente; Coloque as peas em um recipiente limpo e faa a ltima lavagem com gua destilada; Seque na estufa a aproximadamente 50C (no ultrapasse esta temperatura), durante no mximo

2 horas, ou deixe secar a temperatura ambiente.

OBSERVAES

Use soluo de detergente neutro com concentrao de 4% para limpeza de pipetas queapresentam pouca sujeira e concentrao de 8% para limpeza de pipetas que apresentaremmuita sujeira.

Para as pipetas que aps a lavagem continuarem apresentando algum tipo de sujeira, limpe comalgodo umedecido com lcool isoproplico, tomando cuidado para no danificar o pisto.

Sempre aps o uso da pipeta com solues cidas e/ou corrosivas, lavar todas as peas comgua destilada ou etanol.

7.3. Montagem

Coloque o selo e oring no pisto, encaixando em primeiro lugar o selo; Com uma das mos, segure o corpo da pipeta na posio vertical e coloque o pisto; Encaixe o porta-cone no corpo da pipeta; Em seguida coloque e atarraxe a porca da conexo; Coloque o ejetor de ponteiras; A pipeta est pronta para uso.

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8. ANEXO II: VERIFICAO PADRO DA PERFORMANCE

8.1. Consideraes gerais

Este anexo descreve o procedimento para verificao da performance das pipetas utilizando-se omtodo gravimtrico (segundo norma ISO/ FDIS 8655 - Piston-operated volumetric apparatus -Part 6: Gravimetric tests). A utilizao dos procedimentos descritos neste mtodo garanteconformidade com as especificaes internacionais para exatido e preciso.

O teste de conformidade para verificao da exatido e preciso aplicvel a qualquer pipeta(definies no captulo 1). Este teste, que est de acordo com padres internacionais, analisa osistema de pipetagem como um todo: pipeta, ponteira e operador.

O mtodo descrito neste documento inclui um procedimento para correo das perdas porevaporao para pequenos volumes (abaixo de 50 L). Tambm, na converso para volume dasmassas obtidas na balana, so feitas correes referentes temperatura e presso no momento daexecuo do teste.

O usurio deve estabelecer uma rotina para testar suas pipetas com base em: necessidades emtermos de exatido e preciso, frequncia de uso, nmero de usurios para uma mesma pipeta,nmero de ciclos em cada utilizao da pipeta e a natureza dos lquidos pipetados. No existe umintervalo padronizado entre uma checagem e outra. Cabe ao usurio definir este intervalo.A norma ISO/ FDIS 8655 define que a periodicidade mnima de uma vez por ano.

A pipeta deve ser desmontada e montada (de acordo com instrues no manual do fabricante) pelomenos uma vez antes de se realizar o teste de verificao. A pipeta deve ser operada de acordo como manual do fabricante.

8.2. Condies ambientais da sala de teste

A sala de teste (laboratrio) deve ser limpa e ter controle de temperatura e umidade para que ascondies ambientais do local onde ser feita a verificao e a temperatura dos equipamentos utilizadossejam estveis e homogneas antes e durante todo o procedimento.

A pipeta e a gua utilizada no teste gravimtrico devem estabilizar na temperatura da sala de verificaopelo menos 2 horas antes do incio do procedimento. Idealmente, a verificao deve ser feita nasseguintes condies:

1) Temperatura estvel (gua, pipeta e ambiente) entre 15 e 30C;2) Umidade Relativa acima de 50%.

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8.3. Operador

8.3.1. Operao da pipeta

Um procedimento adequado de pipetagem contribui significantemente para a reprodutibilidadedos resultados no teste de verificao. Operadores sem experincia podem ter variaes importantesnos resultados. Para resultados confiveis, o operador deve ser bem treinado e qualificado. Os aspectosda tcnica de pipetagem foram discutidos no captulo 3.

8.3.2. Treinamento

O teste de conformidade deve ser feito por um operador qualificado. Se necessrio, contate umaempresa especializada para solicitar treinamento ao operador.

8.4. Ponteiras

A pipeta que ser testada deve ser operada segundo as instrues fornecidas pelo manual de operao.Novamente, com base no manual de operao que acompanha a pipeta que ser testada, tenhacerteza, antes de comear o teste, que ela est limpa, montada corretamente e de estar utilizando asponteiras recomendadas pelo fabricante.

Consulte o captulo 4 para maiores detalhes.

8.5. Equipamentos utilizados no teste

Para garantir a integridade do procedimento de verificao, todos os equipamentos utilizados duranteo procedimento devem ser verificados regularmente.

8.5.1. Balana

As balanas devem ser calibradas e certificadas por pessoal qualificado usando pesos rastreveis aautoridades reconhecidas nacionalmente (Empresas/ Instituies credenciadas pelo INMETRO epertencentes Rede Brasileira de Calibrao - RBC).

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Em termos prticos, o volume nominal (maior volume selecionvel pelo usurio) pode ser utilizado para a escolha da balana

A legibilidade da balana deve ser escolhida de acordo com o volume selecionado na pipeta que estsendo testada.

8.5.2. Outros equipamentos

Termmetro: incerteza de medio mxima de 0,2C Higrmetro: incerteza de medio mxima de 10% Barmetro: incerteza de medio mxima de 0,5 kPa

8.5.3. Recipientes

Recipientes que sero utilizados durante o procedimento:

Recipiente de origem o recipiente que contm a gua que ser utilizada para a realizao das medidas (o volumedeste recipiente deve ser suficiente para a execuo de TODAS as medidas).

Recipiente para pesagem o recipiente que ser utilizado para a realizao da medida ( o que ser colocado no prato depesagem da balana).

Recipiente de descarte um terceiro recipiente que recolher as alquotas que no sero pesadas.

Recomenda-se que, especialmente para o teste do menor volume da pipeta, a proporo mdiaentre o dimetro e a altura do recipiente para pesagem seja 3:1 ou que o recipiente tenha tampa.Algumas empresas fornecem kits de recipientes adequados realizao do teste gravimtrico.

8.5.4. gua

No teste, utiliza-se gua destilada ou deionizada, nos dois casos deve ser degaseificada (gua grau 3conforme a Norma ISO 3696) temperatura da sala onde ser feita a verificao. Para evitar flutuaes

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na temperatura da gua, use um recipiente de origem que seja suficientemente grande, pois estedeve conter gua suficiente para a realizao de todas as medidas.

8.6. O procedimento de verificao

A verificao da performance analisa tanto a exatido (erro sistemtico) como a preciso (erroaleatrio). Condies, procedimentos e qualificaes previamente descritas neste documento devemser implantados para garantir a validade dos resultados dos testes.Aps rinsar a ponteira, faa 10 pesagens* individuais para cada volume selecionado. Para as pipetasde volume varivel, trs volumes diferentes devem ser selecionados de acordo com a faixa de volumedo modelo que est sendo avaliado. Estes volumes devem ser o volume nominal (mximo), 50% dovolume nominal (volume intermedirio) e o volume mnimo da faixa de volume do modelo (estesvolumes esto definidos no manual da pipeta). Para as pipetas de volume fixo utiliza-se apenas ovolume nominal.

1. Ajuste na pipeta o volume do teste (este deve ser mantido durante todo o procedimento).2. Estime a taxa de evaporao (para volumes pequenos, menores do que 50L). Vide a seguir o

procedimento.3. Faa o teste de verificao: registre as massas no Relatrio de Verificao de Performance.4. Faa os clculos: registre os resultados no Relatrio de Verificao de Performance.5. Compare os resultados com as especificaes de exatido e preciso que esto relacionadas nas

tabelas 1 e 2 (item 8.6.4).

Estas etapas sero detalhadas adiante.

8.6.1. Estimando a taxa de evaporao (massa mdia evaporada por ciclo de pesagem)

Para volumes abaixo de 50L necessrio o uso de um recipiente com tampa. O objetivo minimizar,controlar e quantificar a perda por evaporao durante o ciclo de pesagem. O uso de pinas para amanipulao deste recipiente tambm aconselhvel.

A evaporao pode ser estimada, realizando-se uma srie de quatro simulaes de pesagens, na qualse repete o ciclo de pesagem sem que haja dispensa de gua no recipiente para pesagem. A diferenatotal atribuda evaporao calculada e dividida por 4, para se obter uma mdia. A faixa expressaem mg/ciclo (ou se for um nico ciclo, deve ser expresso em mg). Evite manipular excessivamenteo recipiente. O uso de pinas para manipular o recipiente para pesagem aconselhvel.

As taxas de evaporao geralmente esto entre 0,010 mg e 0,025 mg por ciclo de pesagem. Recalculea taxa de evaporao sempre que as condies ambientais forem alteradas (temperatura, presso eumidade).

* O usurio pode selecionar o nmero de medidas de acordo com as especificaes de exatido e preciso aceitaspela sua metodologia.

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1. Adicione gua ao recipiente para pesagem at que este esteja com 1/3 do seu volume cheio.2. Coloque o recipiente tampado no prato da balana.3. Com a pipeta, aspire a alquota do recipiente de origem.4. Tare a balana e remova o recipiente para pesagem do prato da balana (o uso de pinas para

remov-lo aconselhvel).5. Dispense a alquota no recipiente de descarte ou retorne-a para o recipiente de origem. No a

dispense no recipiente para pesagem.6. Registre o resultado e1.7. Repita as etapas de 3 a 8, trs vezes para obter e2, e3 e e4.8. Calcule a perda/ ciclo: e = (e1 + e2 + e3 + e4)/4 (mg).9. A evaporao por ciclo e (mg) deve ser adicionada ao peso mdio antes do clculo do volume

mdio.

Um exemplo de clculo da taxa de evaporao dado ao final deste captulo

8.6.2. Teste gravimtrico

As tcnicas de aspirao e dispensa esto descritas no captulo 3. Embora vrios mtodos alternativosde pipetagem sejam possveis, sempre utilize o modo normal (modo direto, no utilizar o modoreverso). Para todas as pipetas, evite segurar ou esquentar o porta-cone com a mo durante o teste.

Para pipetas multi-canal, encaixe as ponteiras em todos os canais, mas teste um canal por vez. Eregistre os resultados para cada canal.

1. Preparao

1.1. Coloque gua do recipiente de origem no recipiente para pesagem a uma profundidade de, nomnimo, 3 mm.

1.2. Mea e registre a temperatura da gua do recipiente de origem (t1), a presso do ar e a umidaderelativa da sala. Se o recipiente para pesagem possui tampa, coloque-a.

1.3. Encaixe uma nova ponteira.1.4. Selecione e ajuste o volume que ser testado (este no dever ser alterado durante o teste).1.5. Pr-rinse a ponteira, aspirando a alquota do recipiente de origem e dispensando no recipiente

de descarte 5 vezes, para equilibrar a umidade do ar dentro da atmosfera da pipeta.1.6. Coloque o recipiente para pesagem com gua no prato da balana e tare-a (m0= 0).

2. Ciclo do teste

Cada ciclo do teste deve demorar menos de 1 minuto. Entretanto, um ritmo constante durante aoperao de pesagem deve ser mantido (o ritmo do ciclo e entre os ciclos).

2.1. Encaixe uma nova ponteira na pipeta.2.2. Pr-rinse a ponteira aspirando e dispensando no recipiente de descarte uma vez.2.3. Aspire, como especificado no captulo 3, o volume a ser testado.

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Calcule a temperatura mdia (t) da gua destilada (avariao mxima entre t1 e t2: 0,2C)

t = (t1 + t2)/ 2

2. Clculo da presso mdia

Use a presso baromtrica mdia (B) e a temperaturamdia (t) para determinar o Fator-Z correspondente natabela.

B = (B1 + B2)/ 2

3. Clculo do volume a partir da massa

Multiplique as massas (mg), depois das correes dasperdas por evaporao (para volumes abaixo de 50 L)pelo fator Z para obter os volumes (L).

Vi= Z (mi + e)

Vi = volumes individuais (L)

mi= massas individuais (mg)

e = taxa de evaporao (mg)Z= fator Z (L/ mg)

4. Clculo do volume mdio

Aps calcular o volume individual das pesagens, calculeo volume mdio (resultado expresso em L).

Vi= Volumes individuais

V = volume mdion= nmero de pesagens

2.4. Se o recipiente para pesagem possuir tampa, remova-a.2.5. Dispense o volume testado no recipiente para pesagem e recoloque a tampa com o auxlio da

pina.2.6. Registre a massa m1 do volume testado.2.7. Tare a balana.

3. Repita o teste descrito acima (do item 2.1 ao 2.7) at completar 10 medidas (m1 a m10).

4. Aps a ltima medida, verifique e registre a temperatura da gua do recipiente de origem(t2), a presso atmosfrica e a umidade relativa da sala.

8.6.3. Clculos

1. Clculo da temperatura mdia

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5. Exatido (erro sistemtico)

Diferena entre o volume mdio do teste e o volumeajustado na pipeta. Para pipetas de volume fixo, substituaVs por Vo = volume nominal. A exatido pode serexpressa em mL ou...

...como porcentagem:

es = V - Vses = erro mdioV = volume mdioVs = volume ajustado

es = 100% (V - Vs)/Vs

6. Preciso (erro aleatrio)

Disperso dos volumes dispensados ao redor da mdiados volumes dispensados. Tambm conhecida (de acordocom o contexto) como desvio padro, reprodutibilidadeou repetibilidade.

Vi = volumes individuais

V = volume mdio (calculado comono item anterior)

n = nmero de medidasDP = desvio padro

Como porcentagem, tambm conhecido comocoeficiente de variao (CV).

CV = (DP/ V)x 100%

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Clculos: fator ZZ = fator de converso (mL/ mg), t (C) = mdia da temperatura* , B = presso atmosfrica (hPa)

* esta mdia obtida a partir do valor da temperatura da gua do recipiente de origem medida noincio do teste (t1) e da temperatura da gua do recipiente de origem medida ao final do teste (t2).

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8.6.4. Especificaes

TABELA 1

Esta tabela de especificaes se aplica s pipetas de deslocamento de ar de volume fixo e parapipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares e pistes reutilizveis.

Esta tabela tambm pode ser utilizada para as pipetas de deslocamento de ar de volume varivel.O volume nominal nestas pipetas o maior volume selecionvel pelo usurio e especificadopelo fabricante. Por exemplo: uma pipeta com a faixa de volume especificada de 10 L a 100 L,o volume nominal 100 L. Os erros mximos aceitveis para o volume nominal se aplicam atodos os volumes da faixa especificada: se considerarmos uma pipeta com uma faixa de volumede 10 L a 100 L, o erro sistemtico mximo aceitvel para qualquer volume selecionado de0,8 L e o erro aleatrio mximo aceitvel para qualquer volume selecionado de 0,3 L.

Para volumes intermedirios aos relacionadas na tabela, o valor absoluto dos erros mximos aceitveis do volumeimediatamente maior se aplicam. Por exemplo: para determinar os erros mximos aceitveis para 25 L, usa-se osvalores especificados para 50 L.

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TABELA 2

Esta tabela de especificaes se aplica s pipetas de deslocamento positivo que utilizem capilares epistes reutilizveis e/ ou com volume fixo.

Para volumes intermedirios aos relacionadas na tabela, o valor absoluto dos erros mximos aceitveis do volumeimediatamente maior se aplicam.

OBSERVAES

O usurio pode definir os erros mximos aceitveis (sistemtico e randmico) com base na suametodologia.

O usurio deve testar seu equipamento regularmente, como por exemplo, a cada trs meses.Outros intervalos de tempo entre os testes podem ser estabelecidos (desde que no ultrapasseum ano) com base nos seguintes aspectos: freqncia de uso, nmero de usurios da pipeta,natureza agressiva do material transferido, os erro mximos aceitos pelo usurio.

Quando o teste for feito aps manuteno ou reparo do equipamento, os erros mximos aceitveis(sistemtico e aleatrio) devem obedecer s tabelas relacionadas neste documento (tabela 1 e 2).

8.6.5. Relatrio do procedimento de verificao

Aps o teste, necessrio que as informaes sejam registradas. Anexamos um modelo de relatrio,mas o usurio pode elaborar o seu prprio modelo, desde que este contenha as seguintes informaes:

Identificao da pipeta; Data; Condies do teste (temperatura, presso, umidade relativa); As medidas obtidas para cada volume testado; Os resultados dos clculos; Resultado da comparao com a tabela de especificao.

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Identificao da pipetaModelo Nmero de srie Ponteiras utilizadas no teste

Identificao do tcnicoEmpresa Nome Tel/Email

Tcnico Nome Tel/Email

CondiesData/ Hora do teste Localizao

Temperatura (C) Umidade (%) Presso (hPa)

BalanaModelo Nmero de srie Sensitividade

Resultados do teste

MODELO:

COMPARADO COM AS ESPECIFICAES: APROVADA "REPROVADA "

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8.6.6. Exemplo numrico de verificao da performance

Vamos colocar um exemplo com os clculos que devem ser feitos na verificao da performance.Tomaremos como base a verificao hipottica de 10 L em um pipeta de deslocamento de ar devolume varivel.

1. Como o volume testado menor do que 50 L, a taxa de evaporao deve ser determinada(item 8.6.1.).

Nmero de medidas: 04 (e1, e2, e3 e4)

Taxa de evaporao mdia: e

e1 = 0.016 e3 = 0.021

e2= 0.018 e4 = 0.017

e = (e1 + e2 + e3 + e4)/4 (mg)

e = (0.016 + 0.018 + 0.021 + 0.017)/4

e = 0.018 mg/ por ciclo

2. Registra-se a temperatura e a presso inicial do teste:Ti = 21.5CPi = 1013

3. Realiza-se 10 medidas (item 8.6.2.) e os valores so registrados.

W1 = 9,84W2 = 9,90W3 = 9,91W4 = 9,86W5 = 9,87

W6 = 9,90W7 = 9,92W8 = 9,93W9 = 9,95W10 = 9,92

4. Registra-se a temperatura e a presso final do teste:Tf = 21,5CPf = 1013

5. Clculo da presso e temperatura mdia:

T = (Ti + Tf) / 2T = (21,5 + 21,5)/ 2T = 21,5C

P = (Pi + Pf) /2P = (1013 + 1013) / 2P = 1013

Estes valores de temperatura e presso mdios sero utilizados na determinao do fator de conversoZ.

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6. Converso da massa para volume:Vi = (Wi + e) x Z

Para uma temperatura de 21.5C e uma presso atmosfrica de 1013 hPa o fator Z igual a 1.0032L/ mg.

7. Clculo do volume mdio

V = (9,89 + 9,95 + 9,96 + 9,91 + 9,92 + 9,95 + 9,97 + 9,98 + 10,00 + 9,97)/10V = 9,95 L

8. Anlise da exatido Erro sistemtico - EE= V - VoVo o valor ajustado na pipeta (volume nominal). Neste exemplo equivale a 10L.E = 9,95 - 10E = - 0,05 L

Erro relativo - E%E% = (V - Vo) x 100/ VoE% = (-0.05*100)/ 10E% = - 0,50 %

9. Anlise da preciso (repetibilidade - erro aleatrio) Desvio padro - DP

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DP2v = 1/9 x [(9,89 - 9,95)2 + (9,95- 9,95)2 + (9,96 - 9,95)2 + (9,91 - 9,95)2 + (9,92 - 9,95)2

+ (9,95 - 9,95)2 + (9,97 - 9,95)2 + (9,98 - 9,95)2 + (10,00 - 9,95)2 + (9,97 - 9,95)2 +]

DPv = 0,03 L

Coeficiente de variao CVCV = (DP/ V)x 100%CV= (0,03/9,95) x 100%CV = 0,34 %

10. Colocamos os resultados no relatrio (item 8.6.5.)

Na tabela 1 (item 8.6.4.) temos as seguintes especificaes para 10 L (tabela 1):

s comparar os resultados obtidos (relatrio) com o especificado na tabela. Neste caso, a pipetatestada est aprovada.

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9. ANEXO III: PROCEDIMENTOS DE DESCONTAMINAO

Os procedimentos descritos a seguir podem ser utilizados para alguns modelos de pipetas, emparticular aquelas com pisto metlico. Por isso necessrio consultar as instrues do fabricanteantes de aplicar qualquer um dos mtodos descritos aqui.

INTRODUO

Neste documento, esto descritas uma srie de mtodos para descontaminao da pipeta,especialmente as de pisto metlico. Estes mtodos podem ser fsicos (autoclavagem ou irradiaoUV) ou qumicos. De acordo com o tipo de utilizao da pipeta, deve-se escolher o mtodo dedescontaminao mais eficiente.

Entretanto, considerando o espectro de ao, as vantagens e desvantagens destes mtodos, conclumosque o mtodo mais eficiente a descontaminao qumica.Solues qumicas comerciais, compostas tanto de detergentes como de desinfetantes, garantemuma descontaminao eficiente.

Como o mtodo de descontaminao qumica eficiente, rpido e fcil de realizar, o recomendamospara os procedimentos de descontaminao de rotina.

Procedimento de descontaminao

Os tipos de contaminao podem ser: da amostra para o operador, de uma amostra para outra ou daamostra para a pipeta. Isto pode afetar a segurana do operador, da amostra e conseqentemente oresultado do experimento ou, finalmente, a pipeta.

Existem muitos mtodos para eliminar contaminantes, mas existem algumas dvidas em relao asua eficincia e sua compatibilidade com as pipetas.

Neste documento procuramos esclarecer as dvidas relacionadas ao processo de descontaminao,considerando a variedade de aplicaes das pipetas. Assim, diferentes campos de aplicao serocomentados (qumica, microbiologia e biologia molecular), e mtodos qumicos ou fsicos serodiscutidos. A eficincia do mtodo pode ser explicada atravs do seu mecanismo de ao. Quandomais de um mtodo for proposto, ser feita uma comparao entre eles para auxiliar na escolha domais adequado. Aps a escolha do mtodo de descontaminao, consulte os protocolos no finaldeste captulo.

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Campo de aplicao

9.1. Qumica

Simplesmente lavando as pipetas com gua destilada, as contaminaes por cidos, bases, tampesou solventes orgnicos so eliminadas.

Pode haver necessidade de remoo de outros produtos, tais como leos e graxas. Ento, necessrioutilizar detergentes. Detergentes (surfactantes aninicos) so molculas orgnicas com umaextremidade polar, hidroflica e outra no polar, hidrofbica. Devido a sua estrutura eles tornamresduos insolveis (graxa, por exemplo) em solveis, sendo, portanto, agentes de limpeza eficientes.

9.1.1. Procedimento de limpeza padro (maiores detalhes consultar anexo I)

Este procedimento deve ser utilizado para eliminar os contaminantes provenientes do uso da pipeta(por exemplo: protenas e tampes) e que no requerem tratamento especial para serem eliminados,tais como microorganismos, radiatividade e outros, abordados adiante.

Retire o ejetor de ponteiras puxando-o; Desconecte a porca de conexo separando assim o corpo da pipeta do porta-cone; Remova o conjunto do pisto cuidadosamente e separe o(s) selo(s), mantendo o porta-cone

com a parte mais fina para baixo; Coloque o porta-cone, o conjunto do pisto, o ejetor de ponteiras, o(s) selo(s) em um bquer

(no colocar o corpo da pipeta), completando seu volume com soluo de detergente de 4% a8% em gua morna ( 50C);

Coloque o bquer no banho de ultra-som e deixe aproximadamente 15 minutos (caso no tenhaultra-som, deixar na soluo por 40 minutos);

Descarte a soluo de detergente utilizada.

Freqentemente, o(s) selo(s) ficam presos dentro do porta-cone. Para retir-los deve-se recolocar opisto, pression-lo contra o porta-cone, como se fosse fazer uma pipetagem. Retire o pisto quedever trazer preso a ele o(s) selo(s).

Coloque as peas em um recipiente limpo e faa a ltima lavagem com gua destilada; Seque na estufa a aproximadamente 50C (no ultrapasse esta temperatura), durante no mximo

2 horas, ou deixe secar temperatura ambiente.

OBSERVAES

Use soluo de detergente com concentrao de 4% para limpeza de pipetas que apresentampouca sujeira e concentrao de 8% para limpeza de pipetas que apresentarem muita sujeira.

Para as pipetas que aps a lavagem continuarem apresentando algum tipo de sujeira, limpe comalgodo umedecido com lcool isoproplico, tomando cuidado para no danificar o pisto.

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Sempre aps o uso da pipeta com solues cidas e/ou corrosivas, lavar todas as peas comgua destilada ou etanol.

Monte a pipeta.

9.2. Microbiologia e cultura celular

Nestes campos, necessria a eliminao de uma srie de microorganismos (por exemplo: vrus,bactrias e/ou fungos, assim como leveduras).

Vrias tcnicas, com diferentes espectros e mecanismos de ao, podem ser utilizadas.

9.2.1. Autoclavagem

A caracterstica do ciclo de esterilizao depende da quantidade inicial de microorganismos (a chamadacarga microbial). Geralmente, aceita-se que a chance de um organismo vivel estar presente em umitem autoclavado menor do que 1 em 1 milho (Nvel de Garantia de Esterilidade de 10-6).

9.2.2. Irradiao UV

O comprimento de onda UV est entre 100 nm e 400 nm. Existem 3 tipos de radiao UV, deacordo com o comprimento de onda: UVC (200 nm a 290 nm), UVB (290 nm a 320 nm) e UVA(320 nm a 400nm).

9.2.3. Agentes qumicos

A escolha da soluo qumica deve ser feita considerando-se o tipo de microorganismo que se quereliminar.

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Na tabela a seguir, esto relacionados os principais microorganismos e alguns agentes qumicoscomuns. No caso de manipulao de cepas especiais, deve-se considerar produtos comerciaisespecficos para destru-los, e ter certeza da compatibilidade qumica da pipeta com o respectivoproduto qumico (veja 3.3).

Nvel de atividade: +++: forte, ++: mdio, +: fraco, -: sem atividade.

Os mecanismos de ao destes agentes qumicos esto descritos na tabela a seguir:

9.3. Biologia molecular

Os bioqumicos e biologistas moleculares esto familiarizados com as fontes de contaminao comoproteases, cido nuclico contaminantes (DNA, RNA), nucleases (RNases, DNases) e radioatividade.

9.3.1. Proteases

Proteases so enzimas que degradam protenas. Vrios mtodos de descontaminao e seusmecanismos de ao esto detalhados na tabela a seguir:

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9.3.2. cidos nuclicos (DNA e RNA)

A especificidade e a sensibilidade das tcnicas de PCR e RT-PCR possuem uma desvantagem: fcilcontaminao dos reagentes e das amostras, causando erros sistemticos7.

Outro mtodo:

Glicina/ Tampo HCl (pH=2). A ao desta soluo no documentada (veja protocolo maisadiante)

Nota: todos estes mtodos degradam os cidos nuclicos a molculas de pesos moleculares menores,que no so normalmente amplificadas; entretanto, estes mtodos no limpam.

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9.3.3. Nucleases

Nucleases so enzimas que degradam cidos nuclicos. Possuem uma larga distribuio, sendoencontradas em clulas procariticas e eucariticas, vegetais e animais (na pele, na gua). As DNasesno so muito resistentes, no sendo muito crticas para a maioria das aplicaes em biologia molecular,enquanto que as RNases so mais durveis e resistentes ao calor.

As DNases requerem ons metlicos para sua atividade e podem ser inativadas facilmente comalguns tampes apropriados (com agentes quelantes como EDTA). As RNases no precisam deons metlicos, pois utilizam o grupo 2-hidroxil como reativo, no sendo, portanto, fceis de inativar.

9.3.4. Comentrios sobre os cidos nuclicos e nucleases

Todos os mtodos mencionados degradam parcialmente os cidos nuclicos e as nucleases, masnenhum se mostrou 100% eficiente.

A melhor maneira de evitar contaminao em biologia molecular ter alguns cuidados:

Separe reas e conjuntos de pipetas para a preparao da amostra e para conduo dos ensaios. Use ponteiras com filtro para evitar a contaminao por aerossis. Ou, ainda melhor, utilize pipetas de deslocamento positivo com capilares e pistes descartveis

(proteo total contra contaminao cruzada). Para protocolos crticos de PCR, a utilizao daspipetas de deslocamento positivo requerida quando no pode haver contaminao.

9.3.5. Radioatividade

Para contaminao radioativa fraca, detergentes especficos contendo agentes complexantes podemser utilizados.

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Comparao dos mtodos

Os mtodos so comparados considerando primeiramente a sua eficincia em relao aocontaminante, e depois as vantagens e desvantagens.

9.4. Espectro de ao dos mtodos

Considere duas abordagens:

1. Eu tenho os materiais necessrios para realizar este mtodo no meu laboratrio. O quanto ele efetivo (leia a tabela verticalmente)?

2. Eu preciso eliminar este contaminante. O que posso fazer (leia a tabela horizontalmente)?

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Nvel de atividade: +++: forte, ++: mdio, +: fraco, -: sem atividade, SI: sem informao.

*: detergentes especficos (com agentes complexantes).

Para irradiao UV: +: alguma atividade, -: nenhuma atividade.

O limite de atividade da irradiao UV difcil de avaliar, j que sua ao no depende apenas docomprimento de onda (entre 100 nm e 400 nm), mas tambm de outros fatores, como: tempo deexposio, distncia da lmpada, densidade de emisso, ngulo de exposio e temperaturaatmosfrica.

9.5. Vantagens e desvantagens

Consulte a tabela a seguir. O mtodo deve preencher os seguintes requisitos:

Compatibilidade com os materiais de fabricao da pipeta. Ao rpida. Fcil e seguro de realizar.

* Aqueles feitos de PVDF. Porta-cone resistente radiao UV (feitos de PBT) esto disponveispara P200 e P1000.

Assim sendo, os procedimentos qumicos podem ser considerados como os mais aplicveis para adescontaminao das pipetas.

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Protocolos

De acordo com o mtodo utilizado, diferentes partes da pipeta podem ser descontaminadas.

Nota: Use luvas descartveis durante todo o procedimento de descontaminao.

9.6. Autoclavagem

Remova o ejetor de ponteiras e desrosqueie a porca de conexo. Limpe o porta-cone, a porca deconexo e o ejetor de ponteiras com um detergente e depois autoclave por 20 min a 121C, 0,1Mpa. Deixe as peas secarem ou coloque-as na estufa a 50 - 60C por aproximadamente 30min.

Nota: No autoclave estas peas a 134C, pois isto ir danificar as peas.

No autoclave nenhuma outra pea, alm das relacionadas acima.

9.7. Irradiao UV

Lmpadas UV podem ser instaladas no alto da bancada ou em uma capela de biossegurana, ondeas manipulaes podem ser realizadas. A combinao de bulbos de 254 nm e 300 nm durante 20min pode destruir DNA dupla fita (seqncias longas so mais fceis de inativar)7.

9.8. Solues qumicas

Antes de utilizar uma soluo qumica, tenha certeza da compatibilidade com materiais utilizados nafabricao das pipetas. O fabricante deve fornecer uma lista dos materiais utilizados na fabricaoda pipeta. Abaixo alguns exemplos:

PVDF, PBT, PC, PE, POM, borracha nitrlica, ao inoxidvel, ABS, PEI e PMP. Veja o Glossrioe Abreviaes.

Nota: no aconselhvel embeber o selo e o oring.

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9.8.1. Descontaminao do porta-cone, ejetor de ponteiras e porca de conexo

Seguem dois exemplos de solues qumicas e seus protocolos.

Hipoclorito de sdio

O Hipoclorito de sdio possui uma larga atividade antimicrobiana, ao antibactericida rpida etambm denatura proteases, DNA e RNA. Alm disso, um agente qumico fcil de utilizar, no txico nas concentraes utilizadas e possui baixo custo.

muito importante limpar a pipeta (com um detergente, como por exemplo Mucapur) antes derealizar a desinfeco com hipoclorito de sdio, pois o mtodo pode perder sua eficincia na presenade altas concentraes de material orgnico.

Limpeza

Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-cone.

Dilua o detergente com gua quente a 50-60C em:a) Um banho de ultra-som

ou emb) Um bquer.

Coloque o porta-cone, o ejetor de ponteiras e a porca de conexo:a) No banho de ultra-som por 15 min .

oub) No bquer - as peas devem ser escovadas.

Retire as peas e enxgue bem.

Antes de descartar a soluo de limpeza, adicione hipoclorito de sdio 10% soluo e deixe agirpor 10 minutos. Este procedimento para que a soluo de limpeza seja descontaminada antes deentrar em contato com a rede de gua local.

Desinfeco

Dilua o hipoclorito de sdio em gua destilada a uma concentrao de 10% e coloque emum bquer grande.

Coloque o porta-cone, ejetor de ponteiras e porca de conexo no bquer e deixe agir por 30min.

Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente da torneira, e depois, com guadestilada.

Deixe secar a 50C - 60C por aproximadamente 30 min. Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta (para que as peas

resfriem antes da montagem da pipeta).

Nota: a soluo de hipoclorito deve ser descartada aps 3 dias.

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Glicina/ Tampo HCl (pH2=2)

Prepare a soluo da seguinte maneira:

Tampo 10x: 30,6g de NaCl; 39,2g de glicina, completar com gua destilada at o volume de 523 ml.Adicione HCl 1N em quantidade suficiente para um volume final de 1000mL.

Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-cone. Coloque o porta-cone, a porca de conexo e o ejetor de ponteiras no tampo diludo 1x (diluio

1/10 do tampo descrito previamente) a 95C por 30 min. Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente de torneira e depois com gua destilada. Deixe secar a 50C - 60C por 30 min. Deixe em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta.

9.8.2. Descontaminao da parte inferior e do corpo da pipeta

Para a maioria das aplicaes, a descontaminao da parte inferior e do corpo da pipeta suficiente.

Uma mistura de agentes qumicos recomendada (detergente e desinfetante em um nico produto).

O corpo da pipeta deve ser limpo com uma soluo compatvel (veja item 3.3) apenas na sua superfcie(no mergulhe o corpo da pipeta na soluo descontaminante). A parte inferior da pipeta, que incluipisto, ejetor de ponteiras, porta-cone e porca de conexo (com exceo dos selos do pisto) tambmdevem ser limpos (utilizando-se escovas pequenas para limpar a parte interna do porta-cone) oupodem ser imersos seguindo o procedimentos seguir:

Remova o ejetor de ponteiras, desrosqueie a porca de conexo e remova o pisto do porta-cone. Dilua o agente qumico selecionado (de acordo com as instrues do fabricante) em um bquer. Coloque as partes inferiores (pisto, ejetor de ponteiras, porta-cone e porca de conexo)

desmontadas no bquer. Enxgue muito bem, primeiramente com gua corrente de torneira e depois, com gua destilada. Seque a 50 C - 60 C por 30 min. Deixe as peas em temperatura ambiente por 15 min antes de montar a pipeta.

Concluso

O mtodo de descontaminao da pipeta selecionado de acordo com seu tipo de aplicao.Descontaminar completamente as peas inferiores e limpar o corpo com a soluo de escolha suficiente para a maioria das aplicaes (veja 3.3.2).

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Apndice 1

E os materiais descartveis (ponteiras, capilares e pistes e as Distritips)?Mtodos utilizados para esterilizao dos consumveis plsticos das pipetas

No laboratrio, a autoclavagem o mtodo mais comum para a esterilizao das ponteiras. Entretanto,este processo leva tempo: o tempo da autoclavagem em si, o ciclo de secagem e a estabilizao emtemperatura ambiente por algumas horas.

Nota: o processo de autoclavagem deve ser feito a 121C (20 min, 1 MPa). No recomendadorealizar a autoclavagem a 134 C , pois isto pode danificar os plsticos.

Dependendo do tipo de material, outros mtodos so utilizados pelo fabricante para deixar osconsumveis esterilizados: xido de etileno ou, mais frequentemente, irradiao (raios gama:60Co,ou raios beta: feixe de eltrons).

Como o processo de fabricao automatizado, at, inclusive o estgio final, so normalmenteproduzidas ponteiras limpas, sem nenhum contato manual.

Comentrios

O xido de etileno altamente txico e mutagnico. Portanto, seu uso tem sido muito questionadopor autoridades de sade e de controle ambiental em muitos pases.A irradiao usada nos processos industriais para esterilizao no deixa os materiais radioativos. Aescolha da dosagem baseada em determinaes experimentais regulares.

Apndice 2

Pirognicos

A contaminao por pirognicos pode ser preocupante em alguns procedimentos farmacuticos,nos quais aparelhos mdicos so utilizados para preparaes parenterais (mencionado em inmerosmtodos da Pharmacopia)4.

Pirgenos so endotoxinas produzidas por bactrias Gram negativas, e so qumica e fisicamenteestveis. Muito pouco tem sido publicado sobre como elimin-los.

A utilizao de raios gama em altos nveis de energia (mnimo de 25 kGy) parece eliminar os riscosda contaminao por pirognicos. Em outras palavras, para que um produto possa ser certificadocomo livre de pirognicos, ele tem que ser fabricado e controlado como um equipamento mdico.

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10. ANEXO IV: DEFINIES

Exatido (erro mdio ou erro sistemtico): diferena entre o volume dispensado e o volumenominal ou o volume selecionado na pipeta.Calibrao: conjunto de operaes que estabelecem a relao entre o volume dispensado e o volumenominal ou selecionado correspondente na pipeta.Volume morto de ar: nas pipetas de deslocamento de ar, o volume de ar entre a parte inferior dopisto e a superfcie do lquido.Taxa de evaporao: estimativa da perda de gua causada pela evaporao durante o processo depesagem.Anlise gravimtrica: procedimento geral baseado na determinao da massa das alquotas degua dispensadas por uma pipeta. Os valores so corrigidos com relao perda por evaporao, eento, a massa real e o volume so calculados, com base na densidade da gua em temperaturasespecficas com correes para a presso atmosfrica do local (fator Z).Volume nominal: maior volume selecionvel pelo usurio e especificado pelo fabricante.Nota: isto significa que, para uma pipeta de volume varivel com uma faixa de volume til de 10l a 100l, o seuvolume nominal 100l.Volume selecionado: volume ajustado pelo usurio, para a dispensa do volume escolhido dentroda faixa de volume til.Nota: para as pipetas e volume fixo, o volume selecionado igual ao volume nominal.Preciso (erro aleatrio): disperso dos volumes dispensados ao redor da mdia dos volumesdispensados. Tambm conhecida (de acordo com o contexto) como desvio padro, reprodutibilidadeou repetibilidade.Repetibilidade: a disperso entre os resultados de medidas sucessivas (realizadas em um curto espaode tempo), onde no h alterao dos parmetros nem das condies.Reprodutibilidade: a disperso entre os resultados de medidas realizadas em condies diferentes(local ou operador diferente), mantendo todos os parmetros constantes.Especificaes volumtricas (erros mximos admissveis): so os extremos permitidos (superiore inferior) para o desvio entre o volume dispensado e o volume nominal ou o volume selecionado.Faixa de volume til: parte do volume nominal que pode ser dispensado, dentro do erro mximoespecificado na Norma Internacional ISO/ DIS 8655. O valor superior da faixa de volume til sempre o volume nominal. O valor inferior 10% do volume nominal, se no estiver especificadode forma diferente pelo fabricante.Recalibrao (ajuste feito pelo operador): um procedimento definido pelo fabricante e quepode ser executado pelo usurio final, para garantir que a pipeta opere conforme as especificaespublicadas.Pesagem: pesar significa determinar a massa de uma alquota.Fator Z: fator de converso (L/mg) considerando-se a densidade da gua em contato com o ar,em funo da temperatura e da presso.Ex: Designao (abreviatura) de um instrumento projetado para dispensar volumes.In: Designao (abreviatura) de um instrumento projetado para aspirar volumes.

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11. GLOSSRIO E ABREVIAES

Glossrio

Detergente: molculas orgnicas que tornam solveis resduos insolveis (leos e gorduras). So agentesde limpeza eficientes (a maioria no elimina microorganismos).

Descontaminao: desinfeco de artigos infectados permitindo sua manipulao/ uso (reduo dosmicroorganismos para um nvel aceitvel).

Nota: a descontaminao qumica implica em um processo prvio de limpeza com um detergentepara que o processo de descontaminao possa ser eficiente.

Desinfeco: eliminao seletiva de alguns tipos de microorganismos para prevenir a sua transmisso(reduo do nmero de microorganismos infectantes abaixo do nvel necessrio para causar umainfeco).

Esterilizao: eliminao completa de todos os organismos (por exemplo: clulas, esporos e vrus).

Abreviaes

DNA: cido DesoxirribonucleicoEDTA: cido Etileno DiaminoTetraacticoRNA: cido Ribonucleico

Materiais

ABS: Estireno Butadieno AcrilonitrilaPBT: PoliButileno TereftalatoPC: PoliCarbonatoPE: PoliEtilenoPEI: Imida PolieterPMP: PoliMetilPentenoPOM: PoliOxiMetilenoPP: PoliPropilenoPVDF: Fluoreto de PoliViniliDeno

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12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Cimino, G.D., Metchette, K.C., Tessman, J.W., Hearst, J.E. and Isaacs, S.T. 1990. Post PCRsterilization: a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction. NucleicAcids Research, 19 (1): 99-107.

Deragon, J.M., Sinnet, D., Mitchell, G., Potier, M., Labuda, D. 1990. Use of irradiation to eliminateDNA contamination for PCR. Nucleic acids research, 18 (20): 6149.

Ferron, A.. 1992. Spectre dactivit des antiseptiques et dsinfectants. Bactriologie mdicale (lusage des tudiants en mdecine), Edition C et R.

Gilson Guide to Pipetting 800353A

prEN ISO/ FDIS 8655-1 - Piston-operated volumetric apparatus

Guyomard, S., Goury, V., Laizier, J., Darbord, J.C. Defining of the pyrogenic assurances level (PAL)of irradiated medical devices. 1987. International Journal of Pharmaceutics, 40: 173-174.

Hanne, A., Krupp, G.. Removing DNA contamination from pipettes. Bionews, Eppendorf, No.8.

Hayatsu, H., Pan, S.K, and Ukita, T. 1971. Reaction of sodium hypochlorite with nucleic acids andtheir constituents. Chem. Pharm. Bull, 19 (10) 2189-2192.

Heinrich, M. 1991. PCR carry-over. BFE, 8 (10): 594-597.

Jette, L.P., Ringuette, L., Ishak, M., Limmer, M. and Saint-Antoine, P. 1995. Evaluation of threeglutaraldehyde-based disinfectants used in endoscopy. J Hosp Infect, 30 (4): 295-303.

Jrgen, H. and Kaiser, K. 1996. Avoiding viral contamination in biotechnological and pharmaceuticalprocesses. Nature Biotechnology, 16: 1077-1079.

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature, 339: 237-238.

Leuci, C. 1998. Intrt des EVC dans le secteur biomdical. Caoutchoucs et plastiques. 769.

Manual de operao da Pipetman P - marca Gilson LT801117

Mifftin, T.E. Control of contamination. Molecular Bio-Products.

Ou, Chin-Yih, Moore, J.L, and Schochetman, G. 1991. Use of UV irradiation to reduce false positivityin Polymerase Chain Reaction. BioTechniques, 10 (4): 442.

Part 1: terminology, general *


Part 2: pipettes *


Part 6: Gravimetric test methods *

Prince, A.M. and Andrus, L. 1992. PCR: how to kill unwanted DNA. BioTechniques, 12 (3): 358-360.

Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. In Vitro Amplification of DNA by the Polymerase ChainReaction. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. 14:14.

Taibi, C. Linfection existe, sa prvention aussi. Guide pratique dhygine hospitalire.

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53 de 53


Tritt, C.S. 1997. Sterilization methods. http://www.msoe.edu/~tritt/be4xx/stermeth.html.

Van Bueren, J., Simpson, R.A., Salman, H., Farelly, H.D. and Cookson, B.D. 1995. Inactivation ofHIV-1 by chemical disinfectants: sodium hypochlorite. Epidemiol Infect, 115 (3): 567-579.

Le contrle des micro-organismes par les agents physiques et chimiques. Partie 4, chapitre 5: lecontrle des micro-organismes.

Extraction and purification of RNA. Extraction, purification, and analysis of messenger RNA from eukaryoticcells (7.3-7.5).

Sterilization and sterility assurance of compendial articles, USPXXI. Sterilization and sterility assurance,general information.

Avoiding Ribonuclease contamination. neb.com.

FICHA TCNICA

Volume II Mdulo 2 gua para Anlises Qumicas Instrumentais

Editor: Jos Muradian Filho - Millipore

Coordenao: Cludia Franklin de Oliveira ANVISA Itapuan Abimael da Silva - ANVISA Karen de Aquino Noffs Brisolla - ANVISA Karla de Arajo Ferreira - ANVISA Marcelo Cludio Pereira - ANVISA Max Weber Marques Pereira - ANVISA Renato Almeida Lopes - ANVISA

SUMRIO

1. GUA PARA ANLISES QUMICAS INSTRUMENTAIS .................................................. 51.1. Introduo ............................................................................................................................................. 51.2. Os contaminantes da gua .................................................................................................................. 5

1.2.1. Compostos inorgnicos dissolvidos ........................................................................................ 61.2.2. Compostos orgnicos dissolvidos ........................................................................................... 61.2.3. Partculas e colides .................................................................................................................. 61.2.4. Microorganismos ....................................................................................................................... 71.2.5. Gases dissolvidos ....................................................................................................................... 7

1.3. Monitoramento e controle da qualidade da gua purificada .......................................................... 71.3.1. Monitorao de contaminantes inicos inorgnicos condutividade e resistividade ...... 81.3.2. Monitorao de contaminantes orgnicos TOC ou COT carbono oxidvel total ..... 10

1.4. Especificaes de qualidade ............................................................................................................. 111.5. Tecnologias de purificao de gua para laboratrios ................................................................... 12

1.5.1. Destilao ................................................................................................................................. 121.5.2. Deionizao .............................................................................................................................. 131.5.3. Osmose reversa ........................................................................................................................ 141.5.4. Eletrodeionizao contnua .................................................................................................... 161.5.5. Ultrafiltrao............................................................................................................................. 181.5.6. Microfiltrao em membrana ................................................................................................. 191.5.7. Carvo ativado ......................................................................................................................... 201.5.8. Radiao ultravioleta (UV) ..................................................................................................... 20

2. ESPECIFICAES PARA GUA PURIFICADA .........................

calibraÇÃo pipeta

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