uso de vectores lentivirales para mediar la …

USO DE VECTORES LENTIVIRALES PARA MEDIAR LA TRANSFECCIÓN DEL

GEN DE LA ENZIMA N-ACETIL-GALACTOSAMINA -6-SULFATO-SULFATASA

EN CÉLULAS EN CULTIVO

María Juliana Herrera Mejía

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

INSTITUTO DE ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO

Bogotá D.C.

2012





Ingrid Schuler, PhD.

Decana Académica

Facultad de Ciencias

Janeth del Carmen Arias Palacios, M.Sc. M.Ed.

Directora Carreras de Microbiología

Facultad de Ciencias





Carlos Javier Alméciga Díaz, Q.F., PhD.

Director

Ismael Zamudio, PhD.

Evaluador

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable

por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo

velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y

porque las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes

bien sea en ellas el anhelo de buscar la

verdad y la justicia”

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de

Julio de 1946

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad por la oportunidad que me brindo para formarme como

profesional y los Profesores por trasmitirme sus conocimientos.

A mi tutor Javier Alméciga por abrirme las puertas del IEIM al brindarme este

trabajo de grado, por compartir conmigo cada uno de sus conocimientos, por

confiar en mí y apoyarme cada minuto con esa palabra de aliento y esa alegría al

llegar al laboratorio.

A todas las personas que hacen parte del IEIM por brindarme esa mano amiga y

por las ayudas que siempre recibí de cada uno de ellos.

A todas las personas que de alguna manera colaboraron y apoyaron para el buen

desarrollo de este trabajo.

A Dios por ser mi padre y guía, por

permitirme alcanzar este nuevo logro

que hoy me llena de satisfacción, por

mostrarme que cada obstáculo es una

oportunidad de superación.

A mi hermano Santiago por ser el motor

de mi vida, y ser el dueño de cada uno

de mis logros, porque cada vez me llena

de motivos para salir adelante.

A mis padres por crear de mi lo que soy

hoy, por su amor, comprensión y por

todos los consejos que hicieron de este,

un proyecto posible.

A mis tías por el apoyo siempre

incondicional, porque no hubo segundo

que no estuvieran ahí, por vivir conmigo

esta etapa tan importante de mi vida.

.

TABLA DE CONTENIDO

1.RESUMEN…………………………………............................................................16

1.1 ABSTRACT…………………………………......................................................17

2. INTRODUCCIÓN……………………………........................................................18

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...............................21

4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES…………………….......23

4.1 Errores Innatos del Metabolismo……………...…………………………….....23

4.2 Las Mucopolisacaridosis…………………………...……………………………23

4.3 Mucopolisacaridosis IVA - Morquio A………………………………...………..26

4.3.1 Características Bioquímicas…………………………………………………..27

4.3.1.1 Queratán sulfato y condroitín-6-sulfato………………………..…………..27

4.3.1.2 Gen GALNS…………….…………………………………………………….31

4.3.1.3 Enzima GALNS………………...…………………………………………….33

4.3.2 Características Clínicas……………………...………………………………..37

4.3.3 Diagnóstico……………………...………………………..…………………….40

4.3.4 Tratamiento……………………………...……………………………………...43

4.4 Terapia Génica……………………………………………………………………44

4.4.1 Generalidades…………………………………...……………………………..45

4.4.2 Vectores empleados en Terapia Génica………………………………...…..45

4.4.3 Vectores derivados de virus adenoasociados y su uso en terapia

génica…………………………………………………..……………………………...46

4.4.4 Vectores lentivirales y su uso en terapia génica………………...………….49

5. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...56

5.1 Objetivo general…….…………...……...………………………………………..56

5.2 Objetivos específicos…..………………...………………………………………56

6. METODOLOGÍA………………………………………………………………………57

6.1 Producción de vectores lentivirales………………………...…………………..57

6.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS………………57

6.1.2 Cultivo células 293FT……………...…………………………………………..57

6.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT……………...………..58

6.1.3.1 Concentración y precipitación de vectores Lentivirales con PEG 6000.59

6.1.3.2 Titulación Vectores Lentivirales…………………………………………….59

6.2 Producción adenoasociados a partir de células HEK293….……...………...60

6.2.1 Cuantificación de vectores adenoasociados...……………………………...62

6.3 Evaluación de vectores lentivirales………………...…………………………..63

6.3.1 Cultivo células HEK293 y Fibroblastos Morquio A…………….………...…63

6.3.2 Transfección células HEK293 y fibroblastos humanos MPS IVA con

vectores lentivirales………………………………...………………………………...64

6.4 Evaluación de vectores adenoasociados……………………...………………64

6.4.1 Transfección de células HEK293 con los vectores adenoasociados....….64

6.5 Cuantificación de proteína por el método de MicroLowry……...…………...65

6.5.1 Determinación de la actividad enzimática……...……………………………65

6.6 Análisis estadístico……………………………………………………………….66

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS………………………………...68

7.1 Producción de Vectores Lentivirales……………...……………………………68

7.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS………...…....68

7.1.2 Cultivo células 293FT………………………...………………………………..70

7.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT…………………...…..71

7.1.3.1Titulación Vectores Lentivirales……………………………………………..71

7.2 Producción y cuantificación de adenoasociados a partir de células

HEK293………………………………………………………………………………..72

7.3 Evaluación de vectores lentivirales………………………………………...…..73

7.4 Evaluación de vectores adenoasociados………………………………...……77

8. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….86

9. RECOMENDACIONES………………………………………………………………88

10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..89

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Catabolismo del Queratán Sulfato……………………………………...…..31

Figura 2. Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima

lisosoma…………………………………………………………………………………..36

Figura 3. Estructura terciara de la enzima GALNS………………………………….37

Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas

en pacientes con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A……………………39

Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALN..42

Figura 6. Composición estructural de los lentivirus…………………………………..51

Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus…………………………………………...53

Figura 8. Genoma Lentivirus……………………………………………………………54

Figura 9. Plásmido pLenti6/V5-D-TOPO………………………………………………57

Figura 10. Secuencia de pLenti6/V5-D-TOPO………………………………………..69

Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina…………………..70

Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6…………………………………………………..71

Figura 13. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293

transfectados con vectores lentivirales…………………….……………………….…75

Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares

HEK293 transfectados con vectores lentivirales……………………………………..76


transfectados con vectores adenoasociados…………………………………………79

Figura 16. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares

HEK293 transfectados con vectores adenoasociados………………………………80


transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1………………..81

Figura 18. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados célulares

HEK293 transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1……..82

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis…………………………………...25

Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos…………...30

Tabla 3. Características de vectores empleados en terapia génica………………..46

Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus………………..52

Tabla 5. Titulación vectores lentivirales……………………………………………….72

Tabla 6. Cuantificación de los vectores recombinante………………………………73

ANEXOS

ANEXO A: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en células transfectadas con vectores lentivirales (Realizados en SPSS)…119

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad……………………………………………..…….119

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………………………………………………………..119

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos…………………..……119

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes…………….…….120

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células Lentivirus 1

MOI”……………………………………………………………………………………...120

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Células Lentivirus 5

MOI”……………………………………………………………………………………...120

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “Células Lentivirus 1 MOI” y grupo “Células

Lentivirus 5 MOI” ………………………………………………………………………121

ANEXO B: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en medios de células transfectadas con vectores lentivirales (Realizados en

SPSS)……………………………………………………………………………………122

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad…………………………………………………….122

Tabla 1.2 ANOVA de un factor…………………………………..……………………122

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos……..…………………122

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes……….………….123

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 1

MOI”…………………………………………………………………………...…………123

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 5

MOI”…………………………………………………………………………….………..123

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “Medio células Lentivirus 1 MOI” y grupo “Medio

células Lentivirus 5 MOI”………………………………………………………………125

ANEXO C: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS)

(Realizados en SPSS)……………………………………………………...…………126

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad…………………………….………………………126

Tabla 1.2 ANOVA de un factor……………………………………………….……….126

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………….…………….126

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes…………………..127

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS 1

GV”……………………………………………………………………………………....127


GV”……………………………………………………………..………………………..127


GV”……………..………………………………………………………………………..128

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Células

AVV-GALNS 5 GV” ……………………………………………………………………129


AVV-GALNS 10 GV” …………………………………………………………………..130


AVV-GALNS 10 GV”…………………………………..……………………………….131

ANEXO D: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en medios de células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-

GALNS) (Realizados en SPSS)……………………………………….…………….132

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad………………………………………..…………..132

Tabla 1.2 ANOVA de un factor…………………………...…………………………..132

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos…………..……………132

Tabla1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………………..….133

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 1

GV”……………………………………………………………………………………….133

Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 5

GV”………………………………………………………………………………….……134

Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS

10 GV”……………………………………………………….…………………………..134

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio

células AVV-GALNS 5 GV” ………………………………….………………………..135

Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio

células AVV-GALNS 10 GV”…………………………………….…………………….135


AVV-GALNS 10 GV”……………………………………………………….…………..136

ANEXO E: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS SUMF1)

(Realizados en SPSS)………………………………………………………………...138

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad……………………………………………..……..138

Tabla 1.2 ANOVA de un factor……………………………………………….……….138

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………………………..138

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes…………………..139

Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1

1 GV”…………………………………………………………………………………….139


5 GV”………………………………………………………………………………….…140


10 GV”…………………………………………….……………………………………..140

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo

“Células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”……………………………..………………….141


“Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”……………………………………………….142


“Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”…………………………………..…………..142

ANEXO F: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos

en medios de células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-

GALNS SUMF1) (Realizados en SPSS)…………………………………………...144

Tabla 1.1 Pruebas de normalidad……………………………………………..……..144

Tabla 1.2 ANOVA de un factor………………………………………..………………144

Tabla 1.3 Pruebas Post Hoc: Subproductos Homogéneos………..………………144

Tabla 1.4 Pruebas de t-student para muestras independientes………………......145


SUMF1 1 GV”………………………………………………………………………...…145


SUMF1 5 GV”…………………………………………………………………….……..145


SUMF1 10 GV”………………………………………………………….………………146

Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y

grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”………………..………………..147


grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”………………………………..148


grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”………………………………..148

16

1. RESUMEN

La enfermedad de Morquio A (MPS IVA) es un desorden autosómico recesivo

producido por la alteración en la actividad de la enzima N-acetilgalactosamina-6-

sulfato sulfatasa (GALNS), llevando a la acumulación intralisosomal de los

glicosaminoglicanos (GAGs) queratán sulfato y condroitín 6 sulfato, principalmente

en cartílago y córnea. Actualmente no existe un tratamiento específico para

los pacientes con MPS IV A, por lo cuál es importante evaluar diferentes

estrategias para el desarrollo de una terapia segura y efectiva para estos

pacientes. En el presente trabajo se evaluó la efectividad en la entrega del

material genético por parte de vectores lentivirales y adenoasociados (AAV) en

células HEK293. Los resultados mostraron que los vectores lentivirales,

produjeron un aumento en la actividad enzimática de hasta 3,1 veces más en los

lisados celulares y 5,2 veces en los medios de cultivo con respecto a los valores

del control negativo, lo que los hace buenos candidatos para terapia génica en

Moquio A. Por otra parte, los vectores AAV mostraron un aumento en la actividad

hasta 2,1 veces más tanto en el lisado celular como en el medio. En presencia de

SUMF1 la actividad alcanzó fue 1,9 y 44,5 veces mas alto en el lisado celular y el

medio de cultivo en comparación con el control negativo. Este es el primer ensayo

in vitro para MPS IVA en el que se pone en evidencia la posibilidad de hacer uso

de vectores lentivirales para el desarrollo de una estrategia de terapia génica para

esta enfermedad.

17

1.1 ABSTRACT

Morquio A disease (MPS IV A) is an autosomal recessive disorder caused by the

deficiency of N-acetyl-galactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS) enzyme, leading

to accumulation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate mainly in bone and

cornea. Currently no effective therapies exist for MPS IVA, for which is important to

evaluate different strategies for the development of a safe and effective therapy for

MPS IV A patients. In the present study we evaluated the effectiveness of lentiviral

vector to mediate the delivery of GALNS gene to cultured cells, in comparison with

an adenoassociated virus (AAV) derived-vector. The results showed that the

lentivirals vectors produced a 3.1- and 5.2-fold increase in enzyme activity cell

lysate and culture medium, respectively, than that observed in nontransfected

cells. On the other hand, the AAV vectors showed an increase in the activity up to

of 2.1 times in both cell and culture medium. Furthermore in presence of SUMF1

gene the activity reached up to 1,9 in cell lysate and 44,5 times more in culture

medium than that observed in nontransfected cells. This is the first in vitro assay

for MPS IVA, which demonstrates the feasibility of using lentiviral vectors to

develop a gene therapy strategy for MPS IV A.

18

2. INTRODUCCIÓN

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de enfermedades producidas por

alteraciones en el metabolismo de los GAGs, también conocidos como

mucopolisacáridos (1). Los GAGs están constituidos por cadenas de disacáridos

secuenciales que se unen a una proteína central constituyendo proteoglicanos que

forman parte de la matriz extracelular de los tejidos, lo que se explica en parte el

carácter multisistémico de las MPS (2). Las MPS se producen por acumulación

progresiva de GAGs en los lisosomas de las células del tejido conectivo, incluido

cartílago y hueso. Esta acumulación es producida por la deficiencia de una de las

enzimas lisosomales que los degradan en unidades menores dentro del lisosoma.

La MPS IV A o enfermedad de Morquio A, es una patología de tipo autosómico

recesiva producida por la deficiencia en la actividad de la enzima N-acetil-

galactosamina-6-sulfato-sulfatasa (GALNS), la cual se encarga de catalizar el

catabolismo de los GAGs queratán sulfato (QS) y condroitín-6-sulfato (C6S) (3).

El gen GALNS ha sido clonado y mapeado al cromosoma 16q24.3 (2). Los

pacientes Morquio A se caracterizan por anomalías esqueléticas como talla baja,

tronco corto, hiperlaxitud articular, cuello corto, opacidades corneales, facies

toscas y un severo compromiso cardiaco (4,5).

MPS IVA presenta una incidencia que varía entre 1:45000 nacidos vivos, en

Holanda y Portugal, a 1:76000 nacidos vivos, en Irlanda del Norte (5). Hasta el

19

momento, Colombia no cuenta con cifras sobre la incidencia de esta enfermedad.

Sin embargo, algunos estudios apuntan a que Colombia podría ser uno de los

países con mayor número de individuos afectados con esta enfermedad (6,7).

Adicionalmente, se ha documentado el hallazgo de esculturas precolombinas con

claros rasgos de individuos afectados con MPS IVA; lo que sugiere la presencia

del desorden desde la época prehispánica (8).

Actualmente no existe un tratamiento específico para los pacientes con MPS IV A,

por lo cuál es importante evaluar diferentes estrategias para el desarrollo de una

terapia segura y efectiva para estos pacientes. Dentro de las diferentes opciones,

la terapia génica puede ofrecer al paciente efectos positivos por las siguientes

razones (9): (a) niveles de actividad enzimática del 10% permiten pasar de un

fenotipo severo a uno intermedio o atenuado, (b) no se requiere una regulación

estricta del gen terapéutico, por tratarse de genes de expresión constitutiva, (c) la

corrección de células no transfectadas es posible debido al mecanismo de

corrección cruzada por la captación de la enzima recombinante mediante

receptores de manosa-6-fosfato, (d) ensayos preclínicos de terapia génica en

diferentes modelos animales de MPS ha demostrado la posibilidad de realizar la

corrección de la enfermedad durante periodos de tiempo hasta de 1,5 años en

ratones y 8 años en perros y (e) la coexpresión con el gen del factor activador de

sulfatasa (Sulfatase Modified Factor 1, SUMF1), que codifica para la enzima

formadora de formilglicina encargada de la activación de todas las sulfatasas, ha

20

permitido incrementar hasta 3 veces la actividad de diferentes sulfatasas,

incrementando los beneficios de la terapia en aquellas enfermedades producidas

por la deficiencia de una sulfatasa en las que se ha evaluado su coexpresión con

SUMF1 (10,11). Para Morquio A se han evaluado vectores retrovirales (12),

plasmídicos (13) y derivados de virus adenoasociados (14) (15).

Para el establecimiento de una estrategia de terapia génica para la enfermedad de

Morquio A, en el presente trabajo se evaluaron in vitro vectores lentivirales y

vectores derivados de virus adenoasociados (AAV). En este sentido, se realizó la

producción, concentración y precipitación pertinente de vectores lentivirales a

partir del cultivo de células 293FT con el fin de realizar una posterior titulación de

los mismos. Paralelo a esto se produjeron vectores adenoasociados a partir del

cultivo de células HEK293 y finalmente ambos vectores fueron evaluados en

células HEK293, para lo cual se realizó la transfección y posterior cuantificación

de proteína por el método de MicroLowry y determinación de la actividad

enzimática. Finalmente se hizo un análisis estadístico con el propósito de

comparar los resultados obtenidos durante el estudio.

21

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La enzima lisosomal N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa es la encargada del

catabolismo de los glicosaminoglicanos QS y C6S, mediante la remoción del

sulfato presente en los residuos de galactosa y N-acetilgalactosamina,

respectivamente (16). La deficiencia en la actividad de GALNS produce la

mucopolisacaridosis IV A. En la actualidad, la mucopolisacaridosis tipo IV A no

cuenta con un tratamiento que muestre beneficios significativos para aquellos

pacientes que la padecen. Sin embargo, se han realizado diversos estudios

utilizando terapia de reemplazo enzimático como la más viable. Esta tiene como

objetivo sustituir la enzima que se encuentra ausente o deficiente (17). No

obstante, ésta terapia presenta algunas complicaciones que hacen de ella un

tratamiento dispendioso puesto que se requiere que la enzima sea administrada

semanalmente, lo que obliga al paciente a estar cuatro o cinco horas recibiendo

dicho procedimiento, y presenta costos que pueden alcanzar los US$500.000 por

paciente al año (18,19).

Es aquí donde la terapia génica surge como una posible estrategia para el

tratamiento de ella. La terapia génica se basa en la entrega intracelular de material

genético para producir diversos efectos mediante el reemplazo o reparación del

gen defectuoso, lo que permitirá a la célula sintetizar el producto de dicho gen

adecuadamente (20).

22

En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo de la Pontificia Universidad

Javeriana se ha trabajado durante los últimos años en la evaluación de vectores

derivados de virus adenoasociados para el tratamiento de la enfermedad de

Morquio A. Los ensayos in-vitro e in-vivo han mostrado la factibilidad de usar estos

vectores para el tratamiento de esta enfermedad. Sin embargo, con el objetivo de

incrementar los niveles de actividad enzimática es necesaria la evaluación de

otros vectores virales.

En este sentido es importante reconocer que tan factible es el uso de vectores

lentivirales, sustituyendo así el tratamiento de reemplazo enzimático por uno que

se base en terapia génica, requiriendo con éste una sola administración de la

terapia. Adicionalmente, antes de realizar la evaluación de los vectores en

modelos de animales no humanos, es necesaria su evaluación en células en

cultivo. En la actualidad no existen reportes del uso de vectores lentivirales para la

transfección del gen GALNS.

En el presente trabajo se evaluará un vector derivado de un vector lentiviral para

mediar la transferencia del gen GALNS en células HEK293 y fibroblastos de

paciente MPS IV A. Estos resultados serán comparados con los obtenidos con

vectores derivados de virus adenoasociados, permitiendo la selección del vector

que produzca los mayores niveles de actividad GALNS.

23

4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES

4.1 Errores Innatos del Metabolismo

Los errores innatos del metabolismo son un grupo de enfermedades genéticas que

implican alteraciones bioquímicas incluyendo mutaciones en los genes y

deficiencia enzimática favoreciendo la acumulación del sustrato sobre el que

actúan, generando así trastornos del metabolismo que contribuyen

significativamente a la discapacidad física y psicomotriz (21-23).

Dentro de los EIM conocidos se encuentran las enfermedades de

almacenamiento lisosomal, las cuales se clasifican de acuerdo al sustrato

acumulado e incluyen esfingolipidosis, glicoproteinosis, mucolipidosis,

mucopolisacaridosis, entre otras (24).

4.2 Las Mucopolisacaridosis

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de 11 enfermedades de depósito

lisosomal (EDL) originadas debido a errores innatos del metabolismo de los

glucosaminoglicanos, también llamados mucopolisacáridos (1). Estas

enfermedades son producidas por la pérdida de la actividad, total o parcial, de una

de las enzimas involucradas en su catabolismo. Estos están constituidos por

cadenas de disacáridos secuenciales que se unen a una proteína central

constituyendo los proteoglicanos, que forman parte de la matriz extracelular de los

24

tejidos (25). Entre ellos se encuentran el dermatán sulfato (DS), heparán sulfato

(HS), queratán sulfato (QS), condroitín 4- o 6- sulfato (C4S, C6S) y el ácido

hialurónico (2).

Las MPS se producen por acumulación progresiva de GAGs en los lisosomas de

las células del tejido conectivo, incluido cartílago y hueso. Son causadas por la

deficiencia de las enzimas lisosomales que los degradan (26), las cuales se

encargan de degradar las cadenas de polisacáridos en unidades menores dentro

del lisosoma. Los fragmentos resultantes son degradados por hidrólisis

secuenciales de sus terminaciones. De esta forma, su deficiencia produce

depósito intralisosomal de glucosaminoglicanos degradados incompletamente, lo

que altera la fisiología celular. La Tabla 1 resume el defecto enzimático y las

principales manifestaciones clínicas de las 11 MPS. Con excepción de la MPS II,

la cual posee una herencia ligada al cromosoma X, las MPS son desórdenes de

tipo autosómico recesivos.

Clínicamente las MPS se caracterizan por ser desórdenes multisistémicos

progresivos con alteraciones en riñón, bazo, corazón, sistema esquelético y/o

sistema nervioso central. Sin embargo, entre pacientes con la misma deficiencia

enzimática se presentan diferentes manifestaciones (3, 27). Su tratamiento

requiere la implementación de estrategias paliativas, cirugías de corrección y

prevención, trasplante de médula ósea (28-31) y administración de TRE para MPS

25

I (32,33), MPS II (31,34), MPS VI (35,36). Esta última ha demostrado beneficios

para los pacientes en cuanto a calidad de vida y manifestaciones somáticas (19,

37, 38).

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (14)

Nombre OMIM Enzima deficiente

Gen locus Principales características clínicas

GAGs afectados

MPS IH Enfermedad de Hurler

607014 α-L-iduronidasa 4p16.3 Opacidad corneal, disostosis múltiple,

organomegalia, enfermedad cardiaca, retardo mental, muerte

en la niñez.

Dermatán sulfato y heparán sulfato

MPS IS Enfermedad de Scheie

607015 α-L-iduronidasa

4p16.3 Opacidad corneal, articulaciones rígidas e

inteligencia y expectativa de vida normales.


MPS IH/S Enfermedad de Hurler-

Scheie

607016 α-L-iduronidasa 4p16.3 Fenotipo intermedio entre MPS IH y MPS IS


MPS II Severa

Enfermedad de Hunter

309900

Iduronato-2-sulfatasa

Xq28 Disostosis múltiple, organomegalia, retardo

mental, muerte en la adolescencia


MPS II moderada Enfermedad de Hunter

309900 Iduronato-2-sulfatasa

Xq28 Inteligencia normal, estatura corta,

expectativa de vida normal.


MPS IIIA Enfermeda

d de Sanfilippo

A

252900 Heparan N-sulfatasa

(sulfamidasa)

17q25.3 Retardo mental profundo, hiperactividad, leves

manifestaciones somáticas.

Heparán sulfato

MPS IIIB Enfermeda

d de Sanfilippo

B

252920 α—N-acetilglucosamini

dasa

17q21 Fenotipo similar a MPS IIIA

Heparán sulfato

MPS III C Enfermeda

d de Sanfilippo

C

252930 Acetil CoA: α-glucosaminido N-acetil transferasa

8p11.1 Fenotipo similar a MPS IIIA

Heparán sulfato

MPS IIID 252940 N- 12q14 Fenotipo similar a MPS Heparán

26

Enfermedad de

Sanfilippo D

acetilglucosamina-sulfato-6-sulfatasa

IIIA sulfato

MPS IVA Enfermeda

d de Morquio A

253000 N-acetilgalactosami

na-6-sulfato sulfatasa

16q24.3 Corta estatura, displasia esquelética severa, opacidad corneal, hipoplasia de la

odontoides, laxitud de articulaciones

Queratán sulfato y

condroitín sulfato

MPS IVB Enfermeda

d de Morquio B

253010

ß-galactosidasa 3p21.33 Fenotipo similar a MPS IVA

Queratán sulfato (QS)

MPS VI Enfermeda

d de Maroteaux-

Lamy

253200 N-actilgalactosamin

a-4-sulfatasa (arilsulfatasa B)

5q12 Disostosis múltiple, opacidad corneal,

inteligencia normal, muerte en la adolescencia

Dermatán sulfato

MPS VII Enfermeda

d de Sly

253220 ß-glucuronidasa

7q21.11 Disostosis múltiple, hepatoesplenomegalia, presentaciones fetales o neonatales, moderado

retardo mental.

Heparán sulfato,

dermatán sulfato,

condroitín 4- y 6- sulfato

MPS IX Enfermeda

d de Natowicz

601492 Hialuronidasa

3p21.3-p21.2

Estatura corta, masas en tejidos suaves periarticulares

Hialuronan

4.3 Mucopolisacaridosis IVA - Morquio A

La enfermedad Morquio A fue descrita por primera vez por el pediatra uruguayo

Luis Morquio en 1929, en 4 hermanos que presentaban una distrofia esquelética

familiar severa (39). Es una enfermedad autosómica recesiva producida por la

deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS, EC

3.1.6.4), la cual hidroliza el grupo 6-sulfato de las unidades N-acetilgalactosamina-

6-sulfato del C6S y de las unidades D-galactosa-6-sulfato del QS (3,27).

27

La incidencia varía entre 1:45000 nacidos vivos, en Holanda y Portugal, a 1:76000

nacidos vivos, en Irlanda del Norte (5). Aunque Colombia no cuenta con cifras que

muestren la incidencia de esta enfermedad, algunos estudios preliminares apuntan

a que este es uno de los países con mayor número de pacientes Morquio A (6,40).

4.3.1 Características Bioquímicas

4.3.1.1 Queratán sulfato y condroitín-6-sulfato

Los GAGs son moléculas lineales de heteropolisacáridos formados por unidades

repetitivas de disacáridos característicos para cada uno de ellos (Tabla 2). Estos

heteropolisacáridos son modificados por N-acetilación, N- u O-sulfatación y

epimerización, aumentando la diversidad molecular de cada uno de estos

compuestos (2). Las cadenas de GAGs se encuentran unidas a proteínas

centrales formando macromoléculas conocidas como proteoglicanos (PG), los

cuales forman parte de la matriz extracelular de los tejido (41).

QS, uno de los dos GAGs acumulados en MPS IVA, es un heteropolisacárido que

consta de unidades repetidas de disacáridos de N-acetilglucosamina y galactosa,

la mayoría de ellas sulfatadas (Tabla 2) (42). eEs miembro de la familia de

glicosaminoglicanos que poseen una estructura de polisacárido lineal en el que la

unidad principal se repite (43). A diferencia de los otros GAGs que presentan una

28

amplia distribución en el organismo, el QS se encuentra principalmente en córnea

y cartílago, siendo ésta la principal razón del fenotipo característico de la

enfermedad de Morquio A. La estructura química del QS es más compleja y

variable que la de los otros GAGs, y heterogéneas con respecto a la carga y el

tamaño (42).

Dos tipos de QS se encuentran en los mamíferos de acuerdo con la estructura de

la región de ligamento (42,43). El QS tipo I se encuentra principalmente en la

córnea y también está presente en pequeñas cantidades en el cartílago; mientras

que el QS tipo II está presente en los proteoglicanos de cartílago (44,45). El QS I

se encuentra unido mediante enlace N-glucosídico a residuos de asparagina de la

proteína del núcleo (42), con una longitud que varia entre 8 a 34 residuos, y un

extremo no reductor cubierto por ácido neuramínico, N-acetil-β-galactosamina o α-

galactosa (46,47). Aunque en menor proporción, QS I también se encuentra en

cartílago unido a las proteínas fibromodulina, proteínas ricas en prolina/arginina o

leucina (PRELP) y osteoadherina, con cadenas de 8 a 9 polisacáridos y un mayor

grado de sulfatación que el observado en córnea (48-52).

Por su parte, QS II está ligado al agrecan mediante un enlace o-glicosídico a una

treonina o serina (42), este está conformado por cadenas de 5 a 11 disacáridos

altamente sulfatados, con un extremo no reductor cubierto por ácido neuramínico

29

o N-acetilglucosamina (46, 50). QS II puede ser dividido así: QS II-A que está

presente en el cartílago articular y disco intervertebral, contiene fucosa y ácido N-

acetilneuramínico y el QS II-B presente en la tráquea y el cartílago nasal, en el

cual están ausentes los residuos de fucosa y ácido N-acetilneuramínico (42, 51).

Un tercer posible QS ha sido identificado en el cerebro y se caracteriza por su

unión a la proteína central mediante enlace-O por intermedio de una manosa y

serina o treonina (42, 46).

QS es metabolizado por la acción secuencial, sobre su extremo no reductor, de

dos glicosidasas y dos sulfatasas (Figura 1). La enzima ß-galactosidasa, deficiente

en MPS IV B, remueve los residuos de galactosa, mientras que las tres isoformas

de la ß-hexosaminidasa (A, B y S), deficiente en las enfermedades de Tay-Sachs

y Sandhoff, remueve los residuos de N-acetilglucosamina. La isoforma A remueve

exclusivamente los residuos de N-acetilglucosamina-6-sulfato. En cuanto a las

sulfatasas, el residuo 6 sulfato presente en la galactosa es removido por GALNS, y

el residuo 6 sulfato presente en N-acetilglucosamina es removido por la enzima N-

acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, deficiente en MPS IIID. Sin embargo, los

pacientes con MPS IIID no excretan QS debido a que la isoforma A de la ß-

hexosaminidasa puede remover este residuo en bloque (27).

30

Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos.

Las posiciones de sulfatación están señaladas en rojo ( ) (adaptada de (41)).

El segundo de los GAGs acumulados en MPS IVA es el C6S, este un

heteropolisacárido conformado por unidades de N-acetilgalactosamina, con un alto

grado de sulfatación, y unidades de ácido glucurónico (Tabla 2) (41). Las cadenas

de C6S se encuentran unidas glicosídicamente a una serina de la proteína central,

con una extensión de 100 o más repeticiones de unidades de disacáridos. A

GAG Ácido urónico Galactosa Hexosamina Estructura del disacárido

Herparán Sulfato

Ácido L-idurónico

(IdoA)

N-acetilglucosamina (GlcNAc)

Queratán Sulfato

Galactosa N-acetilglucosamina (GlcNAc)

Condroitín

Sulfato Ácido D-

glucurónico (GlcA)

N-acetilgalactosamina

(GalNAc)

Dermatán

Sulfato Ácido L-idurónico

(IdoA)

N-acetilgalactosamina

(GalNAc)

Hialuronan Ácido D-

glucurónico (GlcA)

N-acetilglucosamina (GlcNAc)

31

diferencia del QS, el C6S se encuentra ampliamente distribuido en el organismo

formando parte de la matriz extracelular del tejido conectivo, en la superficie

celular y en gránulos intracelulares de ciertas células (52). La degradación de C6S

esta dada por la acción secuencial de las glicosidasas ß-glucuronidadasa y ß-

hexosaminidasa y la sulfatasa GALNS, la cual remueve el motivo 6 sulfato de los

residuos de N-acetilgalactosamina-6-sulfato (27).

Figura 1.Catabolismo del Queratán Sulfato

Los números en la figura corresponden a las enzimas deficientes en 1 = MPS IVA, 2 = MPS IVB, 3 = MPS IIID, 4 = Enfermedad de Sandhoff,

y 5 = enfermedades de Tay-Sachs y Sandhoff (tomada de (24)).

32

4.3.1.2 Gen GALNS

El gen humano GALNS ha sido clonado y mapeado al cromosoma 16q24.3 (2);

este posee una longitud de 50 kb con 14 exones y 13 intrones. Con excepción del

exón 14 (800 pb), los exones poseen un tamaño entre 67 y 175 pb, mientras que

el tamaño de los intrones varía entre 380 pb (intrón 7) y 14 kb (intrón 14). La señal

de poliadenilación se encuentra ubicada 33 pb corriente arriba del sitio de

poliadenilación en el exón 14 (53). Un ARNm de 2,3 kb es sintetizado a partir del

gen GALNS, con un marco de lectura abierto de 1,5 kb que codifican para una

proteína de 522 aminoácidos (54), incluido un péptido señal de 26 residuos (55).

La región reguladora 5’ posee un contenido de GC del 70%, con un número de

dinucleótidos CG igual al de GC, lo cual, sumado a la ausencia de una caja TATA

y la presencia de un alto número de sitios de unión para el factor de trascripción

Sp1, sugieren que éste es un gen de expresión constitutiva (53).

Se han identificado cerca de 150 mutaciones en el gen GALNS, incluyendo

mutaciones de sentido errado (69%), sin sentido (5%), alteraciones de corte y

empalme (7%), deleciones pequeñas (13%) y grandes (2%), e inserciones (4%). El

46% de estas mutaciones ocurren menos de tres veces en el total de la población

sugiriendo una elevada heterogeneidad molecular en las mutaciones sobre el gen

GALNS (54,56). Para la población colombiana se identificaron las mutaciones

p.G301C, p.S162F y p.F69V en pacientes del viejo Caldas, de las cuales la última

33

no ha sido reportada en otras poblaciones (6) (56) Posteriormente, las mutaciones

p.A75G y pR386C fueron identificadas en pacientes del departamento de Boyacá

(Saboya y Chiquinquirá), de las cuales la primera no se identificó en otros

pacientes latinoamericanos (57).

A pesar de la elevada heterogeneidad molecular de las mutaciones, se han

observado algunas asociaciones genotipo-fenotipo. Así, 31 mutaciones, la mayoría

de ellas puntuales, están asociadas con fenotipos atenuados, mientras que 101 se

encuentran asociadas con fenotipos severos, todas éstas mutaciones sin sentido,

deleciones grandes y alteraciones del sitio de corte y empalme. También se han

asociado a este último fenotipo el 80% de las deleciones pequeñas y las

inserciones (54).

4.3.1.3 Enzima GALNS

GALNS es un homodímero de 120 kDa, con monómeros de 60 kDa que son

procesados a polipéptidos con un peso molecular de 40 kDa y 15 kDa unidos por

un enlace disulfuro (58). Esta es una enzima lisosomal que se encarga de

hidrolizar enlaces éster sulfato y se requiere en la degradación secuencial de los

glicosaminoglicanos QS y C6S (55).

34

El péptido señal de 26 residuos dirige la proteína naciente al retículo

endoplasmático (RE) donde es modificada mediante N-glicosilación cotraslacional

(59). Esta glicosilación involucra la transferencia en bloque de un oligosacárido

formado por tres glucosas, nueve manosas y 2 residuos de N-acetilglucosamina.

Antes de salir del RE tres residuos de glucosa y uno de manosa son removidos del

oligosacárido (Figura 2) (60).

GALNS es activada por la enzima generadora de formilglicina (FGE) antes de ser

plegada en el RE. Esta es una enzima que se encuentra en el RE y es la

encargada de la conversión de cisteína a formilglicina en el sitio activo de las

sulfatasas (61), que para GALNS se encuentra en la posición C79 (59). El residuo

de formilglicina interactúa directamente en la remoción del azufre en el sustrato

mediante ataque nucleofílico por parte de uno de los grupos hidroxilo al grupo

sulfato, sulfatando la enzima. Posteriormente el otro grupo hidroxilo realiza un

reacción de eliminación en donde la enzima es desulfatada y el residuo de

formilglicina es regenerado (62). FGE es codificada por el gen SUMF1 que posee

9 exones, un tamaño de 106 kb y sintetiza un mRNA de 2,1 kb, con un marco

abierto de lectura que predice para una proteína de 374 aminoácidos (63,64).

SUMF1 es un factor limitante y esencial en la actividad de las sulfatasas: (1)

mutaciones en SUMF1 producen la deficiencia múltiple de sulfatasas, en donde la

actividad de todas las sulfatasas se encuentra afectada, (2) sobrexpresión de una

sulfatasa produce activación parcial de la enzima y disminución en la actividad de

35

otras sulfatasas por saturación del sistema, y (3) coexpresión de una sulfatasa con

SUMF1 lleva a un marcado incremento en la actividad de la sulfatasa (63,64).

Después que la proteína GALNS ha sido activada, plegada y glicosilada, esta es

transportada mediante vesículas desde el RE hasta el aparato de Golgi, donde

recibe modificaciones adicionales necesarias para su direccionamiento al

lisosoma. A diferencia de las proteínas de membrana o de la ruta secretora, en las

que las cadenas de oligosacáridos son procesadas a unidades que contienen

ácido siálico, las enzimas lisosomales son modificadas por la adición de residuos

de fosfomanosil, el cual funciona como un componente esencial en el

reconocimiento del receptor de manosa-6-fosfato en Golgi (65).

Inmediatamente después de realizadas estas modificaciones sobre la cadena de

oligosacáridos, la enzima se une al receptor de manosa-6-fosfato y abandona

Golgi en vesículas recubiertas de clatrina. Estas se fusionan con vesículas del

endosoma temprano en donde la enzima es liberada por una disminución en el pH

y es procesada proteolíticamente, principalmente en el extremo N-terminal (Figura

2). Una pequeña cantidad de la enzima, entre un 2 a 20%, es secretada antes de

llegar al lisosoma, la cual puede ser recapturada de manera autocrina o paracrina

por unión con receptores de manosa-6-fosfato ubicados en la membrana celular,

36

siendo esta la base para el desarrollo de terapias de reemplazo enzimático, génica

y celular (27, 60, 65).

Figura 2. Esquema del procesamiento y direccionamiento de una enzima lisosomal

De esta manera, la estructura terciaria de GALNS (Figura 3) consiste en una forma

monomérica con un dominio N-terminal grande y un dominio C-terminal pequeño.

El dominio N-terminal está conformado por una hoja ß-plegada con 10 cadenas y

37

8 α-hélices, mientras que el dominio C-terminal consiste de una hoja ß-plegada

con 4 cadenas y una α-hélice. El sitio activo (C79) se encuentra ubicado en el

fondo de una cavidad rodeada principalmente por grupos de aminoácidos

cargados (59).

Figura 3. Estructura terciara de la enzima GALNS. La predicción de la estructura terciara fue

realizada por empleando el servidor I-tasser (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). La

predicción de los dos posibles sitios de glicosilación, así como la generación del modelo glicosilado

fueron realizados con la herramienta GlyProt (http://www.glycosciences.de/modeling/). Cortesía de

Alexander Rodríguez.

4.3.2 Características Clínicas

MPS IVA es una enfermedad debida a la falta de la enzima GALNS; esta

deficiencia resulta en la acumulación progresiva de los sustratos QS y C6S

principalmente en hueso y córnea (5, 66). El fenotipo de la enfermedad varía

desde una forma severa caracterizada por una marcada displasia esquelética,

estatura corta, facies toscas, hipoplasia de la odontoides, pectus carinatum,

cifoescoliosis, genu valgum, laxitud de articulaciones, alteraciones auditivas,

38

opacidad corneal, enfermedad de válvulas cardiacas y hepatoesplenomegalia

leve, a formas medias o atenuadas con menor compromiso óseo (Figura 4). A

diferencia de otras MPS, los pacientes con MPS IVA no presentan compromiso de

la esfera mental (3,5,67,68).

Los pacientes Morquio A no presentan manifestaciones clínicas al momento del

nacimiento. Los primeros síntomas de la enfermedad se presentan alrededor de

los dos años de vida, siendo los más comunes las deformidades óseas, la corta

estatura y las anormalidades en la marcha (5). En la niñez temprana los primeros

problemas ortopédicos son la cifosis en la unión torácico-lumbar y una leve

prominencia del esternón, la cual evoluciona rápidamente a pectus carinatum.

Debido a que presentan cuello corto, aunque normal en tamaño, esta

aparentemente es mas grande comparada con el cuerpo, y se encuentra

desplazada hacia atrás. El genu valgum aparece durante este periodo causando

dificultades para caminar (5). Las deformidades de las articulaciones son

evidentes en las muñecas, rodillas, tobillos, codos y hombros. En las extremidades

superiores se presenta pérdida de movimiento, y en las extremidades inferiores el

aplanamiento de la cabeza del fémur y el pobre desarrollo del cuello femoral,

llevan a un movimiento restringido de la cadera, alteraciones en la marcha y dolor

al caminar o estar de pie (67,69).

39

Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas en pacientes

con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A.

Por otro lado, la alteración en la formación del cartílago y ligamentos se manifiesta

principalmente en las vértebras, debido a una maduración anormal como resultado

de una incompleta osificación endocondral. Las vértebras presentan

platiespondilia con bordes irregulares, discos intervertebrales mas angostos de lo

normal y un canal espinal angosto (67,70). Estas alteraciones llevan a hipoplasia

de la odontoides, cifosis y compresión espinal la cual puede producir alteraciones

neurológicas como paraparesis, o incluso paraplejia o cuadriplejia (71,72).

A nivel bucal se presentan dientes pequeños, incisivos en forma de pala, dientes

posteriores cóncavos, y esmalte delgado y de color opaco o amarillento (73).

40

Debido a los problemas óseos y de articulaciones que dificultan el cuidado

personal, y a un esmalte delgado y frágil, los pacientes con MPS IV A desarrollan

problemas de higiene oral llevando en ocasiones a gingivitis (73).

Finalmente, los problemas respiratorios en pacientes MPS IVA incluyen dificultad

respiratoria por deformidades en la caja torácica, obstrucción de vías superiores

durante la flexión de la cabeza, infecciones recurrentes, apnea del sueño

(evidencia por ronquidos) y una tráquea angosta debido a depósitos de GAGs y

deformidades en el cartílago (74,75).

4.3.3 Diagnóstico

El primer método utilizado para el diagnostico de MPS fue el análisis de GAGs en

orina que en la actualidad es utilizado como prueba diagnóstica preliminar. De

este modo las pruebas cualitativas incluyen la precipitación de los GAGs con

albúmina ácida, bromuro de cetiltrimetilamonio o cloruro de cetilpiridinio, las cuales

pueden ser utilizadas en métodos cuantitativos turbidimétricos cuando los valores

son corregidos de acuerdo con la concentración de creatinina y la edad del

paciente, reduciéndose el número de falsos negativos o positivos (76). Sin

embargo, la cuantificación turbidimétrica con cloruro de cetilpiridinio presenta baja

sensibilidad en muestras de pacientes con MPS II e IV A (77).

Uno de los métodos más usados para la detección y cuantificación de GAGs en

orina es la prueba colorimétrica con azul de dimetilmetileno, el cual presenta una

41

sensibilidad cercana al 100%, una especificidad alrededor del 90% y la capacidad

de permitir el diagnóstico de pacientes MPS IS, III y IV, los cuales no son

fácilmente diagnosticados por los otros métodos turbidimétricos (77,78).

El diagnóstico definitivo de las MPS se establece por determinación de la actividad

enzimática. Para MPS IVA la actividad GALNS es determinada en leucocitos y

fibroblastos empleando el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-ß-D-

galactopiranósido-6-sulfato. La reacción requiere la acción secuencial de las

enzimas GALNS y ß-GAL para la liberación del compuesto fluorogénico 4-

metilumbeliferona (Figura 5). En pacientes MPS IV A con fenotipos severos la

actividad GALNS en leucocitos es inferior al 5% de los valores encontrados en

individuos no afectados, mientras que en fibroblastos la actividad se encuentra por

debajo del 1% (79). En pacientes con fenotipos atenuados la actividad enzimática

pueden variar desde 1,2% hasta 37% de los valores normales (80), y en

heterocigotos está en un rango entre 40 y 70% (79). El diagnóstico prenatal puede

ser realizado en líquido amniótico o vellosidades coriónicas, aunque la

identificación de heterocigotos no es tan clara como en el diagnóstico postnatal

(81).

42

Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALNS. ß-GAL: ß-

Galactosidasa de Aspergillus oryzae.

Para el diagnóstico de pacientes Morquio A también se conoce otra estrategia que

consiste en la cuantificación de la enzima GALNS en fibroblastos, plasma o sangre

en papel de filtro empleando anticuerpos monoclonales específicos para la enzima

(82). Basado en el hecho de que las mutaciones sobre el gen GALNS tienen un

efecto directo sobre la estabilidad y plegamiento de la proteína, este método

permite identificar pacientes MPS IVA con base en la disminución de la cantidad

de enzima, comparada contra la encontrada en individuos no afectados.

Finalmente, un método basado en la determinación de disacáridos derivados del

QS, HS y DS por cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a

43

espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS), en muestras de sangre y orina,

permitió la identificación de un ligero aumento en los disacáridos derivados de QS

en muestras de pacientes MPS IVA, comparado contra los valores obtenidos en

individuos no afectados. Este incremento fue más marcado para HS y DS en

muestras de pacientes MPS I, II y VI (83,84). Este método representa una

herramienta importante para la implementación de pruebas de tamizaje neonatal

en las MPS que permitan un diagnóstico y comienzo de la TRE tempranos.

4.3.4 Tratamiento

En la actualidad, la mucopolisacaridosis tipo IV A no cuenta con un tratamiento

que muestre beneficios significativos para aquellos pacientes que la padecen,

siendo entonces manejada exclusivamente mediante correcciones quirúrgicas y

tratamiento farmacológico paliativo (5). Entre ellas se emplean antinflamatorios no

esteroideos para el dolor de las articulaciones, antibióticos para las infecciones

pulmonares y oxígeno para el manejo del compromiso pulmonar y la apnea

obstructiva del sueño (5).

De esta manera, alrededor de los 5 años de edad los pacientes Morquio A pueden

ser sometidos a intervenciones quirúrgicas como la tonsilectomía y

adenoidectomía para prevenir infecciones respiratorias y dificultades respiratorias

(5). A los 10 años aproximadamente el 30% de los pacientes son sometidos a

44

cirugías en la cadera, rodillas y fémur, para corregir problemas de marcha y

enderezar la posición de las extremidades inferiores (5, 69, 85).

Por su parte, aunque se ha probado que el trasplante de médula ósea puede tener

importantes beneficios, aunque variables, en pacientes con MPS I, II, III y VI (28),

este no es una alternativa para el tratamiento de pacientes MPS IVA debido a que

mediante este no se logran efectos sobre las anomalías esqueléticas y oculares,

además existe la dificultad de encontrar un donante compatible (86).

MPS IV A se convierte así en una excelente candidata para un tratamiento por

medio de terapia de reemplazo enzimático (TRE), terapia génica o terapia de

reducción de sustrato debido a la ausencia de síntomas sobre el sistema nervioso

central. La TRE se encuentra en etapas preclínicas usando una enzima

recombinante producida en células CHO (87, 88). Los primeros resultados

mostraron que tras la infusión de la enzima recombinante la actividad se

incrementó principalmente en hígado (3 veces los valores de ratones normales),

mientras que en otros tejidos como hueso, pulmón y riñón, los valores fueron

significativamente menores que los observados en ratones normales.

Recientemente, el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo mostró la

posibilidad de producir en E. coli una enzima GALNS recombinante activa (89).

4.4 Terapia Génica

4.4.1 Generalidades

45

La terapia génica es definida como la transferencia de material genético, ADN o

ARN, que se realiza con el propósito de producir algún efecto terapéutico que

logré la corrección de un defecto genético o que permita la adquisición de una

nueva respuesta funcional (90,91). De esta manera, la transfección puede

efectuarse in-situ, en donde el material genético es administrado por inyección

venosa, arterial o directamente en el órgano de interés; o ex-vivo, en donde

células del individuo son extraídas, transfectadas in vitro y posteriormente

reimplantadas.

Aunque inicialmente la terapia génica fue concebida para el manejo de

enfermedades monogénicas, con el transcurrir del tiempo se ha enfocado

fundamentalmente a la implementación de terapias para cáncer, enfermedades

cardiovasculares y algunas enfermedades virales, las cuales en conjunto

representan el 83% del total de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha. En

el cuarto lugar se encuentran las enfermedades monogénicas, entre las que se

encuentran los errores innatos del metabolismo (92,93).

4.4.2 Vectores empleados en Terapia Génica

La manera más directa de administrar el material genético es por inyección de

ADN desnudo. Sin embargo, es poco eficiente por el corto tiempo de vida media

debido a la presencia de enzimas que lo degradan (94). Por ello, durante las

últimas décadas se han desarrollados vectores virales y no virales con el fin de

optimizar la transferencia génica y lograr una alta expresión del gen de interés

46

durante un periodo prolongado de tiempo (91). En este sentido, el método mas

utilizado para realizar la entrega del gen es el uso de vectores derivados de virus,

entre los que se encuentran los retrovirus, virus del herpes simplex, adenovirus,

lentivirus y virus adenoasociados (91, 94, 95, 96,97).

Por otra parte entre los vectores no virales se encuentran los polímeros catiónicos,

células encapsuladas en polímeros, liposomas, oligonucleótidos antisentido y los

complejos de material genético con péptidos o polímeros (98,99). Paralelamente,

se han desarrollado métodos físicos que facilitan y aumentan el ingreso del vector

a la célula, como electroporación, ultrasonido, biobalistica y oclusión sanguínea

(99). Las principales características de los vectores virales y no virales son

resumidas en la Tabla 3.

Tabla 3. Características de vectores empleados en terapia génica (100).

Vector Ácido nucleico Integración Capacidad (Kb) Células transducidas

Retrovirus ARN Si (al azar) 4 a 8 División

Adenovirus ADN No 4 a 35 División y quiescentes

Adenoasociados ADN No Cercano a 4 División y quiescentes

Lentivirus ARN Si Al azar

4 a 8 División y quiescentes

Herpes simplex ADN No 20 Quiescentes

ADN desnudo ADN No Ilimitada División y quiescentes

No virales ADN ARN

No Ilimitada División y quiescentes

47

4.4.3 Vectores derivados de virus adenoasociados y su uso en terapia génica

Los virus adenoasociados (AAV) son viriones no patogénicos pertenecientes a la

familia Parvoviridae genero Dependovirus, de aproximadamente 20 a 25 nm de

diámetro, compuestos de una mezcla de proteínas de ensamblaje que encapsidan

una genoma de ADN de cadena sencilla de aproximadamente 4,7 kb (101);

requieren la coinfección con un virus ayudador, tipo adenovirus o herpes simplex,

para su replicación. Están constituidos por un genoma de ADN de cadena sencilla.

Hasta el momento se han aislado y caracterizado nueve serotipos diferentes de

AAV, cada uno de los cuales posee una afinidad por algún tejido en especial

(102). En la actualidad el serotipo 8 combinado con promotores hepatoespecíficos,

ha permitido el desarrollo de modelos de terapia génica para las enfermedades de

Gaucher (103), Fabry (104) y Niemann-Pick (105), con lo que se ha logrado un

aumento hasta de 100 veces en la expresión de las enzimas, con respecto a los

valores logrados con el serotipo 2.

En este sentido, la principal diferencia entre los serotipos AAV se encuentra en las

proteínas de la cápside. Los AAV son partículas virales con una cápside formada

por 60 subunidades de las proteínas VP1, VP2 y VP3 en una relación 1:1:18,

respectivamente, con una simetría icosahédrica T=1, indicando que las 60

subunidades están distribuidas sobre la superficie del virus de manera equivalente

(106). Las tres proteínas de la cápside comparten la secuencia del extremo C-

terminal, difiriendo en el extremo N-terminal según el codón de inicio empleando y

48

siendo en tamaño VP1>VP2>VP3 (106). Los 8 serotipos poseen una homología

en la secuencia proteica de la cápside entre el 58 y 88%, siendo AAV4 y AAV5 los

serotipos mas divergentes (107). Las unidades monoméricas de la cápside en los

serotipos están conformadas por una estructura base de 8 cadenas ß-plegadas

formando un motivo ß-barril altamente conservado, y bucles largos entre las

cadenas, los cuales representan las regiones estructuralmente variables entre los

diferentes serotipos (108).

Esta diferencia en la estructura de la cápside lleva al empleo de diferentes

receptores celulares, por parte de cada uno de los serotipos. Para el caso de

AAV2 se ha identificado el proteoglicano heparán sulfato (HSPG), como el

receptor celular empleado por el virus para su internalización, y como

coreceptores el receptor del factor de crecimiento hepático, el receptor del factor

de crecimiento de fibroblastos humano y las integrinas αvß5/α5ß1 (109,110).

HSPG también es usado por AAV3 (111), mientras que AAV1, AAV4, AAV5 y

AAV6 interactúan con glicanos con ácido siálico terminal (112,115). Las MPS son

excelentes candidatos para su tratamiento por terapia génica debido a que: (1)

teóricamente solo el 10% de la actividad enzimática permite pasar de un fenotipo

severo a uno intermedio o atenuado, pues valores cercanos a este porcentaje, e

incluso inferiores, son encontrados en pacientes con las variantes medias y

atenuadas de la enfermedad (27, 105), (2) debido a que los genes que codifican

para las enzimas lisosomales presentan expresión constitutiva, no es necesaria

49

una regulación estricta del transgén (116), (3) es posible realizar la corrección del

defecto en células no transducidas por el vector gracias al mecanismo de

corrección cruzada mediada por el receptor de manosa-6-fosfato (30, 38, 117), (4)

ensayos preclínicos en diferentes modelos animales (ratón, rata, perro y gato) han

permitido niveles enzimáticos terapéuticos hasta por 1,5 años en ratón (118) y 3

años en perros (119), con importantes correcciones bioquímicas y clínicas, y (5)

en las enfermedades producidas por la deficiencia de una sulfatasa (MPS II, MPS

IIIA, MPS IIID, MPS IVA, MPS VI), la coexpresión con SUMF1, in vitro e in vivo, en

algunos modelos de estas enfermedades, ha permitido un incremento en la

actividad de sulfatasa recombinante entre 2 y 3 veces, con un notable efecto en la

distribución de la enzima, la proporción de la enzima secretada y las

manifestaciones bioquímicas y clínicas de la enfermedad (10,11).

Diferentes vectores han sido empleados para realizar la transferencia génica en

modelos animales de EDL, siendo los más frecuentes los lentivirus, adenovirus y

virus adenoasociados (9). Para el caso de los AAV en las MPS estos han sido

empleados en MPS I (120), MPS II (121), MPS IIIA (11), MPS IIIB (122), MPS VI

(123) y MPS VII (124).

En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo se ha trabajado durante los

últimos años en la evaluación de vectores derivados de virus adenoasociados

(AAV) para el tratamiento de la enfermedad de Morquio A. Los ensayos in-vitro e

in-vivo han mostrado la factibilidad de usar estos vectores para el tratamiento de

50

esta enfermedad. Sin embargo, con el objetivo de incrementar los niveles de

actividad enzimática es necesaria la evaluación de otros vectores virales.

4.4.4 Vectores lentivirales y su uso en terapia génica

Los lentivirus son el grupo mas complejo de los Retrovirus siendo el VIH el

miembro más destacado y mejor estudiado, pertenecientes a la familia

Parvoviridae género Dependovirus (125) con un diámetro de 90–130 nm, una

masa de ~ 2,5 x 108 Da (126-128) y una densidad de 1,16 g/ml en los gradientes

de densidad de sacarosa (129). Se componen de 2 copias de ARN, una cápside

nuclear (CN), una cápside (CA), una matriz asociada a la membrana (MA),

proteínas de envoltura, como glicoproteínas de superficie (SU) y las proteínas

transmembrana (TM), enzimas como la integrasa (EN), proteasa (PR), la

transcriptasa reversa (RT) y proteínas accesorias (Figura 6) (130). Las funciones

de cada una de ellas se encuentran resumidas en la tabla 4.

El genoma de ARN monocatenario se encuentra encapsidado dentro de la

membrana plasmática (125), la cápside contiene el genoma viral ARN y las tres

enzimas anteriormente nombradas necesarias para la replicación del virus (131);

este puede ser transcrito por la transcriptasa reversa en ADN de doble cadena tras

la entrada a la célula diana o huésped; este ADN se integra en el genoma de dicha

célula mediante la enzima integrasa viral, completando así el ciclo de infección

(132).

51

Figura 6. Composición estructural de los lentivirus.

El ciclo de replicación (Figura 7) de los retrovirus comienza por la unión a un

receptor en la célula huésped a través de la glicoproteína de superficie del virus.

Posteriormente se da la fusión de las membranas de la envoltura del virus y de la

membrana de la célula huésped que permite la entrada; inmediatamente después

la transcripción tiene lugar, la envoltura del virus se elimina lo cual permite que el

ARN viral se libere paralelamente con las enzimas necesarias para la transcripción

reversa de este (uncoating) (133,134) lo que conduce a la formación de un

complejo pre-integración (CFP) de varias proteínas que permite la translocación

de la información genética en el núcleo (131). La composición exacta del CFP es

aún desconocida pero se da demostrado que contiene ADN de doble cadena

(producto de la transcripción reversa), TR, EN, VPR, NC y algunas copias de la

MA (130, 135-137).

52

Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus (130)

El ARN se transcribe inversamente y se integra en el genoma del huésped con

una preferencia para la integración en las unidades activas de transcripción. Al

final del ciclo de vida viral, el genoma viral de ARN de longitud completa se

transporta fuera del núcleo siendo capturado por la poliproteína gag y la partícula

del virus finalmente es expulsada fuera de la membrana celular. La secuencia de

provirus lentiviral se transfiere posteriormente a la progenie durante la división

celular (131).

Nombre de la proteína Función

Cápside (CA) Gen gag; Protege el núcleo

Integrasa (IN) Gen pol; Necesario para la integración del provirus

Matriz (MA) Gen gag; Se encuentra en la envoltura

Cápside nuclear (NC) Gen gag; Protege el genoma y da forma al núcleo

Proteasa (PR) Gen gag; Protege el genoma y da forma al núcleo

Transcriptasa Matriz (MA) (RT) Esencial para la escisión de proteínas gag durante la maduración

Proteasa (PR) Transcripción reversa del genoma RNA

Glicoproteína de superficie (SU) Glicoproteína de la envoltura exterior; antígeno principal del virus

Proteína Trans membranal (TM) Componente interno de la glicoproteína de la envoltura madura

Proteínas accesorias (Nef, Vif, Vpu, Vpr) Importante para la infectividad y patogenicidad del VIH

53

Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus.

Después de la traducción las poliproteínas son cortadas proteolíticamente para

formar los componentes estructurales y enzimáticos del virus. Los lentivirus

también contienen genes reguladores rev y tat (Figura 8). Rev actúa como un

activador viral transcripcional (138) y es esencial para la replicación viral

(139,140). El segundo gen regulador es un transactivador que aumenta la

actividad transcripcional de la repetición terminal 5 (LTR) de 100 a 500 veces mas.

Además, el gen accesórico vpr, vpu, vig y nef (Figura 8) aumenta la liberación

viral y mejora la capacidad viral para escapar del sistema inmune. Vif (factor

infeccioso del virus) supera un inhibidor endógeno celular de la replicación viral y

54

la proteína viral R (VPR) causa la fase G2 del ciclo celular en el cual la expresión

de productos virales parece ser óptimo (141).

Los lentivirus son capaces de transducir tanto células que no se encuentran en

división tales como macrófagos, células T y células madre hematopoyéticas

(142,143), como células quiescentes por integración en el genoma del huésped

(132). Además se caracterizan por generar rápidas respuestas inmunes y tener

una expresión estable y a largo plazo mediante el establecimiento de un provirus

estable en las células diana (125, 141), por lo cual se están convirtiendo en los

vectores de elección para la entrega de ARN de interferencia (siRNA) (144).

Figura 8. Genoma Lentivirus.

Los vectores lentivirales pueden ser dirigidos selectivamente a ciertas células

usando envolturas quiméricas que son reconocidas por péptidos y receptores

específicos de la célula (145). Otra característica importante se refiere a que ellos

55

se pueden producir empleando proteínas de la envoltura de otros virus

(pseudotipos) (132).

Sin embargo, los lentivirus presentan un problema que es explorado para la

producción de vectores virales. Cuando el ADN viral se transcribe al ARN del virus

pierde secuencias en el extremo 5' y 3' (la secuencia promotora y la señal del Poly

A). Durante la transcripción reversa, el virus copia las secuencias sobre el extremo

3' y los coloca en el extremo 5'. El segmento U3 contiene un cebador y si este es

eliminado, la supresión también se copia en el extremo 5' del ARN. Para que la

replicación completa del lentivirus se lleve a cabo es necesario que el virus

también tenga un promotor. El único promotor que conduce la transcripción del

cDNA es el promotor interno en el plásmido del vector (130, 135-137).

Finalmente, las aplicaciones más comunes de vectores virales incluyen la

restauración de los genes funcionales en estudios de terapia genética, la

investigación estándar de la biología celular que involucra una amplia gama tanto

in vivo como in vitro y en los diseños experimentales y la investigación oncológica

(142). La tecnología de lentivirus ya ha sido evaluada en la fase clínica con

ensayos dirigidos a células T para expresar un gen contra el VIH con resultados

prometedores (147-150). Hasta la fecha, los ensayos clínicos con lentivirus se

basan en la entrega génica ex vivo para células autólogas. En particular, in vitro la

transducción de célula madre hematopoyéticas parece tener una gran promesa

para aplicaciones de terapia génica en un futuro próximo (151).

56

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Evaluar el efecto producido sobre los valores de actividad enzimática de GALNS

tras la transfección del gen GALNS mediada por vectores lentivirales.

5.2 Objetivos específicos

1. Producir vectores lentivirales a partir de virus derivados del VIH que porten el

gen humano de la enzima N-acetil-galactosamina-6-sulfato-sulfatasa a partir

del cultivo de células 293FT.

2. Producir vectores adenoasociados que porten el gen GALNS a partir de

células HEK293.

3. Evaluar los vectores lentivirales y adenoasociados en células HEK293 y

fibroblastos de piel.

4. Comparar la eficiencia en la expresión enzimática obtenida de la utilización de

lentivirus con la obtenida con vectores derivados de virus adenoasociados.

57

6. METODOLOGÍA

6.1 Producción de vectores lentivirales.

6.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS.

Para la elaboración del plásmido de expresión lentiviral Topo-GALNS se empleó

el plásmido TOPO-GALNS previamente construido en el IEIM. Este plásmido porta

el ADNc del gen humano de GALNS insertado en el plásmido pLenti6/V5-D-TOPO

(Invitrogen) (Figura 9)

Figura 9. Plásmido pLenti6/V5-D-TOPO (152)

6.1.2 Cultivo células 293FT (153).

58

Las células 293FT se cultivaron en medio medio D-MEM completo suplementado

con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 mM de aminoácidos no esenciales, 1

mM de piruvato de sodio y 2 mM de L-glutamina. Las células fueron incubabas a

37 C en atmosfera humedad de 5% CO2.

6.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT (154).

Las células 293FT fueron cultivadas en placa de 15 cm de díametro hasta

alcanzar una confluencia del 90-95%. Este día fue considerado como el día

primero. En el segundo día el medio del cultivo se reemplazó con 10 mL de medio

completo con suero sin antibióticos. Para cada muestra a transfectar se preparó

un complejo ADN-lipofectamine™ 2000 complexes (Invitrogen) de la siguiente

manera: en un tubo estéril de 15 mL se diluyeron 9 μg de ViraPower™ Packaging

Mix y 3 µg de TOPO-GALNS en 1,5 mL de medio Opti-MEM I (Invitrogen) sin

suero. La mezcla se homogenizó por agitación suave.

En otro tubo de 15 mL se diluyeron 36 µl de Lipofectamine™ 2000 en 1,5 mL de

medio Opti-MEM I. La mezcla se agitó y se incubó 5 minutos a temperatura

ambiente. Posteriormente se realizó la mezcla de la lipofectamina con la de los

ADNs y se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la

formación del complejo ADN-lipofectamina. A continuación, se adicionó el

complejo gota a gota a la placa de cultivo y se incubó a 37°C en atmosfera

humedad de 5% CO2. Al día siguiente, el medio que contenía el complejo DNA-

lipofectamina se reemplazó con 20 mL de medio completo sin antibióticos e

59

incubado a 37°C en una humedad de 5% CO2. Al cabo de 72 horas de

transfección se recolectó el sobrenadante, se centrifugó a 3000 rpm durante 15

minutos a 4°C y el pellet fue descartado. El sobrenadante se filtró por membrana

de 0,45 μm y se almacenó a – 20 °C para su posterior concentración.

6.1.3.1 Concentración y precipitación de vectores Lentivirales con PEG 6000

(155).

Para la concentración de los vectores se tomaron 20 mL de sobrenadante

obtenidos en el punto anterior y se mezclaron con 5 ml de PEG 6000 al 50 %, 2,12

mL de NaCl 4 M y 2,27 mL de PBS 1x con el fin de tener una concentración final

de PEG 6000 de 8,5 % y 0.3 M de NaCl. La mezcla se incubó durante 1,5 horas a

4°C mezclando suavemente cada media hora. Posteriormente se centrifugó a

7000 rpm durante 10 minutos a 4°C y se observó un pellet de color blanco, se

decantó el sobrenadante, se adicionó 1 mL de PBS 1x y se aplicó vortex durante

30 segundos para resuspender el pellet. Alícuotas de 100 μl se prepararon y se

almacenaron -80°C.

6.1.3.2 Titulación Vectores Lentivirales (154).

El día antes de la transducción las células HEK293 fueron tripsinizadas y

sembradas en una placa de 6 pozos, se incubaron a 37°C con una humedad del

5% de CO2. El día de la transducción se descongeló el stock de vectores

lentivirales y se prepararon diluciones seriadas de 102 hasta 106 en medio de

cultivo completo a un volumen final de 1 mL. El medio de cultivo de las células se

60

se removió y se adicionaron las diluciones de los vectores a la placa. Al siguiente

día, el medio que contenía los vectores lentivirales se reemplazó con 2 mL de

medio de cultivo completo. Para el día 4 las células se trataron de la siguiente

manera: se eliminó el medio y se reemplazó con medio de cultivo completo con 5

µg/µL de blasticidina, para seleccionar las células transducidas con los vectores.

Las células fueron cultivadas durante 12 días realizando cambios del medio de

cultivo cada 3 días. Al cabo de los 12 días se removió el medio y las células se

lavaron dos veces con PBS. Enseguida se adicionó cristal violeta y se incubó

durante 10 minutos a temperatura ambiente; se removió la solución y las células

se lavaron nuevamente con PBS dos veces. Finalmente, se realizó el conteo de

las colonias que presentaban coloración azul y se determinó el titulo de los

vectores lentivirales. Se considera un titulo efectivo entre 1-5 x105 unidades de

transducción (TU)/mL.

6.2 Producción vectores derivados de virus adenoasociados a partir de

células HEK293 (14).

Para la producción de las partículas virales recombinantes adenoasociados (AAV);

se empleó el método de triple transfección libre de adenovirus, desarrollado por

Xiao et al. (156). En este método, células HEK293 se cotransfectaron con: (a) el

plásmido portando el gen de interés flanqueado por los ITRs, (b) el plásmido de

empaquetamiento pXX2 el cual portan las secuencias de los genes Rep y Cap del

serotipo 2 y (c) el plásmido ayudador pXX6-80 que porta las secuencias

adenovirales necesarias para la replicación y empaquetamiento del genoma viral.

61

Para la Cotransfección se empleó la mezcla de liposomas catiónicos

Lipofectamine 2000® (Invitrogen). Dos horas antes de la transfección, se cambió

el medio de cultivo con 15 mL de medio de crecimiento D-MEM, libre de

antibióticos y suero fetal bovino.

La transfección se realizó de la siguiente manera: en un tubo de 15 mL estéril se

mezcló un total de 25 μg de los plásmidos pAAV-CMV-GALNS, pAAV-EF1a-

GALNS, pAAV-AAT-GALNS o pAAV-CMV-SUMF1 con los plásmidos pXX2 y

pXX6-80 en una relación molar 1:1:1 que corresponde a una relación 5:5:15 en

términos de μg de ADN, para cada caja de 10 cm de diámetro. Todos los ADNs

plasmídicos utilizados para la transfección se purificaron empleando el kit

QUIAEX-Maxi-prep (QIAGEN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El

ADN plasmídico (25 μg) se diluyó en 1,5 mL de medio de cultivo libre de suero

Opti-MEM® (Invitrogen) y se mezcló suavemente. En otro tubo se diluyeron 60 μl

de Lipofectamine 2000® con 1,5 mL de Opti-MEM®; la mezcla se agitó

suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos; pasado este

tiempo, se mezclaron las dos soluciones y se incubó por 20 minutos a temperatura

ambiente para permitir que los liposomas formaran los complejos con el ADN;

pasados los 20 minutos la solución ADN-Lipofectamine 2000® se adicionó a los

cultivos de células HEK293, mezclando suavemente por rotación para permitir que

los complejos se distribuyeran uniformemente en la caja de cultivo. Las células

transfectadas se incubaron en una atmósfera del 5% de CO2 a 37°C; doce horas

postransfección, el medio se reemplazó con medio de crecimiento D-MEM fresco

62

y se continuó con la incubación en las mismas condiciones descritas durante 48

horas, momento en el que las células se tripsinizaron y se resuspendieron en 15

mL de solución amortiguadora de lisis (0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5) y se

sometieron a ciclos de congelación y descongelación, alternando los tubos entre

un baño de hielo seco con etanol y un baño serológico a 37° C, mezclando con

vortex después de cada ciclo. Finalmente, la suspensión se centrifugó a 3700 g

durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante representaba la

solución viral primaria la cual se almacenó a -80ºC para su posterior purificación y

cuantificación. Bajo estas condiciones las suspensiones virales son estables por

un año.

6.2.1 Cuantificación de vectores adenoasociados.

Las soluciones virales se cuantificaron por el método espectofotométrico

desarrollado por Sommer et al (157). Este método se basa en la medición de la

absorbancia a 260 y 280 nm de una solución viral purificada. El cálculo de los

genomas virales por mL (gv/mL) tiene en cuenta tanto los coeficientes de extinción

de las proteínas de la cápside del serotipo 2 (VP1, VP2 y VP3), como el del ADN

viral, que depende del peso molecular del genoma del vector. Este método permite

la cuantificación rápida, económica y reproducible de soluciones virales

purificadas, con una correlación del 98% con otros métodos de cuantificación

como ELISA y dot-blot (157). Para la cuantificación, se incubaron 100 µL de la

solución viral purificada por 10 min a 75ºC con 0,5 µL de SDS al 20%, midiendo la

absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Como blanco se empleó una solución

63

de NaCl al 0,9%, la cual fue tratada de igual forma que las muestras. La

concentración de vg/mL se calciló empleando la siguiente ecuación:

donde MWADN corresponde al peso molecular de la secuencia flanqueada por los

ITRs para cada vector basado en el peso molecular de cada nucleótido: A = 312,2

Da, C = 288,2 Da, G = 328,2 Da y T = 303,2 Da.

6.3 Evaluación de vectores lentivirales.

6.3.1 Cultivo células HEK293 y Fibroblastos Morquio A.

La línea celular HEK293 (ATCC CRL1573), es una línea celular permanente de

riñón embrionario humano transformadas con ADN del adenovirus humano tipo 5

(Ad5) (158). Esta línea celular posee una alta eficiencia de transfección, que la

hace ideal para la expresión de proteínas recombinantes y la producción de

vectores virales (158).

Las células HEK293 y fibroblastos de conejo se cultivaron en medio esencial

mínimo Eagle’s MEM (GIBCO), suplementado con penicilina-estreptomicina

(GIBCO) 100 U/mL-100μg/mL, glutamina (GIBCO) 2 mM y suero fetal bovino (SFB

- Invitrogen) al 15%, en una atmósfera al 5% de CO2 a 37°C. Los fibroblastos de

conejo fueron donados por la Dra. Martha Raquel Fontanilla del Grupo de Trabajo

en ingeniería de Tejidos del Departamento de Farmacia de la Universidad

Nacional de Bogotá

vg/mL =4,47x1019 (A260 - 0,59A280)

MWDNA

64

6.3.2 Transfección células HEK293 con vectores lentivirales (154).

El primer día de transfección se descongeló el stock lentiviral y se diluyó

apropiadamente la cantidad de virus en medio completo fresco para obtener la

concentración apropiada (5x104 UT/pozo y 2,5x105 UT/pozo); se mantuvo el

volumen total del medio que contenía los virus tan bajo como fue posible, con el fin

de maximizar la eficiencia de la transfección. Posteriormente se removió el medio

de cultivo de las células y se mezcló el medio que contenía los virus suavemente

adicionándolo a ellas. El segundo día de transducción se removió el medio de

cultivo y se reemplazó por medio fresco. Las células se incubaron a 37°C y 5% de

CO2. Se sembraron 5x104 células/pozo las cuales fueron transfectadas con 1 y 5

MOI (Multiplicity of Infection). Un MOI corresponde a la cantidad de vectores por

célula empleados para realizar la transdución, en este caso un MOI de 1 equivale

a equivale 5x104 TU.

6.4 Evaluación de vectores adenoasociados.

6.4.1 Transfección de células HEK293 con los vectores adenoasociados (14).

Veinticuatro horas antes de la transfección se sembraron 1x105 células HEK293

por pozo en placas de 24 pozos y se cultivaron en 1 mL de medio completo

descrito previamente. El medio se cambió 2 horas antes de la transfección por

medio fresco y 3x1011 gv, 1,8 X1012 gv y 3,6 X1012 gv se adicionaron a cada pozo.

Como control negativo se emplearon células HEK293 sin transfectar. Todas las

transfecciones se realizaron por triplicado. Cuarenta y ocho horas postransfección

65

se recolectó el medio de cultivo y las células se tripsinizaron y resuspendieron en

200 μL de solución de lisis (acetato de sodio 25 mM, ß-glicerolfosfato 1 mM, pH

5,5, Tritón X-100 1%). El proceso de lisado se realizó mediante 3 ciclos de

congelación/descongelación. La solución se clarificó por centrifugación a 2500 g

por 5 minutos. El sobrenadante y el medio de cultivo se almacenaron a -20ºC para

posteriores análisis.

Para la cotransfección con CMV-SUMF1, se sembraron 1,5 x105 células/pozo en

placas de 12 pozos 24 horas antes de la transfección. El medio de cultivo se

reemplazó por medio fresco dos horas antes y las células se transfectaron con 1:1

y 1:2 GALNS:SUMF1. Cuarenta y ocho horas después se recolectó el medio de

cultivo y las células, las cuales procesardos como se describió previamente.

6.5 Cuantificación de proteína por el método de MicroLowry.

La cuantificación de proteína en los lisados celulares y en los medios se realizo

por método de MicroLowry. Diez µL de muestra fueron mezclado con 100 µL de

SDS y 100 µL de solución de cobre en tubo vidrio. La mezcla se incubó durante 10

minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se le adicionó 400 µL de

reactivo de Folin, se incubó 55°C durante cinco minutos y posteriormente se leyó a

una absorbancia de 610 nm. La concentración de proteína fue calculada

empleando una curva de calibración de albumina.

6.5.1 Determinación de la actividad enzimática.

66

La determinación de la actividad enzimática se baso en el método descrito por van

Diggelen et al (79). Este método emplea la acción secuencial de dos enzimas:

inicialmente GALNS remueve el grupo sulfato del sustrato 4-metil-umberiferil β-D-

galactopiranosido-6-sulfato y finalmente el fluorogeno 4-metilumbeliferona es

liberado empleando la enzima β-galactosidasa (Figura 5). La cantidad de 4-

metilumbelifarona liberada es directamente proporcional a la cantidad de GALNS

presente en la muestra analizada. Para la reacción, 10 µL de muestra se

mezclaron con 20 µL de sustrato 4-metil-umberiferil-β-D-galactopiranosido-6-

sulfato (Toronto Research Chemicals) 2 mM en solución amortiguadora NaCl

0,1M, acetato de sodio 0,1M, pH 4,3. La mezcla se homogenizó por vortex y se

incubó 18h a 37°C. Como blanco de reacción se empleó agua destilada.

Trascurrida la incubación se adicionaron 2 µL de una solución 10 mg/mL de β-

galactosidasa de Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich), se homogenizó por vortex y

se incubó por 2 horas a 37°C. Finalmente, se adicionaron 1,9 mL de solución de

parada (glicina 24 g/L, Na2CO3 21,2 g/L, NaOH 7,5 g/L, pH10) La fluorescencia de

la muestra se determinó en fluorometro (Turner) a λex366/λem450. Una unidad

corresponde a los nanomoles nm de 4-metilumbelifarona liberados por hora. Para

los lisados celulares las unidades de enzima se dividieron por los miligramos de

proteína en el lisado (U/mg), mientras que para los medios de cultivo la actividad

se expresó como U/mL.

6.6 Análisis estadístico.

67

Para el análisis estadístico las medias se compararon mediante prueba de t-

student para muestras independientes, ANOVA y Duncan para muestras

independientes, usando el programa estadístico IBM SPSS Statistics 20.

68

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

7.1 Producción de Vectores Lentivirales

7.1.1 Elaboración Plásmido de Expresión lentiviral Topo-GALNS.

Para la producción de vectores lentivirales se empleó el plásmido TOPO-GALNS

previamente construido en el IEIM, el cual portaba el gen humano de GALNS

insertado en el plásmido pLenti6/V5-D-TOPO. Este es un vector de

aproximadamente 7 kb diseñado para facilitar la expresión de TOPO®

cloning rápidamente y generar altos niveles de la expresión de los productos de

PCR en células de mamífero (152) usando the ViralPower™ Lentiviral Expression

System (Invitrogen), el cual contenía un paquete de tres plásmidos (pLP1, pLP2,

pLP/VSVG) que remplazaban las proteínas estructurales y de replicación in trans

que se requerían para la producción de lentivirus (154). Además, las LTR

(repetición terminal larga) HIV-5’ y 3’ fueron modificadas para el Viral packaging

de la misma manera que la transcripción reversa de mRNA viral; la región U3

(ΔU3) de la LTR 3’ fue eliminada lo que facilita la propia inactivación de la LTR 5’

para mejorar la bioseguridad del vector (160); posee HIV-1 psi secuencia

empaquetada del viral packaging (161). (Figura 10).

69

El vector contiene el promotor de citomegalovirus humano (CMV) que produce

altos niveles de expresión del gen de interés en un amplio rango de células

mamíferas (162-164); C-terminal V5 epitope para la detección de la proteína

recombinante de interés (165) y HIV Rev (RRE) para la exportación nuclear de

mRNA viral (166,167).

Figura 10. Secuencia de pLenti6/V5-D-TOPO (152).

El plásmido construido en el IEIM contenía el gen bsd, blasticina resistente, para la

selección en en células mamíferas (168-171). La blasticina (Figura 11), es un

antibiótico aislado de Streptomyces griseochromogenes que se encarga de inhibir

la síntesis de proteínas tanto en células procariotas como eucariotas. La

resistencia es conferida por la expresión de uno de los dos genes blasticina S

deaminasa: BSD de Aspergillus terreus (169) o brs de Bacillus cereus (168). Estas

deaminasas convierten la blasticina S a un derivado no tóxico deaminohydroxy

(169).

70

Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina (154).

7.1.2 Cultivo células 293FT.

Para la producción de vectores lentivirales se hace necesario el cultivo de células

293 FT; esta es una línea celular modificada genéticamente, derivada de células

293 F y estabilizadas expresando el antígeno T de SV40 del plásmido

pCMVSPORT6TAg.neo. El antígeno es controlado por el promotor CMV. Este

plásmido es derivado de pCMVSPORT6, el cual fue modificado con el fin de (1)

incluir un gen de resistencia a neomicina para garantizar la selección estable de

células mamíferas (172), (2) incluir el gen de codificación SV40 para facilitar la

producción de virus y permitir la replicación episomal de plasmidos que contengan

SV40 cercano al promotor.

71

Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6.

La línea celular 293FT es una línea de primaria embrionaria de riñon humano

transformada con con adenovirus humano tipo 5 ADN ( 173,174). El gen

adenovirus E1A es expresado en estas células y participa en la transactivación de

algunos promotores virales, induciéndolas a la producir niveles mas altos de

proteína. Estudios han demostrado la máxima producción de virus en células

humanas 293 expresando el antígeno T de SV40 (175), haciendo de la línea

celular 293FT un adecuado hospedero para la construcción de vectores

lentivirales.

7.1.3 Producción Vectores Lentivirales en células 293FT.

7.1.3.1 Titulación Vectores Lentivirales.

Debido a que el vector TOPO-GALNS es resistente a blasticina se seleccionaron

las células 293FT establemente transducidas, las cuales presentaban resistencia a

72

blasticina. La tabla 5 resume los resultados obtenidos para el proceso de titulación

de los vectores:

Tabla 5. Titulación vectores lentivirales.

Dilución evaluada Número de colonias observadas

10-2 30

10-3 27

10-4 24

10-5 22

10-6 19

Titulo viral 2,1x107 UT/mL

A partir de estos resultados se observa que el título de este stock lentiviral

concentrado fue de 2,1 x 10 7 UT/mL. Aunque este título es inferior al reportado

por Nair A et al. (176) y Ansorge et al. (131), los cuales estaban en el orden 1011

UT/mL y 109 UT/mL respectivamente, se prosiguió con la transfección a células

HEK293 puesto que según las instrucciones del fabricante, lo ideal para llevar a

cabo dicho proceso es un título superior a 1 x105 UT/mL (154).

7.2 Producción y cuantificación de adenoasociados a partir de células

HEK293.

La producción, purificación y cuantificación de los vectores recombinantes

empleadas en el presente trabajo permitieron obtener aproximadamente 1 mL de

73

solución viral purificada con títulos virales del orden de 1013 vg (genomas virales)

/mL (Tabla 5), superiores a los reportados por Zolotukhin et al. (177) y Sommer et

al. (157), los cuales estaban en el orden de 1011 vg/mL, respectivamente.

Tabla 6. Cuantificación de los vectores recombinante.

Vector Tamaño A260 A280 A260/A280 gv/mL

AAV-GALNS 4674 3,512 4,000 0,878 3,58 x1013

AAV-SUMF1 4467 2,535 2,223 1,140 3,97 x1013

7.3 Evaluación de vectores lentivirales.

Las células HEK293 se cultivaron en medio D-MEM completo obteniendo un

recuento total de 1,04 x106 células/mL, 5 % mas a lo obtenido por Warncke et al.

(178), 1 x106células/mL, con células B las cuales serían transfectadas igualmente

con vectores lentivirales.

Inicialmente se planteó la evaluación de los vectores virales en fibroblastos de piel

obtenidos de un paciente con enfermedad de Morquio A. Sin embargo, no fue

posible recuperar los fibroblastos a partir de los stocks congelados en nitrógeno

líquido pues todos se encontraban contaminados. Debido a esto se comenzó la

búsqueda de nuevos fibroblastos para la evaluación de los vectores en células

diferente a las HEK293. Gracias a la colaboración de la Dr Martha Fontanilla del

Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional, se lograron obtener

74

fibroblastos de conejo. Sin embargo no fue posible obtener el número suficiente de

fibroblastos para realizar la evaluación de los vectores en estas células.

Para la transfección de células HEK293 con vectores lentivirales se evaluaron 1

MOI y 5 MOI, lo que corresponde a 50.000 UT y 250.000 UT. Células sin

transducir (sin adición de vector) fueron empleadas como control negativo. De esta

manera, la actividad enzimática en los lisados celulares fue determinada a las 48

horas postransfección observándose una actividad promedio de 0,105 nmol/h/mg

en el control negativo, 0,300 nmol/h/mg con 1 MOI y 0,325 nmol/h/mg con 5 MOI,

lo que sugiere un incremento de 2,8 veces 3,1 veces mas en la actividad,

respectivamente, comparado con el control negativo (Figura 13). Desde el punto

de vista estadístico, entre ellas existen diferencias estadísticamente significativas

(P<0,005) lo que sugiere que el aumento de la actividad enzimática de las células

HEK293 es directamente proporcional a la cantidad de vector agregado.

75

Figura 13. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con

vectores lentivirales (2,1x107 UT/mL).

Por su parte, la actividad enzimática secretadas en los medios de cultivo de las

células transfectadas HEK293 (Figura 14) mostraron una actividad enzimática

promedio de 0,011 nmoles/h/ml, 0,047 nmoles/h/ml y 0,058 nmoles/h/ml para el

control, 1 MOI y 5 MOI respectivamente, que se refiere a un incremento en la

actividad enzimática de 4,2 y 5,2 veces mas respectivamente, en relación con el

control negativo (células sin transducir). Según la prueba t-student realizada para

muestras independientes, los tres tratamientos presentan diferencias

Actividad EnzimáticaCélulas - Lentivirus

MOI

Control 1 5

nm

ol/h

/mg

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

nmol/h/mg

76

estadísticamente significativas entre ellos, indicándose, al igual que en los lisados

célulares, un aumento en la actividad enzimática a media que aumentan las

unidades de transfección (MOI).

Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293

transfectados con vectores lentivirales (2,1x107 UT/mL).

Con referencia a lo anterior, Byers et al. (179), basados en terapia génica, hicieron

uso de vectores lentivirales con el fin de aumentar la actividad de la enzima

deficiente en MPS VI, N-acetil galactosamina 4-sulfatasa, en fibroblastos,

encontrando que en presencia del vector las células aumentaban el nivel de

producción enzimática y esto podía ser mantenido durante 41 días; entonces

sugieren que el efecto de la entrega del gen mediante el uso de este tipo de

Actividad EnzimáticaMedios - Lentivurs

MOI

Control 1 5

nm

ol/h

/ml

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

nmol/h/ml

77

vectores permite una expresión a largo plazo. Por su parte, Kim EY et al. (142)

evaluaron la entrega del gen de la enzima glucocerebrosidasa (GC) empleando el

vector lentiviral Lenti-EF-GC, el cual resulto eficaz para la transducción y

expresión de GC en células como HEK293 5 días postransfección. De este modo,

las células transfectadas expresan niveles mas altos de GC (23335.5U/mg

proteína) que el control (11327,3 U/mg proteína). Así, el nivel enzimático de las

células tratadas fue 2,1 veces mayor que el control. De igual forma, en los medios

de cultivo (18936,6 u/mg) fue 2,4 veces más que en el control (8011,2 u/ml).

Ridet et al (180) evaluaron la entrega del gen GPX1 (LV-GPX) mediada por

vectores lentivirales con el fin de incrementar los niveles de la enzima glutatión

peroxidasa (GPX) encontrando un aumento desde 26,8 µmol NADPD/min/mg

proteína en células transfectadas hasta 53,2 µmol NADPD/min/mg proteína en

células trasnfectadas, lo que demuestra la funcionalidad de los vectores

lentivirales.

7.4 Evaluación de vectores adenoasociados.

Para la transfección de células HEK293 con vectores adenoasociados portador del

gen GALNS (AVV GALNS) se evaluaron 3,6 x 1011 genomas virales (gv), 1,8 x

1012 gv y 3,6 x 1012 gv. La actividad enzimática en los lisados celulares fue

determinada a las 48 horas postransfección observándose una actividad de

0,0074 nmol/h/mg, 0,0070 nmol/h/mg, 0,0032 nmol/h/mg, respectivamente,

mientras que las células sin transfectar la actividad fue de 0,0035 nmol/h/mg

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Glucocerebrosidasa&action=edit&redlink=1

78

(Figura 15). Estos resultados sugieren que existe un máximo de vector tolerado

por la célula que permite la producción de la enzima GALNS.

Los valores anteriores fueron menores a los reportados por Alméciga CJ (14)

puesto que durante su estudio, los valores de actividad enzimática con el promotor

CMV se mantuvieron relativamente constantes durante los 10 días de cultivo y

sólo se observó un ligero aumento en la actividad, no significativo (P>0,05), con

una actividad enzimática final de 12,64 ± 1,25 U/mg) al cabo de los 10 días. Por su

parte, el promotor AAT presentó una actividad máxima hacia el día 4 (18,63 ± 1,39

U/mg) que fue altamente significativa (p<0,001) con respecto a las células sin

transfectar. Este valor descendió 22% hacía el final del estudio, lográndose un

incremento final en la actividad de 23 veces (14,57 ± 0,8 U/mg). Sin embargo, es

importante anotar que la concentración del sustrato empleada en este trabajo fue

10 veces superior la empleada en el presente estudio.

Por su parte, en el presente trabajo la actividad enzimática secretadas en los

medios de cultivo de las células transfectadas HEK293 mostraron una actividad

enzimática promedio de 0,0035 nmol/h/ml, 0,0074 nmol/h/ml, 0,0070 nmol/h/ml y

0,032 nmol/h/ml para el control, 3x1011 gv, 1,8 X1012 gv y 3,6 X1012 gv

respectivamente (figura 16). Según la pruebas t-student realizada para muestras

independientes, los cuatro tratamientos presentan diferencias estadísticamente

significativas entre ellos, indicándose, al igual que en las células, que con ,8 X1012

gv y 3,6 X1012 gv la actividad enzimática disminuye.

79

Figura 15. Actividad enzimática obtenida en lisados celulares HEK293 transfectados con el vector

AAV-GALNS (3,6x1013

gv/ml).

Fraites TJ et al (181) demostraron la enfermedad de Pompe que la construcción

de un vector AAV para la expresión de la α-glucosidasa permite restaurar la

actividad de la enzima tanto in-vitro como in-vivo, lográndose una expresión

estable durante los seis meses posteriores a una inyección intramuscular, con

niveles cercanos a los normales y restauración de la actividadmuscular. Park et al

(182), usaron un vector AAV para expresar la enzimaα-galactosidasa A, deficiente

en la enfermedad de Fabry, mediante una inyección intravenosa del vector a un

Actividad enzimáticaCélulas AVV- GALNS

GV

Control 1 5 10

nm

ol/h/m

g

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

nmol/h/mg

3,6 x 1011

1,8 x 1012

3,6 x 1012

GV

80

modelo murino, alcanzando valores de actividad enzimática entre 2 y 10 veces los

valores normales, con reducción en las acumulaciones lisosomales de

glicoesfingolípidos en hígado,corazón y bazo.


transfectados con vectores adenoasociados (3,6x1013

gv/ml).

La cotransfección con GALNS-SUMF1 en una relación 1:1 produce un aumento en

la actividad GALNS de 1,2 mayor (0,0074 nmol/h/mg), con respecto a las células

no transfectadas (0,0061 nmol/h/mg), valor inferior al reportado por Alméciga CJ

(14) el cual corresponde a un amento de 2,4 veces mas que en el control negativo.

Cuando se empleó una relación GALNS:SUMF1 1:2, se observó un incremento de

Actividad enzimáticaMedios AVV- GALNS

GV

Control 1 5 10

nm

ol/h

/ml

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

nmol/h/mg

3,6 x 1011

1,8 x 1012

3,6 x 1012

GV

81

1,62 veces (0,0099 nmol/h/mg) con respecto al control, valor similar al reportado

por Alméciga CJ (14) 1,8 veces mayor a las células sin transfectar. Adicionalmente

cuando se evaluó la relación GALNS:SUMF1 1:5 se produjo un aumento de 1,9

veces (0,0121 nmol/h/mg) comparado con el control negativo (Figura 17).

Actividad EnzimáticaCélulas - AVV GALNS SUMF1

GV

Control 1 : 1 1 : 2 1 : 5

nm

ol/h/m

g

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

nmol/h/mg

Figura 17. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con

vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 (3,97 x1013

).

En cuanto a los medios de cultivo la cotransfección con GALNS-SUMF1 en una

relación 1:1 se produce un aumento estadísticamente significativo (p<0,05) de

31,5 veces mas (0,0347 nmol/h/mg) en relación con el control negativo (0,0011

nmol/h/mg), valor superior al reportado por Alméciga CJ (14). Un incremento de

33,6 veces mayor (0,037 nmol/h/mg) respecto a las células sin transfectar se

82

presentó al realizar la cotransfección en una relación GALNS-SUMF1:2 mientras

que Alméciga CJ (14) reportó un incremento de 1,8 veces mayor. Finalmente, un

incremento de 44,5 veces mayor (0,049 nmol/h/mg) comparado con el control

negativo (Figura 18), presentándose así diferencias estadísticamente significativas

entre todos los tratamientos (p<0,05).


transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 (3,97 x1013).

El gen SUMF1 que posee 9 exones, un tamaño de 106 kb y sintetiza un mRNA de

2,1 kb, con un marco abierto de lectura que predice para una proteína de 374

aminoácidos (63,64), este presenta un alto grado de homología con genes

Actividad EnzimáticaMedios - AVV GALNS SUMF1

GV

Control 1 : 1 1 : 2 1 : 5

nm

ol/h

/ml

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

nmol/h/ml

83

ortólogos de M. musculus, D. melanogaster, C. elegans y algunos procariotes,

indicando un alto grado de conservación evolutiva de este gen (63, 183). SUMF1

es un factor limitante y esencial en la actividad de las sulfatasas: (1) mutaciones

en SUMF1 producen la deficiencia múltiple de sulfatasas, en donde la actividad de

todas las sulfatasas se encuentra afectada, (2) sobre-expresión de una sulfatasa

produce activación parcial de la enzima y disminución en la actividad de otras

sulfatasas por saturación del sistema, y (3) co-expresión de una sulfatasa con

SUMF1 lleva a un marcado incremento en la actividad de la sulfatasa (63,64).

En este sentido, la coexpresión con SUMF1 ha mostrado ser de gran importancia

tanto en la producción de enzimas para TRE como en el tratamiento de estas

enfermedades mediante terapia génica (63,64). Cuando una sulfatasa lisosomal

es sobreexpresada su activación es incompleta, manifestándose en una

disminución de los rendimientos de producción, para el caso de la TRE (64),

mientras que terapia génica la sobreexpresión de una sulfatasa puede causar la

reducción en la actividad enzimática de otras sulfatasas, llevando a la obtención

de un beneficio parcial de la terapia debido a que la cantidad endógena de SUMF1

no es suficiente para la activación de la sulfatasa que se encuentra

sobreexpresada y la de las otras sulfatasas (64).

Con relación a lo anterior, Cosma et al. (64) reportaron un incremento de 16, 3, 1,5

y 2 veces en la actividad de Arilsulfatasa A (ASA) en células COS-7, hepáticas,

HEK293 y U2OS (línea celular de osteosarcoma), respectivamente,

cotransfectadas con vectores derivados del virus del herpes simplex, portando los

84

genes de ASA y SUMF1, en una relación 1:1. Incrementos en la relación de

ASA:SUMF1, superiores a 1:1,5 no produjeron un aumento significativo en la

actividad ASA (64). Por otro lado, Takakusaki et al. (184) reportaron un incremento

en la actividad de ASA de 5,8 y 6,1 veces en células HEK293 cotransfectadas

mediante liposomas, con plásmidos portando los dos genes, en relación 1:2. Uno

de los trabajos más completos en este campo fue el desarrollado por Fraldi et al.

(10) en donde se evaluó el efecto de la coexpresión de SUMF1 sobre 5 sulfatasas

empleando vectores lentivirales y AAV en fibroblastos de leucodistrofia

metacromática, condrodisplasia punctata ligada al X, MPS II, MPS III y MPS VI. El

incremento en la actividad de las sulfatasas estuvo entre 1 y 2,1 veces con

respecto al observado en células no cotransfectadas con SUMF1. Incrementos en

la relación sulfatasa:SUMF1 por enzima de 1:2 no produjeron incrementos

significativos en la actividad o en la reducción de GAGs (10), motivo por el cual en

el presente trabajo solo se evaluaron las relaciones GALNS:SUMF1 1:1 y 1:2. Es

difícil comparar los resultados del presente trabajo con los reportados en la

literatura debido a la diferencia de enzimas (a pesar que todas son sulfatasas),

promotores, técnicas de transfección y vectores. Sin embargo, los incrementos en

la actividad enzimática, independiente del promotor empleado, fueron similares a

los observados con otras sulfatasas.

Alméciga et al (15) estudiaron la transfección del gen GALNS en MPS IVA en

células HEK293 con el uso de vectores derivados adenoasociados y promotores

CMV, AAT Y AF1 en presencia de SUMF1, demostrando que de esta manera los

85

niveles enzimáticos aumentaban 2,4 veces, 1,5 veces y 1,5 veces, en una relación

GALNS:SUMF1 1:1, con CMV-GALNS, AAT-GALNS, EF1-GALNS

respectivamente y 4,5 veces, 4,8 veces y 5,3 veces mas en una relación

GALNS:SUMF 1:2.

La actividad enzimática detectada en el medio con GALNS:SUMF1 1:1 fue de 0,45

U/mL, 0,18 U/mL y 0,18 U/mL para CMV-GALNS, AAT-GALNS y EF1-GALNS

respectivamente. Los niveles incrementaron 1,8 veces, 3,5 veces y 4,0 veces

respectivamente cuando las células fueron cotransducidas con GALNS:SUMF1 1

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo, se puede

inferir que con el uso de vectores lentivirales se obtiene un mayor incremento en la

actividad enzimática que con el uso de vectores adenoasociados puesto que con

el primero se presentó un incremento en la actividad enzimática de las células

transfectadas con 1 MOI y 5 MOI de 2,8 veces y 3,1 veces respectivamente

comparado con los resultados de células sin transfectar, mientras que con los

segundos se obtuvo un incremento de 2,1 veces y 2 veces con 1 GV y 5 GV

respectivamente indicando así que con el uso de los vectores lentivirales se

obtienen mayores niveles de actividad enzimática.

86

8. CONCLUSIONES

1. Se produjeron vectores lentivirales y vectores adenoasociados AAV GALNS y

AVV GALNS SUMF1 portadores del gen humano GALNS, obteniendo un título

viral que permitió realizar una adecuada transfección a células HEK293 con una

eficiente entrega del mismo, lo cual posibilito el incremento de la actividad

enzimática en dichas células.

2. La transfección con vectores lentivirales en células HEK293 permitió un

aumento en el lisado celular de 3,09 veces mayor para 1 MOI y 2,8 veces para 5

MOI con respecto a las células que no fueron transfectadas mientras que en el

medio de cultivo se evidenció un aumento de 4,2 y 5,27 veces mas que en el

control negativo, lo cual deja en evidencia que este tipo de vectores son muy

eficaces a la hora de entregar el material genético en las células, lo que los

supone como unos excelentes candidatos en terapia génica para pacientes

Morquio A.

3. La transfección con vectores adenoasociados AVV GALNS en células HEK293

permitió un incremento hasta de 2,11 veces mas con 3,6 X 1011 GV en

comparación al control negativo, puesto que al transfectar dichas células con 1,8 x

1012 y 3,6 x 1012 GV la actividad enzimática disminuyó tanto en el lisado celular

como en el medio. Sin embargo, La coexpresión in vitro de GALNS y SUMF1

permitió incrementar la actividad enzimática en el lisado celular hasta 1,5 veces

87

mas (GALNS: SUMF1 1:5) que en el control negativo mientras que en el medio se

presentó un incremento hasta de 44,5 veces mas (GALNS: SUMF1 1:5) que en las

células sin transfectar. Estos resultados muestran la importancia de la coexpresión

con SUMF1 principalmente para lograr un aumento de la actividad en el medio de

cultivo, lo que favorecería in vivo la corrección cruzada mediante captura de la

enzima por el receptor de manosa-6-fosfato en células no transfectadas.

4. La transfección con vectores lentivirales permitió un mayor incremento en la

actividad enzimática de los lisados HEK293 y de los respectivos medios de cultivo

que lo que se obtuvo con vectores adenoasociados, lo que evidencia que es mejor

el uso de vectores lentivirales para terapia génica en MPS IVA.

5. Este es el primer ensayo in vitro para MPS IVA en el que se pone en evidencia

la posibilidad de hacer uso de vectores lentivirales en terapia génica para el

desarrollo de una estrategia de terapia génica para esta enfermedad.

88

9. RECOMENDACIONES

1. Ampliar el estudio realizando los ensayos in vitro pertinentes con fibroblastos

Morquio A o fibroblastos de conejo con el fin de evidenciar la actividad enzimática

que se presentan en estas células al ser transfectadas con vectores lentivirales y

así poder comparar la expresión de estas con células HEK293.

2. Realizar ensayos in vivo que permitan continuar con el estudio, haciendo uso de

ratones o conejos MPS IVA con el fin de evidenciar resultados que permitan

suponer a los vectores lentivirales como unos potenciales candidatos para uso en

terapia génica en dicha patología midiendo el posible aumento que provocarían

estos vectores en la actividad enzimática de las células del modelo animal

utilizado y complementar el estudio con medición de GAGs en orina.

89

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