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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Leandro Vinicius Fernandes de Morais
Atividade antimicrobiana e antioxidante de Licania rigida e Turnera ulmifolia.
Natal – RN
Leandro Vinicius Fernandes de Morais
Atividade antimicrobiana e antioxidante de Licania rigida e Turnera ulmifolia.
Autor discente: Leandro Vinicius Fernandes de Morais
Orientador(a): Profª. Drª Maria das Graças Almeida
Coorientador(a): Profª. Drª Gerlane Coelho Bernardo Guerra
Natal – RN
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte – UFRN, como parte dos requisitos
para obtenção do grau de Mestre
Morais, Leandro Vinicius Fernandes de. Atividade antimicrobiana e antioxidante de Licania rigida e Turneraulmifolia / Leandro Vinicius Fernandes de Morais. - Natal, 2015. 63f: il.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria das Graças Almeida. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em CiênciasFarmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal doRio Grande do Norte.
1. Antibacterianos - Dissertação. 2. Licania rigida - Dissertação. 3.Turnera ulmifolia - Dissertação. I. Almeida, Maria das Graças. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615.281.9
Catalogação da Publicação na FonteUniversidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Folha de Aprovação
Dedicatória
Deus, por sempre atender as minhas preces, com a
resposta mais sabia aos anseios do meu espirito. A
minha família por sempre caminhar ao meu lado na
busca pelos meus sonhos. A meus amigos,
companheiros eternos, que encontramos pelos
nossos caminhos e levamos por toda nossa
existência.
Agradecimentos
Primeiramente e sempre a Deus, por sua infinita graça em todas as minhas decisões
e pelo amor incondicional mostrado a cada momento da minha vida.
Aos meus pais, José Evilázaro e Liduina Fernandes, por todos os preciosos
ensinamentos, que transcendem todas as palavras de agradecimentos que posam
ser ditas.
Aos meus irmãos Túlio e Gabriela, que em todos os momentos foram meus
melhores amigos e sempre com uma palavra amiga ou um conselho me apoiaram
para nunca desistir.
A Cristiano, Luzia, João Batista, Genilma, Edson, por todo o apoio e paciência
dedicados a mim.
A toda a minha família em Apodi, por toda a confiança dedicada, essencial na
concretização das realizações.
A profa. Maria das Graças Almeida, pela orientação e conselho para a construção
deste trabalho e pelo direcionamento em todo o mestrado.
A Profª. Drª Gerlane Coelho Bernardo Guerra, pelo apoio na construção desse
trabalho.
A coordenação do programa de pós-graduação em ciências farmacêuticas, pela
oportunidade da realização do mestrado.
Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas na pessoa da Profa. Drª.
Ana Claudia Ana Claudia Galvao Freire Gouveia por toda a atenção desprendida.
A Elizabeth Cristina Gomes Dos Santos, por não ter medido esforços em todas as
fases do mestrado e por ser uma amiga que ofereceu apoio quando se fez mais
necessário.
Ao Gabriel Araújo da Silva, pela ajuda e pelos conselhos indispensáveis para toda
a elaboração desse projeto.
A todos os que fazem parte do laboratório de farmacologia da UFRN, pela ajuda
com os experimentos lá realizados.
Ao padre Carlos e Giovane ao ajudar na coleta da oiticica em Santana.
Ao Prof. Guilherme Chaves e Walicyranison Plínio na execução dos ensaios
antifúngicos.
A Dona Ana Auxiliadora Fernandes de Vieira e Washington Fernandes da
Rocha, por toda a ajuda prestada com os cuidados dos animais.
Ao Miguel em nome do LASID, ao contribuir com os ensaios antimicrobianos.
A todos que fazem parte do laboratório de farmacognosia, por permitir parte da
realização dos experimentos em suas dependências.
Aos colegas de mestrado por compartilharem todas as experiências vivenciadas.
Aos meus amigos, Antonnyo Palmielly, Lílian Solon e Themístocles Negreiros,
pela amizade, apoio dedicado, momentos hilários e discussões científicas
inimagináveis.
A Aureliana e Fábia, pelo auxílio prestado.
Aos prof. George Queiroz de Brito, profa. Paula da Silva Kujubida, profa. Aline
Schwarz, Bruna Zanetti e Juliana Medeiros, pela oportunidade única de estagiar
na disciplina de toxicologia, na qual aprendi bastante.
A todos que fazem e fizeram parte do LABMULT: Ana, Freire, Marcela, Fabricio,
Carol, Ciele, Karla, Gustavo, Heglayne, Leila, Libne, Rita, Melina, Thamara,
Yonara, Felipe, Clelio.
A José Benilson de Martins Macedo e Maria Aparecida do Nascimento, pela
ajuda prestada.
Ao Rand Randall Martins pela orientação em todo este trabalho e pelos
importantes conselhos.
Aos colegas José Evandro e Everton do Sacramento, pela descontração de
sempre.
A CAPES pelo auxílio financeiro durante o mestrado.
A todos aqueles que acreditaram e de alguma forma colaboraram com a realização
desse projeto.
Resumo
Introdução: Licania rigida Benth e a Turnera ulmifolia Linn. var. elegans são
espécies de plantas regionais do semiárido empregadas no tratamento de
diversas doenças. Objetivos: O intuito desse trabalho foi caracterizar
quimicamente os extratos e suas frações, e investigar o potencial antimicrobiano e
antioxidante. Metodologia: Para a análise química foi realizada a quantificação
total de compostos fenólicos por espectrofotometria e a caracterização
cromatográfica dos extratos e frações. A avaliação da atividade antioxidante foi
realizada pela determinação da capacidade de sequestro do radical DPPH. A
atividade antimicrobiana foi avaliada pelos ensaios de difusão em ágar,
microdiluição em caldo e cinética de morte. Resultados: Os extratos e frações de
L. rigida e T. ulmifolia apresentaram elevado conteúdo fenólico, com a presença
de flavonoides, dos quais foram determinados como marcadores químicos.
Observou-se que os extratos de ambas as espécies agiram como agentes
sequestradores no ensaio da atividade antioxidante in vitro. O extrato da L. rigida
foi a única ativa contra cepas de S. aureus, S. aureus meticilina resistente, S.
epidermidis, e as leveduras, Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida
tropicalis, Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida krusei e Trichosporon
asahii. Conclusão: Com base nesses resultados é possível afirmar que atividade
antioxidante e antimicrobiana possivelmente é atribuída a presença de
polifenólicos e flavonoides evidenciados nos extratos e frações.
Palavras-chave: Turnera ulmifolia, Licania rigida, antibacteriano, antifúngico,
antioxidante.
Abstract
Introduction: Licania rigida Benth and Turnera ulmifolia Linn. var. elegans are
species of semi-arid regional plants used in the treatment of various diseases.
Objectives: The purpose of this study was chemically characterize the extracts and
fractions and investigate the antimicrobial and antioxidant potential. Methods: For
chemical analysis, were performed spectrophotometric quantification of the total
phenolic and characterization of the extracts by chromatographic analysis. Evaluation
of antioxidant activity was done by determining the radical scavenging capacity
DPPH •. Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion, broth microdilutionand
time-kill assays. Results: The extracts and fractions L. rigid and T. ulmifolia showed
a high phenolic content, the presence of flavonoids, which were determined as
chemical markers. It was observed that the extracts of both species performed as
sequestering agents in the trial of antioxidant activity in vitro. The L. rigida extract
was the only active front strains of S. aureus 33591 (methicillin-resistant), S. aureus
29213, S. epidermidis 12228, and also against the yeast, Candida albicans, Candida
dubliniensis, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida
krusei eTrichosporon asahii. Conclusions: Based on these results it is possibly
affirm the antioxidant and antimicrobial activity of L. rigida and attributed the
presence of polyphenolic flavonoid like responsible.
Keywords: Turnera ulmifolia, Licania rigida, antibacterial, antifungal, antioxidant.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Curva de calibração do Ácido Gálico .................................................... 35
Figura 2: Cromatograma padrão do método empregado nas análises ................ 37
Figura 3: Cromatograma gerado pela análise do EBTU ..................................... 38
Figura 4: Cromatograma gerado pela análise da FATU ...................................... 38
Figura 5: Cromatograma gerado pela análise do EBLR ...................................... 39
Figura 6: Cromatograma gerado pela análise da FALR ....................................... 39
Figura 7: Triagem da atividade antibacteriana. .................................................... 43
Figura 8: Cinética de morte de bactérias do gênero Staphylococcus tratados com
EBLR e FALR ....................................................................................... 46
Figura 9: Cinética de morte da C. krusei tratada com EBLR e FALR .................. 49
Lista de Tabelas
Tabela 1: Variação do gradiente do sistema solvente da análise em CLAE ........... 30
Tabela 2: Concentrações de fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteau ...... 35
Tabela 3: Dados dos padrões identificados por CLAE ............................................ 37
Tabela 4: Concentrações de Flavonoides totais ..................................................... 40
Tabela 5: Atividade antioxidante in vitro pelo metódo do DPPH ............................. 40
Tabela 6: Triagem da atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em ágar . 42
Tabela 7: Concentração inibitória mínima do EBLR e FALR, pelo método de
microdiluição .......................................................................................... 44
Tabela 8: Concentração inibitória mínima da EBLR e FALR contra leveduras, pelo
método de microdiluição ........................................................................ 45
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
•OH – Radical Hidroxil
1O2 – Oxigênio Singlet
AMH - Ágar Mueller Hinton
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASD - Ágar Sabouraud Dextrose
ATCC - American Type Culture Collection
CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLAE-DAD - Cromatografia Líquida De Alta Eficiência Acoplada A Detector De
Arranjo de Diodo.
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Deoxyribonucleic acid
DPPH• - Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
EBLR - Extrato bruto L. rigida
EBTU - Extrato bruto T. ulmifolia,
ERO - Espécies Reativas Do Oxigênio
FAD – Foto Arranjo de Diodo
FALR - Fração Acetato de Etila de L. rigida
FATU - Fração Acetato de Etila de T. ulmifolia
FHLR – Fração Hexânica L. rigida
FHTU – Fração Hexânica T. ulmifolia
FRLR – Fração Resiual Licania rigida
FRTU – Fração Residual Turnera ulmifolia
GPx - Glutationa Peroxidase
GR - Glutationa Redutase
GSH - Glutationa Reduzida
GSSG – Glutationa Oxidada
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HNE - 4-hidroxinonenal
HOO• - Radical Peroxila
I.N.T - 2- (4- iodofenil) - 3-(4-nitrofenol)-5-cloreto de fenil tetrazólio
L• - Radical Lipídico
LH – Ácidos Graxos Poliinsaturado
LO• - Radical Alcooxil
LOO• - Radical Peroxil
LOOH - Hidroperóxidos Lipídicos
MDA - Malondialdeído
O2•¯ - Radical Ânion Superóxido
OMS – Organização Mundial de Saúde
O2 – Oxigênio
SAMR - Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina
SISBIO - Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
SOD - Superóxido Dismutase
TCA - Ácido Tricloroacético
TTC - Cloreto de Trifeniltetrazólio
UFC - Unidades Formadoras de Colônias
Vit.E• Radical Tocoferol
YPD - Extrato de Levedura Suplementado com Peptona e Dextrose
γ-GT - Gama Glutamil Transferase
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 14
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 16
2.1 Licania rigida Benth .............................................................................................................................. 16
2.2 Turnera ulmifolia Linn. var. elegans ..................................................................................................... 17
2.3 Espécies Reativas e Estresse Oxidativo ................................................................................................ 18
2.4 Sistema de Defesa Antioxidante ........................................................................................................... 20
2.4.1 Antioxidantes enzimáticos .............................................................................................................. 21
2.4.2 Antioxidantes Naturais ................................................................................................................... 23
2.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais ................................................................................... 24
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 27
3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................................... 27
3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................................... 27
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 28
4.1 Obtenção do Material vegetal e preparo do extrato vegetal ............................................................ 28
4.2 Obtenção das fases orgânicas ........................................................................................................... 29
4.3 Determinação do teor de Polifenólicos totais ................................................................................... 29
4.4 Análise da composição química por Cromatografia líquida de alta eficiência ( CLAE-DAD) ............. 29
4.5 Capacidade de sequestro de radicais livres pelo teste do DPPH ....................................................... 30
4.6 Ensaios de atividade antimicrobiana ................................................................................................. 31
4.6.1 Micro-organismos ..................................................................................................................... 31
4.6.2 Preparo do inóculo microbiano ................................................................................................. 31
4.6.3 Teste de triagem antibacteriana por difusão em ágar .............................................................. 32
4.6.4 Determinação da concentração inibitória mínima por microdiluição ...................................... 32
4.6.5 Determinação da Ação bactericida e fungicida ......................................................................... 33
4.6.6 Cinética de morte microbiana ................................................................................................... 33
4.7 Análise estatística .............................................................................................................................. 34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 35
5.1 Análise fitoquímica ............................................................................................................................ 35
5.2 Ativdade antioxidante ....................................................................................................................... 40
5.3 Atividade antimicrobiana................................................................................................................... 41
6. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 52
7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 53
8. APÊNDICE .................................................................................................................. 60
14
1. INTRODUÇÃO
As plantas e seus subprodutos mostram-se presentes nas práticas humanas
desde tempos imemoráveis, seja como fonte energética ou como um dos primeiros
meios terapêuticos, atualmente vigente em sistemas médicos milenares, como a
medicina chinesa, tibetana, iraniana, asteca e indiana – ayurvédica ( PINTO,
2005;HAYTA; POLAT; SELVI, 2014; JUNIOR; MACIEL).
Esse conhecimento da medicina tradicional vem sendo transmitido ao longo dos
séculos, principalmente por ser fortemente arreigado a hábitos culturais da
população a qual pratica, e continuamente é reorganizado, a fim de adequar – se as
necessidades de um mundo globalizado, buscando equiparar a sua importância a da
medicina alopática. O uso desses recursos terapêuticos ocorre primariamente de
forma alternativa a medicina convencional, e mais pronunciadamente ao combate a
doenças negligenciadas (HEINRICH, 2010).
Dessa forma, seu uso concentra-se principalmente em países em
desenvolvimento, os quais as plantas medicinais são amplamente utilizadas na
atenção primária à saúde (APS). Nesses países, elas são usadas na forma bruta
(não processadas), como chás, fitoterápicos (extratos padronizados e formulados de
plantas) (GURIB-FAKIM, 2006).
Nesse contexto, a organização mundial de saúde (OMS) reconhece que grande
parte da população dos países em desenvolvimento depende da medicina
tradicional para sua atenção primária, tendo em vista que 80% desta população
utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e 85% destes
empregam plantas ou suas preparações (BRASIL et al., 2006, 2012).
Entretanto, o uso de plantas medicinais não se limita apenas como meio
terapêutico, destaca-se também sua importância para a pesquisa farmacológica e o
desenvolvimento de drogas, como matérias-primas para a síntese, ou modelos para
compostos farmacologicamente ativos (BRASIL et al., 2006).
Estima-se que aproximadamente 40% dos medicamentos disponíveis, no ano de
2000, foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de fontes naturais, assim
subdivididos: 25% de plantas, 12% de micro-organismos e 3% de animais
(CALIXTO, 2000).
15
Nesse aspecto, a biodiversidade sobreleva-se como uma das principais fontes de
possíveis fármacos, dessa forma, há grande demanda por estudos que almejam
esclarecer e assegurar o uso racional de vegetais aos quais são atribuídos
propriedades farmacológicas, principalmente os de regiões pouco conhecidas. O
Brasil é um dos líderes nesse tipo de pesquisa, visto que detém a maior diversidade
biológica de plantas do mundo, com cerca de 60.000 espécies vegetais superiores
catalogadas e apenas 8% foram investigadas em relação a sua composição química
(FÁTIMA et al., 2006).
A investigação das propriedades farmacológicas das espécies vegetais presentes
na região semiárida é uma meta científica brasileira, fixada principalmente para o
bioma da caatinga, devido essa apresentar extrema heterogeneidade da sua
fisionomia vegetal e composição florística, além da escassez de estudos que visam
elucidar o verdadeiro potencial de sua biodiversidade (FÁTIMA et al., 2006).
Derivando-se dessa perspectiva científica, insere-se o uso popular da oiticica
(Licania rigida Benth) e da chanana (Turnera ulmifolia Linn. var. elegans), espécies
oriundas do semiárido brasileiro, que são empregadas no tratamento da diabetes e
de processos inflamatórios, doenças essas caracterizadas como crônico-
degenerativas com o envolvimento de espécies reativas de oxigênio(BRITO et al.,
2012).
Outro motivador para a realização desse estudo, é a escassez de projetos que
almejam evidenciar a atividade antimicrobiana dessas espécies, uma vez que existe
urgência para obter-se novos antimicrobianos, e possivelmente, essas espécies
possam deter atividade antimicrobiana devido a capacidade dos compostos que
possui atividade antioxidante, também mostrarem-se ativos contra micro-organismos
patogênicos, como o fenômeno apresentado pelos compostos fenólicos e
terpenoides (SALEEM et al., 2010) .
Portanto, o trabalho apresentado visou elucidar a composição química, o
potencial antioxidante e antimicrobiano das espécies supracitadas. O nosso grupo
de pesquisa já possui trabalhos publicados nessa área, como Nascimento et al.,
2006, que estudou a atividade antioxidante de extratos de Turnera ulmifolia, e Brito
et.al., 2012 que buscou avaliar o seu potencial antioxidante in vivo (SZEWCZYK;
ZIDORN, 2014).
16
2. Revisão bibliográfica
2.1 Licania rigida Benth
Licania rigida Benth (L. rigida Benth); popularmente conhecida como oiticica,
pertence à família Chrysobalanaceae da ordem Rosales e superordem Rosiflorae,
são composta de 17 gêneros e cerca de 450 espécies de hábitos arbustivo e
arbóreo distribuídas em regiões tropicais e subtropicais. No nordeste brasileiro,
encontram-se algumas dessas espécies, como por exemplo: L. rigida Benth., L.
tomentosa (Benth.) Fritsch e Couepia impressa Prance (CORRÊA; PENNA, 1984).
A oiticica apresenta-se como uma árvore de grande porte, podendo atingir até 15
m de altura, com folhas alternas, pecioladas, oblongo-lanceoladas, ásperas,
quebradiças, tomentosas nas faces e com nervuras pronunciadas. Suas flores são
amarelas com 2,5 a 3,5 mm de comprimento, em pequenos grupos, sésseis em
ramos primários da inflorescência (CORRÊA; PENNA, 1984).
Os frutos dessa planta são drupáceos elípticos, com 4 a 5,5 cm de comprimento;
epicarpo liso, seco e verde, mesmo quando maduro; mas tornam-se marrom
esverdeado quando seco. O fruto comporta uma única semente, com formato igual
ao fruto (CORRÊA; PENNA, 1984; QUEIROGA et al., 2013).
Os principais relatos de uso da oiticica referem-se à produção artesanal de
móveis, empregando madeira proveniente de seus troncos, e o uso frutos
empregados na produção industrial de óleo secativo da amêndoa, utilizado pelas
indústrias de tintas, vernizes e na fabricação de sabão, mas em decorrência ao
encerramento das atividades industriais, a exploração dessa cultura foi praticamente
abandonada (BEZERRA et al., 2008; QUEIROGA et al., 2013).
Apesar do uso popular disseminado, há poucos estudos que buscam validar o
potencial farmacológico da L. rigida, os relatos existentes são escassos,
concentrando-se em sua maioria, nas propriedades anti-inflamatórias e
hipoglicemiantes. Apesar dessa conjuntura, Farias e colaboradores (2013) atribuem
às sementes da L. rigida a capacidade sequestradora do Radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazila (DPPH) e atividade antimicrobiana contra o Staphylococcus aureus
(FARIAS et al., 2013a).
17
Os constituintes químicos mais bem descritos na literatura são os presentes no
óleo extraído dos seus frutos e sementes, devido ao seu potencial econômico para
indústria. Esses estudos evidenciaram a presença de ácido licânico (4-ceto-9,11,13-
Ácido Octadecatrienóico), e ácido linoleico (MACEDO et al., 2011). Enquanto que
das raízes da oiticica obteve-se o isolamento de esqualeno, esteroides e de
triterpenoides (BEZERRA et al., 2008). Estudos com as folha da Licania pyrifolia,
evidenciou a presença de canferol, quercetina, miricetina, dentre outros (MENDEZ;
BILIA; MORELLI, 1995).
.
2.2 Turnera ulmifolia Linn. var. elegans
Turnera ulmifolia Linn. var. elegans, popularmente conhecida no Brasil e na
américa latina como chanana, albina, saca-estepe, é um pequeno arbusto,
pertencente a família Turneraceae, constituída por cerca de 135 espécies, com
ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais das américas e da África
(CORRÊA; PENNA, 1984; SZEWCZYK; ZIDORN, 2014).
Caracteriza-se por ser uma planta de porte arbustivo, que atinge até 60 cm de
altura, com folhas aromáticas, pecioladas, oblongas e crenadas. As flores
apresentam corola constituída de cinco pétalas brancas, amarelas ou alaranjadas.
Os frutos são capsulares, contendo em média duzentas sementes. Cresce
preferencialmente em sítios arenosos e úmidos do litoral e nas encostas das serras
(CORRÊA; PENNA, 1984; ANTÔNIO; SOUZA BRITO, 1998).
Existem diversos relatos do emprego da T. ulmifolia na medicina popular em
países diferentes, como no México em que se emprega como tônico contra
indigestão e bronquite. Em todo o continente americano as folhas T. ulmifolia são
usadas na forma de chá e recomendado para distúrbios gastrointestinais,
principalmente para processos ulcerativos (GRACIOSO et al., 2002).
No oeste indiano, as folhas ou toda a planta são empregadas como tônico
revigorante; na Jamaica as folhas da chanana são usadas como agente abortivo;
enquanto que no Caribe, o decocto das folhas é empregado em prescrições para
problemas relacionados à fertilidade (GALVEZ et al., 2006; SILVA, 2007).
No Nordeste brasileiro, a T. ulmifolia é popularmente utilizada como agente
abortivo, expectorante, estimulante, anti-inflamatório, no tratamento de albuminúria
18
e leucorréia. Seu uso também ocorre como medida alternativa no tratamento de
diabetes mellitus, ao empregarem-se preparações obtidas de suas folhas (PRABU et
al., 2009).
Quimicamente, o gênero Turnera caracteriza-se pela presença de flavonoides
(quercetina, apigenina, luteonina, diosmetina), derivados de maltol, arbutina e ácido
elágico. Glicosídeos cianogênicos também foram obtidos de plantas desse gênero
(volkenina, deidaclina, tetrafillina), terpenoides do grupo dos sesquiterpenos e
monoterpenos, β-cariofileno, benzenoides, alcaloides e lipídios (SILVA, 2007;
SZEWCZYK; ZIDORN, 2014).
2.3 Espécies Reativas e Estresse Oxidativo
Os radicais livres ou espécies reativas do oxigênio (ERO), como são
genericamente conhecidas, são produtos intracelulares formados pela redução
parcial do oxigênio (O2) no metabolismo celular normal (RECZEK; CHANDEL, 2015).
Estruturalmente as ERO’s são caracterizadas como moléculas ou fragmentos
celulares que possuem um ou mais elétrons desemparelhados em seus orbitais
moleculares. Este elétron desemparelhado normalmente confere a essas moléculas
um elevado grau de reatividade. Sugere-se que a maior parte da produção
intracelular de ERO sejam derivadas das mitocôndrias em condições fisiológicas
normais. Estudos in vitro estimam que cerca de 1-5% de todo o oxigênio molecular
seja convertido no ânion superóxido (O2•¯), sendo esta a primeira espécie produzida
(YIN; XU; PORTER, 2011; ZHONG; YIN, 2015)
Subsequente à produção do radical superóxido, ocorre à formação do radical
hidroxil, que é a forma neutra do íon hidroxila (•OH), caracterizado por ser uma
espécie altamente danosa ao organismo, devido sua alta reatividade, apesar do seu
tempo de meia vida in vivo ser de aproximadamente de 10-9s. Além dessas
principais espécies reativas, pode ocorrer in vivo, a formação de espécies
radicalares peroxila (HOO•), sendo este a forma protonada do radical superóxido. A
principal consequência de sua formação é a iniciação da cascata de eventos que
leva a peroxidação lipídica (HALLIWELL, 2007; VALKO, MARIAN et al., 2007; YIN;
XU; PORTER, 2011).
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Apesar de ser descrito a importância da produção das espécies reativas em
concentrações controladas, principalmente na defesa contra micro-organismos
invasores, e mais recentemente no mecanismo de sinalização intracelular, há um
controle estrito na concentração de ERO visando manter em um delicado estado de
equilíbrio, a homeostase redox (DRÖGE, 2002; RECZEK; CHANDEL, 2015).
O equilibro do estado redox baseia-se na manutenção precisa das concentrações
das ERO, mantidas em uma faixa estrita pelo monitoramento da produção e por
mecanismos celulares de eliminação de ERO, em que diversas substâncias e
enzimas são capazes de exercer essas funções (FINKEL; HOLBROOK, 2000;
HALLIWELL, 2007). Quando ocorre uma perturbação no estado redox, seja pelo o
aumento na produção de ERO ou por alteração nos mecanismos de remoção, pode-
se instalar um estado de estresse oxidativo, levando a um aumento em sua
concentração (VALKO, M et al., 2006). Em altas concentrações, as ERO estão
implicadas como mediadores de danos a estrutura celular, como por exemplo, o
radical hidroxila pode reagir com todos os componentes da molécula de DNA, agindo
sob ambas as bases nitrogenadas e no esqueleto polissacárido de desoxirribose
(CADENAS; DAVIES, 2000; HALLIWELL, 2007).
As proteínas são uma classe de componentes celulares bastante afetados, pois
todas as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos são susceptíveis ao processo
de oxidação induzido por ERO, principalmente a metionina e a cisteína. Outros
componentes como os ácidos graxos poli-insaturados presentes nas membranas
são extremamente sensíveis à oxidação, desencadeando o processo em cascata de
peroxidação lipídica, produzindo o malondialdeído (MDA) (GRANOLD et al., 2015).
A peroxidação lipídica é tida como uma das principais consequências do estresse
oxidativo, ocorrendo em ácidos graxos poli-insaturados (LH), inicia-se ao radical •OH
capturar um átomo de hidrogênio de um carbono metileno da cadeia polialquil,
levando a geração de um radical lipídico (L•), uma das primeiras espécies geradas
(YIN; XU; PORTER, 2011).
O fato do O2 ser mais solúvel em meio apolar que em meio polar, permite que as
membranas biológicas tenham uma elevada concentração de O2 na região
hidrofóbica medial, no qual este tem o maior potencial para gerar efeitos deletérios
nos ácidos graxos poli-insaturados, principalmente em membrana celulares
(LIEBERT; JONES, 2006).
20
Assim, um ácido graxo com um elétron desemparelhado reage com O2 gerando
um radical peroxil (LOO•), capaz de retirar um hidrogênio de um ácido graxo poli-
insaturado adjacente da membrana, levando a propagação da peroxidação lipídica,
com formação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH). Os hidroperóxidos lipídicos são
instáveis na presença de metais de transição, tais como ferro ou cobre, o qual pode
levar à formação de radicais alcoxil (LO•) e LOO• (GAT et al., 1999; REPETTO;
SEMPRINE; BOVERIS, 2012).
Uma das principais consequências da cascata de peroxidação lipídica é o
malondialdeído (MDA), um dialdeído, altamente reativo, que eventualmente reage
com os grupos amino de proteínas, com fosfolipídios ou com ácidos nucléicos,
induzindo modificações estruturais das moléculas biológicas. Dependendo das
condições do estresse oxidativo, esse aldeído é o mais abundante (HALLIWELL,
2007).
Outros hidroperóxidos são produzidos durante o processo de peroxidação
lipídica, como o 4-hidroxinonenal (HNE), segundo subproduto mais abundante,
contudo o MDA é comprovadamente mutagênico, enquanto que o HNE é o produto
mais tóxico produzido durante a peroxidação (ZHONG; YIN, 2015).
2.4 Sistema de Defesa Antioxidante
Halliwell e Gutteridge (2007) definem antioxidantes como substâncias capazes,
em concentrações relativamente baixas, de competir com outros substratos
oxidáveis e assim, retardar significativamente ou inibir a oxidação desses substratos.
Presume-se que a presença de compostos antioxidantes, advém da exposição as
ERO (DRÖGE, 2002).
Os antioxidantes presentes nas células organizam-se em um sistema
antioxidante, que visa atenuar o estresse oxidativo induzido pelas ERO. Os
mecanismos de atuação das substâncias que compõe esse sistema envolve a
prevenção, o reparo às defesas físicas, bem como as defesas antioxidantes
(GOUGH; COTTER, 2011).
Didaticamente, o sistema de defesa antioxidante é dividido em enzimáticos e não
enzimáticos. O sistema enzimático, é constituído pelas enzimas superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase
(GR), enquanto que os antioxidantes não-enzimáticos, de origem endógena, são
21
constituídos pela glutationa reduzida (D-ϒ-glutamil-L-cisteinil-glicina - GSH), ácido
úrico e proteínas de transporte de metais de transição (transferrina, ceruloplasmina).
Os antioxidantes exógenos incluem os tocoferóis, carotenóides, ascorbato,
micronutrientes (zinco, selênio, manganês), taninos e flavonoides. A presença
desses antioxidantes no sistema celular é conhecida por prevenir danos oxidativos
(BIRBEN et al., 2012).
2.4.1 Antioxidantes enzimáticos
O antioxidante enzimático com ação mais pronunciada é a superóxido dismutase
(SOD), uma enzima capaz de catalisar a reação de dismutação do O2•¯ em peróxido
de hidrogênio (H2O2) e O2. A atividade dessa enzima é fundamental para proteção
celular contra a citotoxicidade mediada pelo O2•¯ (CHOUDHARI et al., 2014).
A SOD apresenta-se como uma isoenzima sob três isoformas presentes nas
células de mamíferos, oriundas da expressão de genes diferentes, mas com a
mesma função. A forma SOD-1 é uma enzima citosólica cobre-zinco, enquanto que
a SOD-2 magnesiana é a isoforma encontrada na mitocôndria. A última isoenzima
relatada na literatura é a forma extracelular SOD-3 também cobre-zinco (LIOCHEV;
FRIDOVICH, 2010).
A glutationa peroxidase outra enzima de grande valia para as defesas
antioxidantes celulares, é uma selenoproteína presente em 4 isoformas, sendo elas:
Gpx1, Gpx2, Gpx3 e Gpx4. Essas enzimas constituem uma família que atua
principalmente na eliminação de peróxidos, que são substratos em potencial para a
reação de Fenton. A GPx atua em conjunto com o GSH, a qual está presente em
células em elevadas concentrações (micromolar). O substrato para a reação
catalisada pela GPx é H2O2 ou um peróxido orgânico, principalmente pela GPx4,
pois está associado à membranas. Os mecanismos de ação da GPx baseia-se na
decomposição dos peróxidos em água (ou álcool), enquanto simultaneamente oxida
GSH. A glutationa peroxidase é amplamente distribuída pelos compartimentos
celulares (RAYMAN, 2012; VALKO, MARIAN et al., 2007).
A catalase é outra enzima que atua na detoxificação do H2O2, presente
principalmente nos peroxissomos, localizada no citoplasma celular, na qual promove
de forma muito eficiente à conversão de peróxido de hidrogênio à água e oxigênio
22
molecular. A catalase tem uma das mais altas taxas de renovação de todas as
enzimas, e devido possuir como substrato para a sua reação o peróxidos, atua de
forma sinérgica a GPx na proteção antioxidante ( HALLIWELL, 2011; BACKOS;
FRANKLIN; REIGAN, 2012).
Atuando de forma sinérgica ao sistema enzimático, os antioxidantes não
enzimáticos complementam a defesa do organismo. Seus principais componentes
são a vitamina E (tocoferóis), vitamina C (ácido ascórbico), o β-caroteno
(carotenoides), e o GSH (HALLIWELL, 2007).
O GSH é um tripeptídeo do tipo tiol dissulfeto, caracterizado principalmente pela
sua capacidade antioxidante multifuncional, considerado o principal tiol que atua no
equilíbrio redox. Amplamente distribuído no citosol, nas membranas celulares e
mitocôndria, sendo o antioxidante solúvel mais presente nesses compartimentos
celulares (JOHNSON; WILSON-DELFOSSE; MIEYAL, 2012).
De forma geral a capacidade antioxidante dos Tióis, principalmente da GSH,
deve-se ao átomo de enxofre que facilmente pode acomodar a perca de um elétron,
como ocorre no processo de neutralização de diversas espécies reativas (HO•,
H2O2, LOO•). Nesse processo, o GSH é oxidado, gerando um radical Glutationa
oxidada (GSSG), que ao se dimerizar, gera a sua forma oxidada do GSSG (VALKO,
M et al., 2006).
A GSSG acumula-se no interior da célula coexistindo em um equilíbrio com sua
forma reduzida. Desse modo, o balanço GSSG/GSH provém um biomarcador
valioso para mensuração do estresse oxidativo. A GSSG retorna a sua forma
reduzida ao restaurar o radical sulfidrila, por ação da glutationa redutase e ao reagir
com proteínas (GU; CHAUHAN; CHAUHAN, 2015).
As principais funções da GSH consistem em atuar como cofator enzimático em
diversas reações que visam atenuar e eliminar as espécies reativas, como a Gpx;
atuar no transporte de aminoácido através da membrana plasmática, como um
sequestrador do hidroxil e oxigênio sigleto (1O2). Além disso, a GSH é capaz de
regenerar as vitaminas C e E (HALLIWELL, 2007).
Outro importante antioxidante não enzimático, o ácido ascórbico, conhecido
popularmente como vitamina C é um potente antioxidante comumente encontrado
no organismo humano em compartimentos celulares hidrofílicos. Em sua forma de
ânion ascorbato, atua como agente redutor ao reagir com a maioria das ERO, sendo
oxidado, nesse processo, a vitamina C. Quando associado a vitamina E no plasma
23
sanguíneo age contra a peroxidação lipídica, na prevenção, pela reação com as
espécies reativas de oxigênio, e restaurando in situ no ponto de início da
peroxidação lipídica ao doar um próton ao radical lipídio, cessando assim a
propagação deste evento (OUDEMANS-VAN STRAATEN; MAN; DE WAARD, 2014).
A vitamina E possui propriedades antioxidantes, sendo encontrada sob oito
diferentes formas, cuja mais ativa é o α-tocoferol, presente principalmente em
membranas devido a sua lipofilicidade. Por suas características químicas é
considerado o antioxidante mais potente ligado a membranas, tendo como maior
função prevenir a peroxidação lipídica (RIZVI et al., 2014).
A sua habilidade em prevenir a peroxidação lipídica deve-se: a capacidade de
ser um bom doador de átomos de hidrogênio; A sua alta permeabilidade por entre as
membranas celulares; Além da habilidade do radical tocoferol (vit. E•), formado no
processo de neutralização de espécies reativas, ser regenerado a sua forma ativa
por redutores citosólicos, como ácido ascórbico (TRABER; ATKINSON, 2007).
2.4.2 Antioxidantes Naturais
Além das defesas antioxidantes endógenas, existe uma vasta gama de
compostos que podem desempenhar atividade protetora contra ERO. Neste contexto
destacam-se os compostos de origem natural, que são definidos como nutrientes
não essenciais, bioativos, obtidos a partir de plantas e presente em diferentes partes
como, sementes, frutos, folhas e raízes (FERREIRA; ABREU, 2007; HUANG; CAI;
ZHANG, 2010).
Estes compostos possuem uma variedade de efeitos na saúde humana, das
quais destaca-se a atividade antioxidante. Diversos são os compostos a que se
inferem essas propriedades, podendo-se incluir carotenoides (α- caroteno, β-
caroteno, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina, astaxantina e licopeno); compostos
fenólicos: ácidos fenólicos (ácidos hidroxibenzóicos e ácidos hidroxicinâmicos),
flavonoides (flavonóis, flavonas, flavanóis, flavanonas, antocianidinas
eisoflavonoides), estibenos, cumarinas e taninos (LÓPEZ-ALARCÓN; DENICOLA,
2013).
Os carotenoides são uma família de composto pigmentares sintetizado por
plantas, micro-organismos e ausente em animais, assim as maiores fontes desses
24
compostos são frutas e vegetais. Diversos estudos concentram-se em descrever a
capacidade antioxidante, principalmente devido sua propriedade sequestradora de
ERO, em especial sua pronunciada habilidade em inativar o radical 1O2. Dessa
forma, as moléculas abrigadas nessa classe possuem um efeito protetor frente a
doenças na qual há o envolvimento de radicais livres.
Os fenólicos constantemente são citados devido a capacidade de exercer
múltiplas atividades biológicas nos vegetais. Atuam no mecanismo de defesa contra
agentes patogênicos, parasitas e predadores, contribuem para a coloração das
plantas, além de serem quimioprotetores (HUANG; CAI; ZHANG, 2010).
A essa classe de compostos também é atribuída uma variedade de atividades
biológicas, como: antioxidante, anticancerígena, antimutagênica, antiaterosclerótica,
antibacteriana, antiviral e anti-inflamatória (HELENO et al., 2015).
Dentre os compostos fenólicos, sobressaem os flavonoides, por apresentarem
uma família que abrange mais de 4000 compostos e por ser a classe de compostos
mais descrita e testada em estudos médicos (HUANG; CAI; ZHANG, 2010).
Os flavonoides são caracterizados como compostos que comumente apresentam
um esqueleto básico de estrutura fenil benzopirona (C6-C3-C6), que consiste em
dois anéis aromáticos (anéis A e B) ligados por 3 carbonos, podendo existir um
centro oxigenado, um anel pirano, ou anel C. De acordo com o nível de saturação e
abertura do anel pirano central, estes compostos podem ser classificados em,
flavonas (uma estrutura básica, com o anel B ligando-se em duas posições),
flavonois (possuem uma hidroxila na posição 3), flavonas (diidroflavonois),
flavononas, isoflavonoides (prinicipalmente as isoflavonas, anel B liga-se ao anel
pirano na posição 3), flavononol, e antocianinas (LI et al., 2014).
Na natureza os flavonoides podem ser encontrados na forma livre (agliconas) ou
na forma ligada a um açúcar (glicoíideos), podendo essa ligação ser por meio de
uma OH, O-glicosilado ou por meio de uma ligação carbônica (C-glicosilados), sendo
esses compostos associados a mais de 80 tipos diferentes de açúcares (RICE-
EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).
2.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais
25
Os produtos naturais ainda são fontes de inúmeras drogas, mesmo com a
diminuição de sua procura em relação aos compostos sintéticos. Esses produtos,
considerados uma das principais fontes de fármacos antimicrobianos, podem ser
obtidos de bactérias, fungos, animais e plantas. Os fármacos pertencentes à classe
dos antimicrobianos, foram rapidamente disponibilizados na prática médica,
acarretando a disseminação de seu uso, associado ao consumo indiscriminado não
orientado (COWAN, 1999; CUSHNIE, T. P TIM; LAMB, 2011).
Passado mais de meio século de uso desses medicamentos, está evidente a
perca significativa de sua eficácia terapêutica, principalmente pelo emprego
irracional, culminando com o desenvolvimento da multirresistência microbiana. No
intuito de reverter este quadro, a indústria farmacêutica tem reunido esforços,
buscando novos fármacos, a fim de empregá-los no combate de cepas resistentes,
como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) (SALEEM et al., 2010).
Como uma das estratégias adotadas para desenvolvimento de novos
antimicrobianos, recorre-se aos produtos naturais, apesar da grande maioria dos
antimicrobianos produzidos, derivarem de metabólitos obtidos a partir de micro-
organismos, principalmente aos do filo Actinomycetes, as plantas apresentam
relevante potencial farmacológico (MISHRA, BHUWAN B.; TIWARI, 2011; TAYLOR,
2013)
As plantas são capazes de sintetizar um elevado número de metábolitos
secundários (cerca de 100,000), dos quais uma grande parte apresenta atividade
anti-infecciosa. Alguns desses compostos possuem um baixo potencial
antimicrobiano quando comparado aos agentes comercializados atualmente, e
outros possuem atividades em concentrações nanomolares (MISHRA, BHUWAN B.;
TIWARI, 2011).
Os metabólitos secudários mais comumente atribuídos como antimicrobianos,
são alcaloides, cumarinas, iridoides, flavonoides, isoflavonas, macrolídeos, fenólicos
simples, saponinas, xantonas, terpenoides e outros (SALEEM et al., 2010).
Os terpenoides são elencados como detentor do potencial antimicrobiano e estão
presentes principalmente em óleos essenciais derivados de flores, ervas aromáticas
e frutas. O seu efeito contra micro-organismos deve-se a capacidade da indução de
reações tóxicas nas membranas bacterianas, induzido diretamente o aumento da
permeabilidade, desestruturação da conformidade nativa, culminando com a total
perca de função levando a perca da viabilidade celular. Como exemplos dessa
26
atividade tem-se a pesquisa realizada por Sfeir et al. (2013) que comprovou a
atividade antibacteriana dos óleos essenciais ricos em terpenoides das plantas
Thymus capitatus e Cinnamomum verum contra S. epidermidis e Streptococcus
pyogenes (TROMBETTA et al., 2005).
Os compostos polifenólicos, bem como os terpenoides, têm sido intensamente
investigados quanto ao seu potencial antimicrobiano, apresentando resultados
significativos como o observado no estudo das folhas da Piper regnellii, conhecida
popularmente como pariparoba, que mostrou ação contra Staphylococcus aureus em
concentrações inibitórias mínimas baixas, devido a presença desse compostos
(SALEEM et al., 2010).
Dentre os compostos fenólicos destacam-se os flavonoides, por ser um dos
metabólitos secundários mais abundantes e por possuir mecanismo de ação distinto
dos agentes terapêuticos convencionais. As principais evidências de sua atividade
referem-se a alta permeabilidade desses compostos através da parede microbiana e
capacidade de se ligar as porinas, presente na membrana externa, ao bloquear as
suas cargas nativas. Além disso, os flavonoides podem complexar as proteínas
solúveis e extracelulares, é inferido aos membros mais lipofílicos dessa classe de
compostos a possibilidade de induzir o rompimento de membranas microbianas
(TAYLOR, 2013).
27
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade antimicrobiana e antioxidante de Licania rigida e Turnera
ulmifolia Linn. var. elegans.
3.2 Objetivos Específicos
Determinar a composição química preliminar dos extratos e frações da Licania
rigida e Turnera ulmifolia.
Avaliar a capacidade antioxidante in vitro dos extratos e frações da Licania rigida
e Turnera ulmifolia.
Investigar o potencial antimicrobiano dos extratos e suas respectivas frações em
ensaio de difusão em ágar.
Determinar a concentração inibitória mínima dos extratos e suas respectivas
frações por microdiluição em caldo.
Estabelecer a cinética de morte antibacteriana e antifúngica dos extratos e
frações que apresentaram atividade nos ensaios anteriores.
28
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção do Material vegetal e preparo do extrato vegetal
As plantas utilizadas durante todo o estudo foram obtidas em uma única coleta,
pois além de minimizar a variação dos constituintes químicos advindos da
sazonalidade intrínseca da população vegetal, ao utilizar-se durante toda a pesquisa
a mesma amostra vegetal também tende-se a eliminar discrepâncias que
eventualmente ocorre em estudos laboratoriais.
As amostras vegetais foram coletadas em abril de 2013, no estado do Rio
Grande do Norte. A L. rigida Benth foi coletada em Florânia, microrregião da serra de
Santana, nas coordenadas: 6°14’07,51” S/36°78’ 21.45”0; e a T. ulmifolia Linn. var.
elegans foi coletada em Natal nas coordenadas: 5°52’17,38” S / 35°10’45 81” O.
Ambas as coletas foram realizadas no horário da manhã e requisitado autorização
ao Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (Sisbio), registrado sob
o número n°40606. L. rigida foi identificada pela Profª Drª Maria Iracema Bezerra
Loiola e registrada sob o número 8206 no herbário da UFRN; enquanto a T. ulmifolia
foi identificada pelo professor Prof. Dr. Jomar Gomes Jardim, com o registro de Nº
16724, no herbário da UFRN.
Após a coleta, as amostras foram levadas ao laboratório para estabilização em
estufa de ar circulante (Nova ética, mod.400-80, São Paulo, Brasil) com temperatura
controlada, não ultrapassando 40°C por 48 horas. Após estabilização, as folhas
foram selecionadas como farmacógeno e triturado em liquidificador industrial
(Skymen - LT-2,0 SUPER-N, Brasil), a fim de obter-se o pó que seria utilizado na
obtenção do extrato.
O processo de extração consistiu em uma maceração por 4 dias, empregando
como solvente extrator etanol a 50%, na proporção de 5 mL de solvente extrator
para 1g de material vegetal processado. O extrato obtido foi filtrado e concentrado
em evaporador rotativo a 40°C, sob pressão reduzida (Rotavapor® R-3 com bomba
de vácuo V-700 Buchi® - Suiça).
29
4.2 Obtenção das fases orgânicas
Os extratos obtidos, extrato bruto de L. rigida (EBLR) e extrato bruto de T.
ulmifolia (EBTU), foram fracionados com solvente de polaridade crescente, iniciando
por dissolução em metanol:água (9:1) e quatro partições com 100 mL de hexano,
obtendo as frações hexânicas de L. rigida (FHLR) e de T. ulmifolia (FHTU). Em
seguida, a fase hidrometanólica foi acrescida de água para obter a proporção
metanol:água (1:7), com posterior partição em acetato de etila, com quatro
repetições, também 100 mL cada, obtendo-se as frações acetato de etila de L.
rigida (FALR) e T. ulmifolia (FATU) e as frações residuais, L. rigida (FRLR) e T.
ulmifolia (FRTU). Todos os extratos brutos e suas respectivas frações foram
concentradas em evaporador rotativo, a temperatura de 40°C, sob pressão negativa.
A partir dos extratos e respectivas frações concentrados foram realizados todos os
testes propostos.
4.3 Determinação do teor de Polifenólicos totais
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da absorbância de
amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido gálico
(10- 350 μg/mL), utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteau, conforme o
procedimento descrito por (GEORGÉ et al., 2005). O teste foi conduzido em triplicata
e o resultado expresso em média e desvio padrão de µg de equivalentes de ácido
gálico por 100 mg de extrato.
4.4 Análise da composição química por Cromatografia líquida de alta
eficiência ( CLAE-DAD)
A análise cromatográfica dos extratos foram realizadas em um CLAE (VARIAN
ProStar HPLC system, WalnutCreek,Au), equipado com bomba quaternária (ProStar
240), autoamostrador (ProStar 410) e um detector (modelo 355 FAD UV/V) acoplado
a uma coluna cromatográfica Phenomenex C18 (4,.6 x 100 mm, tamanho de
partícula 2,.6 μm, Torrance, CA,USA).
O preparo das amostras procedeu de acordo com o padronizado por Aznar e
colaboradores ( 2011), usando o extrato e suas frações dissolvidos em metanol a
uma concentração máxima de 5 mg/mL. Estes foram filtrados em membranas
30
próprias para seringa de 0,22 µm, e para iniciar o teste foram aliquotadas 9 µL de
cada amostra filtrada.
A corrida cromatográfica foi realizada à temperatura ambiente, monitorado a 280
nm, usando um gradiente de solventes de ácido fórmico a 0,1% em água (solvente
A) e acetonitrila ( solvente B), a um fluxo de 1,3 mL/ min, em que a variação de
solvente ocorreu de acordo com o Tabela 1:
Tabela 1: Variação do gradiente do sistema solvente da análise em CLAE
Intervalo de
Tempo (min)
Concentração
da solvente A
(%)
Concentração
da solvente B
(%)
Característica
da fase móvel
0–3 95 5 Faixa isocrática
3–7 95-80 5-20 Alteração linear
7–9 80 20 Faixa isocrática
9-10 80-77 20-23 Alteração linear
10-15 77 23 Faixa isocrática
15–19 77-50 23-50 Alteração linear
*19–20 50-95 50-5 Alteração linear
* intervalo empregado para retornar as condições iniciais do método.
Os testes foram executados em triplicata para cada amostra e os resultados da
análise quantitativa foram expressos em µg de equivalente de padrão
correspondente, por mg de extrato.
4.5 Capacidade de sequestro de radicais livres pelo teste do DPPH
O sequestro de radicais livres (SRL) foi avaliado pelo método do DPPH, baseado
no descoramento de uma solução de DPPH (cor violeta) que ao ceder um átomo de
hidrogênio estabiliza o oxidante (CUENDET; HOSTETTMANN; POTTERAT, 1997).
O meio reacional extemporâneo, foi composto de uma solução de DPPH a 0,06 mM
(6 x 10-6 mol/L) diluído em metanol, sempre diluído abrigado da luz e empregado
imediatamente para evitar sua deterioração. O meio reacional foi constituído por 3,9
mL de solução de DPPH e 0,1 mL de amostra diluída.
A reação foi incubada no escuro a temperatura ambiente, após transcorrido 30
min de incubação, a absorbância foi mensurada a 515 nm, e o zero do aparelho
31
acertado com álcool metílico, pois este foi o agente diluente empregado em todos os
procedimentos. Todas as análises foram realizadas em triplicata e os resultados
obtidos foram expressos em média e desvio padrão de concentração mínima
inibitória de 50%. Como controle positivo do teste foi utilizado o padrão de Carduus
mariannus, pois este apresenta-se presente em medicamentos fitoterápicos que
baseiam seu mecanismo de ação em debelar espécies reativas de oxigênio
(MISHRA, KRISHNANAND; OJHA; CHAUDHURY, 2012).
4.6 Ensaios de atividade antimicrobiana
4.6.1 Micro-organismos
Para a realização dos ensaios de atividade antibacteriana foram selecionadas as
bactérias, Staphylococcus epidermidis (ATCC® 12228™), Staphylococcus aureus
(ATCC® 29213™) Staphylococcus aureus meticilina resistente (ATCC® 33591™),
Escherichia coli (ATCC® 25922™), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e
Pseudomonas aeruginosa (ATCC® 9027™).
Para atividade antifúngica foram utilizadas as leveduras: Candida albicans
(ATCC® 90028™), Candida dubliniensis (CBS 7987), Candida tropicalis (ATCC®
13803™), Candida parapsilosis (ATCC® 22019™), Candida glabrata (ATCC®
2001™), Candida krusei (ATCC® 6258™), Candida rugosa (ATCC® 10571™) e
Trichosporon asahii (CBS 2630).
As bactérias foram mantidas em miçangas a -80°C e em ágar nutriente a 4°C,
cedidas pelo Laboratório de Microbiologia Clínica do Departamento de Análises
Clínicas e Toxicológicas da UFRN. As leveduras foram mantidas em criotubos
contendo caldo YPD (extrato de levedura suplementado com peptona e dextrose) e
glicerol, mantidos a -80°C e cedidas pelo Laboratório de Micologia Médica e
Molecular do mesmo departamento.
4.6.2 Preparo do inóculo microbiano
Para os testes de difusão em ágar e microdiluição em caldo o inóculo bacteriano
foi preparado a partir de um crescimento de 24 h em solução salina estéril, na qual
sua densidade celular foi padronizada de acordo com a escala 0,5 de McFarland
(108 Unidade formadoras de colônias – UFC/mL). O inóculo fúngico foi preparado a
partir de um crescimento de 48 h em ágar Sabouraud dextrosado, com turbidez
32
ajustada de acordo com a escala 0,5 de McFarland (106 UFC/mL) (CLSI, 2013).
Para a curva de morte foi utilizado o inóculo final com densidade celular de 105
UFC/mL e 103 UFC/mL, para bactérias e leveduras, respectivamente (NCCLS,
1999).
4.6.3 Teste de triagem antibacteriana por difusão em ágar
O teste de difusão em ágar consistiu em semear os inóculos bacterianos (1 x 108
UFC/mL) com auxílio de um swab estéril em ágar Mueller Hinton (AMH; Himedia),
com posterior realização de poços. A cada poço foi adicionado 40 µL de extrato
(5mg/mL), fração (5mg/ml) e solução aquosa de dimetilsulfóxido (DMSO) a 5%
(solvente de diluição). As placas testadas foram incubadas a 37 °C. Após 24 h os
diâmetros dos halos de inibição foram medidos em milímetros. Como controle do
método, foram utilizados os discos padronizados com os antimicrobianos
gentamicina 10µg e vancomicina 30µg. Todos os testes foram realizados em
triplicata (CLSI, 2013).
4.6.4 Determinação da concentração inibitória mínima por microdiluição
O teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizado de acordo com o
manual do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Esse ensaio define
qual a menor concentração de uma substância capaz de inibir o crescimento de uma
cepa microbiana (CLSI, 2013).
A determinação da CIM das cepas bacterianas sensíveis as substâncias em
estudo foi realizada pelo método de microdiluição em caldo, que consistiu em
adicionar 100 µL das amostras (EBLR e FALR) em concentrações conhecidas (8, 4,
2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,0625 mg/mL), em caldo Muller Hinton (MH), utilizando-se
uma placa de 96 poços, com posterior adição de 100 µL do inóculo microbiano,
totalizando assim um volume final de 200 µL em cada poço. Foram utilizados
controles de viabilidade (caldo MH com bactéria), esterilidade (caldo MH com
extrato/fração e caldo MH) e do método (vancomicina, vanconcin®). O solvente
diluente, DMSO a 5%, foi utilizado para excluir possível interferência no teste. As
placas foram incubadas em incubadora de bancada (CT – 712- Cientec, São Paulo,
Brasil) a 37 ºC, por 24 h, com agitação a 200 rpm.
33
Para as leveduras, o ensaio de microdiluição foi realizado de acordo com os
procedimentos citados acima, com adequações pontuais.
Essas mudanças consistiram na alteração do meio empregado no teste, usando-
se RPMI-1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol)
ao invés de caldo MH. As concentrações testadas foram 5, 2,5, 1,25, 0,625 0,312,
0,156 0,0780, 0,0390, 0,0195 mg/mL, com incubação a 37°C por 48h (NCCLS,
2002). Como controle do método foi utilizado o antifúngico fluconazol (Prati
Donaduzzi).
Ao final de cada ensaio, em ambos os procedimentos realizou-se a leitura visual
do crescimento microbiano, com o auxílio do cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, Sigma,
Colorado, EUA).
4.6.5 Determinação da Ação bactericida e fungicida
Posterior ao ensaio da determinação da CIM, e antes da adição de TTC, foram
retiradas alíquotas para avaliar a viabilidade dos micro-organismos em ágar Brain
heart infusion agar (BHI) e ágar Sabouraud dextrose estéreis. Com o auxílio de uma
alça bacteriológica retirou-se uma alíquota de cada poço da placa-teste usada na
determinação da CIM. Nas placas de crescimento bacteriano as alíquotas retiradas
foram semeadas em Ágar Brain heart infusion agar (BHI) e incubadas durante 24 h a
37°C. As alíquotas retiradas dos poços com leveduras foram semeadas em ágar
sabouraud dextrose e incubados por 48 h a 37°C. Transcorrido o período de
incubação de cada um dos testes, foi realizada leitura visual para determinar se
houve ou não crescimento dos micro-organismos na ausência da substância
estudada (RAMANUJ; BACHANI; KOTHARI, 2012).
4.6.6 Cinética de morte microbiana
Os ensaios da curva de morte microbiana do EBLR e FALR foram realizados com
as bactérias S. epidermidis (ATCC® 12228™), S. aureus (ATCC® 29213™) e S.
aureus meticilina resistente (ATCC® 33591™), e com a levedura C. krusei (ATCC®
6258™), que se mostrou mais sensível as substâncias estudadas.
Esse teste foi realizado em microplacas estéreis, seguindo o mesmo
procedimento do item 4.6.4, nas concentrações de 0,125 X CIM, 0,25 X CIM, 0,5 X
CIM, 1 X CIM, 2 X CIM e 4 X CIM para as bactérias e 0,25 X CIM, 0,5 X CIM, 1 X
CIM, 2 X CIM e 4 X CIM para as leveduras. As placas foram incubadas a 37°C, sob
34
agitação (200 rpm). Em tempos determinados, para as bactérias (0h, 4h, 6h, 8h, 10h
e 24h) e para a levedura (0h, 6h, 24h, 30h e 48h), os crescimentos microbianos
foram avaliados pela leitura espectrofotométrica em leitora de ELISA (ELX 800-
Epoch, Biotek, USA), a 595 nm. As absorbâncias foram plotadas em gráficos para
determinar a cinética de morte (NCCLS modificado, 1999). Foram utilizados os
mesmos controles citados no item 4.6.4. O experimento foi realizado em duplicata.
4.7 Análise estatística
Os resultados foram descritos como média ± desvio padrão. O tratamento
estatístico foi efetuado pelo do teste de normalidade de Shapiro – Wilks, seguido do
teste de comparação de amostras independentes, pelo teste de Wilcoxon-Mann-
Whitney. Os resultados da cinética de morte microbiana foram analisados pelos
métodos de Kruskal-wallis e comparação múltipla de Dunn’s. Para a comparação
entre grupos foi usado ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. Os valores que
demonstrassem um p menor que 0,05 foram considerados significativos. Os
tratamentos estatísticos foram realizados utilizando os programas, IBM statistics
versão 20.0 e Graph pad prism versão 6.0.
35
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise fitoquímica
A análise química do padrão analítico, dos extratos brutos e suas frações
derivadas, pelo método de Folin-Ciocalteau, mostraram-se específicos e seletivos.
Por meio da interpolação com a curva de calibração construída (Figura 1) foi
possível evidenciar altos teores de compostos fenólicos, os quais distribuíram-se
principalmente no extrato bruto e na fração acetado de etila, tanto para a T. ulmifolia
como para L. rigida, como exposto na Tabela 2. Nesse teste a fração residual de
ambas as espécies não foi avaliada devido não ser possível uma avaliação fidedigna
com resultados consistentes por este método.
Fonte: Arquivo do autor
Tabela 2: Concentrações de fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteau
Amostra mg Eq. de Ácido Gálico mg-1 * Desvio Relativo (%)
EBLR 7,340 1,146
FHLR 0,00 **
FALR 6,549 0,314
EBTU 1 ,608 0,090
FHTU 0,148 0,310
FATU 2,240 0,101
*Fenólicos totais em mg de Equivalente de Ácido gálico /100 mg de extrato. ** Não houve desvio
relativo quantificável.
Figura 1: Curva de calibração do Ácido Gálico
36
Pode-se afirmar que o achado foi promissor e estimulou a continuidade do
estudo, visto que os metabólitos secundários que apresentam grupamentos
fenólicos em sua estrutura são relatados na literatura como detentores de ampla
atividade antimicrobiana e antioxidante. Resultados citados por Saleem e
colaboradores (2010), mostram a presença de compostos fenólicos em diferentes
espécies de plantas usadas no combate a micro-organismos. Dados semelhantes
foram observados por Chirumbolo (2011) em estudos in vitro contra espécies de
Candida spp., Klebsiella pneumoniae e Salmonella Typhimurium e in vivo,
destacando a ação imunoreguladora dos polifenóis, que pode estar envolvida com o
seu potencial antimicrobiano.
Os resultados obtidos do teor de polifenólicos da T. ulmifolia assemelham-se aos
descritos por Nascimento e colaboradores, ao também detectarem compostos
fenólicos em seus extratos (NASCIMENTO et al., 2006).
Enquanto a L. rigida, carece de estudos abordando a sua composição química, a
maioria dos estudos existentes são relacionados à caracterização do óleo extraído
das sementes. Pesquisas realizadas com espécies da mesma família,
Chrysobalanaceae, evidenciam como compostos majoritários os taninos,
flavonoides, saponinas, esteroides livres e quinonas no extrato hidroetanólico da
casca de L. macrophylla (GOMES eta al., 2006) e de cromonas em folhas de L.
arianeae Prance (DE CARVALHO et al., 2005).
Devido à ausência de compostos fenólicos e impossibilidade de solubilizar as
amostras das frações hexânica e residual nos meios reacionais dos testes
posteriores, as demais análises foram conduzidas somente com os extratos brutos e
frações acetato de etila de cada espécie.
A análise cromatográfica inicial dos padrões demonstrou que o método validado
foi específico e seletivo, capaz de eluir e identificar nove padrões de compostos
fenólicos em uma única corrida, como exposto na Figura 2, e os parâmetros de
validação descritos na Tabela 3.
37
Figura 2: Cromatograma padrão do método empregado nas análises
Em ordem de eluição: Ácido Gálico; Ácido Clorogênico; Catequina;(-)Epigalato de epicatequina;
Rutina; Hiperina; Quercetina; Apigenina; Canferol.
Tabela 3: Dados dos padrões identificados por CLAE
Composto Tempo de
retenção (min)
Concentração
Linear (µg/mL)
UV
(nm)
R2
Ácido Gálico 1,71 1,5 – 50 271 0,9945
Ácido Clorogênico 6,47 1,5 – 50 326 0.9973
Catequina 7,19 1,5 – 50 278 0.9993
(-)Epigalato de epicatequina 8,18 1,5 – 50 275 0.9989
Rutina 9.20 1.81–100 275 – 354 0.9976
Hiperina 9.24 1.81–100 256 – 354 0.9995
Quercetina 16.03 1.5–50 255 – 371 0.9991
Apigenina 18,51 1.5–50 266 – 337 0.9989
Canferol 18,85 1.5–50 263 – 367 0.9984
Nas análises das amostras EBLR, FALR, EBTU e FATU por CLAE, foram
observadas a presença de cromatogramas apresentando tempo de retenção e
espectro de UV com máximos de absorção característicos de flavonoides. De acordo
com a comparação do perfil cromatográfico dos padrões disponíveis no laboratório,
ácido gálico, ácido clorogênico, catequina, (-) epigalato de epicatequina, rutina,
hiperina, quercetina, apigenina e canferol, não foi possível confirmar a estrutura dos
flavonoides detectados nos cromatogramas. Sugere-se, pela comparação dos
tempos de retenção e dos espectros de absorção máximo no UV, que no EBTU e da
FATU (Figuras 3 e 4) evidenciam dois compostos majoritários, nos quais o (1) é um
38
flavonol – O – 3 glicosilado semelhante a rutina, enquanto que o composto (2) é uma
flavona glicosilada semelhante ao espectro da apigenina. Brito e colaboradores
(2012), detectaram esses mesmos compostos majoritários nos extratos
hidroetanólicos das folhas de T. ulmifolia.
1) flavonol – O – 3 glicosilado 2). flavona glicosilada;
1) flavonol – O – 3 glicosilado 2). flavona glicosilada;
Nas Figuras 5 e 6, referente às análises cromatográficas do EBLR e FALR,
observou-se a presença de um flavonol-O-3-glicosilado como o composto
majoritário, com a sua concentração mais elevada na fração de acetato de etila
(Tabela 4). Esses dados foram semelhantes aos descritos por Braca e
colaboradores (1999), ao isolar flavonoides O-3-glicosilados de folhas de L.
densiflora, planta pertencente à mesma família da L. rigida.
Figura 3: Cromatograma gerado pela análise do EBTU
Figura 4: Cromatograma gerado pela análise da FATU
39
Figura 5: Cromatograma gerado pela análise do EBLR
1) flavonol-O-3-glicosilado;
Figura 6: Cromatograma gerado pela análise da FALR
1) Flavonol-O-3-glicosilado;
O EBTU e a FATU diferem principalmente em suas concentrações totais dos dois
compostos majoritários, os quais estão quantificados na Tabela 4. Pode-se observar
que a FATU apresentou (262,36 µg Eq.rutina/mg) mais de duas vezes a
concentração de flavonoide em relação EBTU (121,51 µg Eq rutina/mg). Enquanto a
fração da L. rigida (FALR) mostrou concentração maior de flavonoide que o extrato
bruto (EBLR).
40
Considerando-se os resultados obtidos, é possível afirmar que os flavonoides,
principalmente os flavonóis – O – glicosilados, concentraram-se na fração acetato de
etila; e que a análise cromatográfica foi determinante na caracterização dos extratos
e frações, qualificando-se dessa forma, como um importante método empregado em
processos de padronização dos extratos estudados, bem como um método analítico
poderoso capaz de indicar possíveis atividades biológicas que essas plantas
venham apresentar, pois a literatura descreve os compostos fenólicos, de um modo
geral, e os flavonoides como detentores de diversas atividades biológicas,
destacando-se as antioxidante e antimicrobiana (GONZÁLEZ et al., 2011).
5.2 Atividade antioxidante
A capacidade antioxidante desses compostos é atribuída principalmente a
relação estrutura atividade, na qual as hidroxilas fenólicas presentes em suas
estruturas são capazes de neutralizar um grande espectro de ERO, por causa do
potencial de redução ser inferior ao dos radicais, principalmente dos grupamentos
alcoxila, peroxilas e do O2•¯(RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996).
Para avaliar a possível capacidade antioxidante in vitro foi realizado o ensaio do
DPPH•, empregando como padrão o Carduus marianus. Foram testados o EBLR,
EBTU, FALR e FATU, e calculada a capacidade destas substâncias sequestrarem
50% do radical livre (IC50) de DPPH•. Os resultados estão detalhados na Tabela 5.
Tabela 5: Atividade antioxidante in vitro pelo metódo do DPPH
Amostras IC50 (µg/mL)
EBTU 6,47 ± 1,10*
FATU 7,17 ± 0,51
EBLR 35,81 ± 1,10
Tabela 4: Concentrações de Flavonoides totais
Amostras µg Eq rutina/ mg de extrato ± Erro Padrão
EBTU 121,51 ± 2,19
FATU 262,36 ± 0,15
EBLR
FALR
39,14 ± 0,14
127,30 ± 3,59
41
FALR 16,93± 3,15
Padrão (Carduus marianus) 37,95±1,67
Os resultados apontam que os extratos das folhas de Licania rigida e Turnera
ulmifolia e suas frações acetato de etila possuem a capacidade sequestradora do
DPPH análogo ao mostrado pelo padrão empregado.
Dessa forma, pode-se correlacionar a sua capacidade “varredora” a presença
de um vasto conjunto de metábolitos secundários, dentro os quais, os compostos
fenólicos e flavonoides, recebem muita atenção e destacam-se devido a elevada
capacidade redutora, como foi observado com as amostras obtidas da L. rigida.
Esses resultados estão de acordo com o estudo de Farias et al. (2013) ao
pesquisarem a atividade antioxidante das sementes de L. rigida, no qual
empregando o mesmo ensaio, o extrato demonstrou atividade redutora, mas inferior
ao descrito no estudo atual (FARIAS et al., 2013b).
Resultados condizentes com o poder antioxidante da Turnera ulmifolia, foi
encontrado durante o estudo descrito por Nascimento e colaboradores
(NASCIMENTO et al., 2006).
Visto que as ERO tem implicações em diversas enfermidades, principalmente as
crônicas degenerativas, e o uso popular das espécies testadas serem referenciadas
especialmente para essas patologias, o presente trabalho vem inicialmente
direcionar o emprego popular dessas plantas, porém são necessários muitos
estudos a fim de que seja viabilizada a produção de um fitoterápico ou fitofármaco.
5.3 Atividade antimicrobiana
Como teste inicial do processo de investigação da possível atividade
antimicrobiana foi realizado uma triagem antibacteriana com o EBLR, FALR, EBTU e
FATU. O EBLR e FALR, nos quais foram ativos contra as bactérias gram-positivas S.
aureus 29213, S. aureus 33591(meticilina resistente) e S. epidermidis 12228, não
havendo diferença significativa estatística quanto aos resultados entre extrato e
fração exposto na Tabela 6 e na Figura 7. As bactérias Gram-negativas testadas não
tiveram o seu crescimento inibido nas concentrações utilizadas. As bactérias Gram-
positivas são relatadas na literatura como mais suscetíveis as ações dos produtos
naturais, devido principalmente as diferenças morfológicas presentes em sua
estrutura celular. A parede celular das bactérias Gram-positivas é espessa,
42
possuindo várias camadas de peptideoglicano e moléculas de ácido teicóico,
enquanto as bactérias Gram-negativas possuem parede celular fina, com uma única
camada de peptideoglicano, envolvida pela membrana externa, contendo
lipopolissacarídeos, conferindo o caráter hidrofóbico. Dessa forma, a menor
complexidade celular quando comparada com bactérias Gram-negativas, pode estar
influenciando na ação das amostras testadas (GONZÁLEZ-LAMOTHE et al., 2009).
Estudos com o extrato etanólico da casca da L. macrophylla, pertencente a
mesma família, inibiu o crescimento da bactéria Gram-positiva, S. aureus. No
entanto, os extratos obtidos de L. tomentosa (Benth) Fristch mostraram atividade
contra as bactérias Gram-positivas (S. aureus, B. cereus) e Gram-negativas (E. coli,
P. aeruginosa). Acredita-se que a variação dessa atividade deva-se a diferença
entre as espécies vegetais, o tipo de extrato preparado e as condições
experimentais (SILVA et al., 2012).
Quanto a ação antibacteriana do EBTU e FATU, não mostraram nenhum efeito
inibitório contra o crescimento das espécies bacterianas estudadas. Dados que
corroboram com Coutinho e associados (2009), ao testar isoladamente a ação dos
extratos hidroetanólico de T. ulmifolia, não houve CIM substancial, mas quando
associados a gentamicina, potencializou a atividade antimicrobiana contra S. aureus
25923.
Tabela 6: Triagem da atividade antimicrobiana, pelo método de difusão em ágar
BACTÉRIAS
SUBSTÂNCIAS (mg/mL)
ANTIMICROBIANOS (µg)
EBTU FATU EBLR FALR VAN (30) GEN (10)
S. aureus 29213 - - **12±0,6 12,3±0,7 17±0,0 NT
S. aureus 33591 - - 12±0,6 11,3±0,9 17±0,0 NT
S. epidermidis 12228 - - 15,3 0,9 16±0,6 18±0,0 NT
E. coli 25922 - - - - NT 18,3±0,3
P. aeruginosa 27853 - - - - NT 19±0,6
P. aeruginosa 9027 - - - - NT 20,7±0,7
EBTU- extrato bruto de T. ulmifolia; FATU- fração acetato de T. ulmifolia; EBLR- extrato bruto de L. rigida; FALR- fração
acetato de L. rigida; VAN- vancomicina; GEN- gentamicina; **diâmetro do halo inibitório (mm); ( - ) ausência de halo;
NT- não testado; ± erro padrão.
43
Figura 7: Triagem da atividade antibacteriana.
A)S. aureus 29213; B) S. aureus 33591; C) S. epidermidis 12228; EBTU- extrato bruto de T. ulmifolia; FATU-
fração acetato de T. ulmifolia; EBLR- extrato bruto de L. rigida; FALR- fração acetato de etila.(Fonte: autoria
própria)
A triagem demonstrou um possível potencial antibacteriano da L. rigida,
direcionando dessa forma, o aprofundamento do estudo para confirmar esta
atividade, determinando-se as concentrações inibitórias mínimas tanto do seu
extrato bruto quanto de sua fração, pelo método de microdiluição em caldo, usando
cepas bacterianas que se mostraram sensíveis no teste por difusão em ágar.
Para uma melhor comparação da capacidade de inibição, toma-se como base o
conceito definido por Duarte et al.,( 2007) e Aligiannis et al. ( 2001), ao referenciar
uma ação antimicrobiana de produtos naturais como forte para CIM até 500 µg/mL,
moderada para CIM entre 600 µg/mL a 1500µg/mL e fraca para CIM acima de 1600
µg/mL.
44
Partindo desses conceitos e dos resultados presentes na Tabela 7, pode-se
observar que as CIMs apresentaram potencial forte, variando de 0,25 a 0,5 mg/mL,
com ação antibacteriana concentração dependente. A bactéria S. epidermidis foi a
mais sensível ao EBLR e FALR, enquanto a FALR foi mais ativa contra S. aureus
33591 e S. epidermidis 12228, com as CIMs correspondentes a 0,25 mg/mL.
O teste de viabilidade celular, realizado posteriormente, permitiu afirmar que
tanto o extrato bruto quanto a fração acetato da L. rigida foram bactericidas, devido
impossibilitar o crescimento bacteriano, em placas de ágar MH isentas da substância
teste.
Esse estudo fornece informações valiosas, tendo em vista que o objetivo desse
ensaio é avaliar o efeito apresentado posteriormente a exposição a uma substância
testada. Dessa forma, a análise permitiu mostrar que as bactérias não foram
capazes de se multiplicar em meio sólido após exposição as plantas teste nas
concentrações da CIM, na qual o dano causado inviabilizou a multiplicação
bacteriana que normalmente cresce após a exposição a antibióticos usados na
clínica (RAMANUJ; BACHANI; KOTHARI, 2012).
Tabela 7: Concentração inibitória mínima do EBLR e FALR, pelo método de microdiluição
BACTÉRIAS EBLR (mg/mL) FALR (mg/mL) Vancomicina (µg/mL)
S. aureus 29213 0,5 0,5 0,5
S. aureus 33591 0,5 0,25 0,5
S. epidermidis 12228 0,25 0,25 0,5
Devido ao potencial antibacteriano considerável dessa planta foi realizado o
estudo da atividade antifúngica, pelo método de microdiluição. Pode-se observar
que o EBLR mostrou amplo espectro de ação quando comparado a FALR, atuando
contra a maioria das leveduras estudadas (Tabela 8).
Tanto o extrato quanto a fração apresentaram atividade forte contra as leveduras
C.krusei, C. rugosa, T. asahii; moderada contra C. parapsilosis; e fraca contra C.
tropicalis. Dentre as cepas analisadas, a C. krusei foi a mais suscetível as
substâncias testadas, enquanto a C. glabrata não foi inibida nas concentrações
testadas.
45
Tabela 8: Concentração inibitória mínima da EBLR e FALR contra leveduras, pelo método de
microdiluição
LEVEDURAS EBLR(mg/mL) FALR (mg/mL) FLUCONAZOL (µg/mL)
Candida albicans 2,5 >5 512
Candida dubliniensis 2,5 >5 512
Candida tropicalis 5 5 512
Candida parapsilosis 0,63 1,25 32
Candida glabrata >5 >5 512
Candida rugosa 0,16 0,08 4
Candida krusei 0,08 0,02 126
Trichosporon asahii 0,16 0,04 4
Para confirmar os resultados obtidos no ensaio da CIMs e caracterizar o tipo de
atividade que o extrato e a fração apresentaram, foram realizados os testes de
cinética de morte, os quais podem ser constatados na Figura 8 e 9. Na Figura 8A,
observa-se que após 2h de exposição ao EBLR há redução do crescimento
bacteriano, com um leve aumento após 4h de tratamento. No entanto, a comparação
do controle com as concentrações de 1XCIM, 2XCIM e 4XCIM (p<0,05) (24 horas de
exposição), mostrou considerável diminuição do crescimento do S. aureus 29213.
Na Figura 8B há redução do crescimento após 2h de exposição a FALR, com um
aumento pouco acentuado no período de 8 h, tendendo a se estabilizar no tempo de
10h, nas concentrações de 1XCIM, 2XCIM e 4XCIM. Comparando-se o crescimento
controle com as concentrações testadas, observa-se redução do crescimento do S.
aureus 29213 – 1XCIM e 4XCIM (p<0,05) e 2XCIM(p<0,01) ao final do ensaio. Não
houve diferença significativa entre a vancomicina e as concentrações 1XCIM, 2XCIM
e 4XCIM, para o tempo final da cinética, no entanto diferiu do controle (p<0,001).
O crescimento do S. aureus meticilina resistente (33591) apresentou inibição
significativa estatisticamente a partir de 4h de tratamento com EBLR, quando
comparado ao controle nas concentrações 1 XCIM, 2XCIM e 4XCIM (p<0,01),
(Figura 8C). Não houve diferença entre o tratamento com a vancomicina e essas
concentrações, diferindo do controle (p<0,001).
46
Figura 8: Cinética de morte de bactérias do gênero Staphylococcus tratados com EBLR e
FALR
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5g/mL
S. aureus 29213 (Extrato bruto)
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5 g/mL
S. aureus 29213 (Fração)
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5g/mL
S. aureus 33591 (Extrato bruto)
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
S. aureus 33591 (Fração)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5g/mL
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
S. epidermidis 12228 (Extrato bruto)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5g/mL
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
S. epidermidis 12228 (Fração)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Controle
0.125 X CIM
0.25 X CIM
0.5 X CIM
1.0 X CIM
2.0 X CIM
4.0 X CIM
DMSO 5%
Vancomicina 0,5g/mL
Tempo (h)
D.O
. 5
95
nm
A B
C D
E F
A) S. aureus 29213 tratado com EBLR; B) S. aureus 29213 tratado com FALR; C) S. aureus 33591 tratado
com EBLR; D) S. aureus 33591 tratado com FALR; E) S. epidermidis 12228 tratado com EBLR; F) S.
epidermidis 12228 tratado com FALR() controle; () 0,125 X CIM; () 0,25 X CIM; () 0,5 X CIM; () 1,0
X CIM; (O) 2,0 X CIM; () 4,0 X CIM; () DMSO 5%;()Vancomicina 0,5 µg/mL.
47
O tratamento do S. aureus 33591 com FALR (Figura 8D) mostra redução do
crescimento também após 4h de exposição, com um leve aumento depois do tempo
de 8h. Verifica-se nessas condições, o decréscimo do crescimento nas
concentrações de 0,5XCIM (p<0,05), 1XCIM, 2XCIM e 4XCIM (p<0,01) quando
confrontado com o crescimento controle. Não houve diferença estatística entre o
tratamento com a vancomicina e a FALR (concentrações inibitórias e superiores)
(p<0,001). Apesar da concentração 0,5XCIM ter reduzido o crescimento bacteriano
na curva de morte, não foi capaz de inibi-lo na determinação da CIM e no teste de
viabilidade (Tabela 6).
Na Figura 8E observa-se o início da atenuação do crescimento do S. epidermidis
12228 exposto ao EBLR, após 4h exposição nas grandezas de 1XCIM, 2XCIM e
4XCIM. Quando o crescimento bacteriano é avaliado nessas mesmas concentrações
e comparando ao controle de crescimento após 24h de contato, há uma redução
significativa da redução do crescimento (p<0,05).
Quanto ao tratamento com a FALR (Figura 8F), o crescimento bacteriano tende a
diminuir após 4h de tratamento, com resultados significativos quando comparados os
dados do crescimento controle e das concentrações 1XCIM, 2XCIM e 4XCIM
(p<0,01). A inibição no crescimento bacteriano exercido pela vancomicina não diferiu
significativa em relação as concentrações CIM e superiores testadas e como
esperado, diferindo do controle (p<0,01).
Analisando todos os dados acima descritos e as tabelas presentes no Apêndice
A, pode-se confirmar que tanto o extrato bruto quanto a fração acetato da L. rigida
possuem atividade bactericida contra as espécies do gênero Staphylococcus
testadas, nas concentrações de 1XCIM, 2XCIM e 4XCIM, quando comparadas ao
crescimento controle.
Esse ensaio também comprova a ação tempo dependente das amostras
testadas, assemelhando-se aos estudos obtidos por Limsuwan et al (2012), ao
confirmarem a atividade antimicrobiana dos extratos de Rhodomyrtus tomentosa, da
mesma família da L. rigida, Chrysobalanaceae.
S. aureus é uma bactéria relatada como a mais patogênica de seu gênero, possui
alta resistência a destruição quando exposta ao ambiente, sendo encontrada
principalmente em infecções cutâneas e intestinais, apresentando capacidade de
evasão do sistema imunológico. Outra característica marcante desse micro-
48
organismo é a sua habilidade em desenvolver resistência aos antimicrobianos
usados comumente para tratar infecções em que o S. aureus seja o agente
causador (SAVOIA, 2012).
É relevante mencionar a atividade apresentada sobre a cepa meticilina
resistente, na qual se mostrou mais suscetível a FALR, pois uma das preocupações
mundiais é o crescente surgimento de micro-organismos resistentes, consideradas
verdadeiras ameaças a saúde da população (WHO, 2014).
A atividade contra S. epidermidis também merece destaque, visto que esses
micro-organismos coagulase negativo são constantemente reportados como
colonizadores de diversos aparelhos usados em hospitais, principalmente, em
cateteres intravascular de permanência (GARA; HUMPHREYS, 2001).
Diversas estratégias são usadas para inibir a formação do biofilme colonizador
dos aparatos terapêuticos, mas devido a resistência inerente do biofilme aos
antimicrobianos convencionais e a crescente resistência apresentada a essas
substâncias, é incessante a busca por novas medidas para combatê-lo.
Por sua vez, as estratégias alternativas, buscam mecanismos que possam
impedir a colonização do aparato implantado no paciente, seja usando biomateriais
resistentes a colonização ou empregando agentes antissépticos impregnados aos
cateteres. Assim, recorrer-se a produtos derivados de vegetais pode fornecer um
forte aliado ao combate da formação de biofilmes derivado de S. epidermidis
(GARA; HUMPHREYS, 2001).
Desse modo, uma das futuras aplicações dessa espécie vegetal seria como um
fitoterápico que combateria infecções causadas por bactérias desse gênero e
possivelmente infecções refratárias a antibióticos (LEWIS; AUSUBEL, 2006;
MARTÍNEZ; BAQUERO; ANDERSSON, 2007).
A Figura 9 e o Apêndice B referem-se ao ensaio da cinética de morte da levedura
C. krusei e sua análise estatística, nos quais demonstram que em todas as
concentrações iguais ou superiores a CIM, o extrato e a fração tiveram ação
inibitória no crescimento da levedura testada.
49
Figura 9: Cinética de morte da C. krusei tratada com EBLR e FALR
A) C. krusei tratada com FALR; B) C. krusei tratada com EBLR. () controle;; () 0,25 X CIM; () 0,5 X CIM;
()1,0 X CIM; () 2,0 X CIM; (O) 4,0 X CIM; () DMSO 5%;() Fluconazol 126 µg/mL.
Pode-se observar que após 24h, o crescimento da C. krusei tende a diminuir ou
a estabilizar quando exposta ao EBLR, aumentando após 30h, quando comparado
ao controle. O crescimento controle diferiu significativamente das concentrações de
1XCIM (p<0,01), 2XCIM e 4XCIM (p<0,05), no tempo de 48h, quando pareado ao
crescimento isento de tratamento (Figura 9A).
Quanto ao tratamento com a FALR, verifica-se redução do crescimento da
levedura nas concentrações de 2XCIM e 4XCIM (p<0,05) quando comparadas ao
controle, após exposição de 48h (Figura 9B).
O fluconazol iniciou a inibição do crescimento da C. krusei após 6h de exposição,
não sendo observado diferença significativa entre as amostras testadas, mas
verifica-se diferença significativa ao comparar-se com o controle do teste (p<0,001).
Esses dados corroboram com os resultados obtidos no teste de viabilidade, em que
mostra ação fungistática do EBLR e FALR, mesmo não sendo verificada diferença
entre o controle e a concentração 1XCIM, quando a levedura foi exposta a fração.
Esses resultados são relevantes no contexto da grande demanda por novos
medicamentos contra essas cepas fúngicas. Esse quadro ocorre principalmente
devido a uma crescente população de pacientes imunossuprimidos, cada vez mais
diagnosticados com infecções fúngicas, muitas das quais são invasivas (MICELI;
DÍAZ; LEE, 2011).
Pesquisas relatam que a C. albicans é a levedura isolada com maior frequência
em pacientes internados com fungemias. Entretanto, nos últimos anos esse quadro
50
vem se modificando, em virtude do crescente número de novas infecções não-
albicans, nas quais são reconhecidas como uma importante fonte de infecção
(ALCAZAR-FUOLI; MELLADO, 2014; MICELI; DÍAZ; LEE, 2011).
Aliado a essa condição flagelante ao paciente, existem dois fatores agravantes,
a capacidade inerente dessas espécies de Candida apresentarem uma
multirresistência aos medicamentos usados no combate de sua infecção, e a
possibilidade destas espécies formarem biofilme fúngico em aparatos médicos
(COSTA et al., 2013).
Dessa forma, os resultados encontrados nesse estudo podem ser uma
esperança no combate as infecções causadas por essas leveduras, uma vez que o
EBLR e a FALR foram ativos contra a maioria das cepas e com uma potente
capacidade de inibi-los. Supõem-se que as diferenças observadas na determinação
das CIMs entre C. rugosa, C. krusei e T. asahii, deva-se principalmente a
sensibilidade inerente dos micro-organismos ao EBLR e a FALR, bem como, as
diferenças da sua composição química.
Pressupõe que esses compostos secundários seriam os principais responsáveis
pela atividade antifúngica, inibindo o processo de esporulação (CUSHNIE, T.P. TIM;
LAMB, 2005). Os flavonoides e demais compostos fenólicos descritos nos ensaios
anteriores, podem também estar atuando, ao causar ruptura da membrana celular
fúngica, inibir o processo de brotamento e diminuir a homeostase do Ca+ e H+
(ANSARI et al., 2013).
Há várias décadas esses compostos são tidos pela literatura como responsáveis
pela atividade antimicrobiana contra diversos patógenos. Essa ação deve-se
principalmente a sua relação estrutura atividade, em que os grupamentos
característicos atuariam gerando um dano a membrana celular, por indução da
formação de poros e também pela diminuição da sua fluibilidade. Além dessas
atividades, são também relatados como detentores da capacidade de inibir a síntese
da membrana, ácidos nucleicos e o metabolismo celular (CUSHNIE, T. P TIM;
LAMB, 2011).
Dessa maneira pode-se observar que o estudo demonstrou a atividade
antioxidante in vitro dos EBTU, FATU, EBLR e FALR e também a comprovação da
atividade antimicrobiana do EBLR e FALR, permitindo expandir o uso dessas
substâncias em aplicações.
51
Primeiramente como coadjuvante em formulações farmacêuticas, no qual o
EBTU e FATU, poderiam estar atuando como antioxidantes de emulsões e outras
formulações, enquanto que o EBLR e a FALR, pode vir a se tornar além de
antioxidantes, agentes conservantes, devido a atividade mostrada contra os micro-
organismos testados. Essas aplicações são uma resposta as novas demandas do
mercado que vem se modificando e buscando introduzir formulações mais seguras
para os diversos consumidores (OSTROSKY et al., 2011; PATRON; COMMITTEE;
CHANCELLOR, 2010).
O EBLR e a FALR por apresentarem atividade antimicrobiana contra cepas de
importância clínica, podem ser empregados de maneiras mais diversas como
medida alternativa para o combate ao biofilme, tanto bacteriano como fúngico, por
meio de impregnação em dispositivos médicos. Os produtos derivados da L. rigida
podem vir a ser usados como antimicrobiano tópico, pois o seu uso popular, de
longa data, assegura que nenhuma reação ao medicamento grave possa vir a
ocorrer a substâncias derivadas dessa planta (HALL-STOODLEY; COSTERTON;
STOODLEY, 2004). Todas essas proposições dependem de estudos posteriores,
para assegurar e viabilizar o seu emprego em produtos farmacêuticos, assim
valorizando mais os produtos naturais.
52
6. CONCLUSÃO
Considerando os resultados experimentais obtidos in vitro pode-se concluir que:
O método analítico empregado nas análises, mostrou-se eficaz na
determinação dos componentes do EBTU, FATU, EBLR, FALR;
Os extratos hidroetanólicos de Licania rigida, sua fração acetato de etila, o
extrato bruto Turnera ulmifolia e sua fração acetato de etila demonstraram eficaz
atividade antioxidante demonstrada pelo método de sequestro do radical DPPH.
Baseada na caracterização cromatográfica do EBTU e da FATU supõe-se que
os dois compostos majoritários foram um flavonol – O – 3 glicosilado semelhante a
rutina e uma flavona glicosilada semelhante ao espectro da apigenina. Enquanto que
o composto majoritário do EBLR e FALR foi um Flavonol –O – 3 – glicosilado.
Os EBLR e a FALR apresentaram atividade antimicrobiana contra as cepas de
bactérias Gram – positivas e de leveduras.
Os EBLR e FALR apresentam CIMs consideravelmente forte para fungos e
bactérias. A atividade antibacteriana apresentou-se como bactericida e a antifúngica
como fungistática.
A atividade antibacteriana e antifúngica caracterizaram-se como tempo e
concentração dependentes.
53
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60
8. Apêndice
APÊNDICE A – Avaliação estatística da cinética de morte bacteriana
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. aureus 29213 exposto ao EBLR
Comparações dos tempos Significância p< 0,05
T0 vs T2 Não
T0 vs T4 Não
T0 vs T8 Sim
T0 vs T10 Sim
T0 vs T24 Sim
T2 vs T4 Não
T2 vs T8 Não
T2 vs T10 Não
T2 vs T24 Não
T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não
T4 vs T24 Sim
T8 vs T10 Não
T8 vs T24 Não
T10 vs T24 Não
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. aureus 29213 exposto a FALR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05
T0 vs T2 Não
T0 vs T4 Não
T0 vs T8 Não T0 vs T10 Sim
T0 vs T24 Sim
T2 vs T4 Não
T2 vs T8 Não
T2 vs T10 Não T2 vs T24 Não
T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não
T4 vs T24 Sim
T8 vs T10 Não T8 vs T24 Não
T10 vs T24 Não
61
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. aureus 33591 ao EBLR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05 T0 vs T2 Não T0 vs T4 Não T0 vs T8 Não
T0 vs T10 Não T0 vs T24 Sim T2 vs T4 Não T2 vs T8 Não
T2 vs T10 Não T2 vs T24 Não T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não T4 vs T24 Não T8 vs T10 Não T8 vs T24 Sim T10 vs T24 Não
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. aureus 33591 exposto a FALR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05 T0 vs T2 Não T0 vs T4 Não T0 vs T8 Não
T0 vs T10 Não T0 vs T24 Sim T2 vs T4 Não
T2 vs T8 Sim T2 vs T10 Não T2 vs T24 Não T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não T4 vs T24 Não T8 vs T10 Não
T8 vs T24 Sim T10 vs T24 Não
62
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. epidermidis 12228 exposto ao EBLR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05 T0 vs T2 Não T0 vs T4 Não T0 vs T8 Não
T0 vs T10 Não T0 vs T24 Sim T2 vs T4 Não T2 vs T8 Não
T2 vs T10 Não T2 vs T24 Não T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não T4 vs T24 Não T8 vs T10 Não T8 vs T24 Sim
T10 vs T24 Não
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do S. epidermidis 12228 exposto a FALR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05 T0 vs T2 Não T0 vs T4 Não T0 vs T8 Sim
T0 vs T10 Sim T0 vs T24 Sim T2 vs T4 Não T2 vs T8 Não
T2 vs T10 Não T2 vs T24 Não T4 vs T8 Não
T4 vs T10 Não T4 vs T24 Não T8 vs T10 Não T8 vs T24 Não
T10 vs T24 Não
63
APÊNDICE B – Avaliação estatística da cinética de morte fúngica
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte do da Candida krusei exposta ao EBLR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05
T0 vs T6 Não T0 vs T24 Sim T0 vs T30 Sim
T0 vs T48 Sim T6 vs T24 Não T6 vs T30 Não
T6 vs T48 Sim T24 vs T30 Não T24 vs T48 Não
T30 vs T48 Não
Comparação estatística dos resultados da cinética de morte da Candida krusei exposta a FALR
Comparação dos tempos Significância p< 0,05
T0 vs T6 Não
T0 vs T24 Não
T0 vs T30 Sim
T0 vs T48 Sim
T6 vs T24 Não
T6 vs T30 Não
T6 vs T48 Sim
T24 vs T30 Não
T24 vs T48 Não
T30 vs T48 Não