1. INTRODUÇÃO

Atualmente é muito importante o conhecimento de Espectrofotometria em

análises químicas, devido o fato expõem-se os conteúdos básicos para compreensão de tal

assunto.

Primeiro o conceito, Espectro que é o registro das características espectrais de

uma substância, mostrando a quantidade de energia absorvida ou emitida a cada comprimento

de onda ou de freqüência do espectro eletromagnético.

Espectro eletromagnético é um arranjo da radiação conhecida de acordo com o

comprimento de onda ou energia de fóton; já o instrumento espectrofotômetro que permite o

desmembramento da radiação policromática, por meios dispersivos (rede ou prisma) ou não

dispersivos (interferômetros), permitindo determinar a intensidade da radiação nos diferentes

comprimentos de onda, através da obtenção do espectro, isto é, fornecendo a razão, ou uma

função da razão, do poder da radiação de dois feixes em função do comprimento de onda

espectral.

A radiação infravermelha corresponde aproximadamente a parte do espectro

eletromagnético situada entre regiões do visível e das microondas, sua maior utilização são

para compostos orgânicos, que está situada entre 4.000 e 400 cm-1.

Banda de absorção é o registro, num espectro, da absorção da radiação

incidente numa amostra, num intervalo de freqüências.

2. FUNCIONAMENTO DO APARELHO

O funcionamento consiste em passar um feixe de energia radiante através da

solução e medir sua absorção, assim, utiliza-se um colimador que localiza o feixe especifico

de luz sobre um prisma de quartzo, que decompõe a luz nas cores do espectro. O feixe de luz

monocromática especifico a ser usado é localizado por uma fenda seletora e enviado para uma

cubeta contendo a solução a ser analisada. A luz transmitida é medida por uma fotocélula

1

acoplada a um galvanômetro, portanto, a diferença é a luz absorvida. Um feixe de energia

radiante (luz) atravessa a solução e a quantidade desta luz que for absorvida pela substancia

informa obre a quantidade e a qualidade dos componentes desta solução.

Nota-se que há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e tungstênio,

cujas emissões são focalizadas através de uma lente sobre a amostra. Portanto, todo o espectro

de emissão da lâmpada incide sobre a mesma, sendo que a radiação incidente será, em parte,

absorvida. Esta radiação que atravessa a amostra (transmitida ou emergente) ira incidir sobre

uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de difração. Esta

grade irá difratar a radiação, separando seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada

um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma

corrente elétrica cuja magnitude depende da intensidade da emissão (se aplica o efeito

fotoelétrico).

Na faixa correspondente aos raios IV, nenhuma sensação de cor pode ser

observada, enquanto que no espectro visível, existe correspondência entre o comprimento de

onda e a cor. O comprimento de onda é simbolizado pela letra grega lambda (λ) e é medida

em nanômetros (nm). As faixas visíveis, que podem ser vistas pelo olho humano e sem ajuda

de aparelhos, vai de 400 a 750 nm. As lâmpadas usadas no espectro visível são de tungstênio

e na espectroscopia na região ultravioleta utiliza normalmente uma lâmpada de deutério.

3. APARELHAGEM E INSTRUMENTOS

Para as medidas na região do infravermelho médio (2.5 a 50µm), são muitas as

diferenças entre os instrumentos da espectrofotometria no UV e no visível, e os instrumentos

destinados ás determinações no infravermelho.

Estas modificações são ditadas, principalmente, pelo fato de o vidro e o quartzo

absorverem fortemente na região infravermelha e de as células fotomultiplicadoras serem

insensíveis a radiação infravermelha.

Empregam-se bastantes superfícies espelhadas na face frontal a fim de evitar-se

a passagem da radiação através de camadas de vidro ou de quartzo, a reflexão das superfícies

metálicas é em geral muito eficiente na região infravermelha.

As células de absorção e as janelas dos instrumentos, no entanto, devem ser

fabricadas com materiais transparentes ao infravermelho. A seguir na tabela estão as

2

substâncias que se usam mais comumente com a radiação infravermelho, com as respectivas

bandas de transmissão utilizáveis.

As principais fontes de radiação infravermelho que se usam nos

espectrofotômetros são: um fio de níquel-cromo (nichrome) montado sobre um suporte de

cerâmica; uma lâmpada de Nernst, que é constituída por um filamento de óxidos de zircônio,

de tório e cério aglutinados por um cimento apropriado; uma lâmpada Globar, que tem um

bastão de carbeto de silício aglutinado. Estas fontes são aquecidas eletricamente a

temperaturas na faixa de 1.200 – 2.000°C, na qual ficam incandescentes e emitem radiação

infravermelha com um espectro parecido com o do corpo negro.

Os espectrofotômetros de infravermelho tradicionais eram construídos com

monocromadores de prismas de cloreto de sódio ou d brometo de potássio. Estes prismas

tinham a desvantagem de serem higroscópicos e também de exigirem duas unidades

diferentes para se operar na região do infravermelho médio, a fim de se conseguir dispersão

conveniente sobre toda a região.

Por estas razões, as redes de difração substituíram os prismas como os

dispositivos principais de monocromatização na região infravermelha.

As redes têm poder de resolução mais elevado que os prismas e podem ser

projetadas para operar eficientemente sobre uma região espectral mais ampla que os prismas.

Mesmo assim, a maioria dos instrumentos de rede opera com duas redes,

havendo uma substituição automática da rede nas vizinhanças de 2.000 cm-1. O esquema de

um espectrofotômetro de infravermelho de rede esta na Figura 3.2.

3

A detecção do sinal de infravermelho tem, como é claro, importância

primordial. Dispõe-se de vários detectores para este fim, e o tipo usado num instrumento

dependerá do tipo e da qualidade do espectrofotômetro.

4. MANUSEIO DAS AMOSTRAS

O manuseio das amostras é a parte mais difícil e demorada de uma análise

espectrométrica no infravermelho, essas amostras podem ser gasosas, líquidas ou sólidas.

4.1 GASES

O espectro de um líquido de ponto de ebulição baixo ou gás pode ser obtido

expandindo-se a amostra em uma célula cilíndrica evacuada dotada de janelas apropriadas.

Para esse propósito, uma variedade de células cilíndricas está disponível, com ópticos que vão

de alguns centímetros a 10 m ou mais.

Os caminhos ópticos mais longos são obtidos em células compactas com

superfícies internas refletoras, de modo que o feixe faz numerosas passagens pela amostra

antes de sair da célula.

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4.2 LÍQUIDOS

Quando a quantidade de uma amostra líquida é pequena ou quando um

solvente um solvente apropriado não está disponível, é pratica comum obter-se o espectro do

líquido puro. Em geral uma gota do líquido puro é espremida entre duas placas de sal de rocha

para produzir uma camada com espessura de 0,01 mm ou menos. Tal técnica não fornece

dados de transmitância reprodutíveis, mas os espectros resultantes são normalmente

satisfatórios para investigações qualitativas.

Amostras de líquidos puros podem conter água suficiente para embaçar as

placas de sal e tornar necessário um polimento periódico das mesmas.

4.3 SÓLIDOS

A maior parte dos compostos orgânicos apresenta numerosos picos de absorção

na região do infravermelho médio, e encontrar um solvente que não tenha picos que se

superpõem é quase impossível.

Por isso, os espectros são freqüentemente obtidos com dispersões do sólido em

uma matriz sólida ou líquida. Geralmente, nessas técnicas, a amostra precisa ser moída até

que o tamanho das partículas seja menor que o comprimento de onda da radiação, para evitar

os efeitos de espelhamento de radiação. Uma das técnicas mais populares para manuseio de

amostras sólidas é o pastilhamento com KBr; já o espectro no infravermelho de sólidos que

não são solúveis em um solvente transparente no infravermelho ou que não podem ser

convenientemente transformadas em pastilhas com KBr são obtidos dispersando-se o analito

em um óleo mineral ou hidrocarboneto fluorado dispersantes. As dispersões são feitas

moendo-se 2 a 5 mg da amostra finamente pulverizada na presença de uma ou duas gotas de

um óleo de hidrocarboneto pesado (Nujol); a dispersão resultante é examinada como um filme

entre placas salinas planas; o comportamento de sólidos no infravermelho pode também ser

obtido por técnicas de reflectância e pelo método fotoacústico.

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5. TIPOS DE LASER

A chamada radiação infravermelha (IR) corresponde aproximadamente à parte

do espectro eletromagnético situada entre as regiões do visível e das microondas. A porção de

maior utilidade para a área da química está situada entre 4000 e 400 cm -1, que é chamada de

região do infravermelho médio (MIR). As outras regiões, do infravermelho próximo (14290-

4000 cm-1) e do infravermelho distante (700-200 cm-1) tem também atraído atenção.

Embora o espectro de infravermelho seja característico da molécula como um

todo, certos grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais ou menos na mesma

freqüência, independente da estrutura da molécula. È justamente a presença destas bandas

características de grupos que permitem ao químico a obtenção, através do exame do espectro

e consulta a tabelas, de informações estruturais úteis, e é neste fato que baseamos para fazer a

identificação das estruturas.

Uma lâmpada de tungstênio é uma excelente fonte de radiação contínua na

região do visível e do infravermelho próximo. Um filamento de tungstênio opera,

normalmente, em uma temperatura próxima de 300K e produz radiação útil na faixa de 320 a

2500 nm. Essa faixa cobre toda a região visível e parte das regiões infravermelha e

ultravioleta. A espectroscopia na região ultravioleta utiliza normalmente uma lâmpada de

deutério, na qual uma descarga elétrica (um arco, uma espécie de centelha elétrica) provoca a

dissociação do D2 e a emissão da radiação ultravioleta de 200 a 400 nm (mostrada na figura

abaixo). Em um espectrofotômetro ultravioleta-visível típico, a troca entre as lâmpadas de

deutério e tungstênio é feita entorno de 360 nm, de forma que esteja sempre sendo usada a

fonte mais intensa. Para as regiões visíveis e ultravioleta também são muito utilizadas

lâmpadas de descarga elétrica cheias com vapor de mercúrio ou gás xenônio. Existem

lâmpadas diferentes para quase todos os metais. Altamente sensível, é o método de escolha

para dosar mercúrio.

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6. LEITURA DE RESULTADOS

Pequenas diferenças na estrutura e na constituição de uma molécula resultam

em mudanças significativas na distribuição dos picos de absorção nesta região do espectro,

que se estende cerca de 1200 a 700 cm-1 (8 a 14 m). Em conseqüência, uma semelhança

estreita entre dois espectros nessa região de impressões digitais constitui-se em forte

evidência da identidade dos compostos que produziram os espectros.

Os espectros no infravermelho possuem uma característica única,

principalmente na região de impressão digital. As duas moléculas diferem apenas por um

grupo metila e, no entanto, os espectros diferem significativamente em suas aparências na

região de impressão digital.

O estabelecimento indubitável da identidade ou da estrutura de um composto

dificilmente é possível apenas à partir das tabelas de correlação. Aparecem incertezas

principalmente devido a freqüência de grupos superpostos, variações espectrais devido ao

estado físico da amostra e limitações instrumentais.

Ao se usar as freqüências de grupos, é essencial que todo o espectro, em vez de

uma pequena parte isolada, seja considerado e inter-relacionado. Uma interpretação baseada

em uma parte do espectro deveria ser confirmada ou rejeitada pelo estudo de outras regiões.

As tabelas de correlação servem apenas como guias para um estudo posterior mais cuidadoso.

Um estudo das características de absorção de grupos funcionais, bem como de

outras propriedades físicas da amostra, podem permitir a identificação inequívoca. A

espectroscopia no infravermelho, quando usado em conjunto com outros métodos,

normalmente torna possível a identificação positiva de uma espécie.

As tabelas de correlação dificilmente bastam para a identificação positiva de

um composto orgânico a partir de seu espectro de infravermelho. Há, no entanto, vários

catálogos de espectros no infravermelho disponíveis que ajudam uma identificação qualitativa

fornecendo espectros de um grande número de compostos puros para a comparação. A busca

manual de catálogos de espectros grandes é lenta e tediosa. Por esta razão, sistemas de busca

por computador têm sido amplamente usado nos últimos anos.

Atualmente, os fabricantes de instrumentos oferecem sistemas de busca para

auxiliar o químico a identificar compostos a partir de dados armazenados de espectros no

infravermelho. Os bancos de memória desses instrumentos são capazes de armazenar perfis de

cerca de 100 mil compostos puros.

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7. TIPOS DE APARELHOS

A Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIV) é uma

técnica de análise para colher o espectro infravermelho mais rapidamente. Em vez de se

coletar os dados variando-se a freqüência da luz infravermelha monocromática, a luz IV (com

todos os comprimentos de onda da faixa usada) é guiada através de um interferômetro. Depois

de passar pele amostra o sinal medido é o interferograma. Realizando-se uma transformada de

Fourier no sinal resulta-se em um espectro idêntico ao da espectroscopia IV convencional

(dispersiva).

Os espectrofotômetros FTIV são mais baratos do que os convencionais porque

é mais simples construir um interferômetro do que um monocromador. Em adição, a medida

de um único espectro é bem mais rápida nessa técnica porque as informações de todas as

freqüências são colhidas simultaneamente. Isso permite que se façam múltiplas leituras de

uma mesma amostra e se tire a média delas, aumentando assim a sensibilidade da análise.

Devido às suas várias vantagens, virtualmente todos os espectrofotômetros de infravermelho

modernos são de FTIR.

Dentre os tipos de reflexão mais usados estão os de espectrometria de reflexão

difusa e de reflectância total atenuada. A espectrometria de reflexão difusa no infravermelho

com transformada de Fourier (em inglês, DRIFTS) pode ser um método efetivo de se obter

espectros de infravermelho diretamente de amostras pulverizadas com um mínimo de

preparação da amostra. Além de poupar tempo na preparação da amostra, permite a aquisição

de dados convencionais de infravermelho em amostras que não foram alteradas

significativamente em relação a sua forma original.

A reflexão difusa é um processo complexo que ocorre quando um feixe de

radiação atinge a superfície de um pó finalmente dividido. Com esse tipo de amostra, ocorre

reflexão especular em cada superfície plana. No entanto, como há muitas destas superfícies e

elas estão orientadas aleatoriamente, a radiação é refletida em todas as direções.

Na espectrofotometria de reflectância total atenuada, utiliza-se um sensor

especial baseado na radiação que passa por um guia de onda recoberta, ou seja, o sinal é

reduzido pela presença de analito.

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Quando a radiação passa pela guia de onda, ela é totalmente refletida por

ambas as superfícies. Na superfície superior existe uma fina camada de vidro poroso, de baixo

índice de refração, impregnado com um indicador específico para a amostra.

A cada vez que os raios de radiação se deslocam a partir da superfície

superior, parte da onda evanescente é absorvida pelo complexo metálico e menos a radiação é

refletida. A intensidade da radiação que emerge do sensor diminui quando o que se procura na

amostra está presente.

Essa é uma técnica geralmente utilizada para se obter espectros de

infravermelho de amostras que são de difícil manuseio, como sólidos de solubilidade limitada,

filmes, pastas, fios, adesivos e pós.

Outro método conhecido é a espectroscopia fotoacústica no infravermelho,

assim como estudos espectrais no ultravioleta e visível, a técnica é aplicada proveitosamente

em amostras sólidas e líquidas que são de difícil manuseio por técnicas comuns, devido sua

tendência de espalhar radiação. Além disso, o método tem sido usado para detectar

componentes de misturas separadas por cromatografia em camada delgada ou cromatografia

líquida de alta eficiência. A maior parte desse trabalho tem sido realizada com instrumentos

com transformada de Fourier, devido a sua melhor característica de sinal-ruído. A maioria dos

fabricantes oferece células fotoacústicas como acessórios para instrumentos FTIR.

A espectroscopia fotoacústica no infravermelho também tem sido usada para

monitorar concentrações de poluentes na atmosfera.

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8. FERRAMENTAS MATEMÁTICAS

As transformadas contínuas e discretas de Fourier têm muitas aplicações em

disciplinas científicas em Física, Física e Química Quântica, Teoria dos números, Estatística,

Óptica, entre outras. Nos campos relacionados com o processamento de sinal, a trans formada

de Fourier é tipicamente utilizada para decompor um sinal nas suas componentes em

freqüência e suas amplitudes. As transformadas são operadores lineares e, com a devida

formalização, são também unários uma propriedade conhecida como o teorema de Pontryagin.

As transformadas são invertíveis, e a transformada inversa tem quase a mesma forma que a

transformada. As funções de base sinusoidal são funções de diferenciação, o que implica que

esta representação transforma equação diferencial linear com coeficientes constantes em

equações algébricas ordinárias. (por exemplo, um sistema linear invariante no tempo, a

freqüência n é uma quantidade conservada, logo o comportamento em cada freqüência pode

ser resolvido independentemente).

Por meio do teorema de convolução, as transformadas tornam a complicada

operação de convolução em multiplicações simples, o que as torna um método eficiente de

calcular operações baseadas em convolução, como a multiplicação polinomial, a

multiplicação de números grandes e o calculo da função densidade de probabilidade de uma

soma de variáveis aleatórias. A versão discreta da transformada de Fourier pode ser calcula

rapidamente por computadores, utilizando algarismos baseados na transformada rápida de

Fourier.

Geralmente, a denominação “Transformada de Fourier” refere-se a

transformada de Fourier para funções continuas, que representa qualquer função integrável,

como a soma de exponenciais e amplitude complexa.

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Transformada de Fourier para funções contínuas

Para uso em computadores, tanto para aplicações científicas ou em

processamento digital de sinal, é preciso ter valores xk discretos. Para isto existe a versão da

função transformada para funções discretas.

Um método largamente utilizado para o cálculo computacional desta versão é o

transformada rápida de Fourier algoritmo FFT ( Fast Fourier Transform) cuja complexidade é

O(“n” log “n”) contra O(n2) necessários para o mesmo cálculo, porém pela definição.

9. FUNCIONAMENTO INTERNO

A figura abaixo mostra as características essenciais de um espectrofotômetro

de feixe simples. A radiação proveniente de uma fonte é separada em pequenos intervalos de

comprimentos de onda por um monocromador, passa através de uma amostra e é medida por

um detector. Medimos, inicialmente, a intensidade de energia radiante (P0, watts/m2) que

atinge o detector usando uma célula com a referência (um branco, ou um solvente ou um

reagente), que é colocado no compartimento da amostra. Quando a referencia é substituída

pela amostra de interesse, normalmente alguma radiação é absorvida, e a energia radiante que

atinge o detector (P) é menor que P0. a razão P/ P0, que é um número entre 0 e 1, é a

transmitância (T). A absorvância, que é proporcional à concentração, é A = log P0/P = - log T.

Figura 9.1 - Espectrofotômetro de feixe simples

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Um espectrofotômetro de feixe simples não é cômodo, pois a amostra e a

referência têm que ser colocadas alternadamente no caminho do único feixe de radiação. Para

medidas em diferentes comprimentos de onda, devemos medir a referencia a cada

comprimento de onda. Um instrumento de feixe simples não é adequado para medidas de

absorvância em função do tempo, como por exemplo, em experimentos de cinética química,

pois tanto a fonte de radiação como o detector apresentam pequenas variações.

A figura a seguir mostra esquematicamente um espectrofotômetro de feixe

duplo, em que a radiação direcionada por um espelho rotatório (o alternador de feixe), passa

alternadamente através da amostra e da referência. Quando a radiação passa pela amostra, o

detector mede a energia radiante P. quando o alternador faz a radiação passar através da

referência, o detector mede P0. O feixe passa alternadamente através da amostra e da

referência várias vezes a cada segundo, e o instrumento compara automaticamente P e P0 de

modo a obter a transmitância e a absorvância. Esse procedimento, em que as intensidades da

radiação que emergem das duas cubetas são comparadas freqüentemente, permite a correção

automática para as variações na intensidade da fonte e na resposta do detector com o tempo e

com o valor de comprimento de onda. A maioria dos espectrofotômetros de qualidade permite

uma varredura automática do espectro em termos de comprimento de onda e o registro

contínuo da absorvância contra comprimento de onda.

Figura 9.2 - Espectrofotômetro de feixe duplo

Um procedimento de rotina em espectrofotômetros de duplo feixe é obter

inicialmente uma linha de base usando-se a solução de referencia em ambas as cubetas. O

valor da absorvância da linha de base, em cada comprimento de onda, é então subtraído do

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valor da absorvância medido para a amostra, de modo a se obter o valor real da absorvância

da amostra em cada comprimento de onda.

Um espectrofotômetro ultravioleta-visível de duplo feixe, mostrado a seguir, a

radiação correspondente a região do visível é proveniente de uma lâmpada incandescente com

filamento de tungstênio e bulbo de quartzo, contendo uma atmosfera rarefeita de halogênio.

Na região do ultravioleta a fonte é uma lâmpada de descarga elétrica em deutério, que emite

na faixa espectral de 200 a 400 nm. Apenas uma das lâmpadas é usada de cada vez. A rede de

difração 1 seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda pra incidir no

monocromador. Este, por sua vez, estreita ainda mais a faixa de comprimento de onda que

passara através da amostra. Após ser alternado e transmitido através da à ostra e da

referência, o sinal é detectado por uma fotomultiplicadora (um tubo fotomultiplicador), que

produz uma corrente elétrica proporcional à intensidade de energia radiante.

Figura 9.3 - Diagrama esquemático do banco óptico do instrumento

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10. LIMITAÇÕES DO APARELHO

10.1 LINEARIDADE/SENSIBILIDADE

Quando executado de acordo com o recomendado, o teste é linear até 15

mg/dL, amostras com valores superiores a 15 mg/dL devem ser diluídas com solução salina a

ponto de ficar entre 0-15 mg/dL e então os resultados devem ser multiplicados pelo fator de

diluição. (Sensibilidade: 0,389 mg/dL).

10.2 INTERFERÊNCIAS

Deve-se ter cuidado para evitar a contaminação de fósforo. O uso de tubos

descartáveis ou cubetas de plástico é recomendado.

Amostras hemolisadas, lipêmicas e ictéricas podem causar resultados

falsamente elevados. Neste caso, sugere-se branco de amostra. Para 1,0 mL de solução salina

0,9%, adiciona-se 2 mL de amostra e ler absorbância contra o branco de solução salina em

340 nm. Subtrai-se a absorbância do branco da amostra da absorbância do desconhecido.

Quando executado de acordo com o recomendado, o teste é linear até

1000mg/dL. Amostras com valores superiores a este valor devem ser diluídas com solução

salina a ponto de ficarem entre 0,64 e 1000 mg/dL, e os resultados devem ser multiplicados

pelo fator de diluição. A sensibilidade do ensaio é de 0,640 mg/dL.

Ou seja, o aparelho não tem limites consideráveis, a sua limitação esta em manusear

corretamente as amostras e não deixar que haja interferência do ambiente onde ele está.

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11. EXEMPLOS DE BANDAS DE ALGUNS COMPOSTOS

Devido à importância do compreendimento e estudo das bandas dos compostos

em espectrometria, a seguir tem a exemplificação de bandas de alguns compostos.

Figura 11.1 - Banda de alcano

Figura 11.2 - Banda de alceno

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Figura 11.3 - Banda de álcool

Figura 11.4 - Banda de alcino

16

Figura 11.5 - Banda de composto aromático

Figura 11.6 - Banda de aldeído

17

Figura 11.7 - Banda de cetona

Figura 11.8 - Banda de ácido carboxílico

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Figura 11.9 - Banda de éster

Figura 11.10 - Banda de haleto

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12. INDICAÇAO DE USO NA INDÚSTRIA E NA SAÚDE

A importância da espectrometria no infravermelho para o trabalho do químico

pode ser medida pelo numero de livros publicados que se dedicam inteiramente, ou em parte,

à discussão da aplicação deste. Existem muitas compilações de espectros, bem como índices

para coleções de espectros e para a literatura. Dentre estas, as mais comumente utilizadas são

as publicações por Sadtler (1972) e pela Aldrich (1985).

Um dos exemplos que a espectrofotometria pode fazer, é a medida contínua de

O2 e CO2 nas vias respiratórias de uma pessoa saudável. O O2 é detectado pela absorção da

radiação ultravioleta no comprimento de onda de 147 nm. O CO2 é detectado pela absorção da

radiação infravermelha no numero de onda de 2,3 X 103 cm-1. [P. B Amoudse, H. L. Pardue, J. D.

Bourland, R. Miller, and L. A. Geddes, “Breath-by-Breath Determination of O2 and CO2 Based on

Nondispersive Absorption Measurements” , Anal. Chem. 1992, 64, 20.].

É possível também observarmos uma única molécula de DNA com um

sinalizador molecular. A cadeia de único elo, proveniente do ácido desoxirribonucléico

(DNA) ou do acido ribonucléico (RNA), mostrada na figura abaixo, pode funcionar como um

“sinalizador molecular”. As duas terminações da molécula encontram-se interligadas por meio

de ligações de hidrogênio, criando uma estrutura em forma de “grampo de cabelo”. Por meio

de um processo químico, uma molécula de um corante fluorescente, F, adicionada a uma das

pontas da cadeia e uma molécula supressora de fluorescência, Q, é adicionada à outra ponta.

Quando a molécula de corante absorve um fóton, a energia de excitação é transferida de

maneira eficiente para a molécula supressora vizinha, que dissipa essa energia sob a forma de

calor, em vez de luz. Como conseqüência, há pouca fluorescência a partir do sinalizador

molecular. Quando DNA ou RNA complementar é adicionado, ele se liga ao “grampo de

cabelo”, forçando a abertura das pontas da cadeia do sinalizador, o que afasta a terminação

fluorescente da terminação supressora. Agora, o corante torna-se fluorescente, pois o

supressor está muito distante para que ocorra uma transferência eficiente de energia entre eles.

A seqüência molecular do sinalizador é projetada para se associar a um determinado tipo de

DNA. Quando este DNA complementar é encontrado, ocorre um grande aumento na

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fluorescência. O sinalizador “acende”! Os sinalizadores moleculares estão sendo

desenvolvidos para detectar mutações genéticas e vírus, bem como para analisar sangue e

tecidos transplantáveis. A figura abaixo nos da uma idéia de como funciona o processo.

Figura 12.1 - Esquematização do processo

As aplicações analíticas da espectrofotometria se fundamentam na

proporcionalidade entre a absorvância e a concentração, expressa analiticamente por meio da

Lei de Beer. A absorvância de uma mistura é a soma das absorbâncias dos componentes

individuais presentes na mistura. De uma maneira simples, podemos determinar a

concentração de duas espécies em uma mistura por cálculos feitos a mão. Para isso,

resolvemos um sistema de duas equações lineares para absorvância em dois comprimentos de

onda diferentes. Este procedimento torna-se mais exato se os dois espectros de absorção não

têm muita superposição.

Dentre outros processos que a espectrofotometria é utilizada estão,

controle de hemodiálise, titulação espectrofotométrica, o uso em usinas de açúcar e álcool e

até determinação de acido tricloroacético em urina.

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13. REFERÊNCIAS

HARRIS, D. C. Análise química quantitativa. Tradução de José Alberto Portela Bonapace e Oswaldo Esteves Barcia. Rio de Janeiro: LTC, 2005.

SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. Tradução de Paula Fernandes de Aguiar e Ricardo Bicca de Alencastro. Rio de Janeiro: LTC, 2000.

VOGEL, A.I. Análise química quantitativa. 5ª edição. Rio de Janeiro: Editora LTC, 2002.

WILLIE, A. B. Manual de espectroscopia vibracional. Editora McGraw-Hill, Ltda. São Paulo.

Espectrofotometria de infravermelho médio. Disponível em <http://www.scielo.br>.

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