espectrofotometria e curvas

ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO PARA ANALLISES BIOQUÍMICAS

GRUPO 1

2002

GRUPO 1

ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS- PADRÃO PARA ANÁLISES BIOQUÍMICAS

Luiz Edson

LAVRAS

MINAS GERAIS - BRASIL

2002

SUMÁRIO

Introdução..................................................................................................................................1

Objetivo......................................................................................................................................2

Referencial teórico.....................................................................................................................4

Carboidratos:..............................................................................................................................7

Proteínas:..................................................................................................................................11

Material e métodos...................................................................................................................16

Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos (aa) a partir de uma solução de

glicina (0,1mol/mL):..............................................................................................................16

Resultados e discussão.............................................................................................................23

1- Curva Padrão Para Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido Dinitrosalicílico............24

Gráfico1: repetição 1................................................................................................................25

Gráfico 2 : repetição 2..............................................................................................................25



2- Curva Padrão Para Aminoácidos (α-NH2) Pelo Método da Ninhidrina...............................27




3- Curva Padrão Para Proteína Pelo Método de Bradford......................................................30





4- Curva Padrão Para Açúcares Totais Pelo Método da Antrona............................................33





Referências Bibliográficas.......................................................................................................38

ANEXOS A..............................................................................................................................39

ANEXOS B..............................................................................................................................41

1 INTRODUÇÃO

Todos tecidos vivos, animais e vegetais, são constituídos por

substancias químicas que podem ser classificadas em duas categorias:

macromoléculas e micromoléculas de acordo com deu peso molecular. A

categoria das macromoléculas inclui as proteínas, os ácidos nucléicos e os

polissacarídeos. Já a categoria das micromoléculas inclui os aminoácidos,

lipídeos e ácidos orgânicos.

Estas substâncias podem variar quantitativamente, refletindo

alterações de estado metabólico da planta. E estas variações podem ser

detectadas, sendo está uma ferramenta para estudo de plantas em

diferentes condições como estresse hídrico, níveis de luz, etc.

Para a detecção e quantificação destas substancias, são usados

métodos baseados na fotometria, o qual mede o resultado das reações

químicas específicas, as quais produzem coloração ou turvação do meio

de reação.

Os métodos fotométricos são analíticos, pois realizam medidas

absolutas ou comparativa da energia radiante transmitida, emitida ou

absorvida pelas soluções.

As curvas padrão serão obtidas com o uso de soluções de

concentrações conhecidas, submetidas às reações colorimétricas

específicas, lendo-se a absorbância em espectrofotômetro. As curvas

serão utilizadas para determinar a concentração de uma substancia

específica em amostras de tecido vegetal.

1

OBJETIVO

As aulas práticas de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas

visam mostrar aos alunos desta disciplina os experimentos que os ajudem

a compreender os princípios básicos e fundamentais da química, dentro da

programação do curso. Para cada assunto da prática há parte teórica, que

resumidamente dá ao aluno algumas informações sobre a teoria e parte

prática, contendo o roteiro das atividades.

Antes de cada aula o aluno deve estar preparado(ter lido a teoria)

para melhor compreender as explicações do professor sobre os objetivos

da aula.

Outros objetivos:

- Familiarizar-se com os reagentes e métodos necessários

para a elaboração das curvas padrão;

- Familiarizar-se com os métodos de Antrona, DNS,

Bradford e Ninhidirna, os quais são de uso rotineiro no

laboratório de bioquímica e metabolismo e podem ser

posteriormente empregados em avaliações bioquímicas em

nossas dissertações;

- Entender os cálculos de concentração e volume necessários

para o preparo dos reagentes;

- Treinar o uso de pipetas e vidrarias necessárias para as

reações;

- Treinar o uso do espectrofotômetro;

- Entender e interpretar os resultados experimentais;

2

- Elaborar as curvas padrão a partir das medições realizadas

e verificar o grau de ajuste das mesmas.

3

2 REFERENCIAL TEÓRICO

1. Aminoácidos:

Os aminoácidos apresentam em sua cadeia um grupamento

carboxil e um grupamento amino ligados ao mesmo carbono (carbono ).

Neste carbono estão ligadas as cadeias laterais, as quais proporcionam as

diferenças entre um aminoácido e outro. Todos os aminoácidos, com

exceção da glicina, apresentam ligados a seu carbono α grupamentos

distintos. As cadeias laterais ou grupamentos R diferem em estrutura,

tamanho e carga elétrica, portanto, lhes conferem características

diferentes influenciando em sua solubilidade na água e reatividade

química. Essas características também conferem propriedades diferentes à

molécula protéica que integram. Podem ser agrupados em aminoácidos

básicos, ácidos ou neutros (Nelson & Cox, 2000).

Além dos vinte aminoácidos padrões, existem alguns formados a

partir de modificações deles, os quais podem fazer parte de estruturas

celulares como a parede celular ou alguns tipos de tecido, exemplos: 4-

hidroxiprolina, derivado da prolina e 5-hidroxiglicina, derivado da glicina

(Nelson & Cox, 2000).

Os aminoácidos são moléculas anfóteras, isso quer dizer que eles

podem agir como tampões em soluções, porém cada aminoácido difere

em sua propriedade ácido-base, possuindo pK1 (– COOH), pK2 (– NH3+) e

pKR (grupo R) distintos (Nelson & Cox, 2000).

4

A união de aminoácidos forma os polipeptídeos com peso

molecular abaixo de 10.000 daltons e as proteínas. Esta união ocorre por

desidratação, formando a ligação peptídica entre o grupo amino de um

aminoácido e o grupo carboxil de outro.

A ionização de polipeptídeos depende de seus grupos α-amino e α-

carboxil livre em cada extremidade e do número de seus grupos R

ionizáveis.

Métodos de quantificação de aminoácidos

A análise quantitativa de aminoácidos é importante para a

determinação da estrutura das proteínas e dos complexos peptídicos

similares, que são elementares para a determinação química de amostras

de moléculas orgânicas (Spackamn, Stein e Moore, 1958).

A quantificação de aminoácidos é determinada pelo método da

Ninidrina (Hidrato de tricetohidrindeno):

A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reação de desaminação

oxidativa dos aminoácidos, produzindo amônia (NH3) e a redução da

ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amônia liberada, formando

um complexo azul, com absorção máxima em luz de comprimento de

onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida em condições

padronizadas serve de base para um teste quantitativo para aminoácidos,

podendo detectar até 1g de aminoácido. Outras aminas além dos

aminoácidos, também reagem com a ninhidrina, formando uma cor azul,

mas sem ocorrer liberação de CO2, a qual é indicativa de um aminoácido.

A amônia (NH3) e peptídeos também reagem, porém, mais lentamente

que os -aminoácidos. A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um

complexo de cor amarela quando reagem com a ninhidrina.

5

O método da fluorescamina também é utilizado. A fluorescamina

é um reagente mais sensível que a ninhidrina, sendo capaz de detectar

nanogramas de aminoácidos. Semelhante a ninhidrina, a fluorescamina

forma um complexo com outras aminas que não aminoácidos (Murray,

1994).

Outros métodos utilizados para determinação de aminoácidos

específicos são:

Reação de Pauly: O ácido sulfônico reage com o aminoácido histidina

produzindo um composto de coloração vermelha;

Reação de Sakuguchi: O -naftil e Hipoclorito de Sódio reagem com a

arginina, produzindo um composto avermelhado;

Reação de Folin-Ciocalteau e Millon: Específica para o aminoácido

tirosina;

Reação de Holkins-Call: Específica para o aminoácido triptofano;

Reação do Nitroprusiato: Específica para o aminoácido cisteína (Oliveira,

1992).

6

Figura 1. Molécula de Ninidrina

2. Carboidratos:

Os carboidratos podem ser classificados como poliidroxialdeídos

ou poliidroxicetonas, ou ainda que por hidrólise produza-se esses

compostos.

Existem três grupos de carboidratos de acordo com o número de

monômeros componentes da molécula.

Os monossacarídeos são os açúcares simples, que não podem ser

hidrolisados em unidades menores; neste grupo incluem-se as pentoses e

hexoses, sendo a glicose provavelmente o monossacarídeo mais

conhecido.

Os oligossacarídeos são polímeros hidrolisáveis de

monossacarídeos, contendo de duas a seis moléculas de açucares simples

ligados entre si; um exemplo é a sacarose, formada por uma molécula de

glicose e uma de frutose.

Em geral, os mono- e oligossacarídeos são compostos cristalinos,

solúveis em água e com sabor adocicado.

Os polissacarídeos são grandes moléculas que podem apresentar

cadeias ramificadas complexas ou lineares, geralmente são insolúveis em

água e não apresentam sabor; podem ser formados por um só monômero

ou por uma combinação de dois ou mais monossacarídeos.

Os monossacarídeos apresentam reações de enolização quando

tratados com álcali diluído durante várias horas. No caso da glicose, a

mistura resultante contém frutose e manose. Se por sua vez a frutose for

submetida ao mesmo tratamento, resultará em uma mistura de manose e

7

glicose, pois nessas condições os monossacarídeos são instáveis, sofrendo

oxidação, degradação e polimerização.

Os monossacarídeos são estáveis quando tratados em soluções de

ácidos minerais diluídos, mesmo sob aquecimento; entretanto, as aldoses

sofrem desidratação quando são aquecidas em presença de ácidos

minerais fortes, formando furfural no caso das pentoses ou

hidroximetilfurfural no caso das hexoses.

Esta reação constitui a base de alguns testes qualitativos de

açúcares, pois os furfurais reagem com determinados compostos

aromáticos, formando produtos coloridos característicos (Conn e Stump,

1993).

2.1. Açúcares solúveis totais:

Esta classe inclui vários monossacarídeos e oligossacarídeos

metabolicamente ativos, entre os quais já foram citados: glicose, frutose e

sacarose.

A determinação quantitativa desses açúcares é feita pelo método

da antrona. Esse composto é um hidroxiantraceno, trata-se de uma

substância estável, sólida, incolor, com ponto de fusão a 154 C e peso

8

molecular de 194,23. A reação é realizada em meio fortemente ácido,

onde há hidrólise dos dissacarídeos e formação de furfurais, os quais

reagem com a antrona formando um produto de coloração azul-

esverdeada, que é quantificada colorimetricamente.

No presente trabalho dosou-se os açúcares solúveis totais pelo

método proposto por Yemm e Willis (1954).

2.2. Açúcares Redutores:

Os açúcares redutores participam de diversas rotas metabólicas

nas plantas, tais como a rota das pentoses, o ciclo de Krebs e a glicólise.

9

Figura 3. Reação da antrona com ácido sulfúrico e depois com o açúcar solúvel.

A quantificação de monossacarídeos pode dar uma indicação indireta da

capacidade fotossintética da planta.

Esses açúcares tem caráter redutor devido à presença de um grupo

aldeído ou cetona livre na molécula. Eles são capazes de reduzir diversos

íons metálicos e a partir dessa propriedade foram desenvolvidos vários

métodos de identificação e quantificação desses açucares. A seguir

apresenta-se alguns desses métodos:

Reação de Benedict: O reagente contém íons de cobre na forma

oxidada (Cu 2+), os quais são mantidos em solução formando um

complexo alcalino de citrato. Em presença de açucares redutores o

cobre é reduzido formando um precipitado de coloração amarela

ou vermelha (Cu2O). O açúcar por sua vez é oxidado, quebrado e

polimerizado na solução alcalina (Conn e Stumph, 1993);

Outras reações de redução: redução da ferricianida, reação com

ácido para-hidroxibenzóico hidrazida (PHABAH) e 3,4

dinitrobenzóico, reação com trifenil tetrazolium, método do ácido

cítrico, do fenolsulfúrico, do ferro reduzido e azul de metileno;

Método de Somogy e Nelson: é baseado na reação de um

composto contendo cobre em meio alcalino, sendo a reação

quantificada por colorimetria;

Método do ácido dinitrosalicílico (DNS), esse método foi

desenvolvido por Sumner e colaboradores (1921-44 citados por

Miller, 1959). Utiliza-se alem do DNS, sais de Rochelle, fenóis,

bissulfito de sódio e hidróxido de sódio. A química do DNS foi

muito discutida, mas na reação ocorre a redução do ácido 3,5

10

dinitrosalicílico para 3-amino-5nitrosálico, o qual é um produto de

cor laranja, enquanto o grupo aldeído dos açucares redutores é

oxidado para carbonila.

No presente trabalho usou-se o método do DNS para dosagem dos

açúcares redutores, segundo Miller (1959).

Figura 1. Reação do DNS com o açúcar redutor.

3. Proteínas:

Existem diversos métodos para determinação de proteínas, mas

nenhum é inteiramente satisfatório, pois todos apresentam limitações.

A escolha baseia-se na natureza das proteínas e de outros

11

componentes da amostra, no tempo da reação, na precisão desejada e

na sensibilidade da análise. A seguir alguns métodos são citados:

Método do biureto: a reação ocorre em solução alcalina em

presença de solução de sulfato de cobre diluída, ocorrendo

a formação de um composto de cor púrpura. A cor deve-se

à ligação do átomo de cobre com quatro átomos de

nitrogênio das cadeias peptídicas. Este método é simples

para medir proteínas totais, mas requer de 20 a 40 mg de

proteína e tem a desvantagem de sofrer interferência pela

presença de NH4 na amostra.

Método de Kjeldhal (1998): baseia-se na digestão da

proteína, sob alta temperatura, com ácido sulfúrico.

Adiciona-se pequena quantidade de óxido de mercúrio

para acelerar a reação e de sulfato de potássio ou sódio

anidro para aumentar a temperatura e acelerar a reação.

Esta reação deve ser feita em capela com exaustor ligado

devido aos vapores de mercúrio. Após a completa

transformação dos compostos nitrogenados em sais de

amônio, a mistura é fortemente alcalinizada com NH4OH,

sendo que a amônia reage com um volume conhecido de

ácido bórico e é titulada com ácido clorídrico. A

quantidade calculada de N encontrada por esta titulação é

multiplicada por um fator médio de 6,25 para fornecer a

quantidade de proteína total da amostra. Segundo Oliveira

(1992), este método apresenta a desvantagem de ocorrer

12

muito erro se a quantidade de N for muito pequena e

também depende de fator de conversão médio para cada

espécie. Este método é pouco útil para estudos em

metabolismo vegetal, pois as mudanças de composição

protéica ocorre principalmente em termos qualitativos.

Método turbidimétrico: baseia-se na precipitação de

proteínas em presença de um ácido. É o mais rápido,

demorando apenas 10 a 15 minutos. Tem a limitação de

que nem todas as proteínas se precipitam da mesma forma

em presença de ácidos e os ácidos nucléicos também

podem se precipitar nessas condições;

Método de Folin-ciocalteal (1969): é uma modificação do

método de Lowry (1951), onde o cobre em meio alcalino

reage com as proteínas, formando um complexo (reação de

Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta

aminoácidos fenólicos que reduzem o reagente de Folin,

dando uma cor azul. A intensidade da cor é máxima em pH

10 e é medida em espectrofotômetro a 660 nm após 30 a

120 minutos. A proporção de aminoácidos fenólicos é mais

ou menos constante na estrutura primária das proteínas.

Comparando-se o teor destes aminoácidos no padrão com

os existentes nas amostras pode-se calcular o teor de

proteínas nas amostras. Trata-se de um método muito

sensível, podendo analisar amostras com 5µg de proteínas,

mas a amostra não pode conter fenóis ( Pinto, 1992);

13

Método de Bradford (1976): é utilizado na determinação

do conteúdo de proteínas totais que se ligam ao corante de

um modo proporcional à concentração. O corante utilizado

é o Comassie Brilliant Blue G- 250, o qual existe em duas

formas coloridas diferentes, a vermelha e a azul. A forma

vermelha é convertida na forma azul após a ligação do

corante com a proteína. Esta coloração ocorre rapidamente

(2min.) e é estável por até uma hora. O método tem

sensibilidade para detectar até 5µg/mL de proteína;

Método de Lowry: é o mais utilizado, entretanto muitas

substâncias tem sido descritas por interferirem na

determinação de proteínas por este método.

O método de Bradford é simples e mais sensível do que o

de Lowry, no qual o desenvolvimento da cor é menos estável

para a precipitação de proteínas com ácidos (Peterson, 1979

citado por Pinto, 1982).

Comparando os métodos, Bradford (1976) verificou que o

método de Lowry indicava menos proteína e a parte linear da

curva para Lowry incluía uma faixa mais estreita de

concentrações. Além disso, há um espalhamento maior dos

pontos, o que dificulta o estabelecimento de uma curva padrão

para o Lowry.

14

Neste trabalho utilizou-se o método de Bradford para

determinação da curva padrão de proteína.

15

MATERIAL E MÉTODOS

Determinação De Aminoácidos (-NH2) Pelo Método Da Ninhidrina:

Preparo dos Reagentes:

A) Tampão citrato de sódio 0,2 M – pH 5,0

B) Reagente ninhidrina 5% dissolvida em Metil Celosolve (2,5g de ninhidrina em

50mL de Metil Celosolve)

C) KCN (2% em Metil Celosolve) – 2mL de KCN 0,01M (65mg KCN/ 100mL

de água destilada) em 100mL de Metil Celosolve

D) Etanol 60% (v/v)

Observação: quando guardados separadamente e de modo adequado podem ser armazenados por até 30 dias.

Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos (aa) a partir de uma solução de glicina (0,1mol/mL):

- pode ser utilizado outro aminoácido ou outra mistura de aminoácidos, desde

que nesta concentração final***.

Após a adição do padrão de aminoácidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar

ao banho-maria à 100ºC por 20 minutos para desenvolver a coloração.

Posteriormente, completar com etanol 60% (1,3 mL) e agitar novamente (o volume

final da reação é de 4,0mL).

16

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos

Tubos

GLY (0,1mol/mL)

(mL)Água(mL) mol de aa

Reagentes A+B+C(mL)**

Etanol 60%(mL)***

01 0,0 1,0 0,00 1,7 1,302 0,2 0,8 0,02 1,7 1,303 0,4 0,6 0,04 1,7 1,304 0,6 0,4 0,06 1,7 1,305 0,8 0,2 0,06 1,7 1,306 1,0 0,0 0,10 1,7 1,3

** 0,5 mL de A + 0,2mL de B + 1,0mL de C

Fazer a leitura a 570nm após o resfriamento.

Para quantificar os aminoácidos em tecidos vegetais seguir o procedimento de

extração mais indicado para cada tecido e posteriormente usar até 1,0mL de extrato

(máximo), adicionando os reagentes e seguir as recomendações como estão indicadas

na tabela 1.

17

Determinação De Proteínas Pelo Método De Bradford (Comassie Blue G-250):

Preparo do reagente:

Dissolver 100 mg de Comassie blue G-250 em 50 mL de etanol

95%. A esta solução adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85%. A

solução resultante é diluída para 1 litro com água. As concentrações

finais são: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol

(Deixar 12 horas agitando em overnight).

Atenção: ácido fosfórico tem que ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol, nunca

o contrário. reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado.

Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas a partir de uma solução de Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10g/0,1mL):

Tabela 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas

TubosBSA (1mg/mL)

(mL)Água(mL)

PROTEÍNAg/0,1mL

COMASSIE(mL)

01 0,00 0,10 0 5,002 0,02 0,08 20 5,003 0,04 0,06 40 5,004 0,06 0,04 60 5,005 0,08 0,02 80 5,006 0,10 0,00 100 5,0

Observação: para minimizar os erros de pipetagem pode-se preparar soluções de 20,

40, 60, 80 e 100g de BSA/0,1mL e retirar uma alíquota de 0,1mL de cada uma e

adicionar os 5,0 mL do reagente Comassie Blue.

18

A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes

iguais do extrato e de TCA (10%) resultando em uma concentração final de TCA

igual a 5%.

Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado ressuspendido com NaOH

0,1N. Posteriormente, retirar uma alíquota de 0,1mL da proteína ressuspendida,

adicionar 5mL do reagente de Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm.

Determinação De Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido

Dinitrosalicílico (DNS)

Preparo dos reagentes:

A – DNS (Dissolver 2,5g de ácido dinitrosalicílico (DNS) e

adicionar 50mL de NaOH 2N (utilizar um bequer de 500 mL).

B - Dissolver 75g de Tartarato duplo de Sódio e Potássio (Sal de Rochelle), adicionar

125mL de água e agitar sob aquecimento até a dissolução total

Posteriormente, adicionar o reagente B sobre o A, misturando-o sob

aquecimento até dissolver completamente. Depois de resfriada, completar o volume

da solução para 250mL.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores (AR) a partir de uma solução de glicose (10mM):

- pode ser utilizada uma mistura de frutose e glicose desde que dêem a mesma concentração final.

Tabela 3. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores

TubosGlicose (10mM)

(mL)Água(mL) moles de AR

DNS (A+B)(mL)

01 0,0 1,5 0,0 1,002 0,2 1,3 2,0 1,003 0,4 1,1 4,0 1,004 0,6 0,9 6,0 1,0

19

Após adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos para

banho-maria à 100ºC por 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e

completar o volume para 10mL com água destilada ou não (conforme o caso). Fazer a

leitura a 540nm.

Para quantificar os AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado,

pode-se usar até 1,5 mL de alíquota e adicionar o reagente de DNS e posteriormente

seguir as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.

20

Determinação De Açúcares Solúveis Totais Pelo Método Da Antrona:

Preparo do reagente:

Pesar 40mg de Antrona, colocar em um bequer e adicionar 1,0mL de água

destilada e depois 20mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Este reagente deve

ser preparado na hora do uso.

Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais

(AST) a partir de uma solução de glicose (60g/mL ou 0,333 mM de glicose):

Tabela 4. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais

TubosGlicose (60mg/mL)

(mL)Água(mL) g/mL de AST

ANTRONA(mL)

01 0,0 1,0 0,0 2,002 0,1 0,9 6,0 2,003 0,2 0,8 12,0 2,004 0,4 0,6 24,0 2,005 0,6 0,4 36,0 2,006 0,8 0,2 48,0 2,007 1,0 0,0 60,0 2,0

Primeiro adicionar a solução de glicose e depois o reagente Antrona. Agitar os

tubos e levá-los ao banho-maria à 100ºC por 3 minutos. Resfriar à temperatura

ambiente ou no gelo e fazer a leitura a 620nm.

Para quantificação de AST em extrato de tecidos vegetais pode-se usar

alíquotas de até 1,0mL.

21

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para se estudar o teor das biomoléculas (aminoácidos, proteínas,

açúcares redutores e açúcares solúveis totais) dos tecidos vegetais

necessita-se de uma curva padrão. Esta, por possuir quantidades

conhecidas da molécula em questão, permite estimar a quantidade dela

no tecido vegetal.

Cada ponto das curvas padrões foi obtido com uma concentração

conhecida da substância desejada, ou seja, para aminoácidos usou-se

glicina, para proteínas, soro albumina bovina (BSA) e para açúcares

redutores e solúveis, glicose. Sendo que cada componente do grupo

realizou duas pipetagens, totalizando oito repetições por ponto.

Após a leitura no espectrofotômetro, montou-se o gráfico de

dispersão, onde os pontos em cada concentração correspondem a média

de cada componente. Aplicou-se, então, regressão linear, sendo que a

fórmula y = ax + b serve para determinar a concentração das substâncias

extraídas de um tecido vegetal, onde y é o valor da absorbância e x é a

concentração a ser determinada. O R2 avalia a variação dos resultados

obtidos na curva. Quanto menor a variação, o resultado de R2 estará mais

próximo de 1 (resultado ideal), que pode ser alcançado se a variação for

uniforme. Sendo assim, quanto mais próximo de 1, mais precisas serão as

determinações do teor da substância no tecido vegetal.

22

Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era

responsável por duas repetições de cada ponto das curvas, totalizando

oito repetições por ponto. Márcio foi repetição I, Daniela repetição II,

Ednabel repetição III e Anne repetição IV.

As curvas padrões foram determinadas no Windows Exel com o

uso do gráfico de dispersão, sobre o qual aplicou-se regressão linear, cujo

modelo é y = ax + b. Como critério de qualidade de ajuste foi utilizado o

R2.

Os resultados obtidos nas atividades realizadas foram apresentados

na forma de tabelas e gráficos.

1- Curva Padrão Para Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido Dinitrosalicílico

Tabela 1. Valor de absorbância de açúcares redutores (A540 nm) de cada um dos

participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.

TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média

01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,2309 0,1897 0,1788 0,1941 0,1983

03 0,3866 0,4809 0,4060 0,3873 0,4152

04 0,5795 0,5607 0,5507 0,5831 0,5675

23

Gráfico1: repetição 1

Gráfico 2 : repetição 2

24



25

Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4

2- Curva Padrão Para Aminoácidos (α-NH2) Pelo Método da Ninhidrina

Tabela 1. Valor de absorbância de aminoácidos (A570 nm) de cada um dos participantes do

grupo em cada ponto da curva e sua média.


01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,1609 0,1217 0,1556 0,1222 0,1401

03 0,2075 0,2138 0,2048 0,2551 0,2203

04 0,2770 0,2438 0,2529 0,2433 0,2542

05 0,3544 0,3406 0,3490 0,3890 0,3582

06 0,3953 0,3877 0,5504 0,4909 0,4560

26


Gráfico 2: repetição 2

27



28


3- Curva Padrão Para Proteína Pelo Método de Bradford

Tabela 1. Valor de absorbância de proteínas (A595 nm) de cada um dos participantes do

grupo em cada ponto da curva e sua média.


01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,0641 0,0397 0,0136 0,0432 0,0401

03 0,1380 0,0993 0,1114 0,1029 0,1129

04 0,2429 0,1661 0,1558 0,1705 0,1838

05 0,3145 0,2456 0,2240 0,2583 0,2594

06 0,4086 0,2961 0,3367 0,3038 0,3363

29



30



31


4- Curva Padrão Para Açúcares Totais Pelo Método da Antrona

Tabela 1. Valor de absorbância de açúcares solúveis totais (A620 nm) de cada um dos

participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.


01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

02 0,1947 0,2816 0,1795 0,2186 0,2186

03 0,3529 0,4485 0,3519 0,3844 0,3844

04 0,5682 0,6509 0,5589 0,5927 0,5926

05 0,7280 0,8495 0,8907 0,8227 0,8227

06 0,9290 0,9728 0,9974 0,9664 0,9664

32



33



34


35

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254, 1976.

DUBOIS, M; et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substance. Analytical Biochemistry, 28 (3), 350-356, 1956.

JEFFERY, G.H. et al. Análise química quantitativa. Vogel, 1992. 712p.

MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31: 426-428, 1959.

MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; RODWELL, V.W. Harper: Bioquímica. 7.ed. São Paulo: Ateneu editora, 1994. 763p.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p.

OLIVEIRA, L.E.M. Utilização de laboratórios e preparo de soluções e reagentes para análise bioquímicas (apostila). 1992.

Relatório de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas. UFLA.Roteiros de aulas práticas de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas. Curvas padrões. Lavras, UFLA.

36

SOUTHGATE, D.A.T. Determination of food carbohydrates. 2.ed. London: Elsevier Applied Science, 1991. 232p.

SPACKMON, D.; STEIN, W.; MOORE, S. Automat recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Analytical Chemistry, 30 (7), p. 1190-1206, 1958.

37

espectrofotometria e curvas

Documents