universidade federal de goiÁs programa … · universidade federal de goiÁs programa de...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
LOURIVAL DE ALMEIDA SILVA
Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum
Goiânia
2015
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ x ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Lourival de Almeida Silva E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não
Vínculo empregatício do autor Professor do Ensino Básico, Técnico e Tecnológico do IF Goiano, campus Ceres.
Agência de fomento: Sigla: País: UF: CNPJ: Título: Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de
Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum. Palavras-chave: Reposicionamento de fármacos, Metabolismo Energético, Leishmania spp; Apicoplasto; Plasmodium
falciparum. Título em outra língua: In silico drug repositioning for neglected tropical diseases with emphasis on energy metabolism
of Leishmania spp and Plasmodium falciparum apicoplast. Palavras-chave em outra língua: Drug Repositioning; Energy metabolismo, Leishmania spp; Apicoplast;
Plasmodium falciparum. Área de concentração: Parasitologia Data defesa: 27/02/2015 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical Orientador (a): Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* Prof. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e Prof. Dra. Ana Maria de Castro E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. _____________________________________ Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.
ii
LOURIVAL DE ALMEIDA SILVA
Reposicionamento in silico de fármacos para doenças negligenciadas com ênfase no metabolismo energético de Leishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás como requisito para a
obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e
Saúde Pública.
Orientador: Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Co-orientadores: Profº. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e
Profª. Dra. Ana Maria de Castro
Goiânia
2015
Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG.
Silva, Lourival de Almeida Reposicionamento in silico de fármacos para doençasnegligenciadas com ênfase no metabolismo energético deLeishmania spp e apicoplasto de Plasmodium falciparum [manuscrito] / Lourival de Almeida Silva. - 2015. xvi, 96 f.
Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra; co-orientadorDr. Pedro Vítor Lemos Cravo; co-orientador Dr. Ana Maria de Castro.Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto dePatologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública, Goiânia, 2015. Bibliografia. Apêndice. Inclui siglas, mapas, abreviaturas, tabelas, lista de figuras, lista detabelas.
1. Reposicionamento de fármacos. 2. Metabolismo Energético. 3.Leishmania spp. 4. Apicoplasto. 5. Plasmodium falciparum. I. BarretoBezerra, José Clecildo , orient. II. Lemos Cravo, Pedro Vítor , coorient. III. Título.
iii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno: Lourival de Almeida Silva
Orientador: Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Co-orientadores: Profº. Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo e
Profª. Dra. Ana Maria de Castro
Membros:
1. Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra – IPTSP/UFG
2. Profº. Dr. Cláudio Carlos da Silva – PUC/GO
3. Profª. Dra. Carolina Horta Andrade – FF/UFG
4. Profª Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda – ICB/UFG
5. Profº Dr. Clayton Luiz Borges ICB/UFG
Data: 27/02/2015
iv
Dedico esse trabalho a minha fiel companheira,
esposa e amiga Jucilene de S. R Almeida que sempre
me apoiou e me auxiliou em tudo. Sem ela eu não teria
conseguido. Dedico também as minhas filhas, Beatriz
R. Almeida e Júlia R. Almeida que me alegraram e me
incentivaram nos momentos difíceis.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo privilégio do recomeço e por me ensinar que os acontecimentos não são precoces ou se atrasam, eles ocorrem no tempo Dele.
Ao professor Dr. José Clecildo Barreto Bezerra pela confiança e lealdade de sua orientação nesse trabalho, e por não ter sido apenas um orientador, mas um amigo e uma inspiração para mim.
Ao professor Dr. Pedro Vítor Lemos Cravo pela paciência, presteza e cumplicidade no auxílio para realização desse trabalho.
A professora Dra. Ana Maria de Castro pela solicitude, gentileza e doçura ao responder os pedidos de ajuda.
A professora Dra. Marina Clare Vinaud pelo apoio, sugestões e críticas feitas ao trabalho.
A biomédica Dra. Tatiane Luiza da Costa pelo imenso esforço empregado na realização dos testes com os fármacos.
Aos secretários da pós-graduação José Clementino e Kariny Soares pela gentiliza e presteza no atendimento de minhas solicitações.
Ao programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública por me oportunizar esse feito.
Ao diretor geral Hélber Souto Morgado e ao diretor de ensino Cleiton Mateus do Instituto Federal Goiano, campus Ceres por terem apoiado a realização desse trabalho.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ..................................................................................................... v
SUMÁRIO ....................................................................................................................... vi
FIGURAS E TABELAS ................................................................................................ viii
FIGURAS E TABELAS DOS ARTIGOS ...................................................................... ix
SIGLAS E ABREVIATURAS ......................................................................................... x
RESUMO ....................................................................................................................... xii
ABSTRACT .................................................................................................................. xiii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
1.1 Doenças Tropicais Negligenciadas ........................................................................ 1
1.2 As Leishmanioses .................................................................................................. 5
1.2.1 Ciclo Biológico de Leishmania spp. ................................................................... 5
1.2.2 Formas clínicas .................................................................................................. 7
1.2.3 Epidemiologia e controle .................................................................................... 7
1.2.4 Tratamento e resistência ..................................................................................... 9
1.2.5 Metabolismo energético como alvo de fármacos antileishmania ..................... 14
1.3 Malária ................................................................................................................. 21
1.3.1 Ciclo biológico do Plasmodium sp ................................................................... 21
1.3.2 A doença ........................................................................................................... 24
1.3.3 Epidemiologia e controle .................................................................................. 25
1.3.4 Tratamento e resistência ................................................................................... 27
1.3.5 O apicoplasto e terapia antimalárica ................................................................. 45
1.4 O reposicionamento in silico de fármacos para as leishmanioses e malária ....... 48
2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 52
3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 53
3.1 Geral ..................................................................................................................... 53
3.2 Específicos ........................................................................................................... 53
4 MÉTODO(S) ............................................................................................................... 54
4.1 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo
energético de Leishmania ........................................................................................... 54
4.2 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo do
apicoplasto de Plasmodium falciparum ...................................................................... 56
vii
5 RESULTADOS ........................................................................................................... 60
5.1 Artigo 1 – In Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for Alternative
Leishmaniasis Treatments .......................................................................................... 60
5.2 Artigo 2 – A Systematic in Silico Search for Target Similarity Identifies Several
Approved Drugs with Potential Activity against the Plasmodium falciparum
Apicoplast ................................................................................................................... 60
6 DISCUSSÃO GERAL ................................................................................................ 75
6.1 Fármacos que atuam no metabolismo energético de Leishmania spp ................. 75
6.2 Fármacos que atuam no apicoplasto de P. falciparum ........................................ 77
7 CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................................... 80
8 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 81
9 APÊNDICE ................................................................................................................. 94
Bases de dados consultadas ....................................................................................... 94
viii
FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Estádios evolutivos de Leishmania amazonensis. Forma promastigota (×1000;
A) e amastigota (B). Amastigotas estão infectando um macrófago ......................... 5
Figura 2 Ciclo de vida de Leishmania spp. causador da leishmaniose............................ 6
Figura 3 Distribuição geográfica das leishmanioses no mundo. A) Leishmanioses
cutânea e cutânea mucosa no Novo Mundo. B) Leishmaniose visceral no Velho e
no Novo Mundo. ....................................................................................................... 8
Figura 4 As principais vias do metabolismo energético em Leishmania major. Reações
da glicólise, que ocorrem no glicossomo no citosol e ciclo de Krebs, na
mitocôndria.. ........................................................................................................... 16
Figura 5 Metabolismo do carbono de Leishmania mexicana nas formas promastigotas
(A) e amastigotas (B)... ........................................................................................... 20
Figura 6 Ciclo biológico do Plasmodium spp.. .............................................................. 24
Figura 7 Mapa da população mundial sob-risco de contrair malária. ............................ 26
Figura 8 Fórmulas moleculares da artemisinina e seus derivados.................................. 30
Figura 9 Esquema para a origem de todos os plastídeos por endossimbiose primária e
secundária.. ............................................................................................................. 46
Tabela 1 DALYs estimadas (em milhões de dólares) das DTNs resultantes da
sobrecarga global de doença, estudo de 2010. ......................................................... 2
Tabela 2 Principais fármacos antimaláricos. World Health Organization. Guideline for
the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. ................................................ 28
Tabela 3 Terapia combinada baseada em artemisinina. World Health Organization.
Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010. .......................... 32
Tabela 4 Fármacos reposicionados com êxito para novas indicações. ........................... 49
ix
FIGURAS E TABELAS DOS ARTIGOS
Artigo 1
Figure 1. Flowchart depicting the overall strategy and results of this work...................62
Table 1. New drug-target associations disclosed in the present study...........................63
Artigo 2
Figure 1. Distribution of the expected apicoplast targets according to their predicted
metabolic function in the apicoplast...............................................................................68
Figure 2. Flowchart summarizing the work pipeline and corresponding results (*denotes
the targets that were discarded on the basis of having chemical affinity to dietary
supplements/nutraceuticals)............................................................................................69
Table 1. Examples of drug-target associations previously determined, that were
correctly identified in the present study..........................................................................70
Table 2. New drug-target associations disclosed in the presente study..........................71
x
SIGLAS E ABREVIATURAS
AA Ácido Azelaico
ABCD Anphoterecin B Coloidal Dispersion
ABLC Anphotericin B Lipid Complex
AKT Protein Kinase Threonine
ADP Adenosine Diphosphat
AnA Anphotericin A
AnB Aphotericin B
ATP Adenosine Triphosphat
DesA3 Stearoyl-CoA 9-desaturase
DNA Desoxirribonucleic acid
DALY Disability-Adjusted Life-Years
DTN Doenças Tropicais Negligenciadas
ED50 Half Efective Dose
EUPATHDB Eucariotic Pathogene DataBase Resources
FDA Food and Drug Administration
GBD Global Burden of Disease
G6PD Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase
GENE DB Gene DataBase
HIV/AIDS Human immunodeficiency Virus/ Acquride Immunodeficiency
Syndrome
HAP Histo Aspartic Protease
IC50 Half maximal inhibitory concentration
ISO Isonoxil
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
k-DNA Knetoplastid DNA
LD50 Half maximal Lethal Dose
logP logarithm partition coefficient
LND Lonidamina
LTA Leishmaniose tegumentar americana
LV Leishmaniose Visceral
L-AnB Liposomal Anphotericin B
xi
NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotíde Phosphate Hydrogen
N86Y asparagine 86 tyrosine
ONG Organização Não Governamental
OMS Organização Mundial da Saúde
PABA Para-aminobenzoic acid
PfATPase Plasmodium falciparum Adenosine Triphosphatase
PfCYTB Plasmodium falciparum cytochrome b
PfCRT Plasmodiu falciparum chloroquine resistance transporter
PfDHFR Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase
PfDHPS Plasmodium falciparum dihydropteroate synthase
PfMDR Plasmodium falciparum multidrug resistance
PfNHE1 Plamodium falciparum sodium/proton exchanger 1
pH Potencial Hidrogeniônico
PMI Phosphomanose Isomerase
PQB Proteína Quinase B PvMDR Plsmodium vivax Multidrug Resistance
RNA Ribonucleic Acide
PLASMODB Plasmodium Genomics Resource DataBase
SinanNET Sistema de informação agravos de notificação
SNP Single Nucleotide polymorfism
STITCH Search Tool for Interactions of Chemicals
TCA Terapia de Combinação baseada na artemesinina
TDR TARGETS Tropical Disease Research Targets
TRITRYpDB Trypanosomatidae DataBase
TTDB Therapeutic Targets DataBase
WHO World Health Organization
Y184F Tyrosine 184 phenylalanine
D1246Y Aspartic acid 1246 Tyrosine
xii
RESUMO
As leishmanioses são parasitoses negligenciadas responsáveis por prejuízos físicos,
econômicos e sociais. A malária, embora não seja classificada como negligenciada, é
responsável por altos índices de morbidade e mortalidade, principalmente nos países
africanos. Ao longo dos anos, o tratamento dos infectados tem sido a forma mais eficaz
de controle dessas endemias. Entretanto, os efeitos tóxicos, o alto custo dos fármacos e
a resistência dos parasitos têm sido os maiores desafios enfrentados pela terapêutica das
leishmanioses e da malária. Sendo assim, é urgente a necessidade de desenvolver novos
fármacos que minimizem esses transtornos e contribuam para erradicação dessas
parasitoses. Diante disso, laboratórios acadêmicos, governos e organizações não
governamentais têm apoiado projetos voltados para o reposicionamento de fármacos
aprovados com vistas a reduzir custos e tempo de produção de novos antiparasitários.
No presente trabalho, utilizamos a bioinformática para identificar, buscar e analisar
alvos moleculares do metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P.
falciparum, visando o reposicionamento in silico de fármacos. Utilizando a base de
dados TDR Targets, identificamos 94 genes e 93 alvos do metabolismo energético de
Leishmania. Em seguida, utilizando a sequência peptídica de cada alvo, interrogamos as
bases de dados Drug Bank e TTD na busca de fármacos. Nossa busca resultou em 44
alvos positivos, dos quais 11 interagiam com 15 fármacos aprovados para uso em
humanos. Utilizamos estratégia semelhante para identificar fármacos antimaláricos que
atuassem especificamente contra o metabolismo do apicoplasto. A base de dados
GeneDB do genoma de P. falciparum foi usada para compilar uma lista de cerca de 600
proteínas com peptídeos sinais do apicoplasto. Cada uma dessas proteínas foi tratada
como potencial alvo de fármaco e sua sequência prevista foi usada para interrogar três
diferentes bases de dados de acesso livre (TT DB, DrugBank e STITCH ) Identificamos
fármacos com potencial de interagir com 47 peptídeos supostamente envolvidos na
biologia do apicoplasto do P. falciparum. Quinze desses alvos hipotéticos são previstos
interagir com fármacos já aprovados para uso clínico, mas que nunca foram avaliados
contra os parasitos da malária. Os nossos resultados sugerem que os fármacos aqui
identificados apresentam potencial para tratamentos das leishmanioses e da malária,
mas que necessitam de validação experimental para confirmar sua eficácia.
xiii
ABSTRACT
Leishmaniasis is a neglected tropical disease responsible for physical, economic and
social damages. Even though malaria is not classified as a neglected tropical disease, is
responsible for high morbidity and mortality, especially in African countries. Current
treatments for both diseases face several drawbacks, including the evolution of drug-
resistant parasites, the high cost of major drugs and the high toxicity of others. For these
reasons, there is an urgent need to develop new drugs that minimize these downsides
and, consequently, help eradicate these diseases. To overcome these difficulties, both
academics and pharmaceutical companies are increasingly employing the so-called
“drug repositioning strategy”. Drug repositioning aims to find new applications for
drugs approved for other indications, and has proven valuable for decreasing research
costs as well as to decrease the time required to market the "new" drug. In the present
study, we used bioinformatics to identify and analyze molecular targets of the energy
metabolism of Leishmania spp and of the P. falciparum apicoplast. The energy
metabolism of Leishmania and the apicoplast metabolism have various enzymes that
can be targeted by specific drugs, leading to lower toxicity and more promising
therapies for humans. Using the TDR Targets database, we were able to identify 94
genes and 93 Leishmania energy metabolism targets. We identified 44 positive targets
in these databases, and for 11 of these targets we found drugs already approved for use
in humans. We used a similar strategy to identify antimalarial drugs that acted
specifically against the apicoplast metabolism. The GeneDB database of the P.
falciparum genome was used to compile a list of 600 proteins with apicoplast signal
peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted
sequence was used to interrogate three different open access databases (DB TTD,
DrugBank and STITCH ). We identified many drugs with the potential to interact with
47 peptides allegedly involved in apicoplast biology in P. falciparum. Fifteen of these
hypothetical targets are predicted to interact with drugs are already approved for
clinical use, but were never evaluated against malaria parasites. Our results suggest that
the drugs identified here show potential activity against leishmania parasite and malaria,
but need experimental validation to confirm their effectiveness.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Doenças Tropicais Negligenciadas
As Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) afetam populações de baixa
renda, politicamente marginalizada e que vivem em zonas rurais e urbanas, cujas
condições de moradia, saneamento e de serviços médicos são muito precárias
(DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, 2010). Essas doenças são causadas por cerca 17
diferentes tipos de parasitos, incluindo as helmintíases: esquistossomose, filariose
linfática, oncocercose, teníase e cisticercose, ancilostomíase, ascaridíase e tricuríase;
protozooses: leishmaniose, doença de Chagas, tripanossomíase africana; bacterioses:
lepra, tuberculose e tracoma e as viroses dengue e raiva (HOTEZ et al., 2014; HOTEZ
PJ, MOLYNEUX DH, FENWICK A, 2007). Essas doenças se distribuem
principalmente em regiões tropicais e afetam cerca de um bilhão de pessoas,
provocando prejuízos econômicos e à saúde das comunidades afetadas.
As DTNs são as principais causas de morbidade e mortalidade nos países da
África, Ásia e América Latina, nos quais se concentram os maiores bolsões de pobreza
do mundo. Todas essas doenças caracterizam-se por apresentar enorme impacto
individual, familiar e comunitário nos países pobres e em desenvolvimento no que diz
respeito à qualidade de vida, perda da produtividade, agravamento da pobreza, bem
como o alto custo dos cuidados com a saúde de longo prazo dos afetados (DAUMERIE,
DENIS; SAVIOLI, 2010).
Assim, os impactos individuais mais comuns relacionados a algumas DTNs são:
a esquistossomose diminui a capacidade cognitiva de crianças, produz má nutrição,
perda de peso e, consequentemente, abandono da escola. A lepra provoca a perda de
membros, discriminação e marginalização social. A tripanossomíase africana (doença
do sono) produz debilidades severas e todos os casos não tratados evoluem para o óbito.
A doença de Chagas compromete o coração, esôfago, estômago e intestinos diminuindo
a qualidade de vida do paciente, incluindo a perda da capacidade de trabalho. A
leishmaniose causa lesões na pele, deformações faciais e na sua variante clínica mais
grave provoca a morte dos pacientes não tratados. A filariose linfática deforma
membros e exclui os afetados do convívio social. A oncocercose produz cegueira e
2
incapacita os afetados para o trabalho e vida social (DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI,
2010).
Esses efeitos das DTNs são reportados como perda de anos de vida ajustados à
incapacidade (do inglês DALY, Disability-Adjusted Life-Years) e são usados para
analisar o impacto dessas doenças sobre a saúde dos indivíduos. O DALY foi usado pelo
Global Burden of Disease Study 2010 (GBD 2010) como instrumento para avaliar e
comparar local e globalmente o impacto de um número relativo de doenças. A tabela 1
apresenta as DALYs estimadas pelas principais DTNs indicadas no GBD 2010.
Tabela 1 DALYs estimadas (em milhões de dólares) das DTNs resultantes da sobrecarga global de doença, estudo de 2010.
Doenças DALYs
DTNs 26,06 (20.30–35.12)
Esquistossomose 3.31 (1.70–6.26)
Ancilostomíase 3.23 (1.70–5.73)
Ascaridíases 1.32 (0.71–2.35)
Leishmanioses 3.32 (2.18–4.90)
Tripanossomíase Africana 0.56 (0.08–1.77)
Doença de Chagas 0.55 (0.27–1.05)
Tricuríase 0.55 (0.27–1.05)
Lepra 0.006 (0.002–0.11)
Filariose linfática 2.78 (1.8–4.00)
Tracoma 0.33 (0.24–0.44)
Oncocercose 0.49 (0.36–0.66)
Cisticercose 0.50 (0.38–0.66)
Amebíase 2.24 (1.73–2.84)
Criptosporidiose 8.37 (6.52–10.35) Adaptada de : Hotez PJ, Alvarado M, Basáñez M-G, Bolliger I, Bourne R, et al. (2014) The Global Burden of Disease Study 2010: Interpretation and Implications for the Neglected Tropical Diseases. PLoS Negl Trop Dis 8(7): e2865.
Alguns especialistas, entretanto, acreditam que os DALYs não são suficientes
para expressar os prejuízos causados pelas DTNs. Eles alegam que os DALYs não
levam em conta o impacto econômico, social e psicológico causados pelas DTNs
(HOTEZ et al., 2014). Do ponto de vista econômico, os efeitos podem ser diretos ou
3
indiretos para os países endêmicos. Os efeitos diretos estão relacionados aos custos com
programas de prevenção, diagnósticos, tratamento dos doentes e internação. Os efeitos
indiretos são aqueles que diminuem produtividade, provocam afastamento temporário
ou permanente do trabalho e geram desemprego (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX,
2010). Na América Latina, é estimado que a doença de Chagas cause a perda de
752.000 dias úteis de trabalho por ano devido as mortes pela doença. No Brasil, as faltas
ao trabalho dos indivíduos afetados pela doença de Chagas provocam uma perda de 5-6
milhões de dólares por ano (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010).
Assim, questiona-se qual o custo das DTNs para os países afetados e o custo-
benefício produzido pelo tratamento dessas doenças. Algumas DTNs possuem
programas de controle baseados no tratamento preventivo. Os principais exemplos são a
filariose linfática, a esquistossomose, a oncocercose e as geo-helmintíases (ascaridíase,
ancilostomíase e tricuríase). Esses programas recebem apoio de governos locais, de
agências técnicas, das indústrias farmacêuticas, organizações humanitárias e fundações.
Os custos incluem: treinamento, educação em saúde, campanhas de prevenção,
obtenção e distribuição de fármacos. Muitos estudos indicam que custo total para tratar
as DTNs é menor do que aquele destinado aos programas de prevenção e tratamento do
HIV/AIDS, da tuberculose e da e malária (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010).
Vários fatores contribuem para os baixos custos do controle ou erradicação das
DTNs, dentre eles destacam-se a doação de fármacos pelas indústrias farmacêuticas, a
distribuição simultânea dos fármacos e o trabalho voluntário (CONTEH; ENGELS;
MOLYNEUX, 2010). O custo benefício para evitar as DALYs é um dos mais baixos.
Por outro lado, admite-se que algumas doenças poderiam apresentar um custo mais alto
porque a identificação dos casos e a intervenção ambiental são as mais importantes
ações. Por exemplo, a leishmaniose e triponossomíase africana têm um custo de 12-24 e
11-22 dólares, respectivamente, por DALY evitada. Mas isso só ocorre devido à
contribuição do setor privado e ao baixo preço de alguns fármacos utilizados. Já o custo
para gerenciamento de casos de dengue gira em torno de 716 a 1757 dólares por DALY
evitada e se for voltado para o controle ambiental o custo sobe para 2440 dólares por
DALY evitada (CONTEH; ENGELS; MOLYNEUX, 2010).
Embora as DTNs provoquem um impacto tão grande sobre as populações pobres
e marginalizadas do mundo, somente a partir do ano de 2000 que algumas medidas mais
efetivas começaram ser implementadas. Ironicamente, quando as Nações Unidas
4
anunciaram os oito objetivos para o desenvolvimento do Milênio, as DTNs ficaram de
fora. O sexto objetivo apregoava: “Combate ao HIV/AIDS, malária e outras doenças”.
Essa omissão, no entanto, provocou um movimento de cientistas, organizações não
governamentais (ONGs) e fundações no sentido de dar a merecida atenção as DTNs
(BLAKE; ADAMS, 2012).
Deste modo, um pouco mais de uma década, a Organização Mundial da Saúde
(OMS) publicou o Relatório Global de 2010, intitulado “Trabalhando para superar o
impacto global das Doenças Tropicais Negligenciadas”. Essa publicação provocou uma
série de encontros, envolvendo representantes dos governos, ONGs, OMS, cientistas,
indústrias farmacêuticas e a fundação Bill & Melinda Gates num esforço conjunto para
controlar ou erradicar, até 2020, as 11 mais importantes DTNs. As principais ações
envolvem o financiamento de pesquisas para o desenvolvimento de novos fármacos, a
doação de fármacos e as campanhas de prevenção. Esse esforço devem beneficiar cerca
1,4 bilhão de pessoas ao redor do mundo afetadas pelas DTNs..
(http://www.gatesfoundation.org/press-releases/Pages/combating-10-neglected-tropical-
diseases-120130.aspx).
No caso particular da leishmaniose, a OMS pretende detectar 70% de todos os
casos da forma cutânea e tratar pelo menos 90% dos casos detectados no Oeste do
Mediterrâneo até 2015. Para o subcontinente indiano, a OMS deseja alcançar 100% de
detecção e tratamento dos casos de leishmaniose visceral até 2020. Além disso, as
estratégias globais da OMS para o controle da leishmaniose também envolvem os
continente Europeu e as Américas, alcançando mais de 90 países afetados por essa
parasitose (SAVIOLI, 2012).
As DTNs são ainda graves problemas de saúde pública no mundo. Os efeitos
dessas doenças são maiores nos países pobres e desenvolvimento, agravando a pobreza
e reduzindo a esperança de vida. A erradicação ou o controle definitivo das DTNs deve
ser resultado de um esforço coletivo no qual envolve o poder público, os centros de
pesquisa acadêmicos, as indústrias farmacêuticas, bem como as agências de apoio
humanitário.
5
1.2 As Leishmanioses
As leishmanioses formam um complexo de doenças que afetam mamíferos e são
causadas por cerca de vinte espécies diferentes de protozoários do gênero Leishmania.
A transmissão natural pode ser zoonótica ou antroponótica e ocorre pela picada de
flebotomíneos. Esses insetos pertencem à família Psychodidae, sub-família
Phlebotominae com dois gêneros epidemiologicamente importantes: Phlebotomus e
Lutzomyia. O primeiro, tipicamente representa as espécies do Velho Mundo e, o
segundo, as espécies do Novo Mundo (READY, 2010).
1.2.1 Ciclo Biológico de Leishmania spp.
Leishmania spp. apresenta dois estádios morfofisiológicos distintos (figura 1).
As formas promastigotas são encontradas nos insetos vetores e são alongadas,
flageladas e móveis, enquanto que as formas amastigotas são esféricas, sem flagelo
aparente e são encontradas no interior de macrófagos do sistema retículo-endotelial do
hospedeiro vertebrado (SANTOS et al., 2008).
Figura 1 Estádios evolutivos de Leishmania amazonensis. Forma promastigota (×1000; A) e amastigota (B). Amastigotas estão infectando um macrófago (×1000) (Santos et al. 2008) (domínio público)
A B
6
O vetor adquire o protozoário ao ingerir macrófagos infectados com a forma
amastigota. No intestino, as formas amastigotas se transformam em promastigotas pro-
cíclicas imaturas, que se multiplicam por divisão binária e, em seguida, transformam-se
em promastigotas metacíclicas infectantes e migram para a probóscide do inseto.
Durante o repasto sanguíneo, essas formas são transmitidas para o hospedeiro
vertebrado. Nesse hospedeiro, as formas promastigotas são fagocitadas por macrófagos
do sistema retículo-endotelial, mediada por receptores específicos. No interior do
vacúolo digestório do macrófago, as formas promastigotas perdem o flagelo e se
transformam em amastigotas (figura 2). Em seguida, se multiplicam e rompem os
macrófagos, provocando novos episódios de fagocitose. Embora esse fenômeno esteja
relacionado diretamente à patogenia das diferentes espécies de Leishmania, o
estabelecimento da doença depende do sucesso da transformação sofrida pelo parasito,
da resposta imunológica do hospedeiro e da virulência do parasito (ROSENZWEIG et
al., 2008; SANTOS et al., 2008).
Figura 2 Ciclo de vida de Leishmania spp. causador da leishmaniose. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/. Página do Centro de Controle de Doenças, governo dos Estados Unidos. Conteúdo de domínio público, conforme política de acesso.
7
1.2.2 Formas clínicas
As leishmanioses manifestam-se, clinicamente, de três formas. A forma cutânea
caracteriza-se, inicialmente, pelo aparecimento de pápulas eritematosas no local da
picada. Posteriormente, as pápulas aumentam e rompem-se, formando úlceras indolores
com borda bem demarcada e elevada. Após a cura, uma cicatriz profunda toma o lugar
da ferida (MASMOUDI et al., 2013). As principais espécies envolvidas na forma
cutânea são: L. tropica e L. aethiopica. A forma cutaneomucosa é reconhecida pelo seu
comportamento crônico, latente e metastático, caracterizado por lesões secundárias
distantes produzidas pela disseminação do parasito. Essas lesões são encontradas
especialmente na região oral e nasofaringea da face, desfigurando o rosto do paciente.
Diferentemente da forma cutânea, as lesões da forma cutaneomucosa não são auto-
resolvidas e são mais resistente ao tratamento com antimoniais (RONET; BEVERLEY;
FASEL, 2011). As espécies comumente relacionadas são L. (Viannia) braziliensis, L.
mexicana e L. peruviana. Na forma visceral, considerada a mais grave, o parasito é
levado do local de inoculação para o fígado, baço e medula óssea, resultando em perda
de peso e imunossupressão. Sem tratamento adequado, a maioria dos pacientes evolui
para o óbito. As espécies causadoras da leishmaniose visceral são: L. (leishmania)
donovani e L. infantum (SANTOS et al., 2008).
1.2.3 Epidemiologia e controle
As leishmanioses estão entre as endemias de maior impacto socioeconômico nos
países subdesenvolvidos e em desenvolvimento. São prevalentes em 98 países, três
territórios e cinco continentes (figura 3). Aproximadamente, 1,3 milhão de novos casos
ocorrem anualmente no mundo, dos quais 300.000 são da forma visceral (LV). Mais de
90% dos casos de LV ocorrem em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão.
Para a leishmaniose cutânea os países atingidos são Afeganistão, Algéria, Brasil,
Colômbia, Iran, Paquistão e Peru, Arábia Saudita, Síria e Tunísia, enquanto
leishmaniose cutaneomucosa afeta principalmente o Brasil, Peru e Bolívia, totalizando
um milhão de casos. Dos 1,3 milhão de casos estimados, apenas 600.000 são atualmente
relatados nesses países (ALVAR et al., 2012).
8
O número real de casos não é possível determinar, mas certamente supera os
relatados e possivelmente o estimado (ALVAR et al., 2012). O número de mortes pela
doença é também subestimado em vários desses países. Uma das razões é a morte do
indivíduo antes da doença ser diagnosticada. Entretanto, baseando-se no relato de
alguns países, estima-se que o número de mortes por leishmaniose visceral seja de
20.000 a 40.000 pessoas por ano (ALVAR et al., 2012).
No Brasil, foram relatados 18.226 casos de leishmaniose cutânea em 2013,
sendo que quase três mil casos ocorreram na região Centro-Oeste. Já para a
leishmaniose visceral foram relatados 3.253 casos, com 278 casos notificados na região
Centro-Oeste. O número de mortes por LV foi 233 e 33 no Brasil e no Centro-Oeste,
respectivamente [http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/vigilancia-de-a-a-z].
As medidas de controle e prevenção ainda estão restritas ao controle vetorial e
dos reservatórios e ao tratamento dos doentes (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012).
Vacinas antileishmania de segunda geração só devem estar disponíveis em 25 anos.
Figura 3 Distribuição geográfica das leishmanioses no mundo. A) Leishmanioses cutânea e cutânea mucosa no Novo Mundo. B) Leishmaniose visceral no Velho e no Novo Mundo. WHO, 2010. Disponível em (http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/)
Os vetores das leishmanioses são susceptíveis aos inseticidas usados contra
outros vetores, incluindo malária e filariose. No passado, o uso de DDT reduziu
drasticamente os casos de leishmaniose em várias partes do mundo. O uso de
inseticidas é recomendado onde os flebotomíneos vivem próximo às residências, como
ocorre em várias regiões da Índia e do Oeste da África (CHAPPUIS et al., 2007). O cão
A B
9
doméstico é o reservatório de maior relevância na epidemiologia da leishmaniose
visceral. Entretanto, as medidas adotadas para o controle da leishmaniose canina ainda
são motivos de muitos debates. Essas medidas envolvem o sacrifício dos cães positivos,
combatida pela sociedade protetora dos animais; o tratamento dos cães infectados, que
induz resistência e é pouco eficaz; vacinação dos cães, também tida como efetiva
(CHAPPUIS et al., 2007). Sendo assim, o tratamento dos indivíduos infectados é a
alternativa mais comum empregada para o controle e erradicação dos diferentes tipos de
leishmaniose.
1.2.4 Tratamento e resistência
Embora tenha ocorrido avanço nas pesquisas em leishmaniose nos últimos anos,
a terapêutica para essa parasitose permaneceu a mesma nas últimas cinco décadas. Ao
longo dos anos, os antimoniais pentavalentes têm sido os fármacos de escolha. Outros
fármacos, como anfotericina B e miltefosina foram introduzidos, visando contornar o
problema de resistência dos parasitos aos antimoniais. Entretanto, esses fármacos são de
alto custo, o que inviabiliza seu uso em saúde pública. Além desses fármacos citados
anteriormente, também são utilizados pentamidina, aminosidina (paromicina),
aluprurinol e itraconazol (AMATO et al., 2007; MASMOUDI et al., 2013; MINODIER;
PAROLA, 2007).
Antimoniais Pentavalentes
Os antimoniais pentavalentes estibogluconato de sódio e antimoniato de
meglumina, nomes genéricos para Pentostam® e Glucantime®, respectivamente, são os
fármacos de escolha para o tratamento das leishmanioses, quando não há relatos de
resistência (MASMOUDI et al., 2013; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). O
estibogluconato de sódio é administrado por via intravenosa ou intramuscular
obedecendo aos seguintes esquemas terapêuticos: 20 mg/kg/dia por 30 dias para
leishmaniose visceral causada por espécies do Velho Mundo; 100-500 mg intralesional
por sessão (1-5 sessões) por 3 a 7 dias para leishmaniose cutânea requerendo terapia
local; 20mg/kg/dia por 20 dias para leishmaniose cutânea requerendo terapia sistêmica e
10
leishmaniose cutâneo-mucosa. O antimoniato de meglumina possui esquema terapêutico
semelhante (MASMOUDI et al., 2013).
Os efeitos colaterais mais comuns aos antimoniais são náusea, vômitos, diarreia,
dor abdominal, anorexia, mialgia, cefaleia e letargia. Esses sintomas são inerentes ao
tratamento e são dose-independente. Por outro lado, as manifestações tóxicas cardíacas,
hepáticas, pancreáticas e renais aos antimoniais são dose-dependente e surgem na
segunda semana do tratamento (MASMOUDI et al., 2013).
Embora o exato mecanismo de ação desses fármacos seja pouco conhecido,
alguns efeitos dos antimoniais são bem relatados. Essas moléculas são administradas na
forma pentavalentes de pró-fármaco e convertida na sua forma trivalente ativa
(SHAKED-MISHAN et al., 2001; SINGH; KUMAR; SINGH, 2012). A redução
mediada pelo parasito é atribuída à ação de uma redutase, que também está relacionada
à resistência ao fármaco. Essa evidência é corroborada pela observação de que
amastigotas de L. donovani resistentes aos pentavalentes têm baixa atividade de
redutase (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012).
Ambas as formas pentavalentes e trivalentes são ativas contra as espécies de
Leishmania e parecem atuar na fragmentação do DNA, na β-oxidação de ácidos graxos
e na fosforilação do ADP. Além disso, parece atuar na inibição da glicólise e da
tripanotiona redutase, uma enzima responsável pela proteção do parasito contra espécies
ativas de oxigênio e nitrogênio (OPPERDOES; MICHELS, 2008; SINGH; KUMAR;
SINGH, 2012).
Anfoterecina B
A Anfotericina B (AnB) é um antibiótico macrolídeo obtido a partir da cultura
Streptomyces nodosus e comercializado com os nomes de Abelcet®, AmBisome®,
Amphocil®, Fungizone®. Esse fármaco é largamente utilizado para o tratamento de
infecções fúngicas, atuando como fungistático ou fungicida, dependendo da dose
administrada. A anfotericina A, produzida pela mesma cultura de bactérias, não é
utilizada em tratamento clínico de infecções fúngicas em razão de sua alta toxicicidade.
Os efeitos colaterais tóxicos observados na terapia com a anfotericina B são atribuídos à
contaminação por anfoterecina A, que não são completamente removidos durante o
11
processo de purificação (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007; SINGH; KUMAR;
SINGH, 2012).
A AnB é utilizada para tratamento das leishmanioses em regiões onde os
parasitos são resistentes aos antimoniais. No estado de Bihar, conhecida região
endêmica na Índia, a AnB é o fármaco de escolha devido à resistência aos antimoniais.
A AnB atua sobre o ergosterol da membrana celular dos fungos, que também é
encontrado no parasito Leishmania. A membrana celular dos macrófagos também é
afetada devido à presença de colesterol. Entretanto, a AnB possui maior afinidade pelo
ergosterol e, portanto, maior efeito letal. O mecanismo de ação da AnB consiste em se
ligar ao ergosterol da membrana celular do parasito e provocar alterações osmóticas que
culminam na lise celular (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007; SINGH; KUMAR;
SINGH, 2012).
A AnB tem baixa absorção gastrointestinal e por isso é administrada via
parenteral com injeções intravenosas. As doses recomendadas pela Organização
Mundial da Saúde são 1mg/kg em infusões diárias por 20 dias ou infusões em dias
alternados por 30 dias. Os efeitos colaterais agudos comumente observados são
calafrios, febre, anorexia, náuseas, vômitos, cefaleias, mialgia, artralgia e hipotensão.
Efeitos tóxicos graves são observados em infusões rápidas do fármaco, que não são
recomendadas (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012).
A AnB possui também formulações lipossomais criadas para minimizar os
efeitos colaterais e aumentar a eficácia do fármaco. Essas formulações lipossomais são
L-AnB ( Ambisome®), AnB dispersão coloidal: ABCD (Amphocil®) e AnB complexo
lipídico: ABLC (Abelcit®). Solomon e colaboradores (2013), demonstraram que a L-
AnB é mais eficaz, melhor tolerada e mais custo efetiva para o tratamento da
leishmaniose cutânea do que os antimoniais (SOLOMON et al., 2013).
Miltefosina
A miltefosina é o fármaco antileishmania mais eficaz atualmente, podendo ser
empregado para o tratamento de todos os tipos de leishmaniose. A miltefosina foi
primeiramente aprovada para uso tópico no tratamento de metástase cutânea do câncer
de mama, embora sua alta efetividade antitripanossomal já tivesse sido demonstrada.
Formulações orais de miltefosina foram também avaliadas para o tratamento de tumores
12
sólidos, mas foram abandonadas em razão dos fortes efeitos colaterais apresentados
(DORLO et al., 2012).
A miltefosina é comercializada com os nomes de Miltex®, líquido para uso
tópico em humanos; Milteforan®, líquido para uso oral em animais e Impavido®,
formulação sólida para uso humano. Esse último foi recentemente aprovado pelo Food
and Drug Administration (FDA) para o tratamento das três formas clínicas de
leishmaniose. O Impavido® foi o primeiro fármaco aprovado pelo FDA para tratamento
das leishmanioses(http://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/).
Miltefosina (hexadecylphosphocholine) pertence à classe dos alquilfosfocolina,
que são ésteres de fosfocolina de álcoois alifáticos de cadeia longa. Esses compostos são
estruturalmente relacionados ao grupo dos alquil-lisofosfotidilcolinas, que são análogos
sintéticos dos lisofosfatidilcolinas ou lisolecitinas, mas sem seu grupo glicerol. A
miltefosina atua como inibidor Akt, também conhecida como Proteína Quinase B
(PQB) (DORLO et al., 2012).
Embora seja o fármaco mais eficaz no tratamento das leishmanioses, a
miltefosina ainda custa muito caro para os países subdesenvolvidos que enfrentam
endemias de leishmaniose. Na Índia, por exemplo, o custo para o tratamento de um
paciente do sexo masculino, com massa corporal de 39 kg é em torno 200 dólares. Nos
países desenvolvidos o valor pode chegar a 3000 euros (DORLO et al., 2012).
A miltefosina age de modo semelhante nas células tumorais e em Leishmania.
Os efeitos atribuídos são apoptose e perturbação da via de sinalização celular
dependente de lipídios, embora o mecanismo preciso seja pouco claro. Nas formas
intracelulares de Leishmania, após a absorção do fármaco, ele atua no metabolismo de
lipídios e na composição da membrana, provoca fragmentação do DNA, induzindo
apoptose e inibe a citocromo c oxidase da mitocôndria (DORLO et al., 2012; SINGH;
KUMAR; SINGH, 2012).
Quanto à resistência dos parasitos Leishmania à miltefosina ainda não há relatos
clínicos ou laboratoriais. Indução de cepas resistentes in vitro já foi obtida, mas não in
vivo. Além disso, o mecanismo no qual o parasito adquire resistência ainda não está
claro. Alguns autores, entretanto, alertam para o risco do surgimento de formas
resistentes de Leishmania à miltefosina em regiões endêmicas, onde o tratamento por
via oral pode induzir a seleção de formas resistentes (DORLO et al., 2012; SINGH;
KUMAR; SINGH, 2012).
13
Pentamidina
A pentamidina tem sido usada para o tratamento das diferentes formas clínicas
da leishmaniose. Durante muitos anos foi usada para tratamento da LV na Índia, mas
abandonada após o surgimento de cepas resistentes (SINGH; KUMAR; SINGH, 2012).
Entretanto, para o tratamento da leishmaniose cutaneomucosa, a pentamidina
demonstrou excelentes resultados, superando a eficácia do estibogluconato e
apresentando eficácia equivalente à meglumina (AMATO et al., 2007). Esses
resultados, no entanto, não são os mesmos para todas regiões endêmicas, podendo variar
entre as diferentes espécies causadoras.
A pentamidina (Pentacarinat®) é usada em esquemas terapêuticos que
dependem da forma clínica da leishmaniose. Para a forma visceral é usado 4mg/kg de
isetionato de pentamidina, em dias alternados, até um máximo de 10 injeções,
preferencialmente por via intramuscular. Para a forma cutânea emprega-se 4mg/kg de
isetionato de pentamidina, por via intramuscular, a cada três dias (um dia sim, dois não),
num total de 3 injeções. Para a leishmaniose mucocutânea utiliza-se 4mg/kg de
isetionato de pentamidina, por via intramuscular, a cada três dias (um dia sim, dois não),
num total de 5 injeções. Os efeitos colaterais mais comuns são: hipotensão,
hipoglicemia, pancreatite, arritmia cardíaca, leucopenia, trombocitopenia, insuficiência
renal aguda, hipocalcemia e taquicardia ventricular (MASMOUDI et al., 2013; SINGH;
KUMAR; SINGH, 2012).
A pentamidina é uma diamina aromática denominada 4-[5-(4-
carbamimidoylphenoxy) pentoxy] benzenecarboximidamide. Originalmente, foi usada
para tratamento da tripanossomíase africana, mas tem sido usada desde a década de
1930 para o tratamento das leishmanioses (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007). A
redução de sua eficácia e o alto risco de resistência tem diminuído seu uso em algumas
regiões endêmicas, todavia algumas combinações com outros fármacos têm sido
propostas. O mecanismo de ação permanece pouco claro, mas há evidências de que a
pentamidina entra no protozoário Leishmania utilizando transportadores argininina e
poliamina. Sun & Zhang (2008) demonstraram que a pentamidina atua
inespecificamente sobre RNA-t, impedindo a aminoacilação e a tradução gênica (SUN;
ZHANG, 2008).
14
Paromomicina
A paromomicina é um antibiótico aminociclitol-aminoglicosídeo empregado
para tratamento de infecções bacterianas. Utilizado em terapia combinada ou isolada
demonstrou alta eficácia no tratamento da leishmaniose visceral. Entretanto, era
conhecida por apresentar eficácia reduzida para as formas cutâneas de leishmaniose.
Recentemente, um estudo feito com 31 pacientes com leishmaniose cutânea pós kalazar
tratados com paromomicina demonstrou ser altamente tolerada pelos pacientes,
apresentando efeitos colaterais insignificantes. A eficácia, no entanto, permaneceu
baixa, em torno de 37% de cura (SUNDAR et al., 2014).
A paromomicina foi comparada com anfotericina B para o tratamento de
leishmaniose visceral em estudo multicêntrico de fase 3, realizado em Bihar, Índia. A
paromomicina foi administrada por via intramuscular em doses diárias de 11 mg/kg por
21 dias. Os resultados demonstraram que a paromomicina foi tão eficaz quanto à
anfotericina B (SUNDAR; JHA; THAKUR, 2007). Outro estudo de fase 3 testou a
paromomicina isolada ou combinada com gentamicina em pacientes com leishmaniose
cutânea, causada por Leishmania major na Tunísia. Os resultados comprovaram que
aplicação de creme contendo 15% de paromomicina com ou sem 0,5% de gentamicina
conferiu cura em até 82% dos casos (BEN SALAH et al., 2013).
1.2.5 Metabolismo energético como alvo de fármacos antileishmania
O processo de geração de energia nos seres vivos pode ocorrer na presença ou na
ausência de oxigênio. O processo aeróbico consiste na completa oxidação da glicose em
gás carbônico e água, mediante reações do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória,
ambas de ocorrência mitocondrial. Nessa via, o oxigênio age como aceptor final de
elétrons durante o processo chamado de fosforilação oxidativa, no qual ocorre a maior
produção de ATP. Já nos processos fermentativos, a geração de energia não envolve a
participação do oxigênio e as reações não quebram a glicose por completo, o que resulta
em intermediários com potencial energético, tais como etanol e lactato. As fermentações
alcoólicas e lácticas são antecedidas pelas reações de glicólise, que consistem na quebra
15
da glicose em piruvato. A glicólise ocorre no citosol e é composta de dez reações que
quebram a molécula de glicose em duas moléculas de piruvato.
Nos kinetoplastideos, incluindo o genêro Leishmania, o processo de geração de
energia apresenta algumas peculiaridades, que os tornam diferentes dos demais
organismos. Nos kinetoplastídeos existem três locais onde as reações geradoras de ATP
ocorrem: no citosol, no glicossomo e na mitocôndria (figura 4) (HANNAERT, 2003).
O glicossomo é uma organela membranosa exclusiva dos kinetoplastídeos,
semelhante ao peroxissomo das células animais. Embora apresente outras enzimas ou
sistemas enzimáticos, o glicossomo está intimamente relacionado à geração de energia
por meio da glicólise (HANNAERT, 2003; OPPERDOES; COOMBS, 2007). Nessa
organela, ocorrem os sete primeiros passos da glicólise, que resultam na quebra da
glicose em duas moléculas de 3-fosfoglicerato. As três últimas reações ocorrem no
citosol e culminam na formação de piruvato (OPPERDOES; COOMBS, 2007). O
piruvato, por conseguinte, é oxidado na matriz mitocondrial à acetil-CoA, que reage
com oxaloacetato, iniciando o ciclo de Krebs. O processo é finalizado com cadeia
transportadora de elétrons (BRINGAUD; RIVIÈRE; COUSTOU, 2006) (figura 4).
Diferentemente dos mamíferos que possuem milhares de mitocôndrias, os
kinetoplastídeos apresentam apenas uma mitocôndria. Este fato torna esses protozoários
extremamente dependentes de sua mitocôndria (MEHTA; SHAHA, 2004). A
mitocôndria dos kinetoplastídeos apresenta densidade da matriz, número e forma das
cristas ligeiramente diferentes das mitocôndrias dos mamíferos. A matriz é ocupada
principalmente por moléculas de DNA circulares, denominadas DNA do kinetoplasto
ou k-DNA. O genoma contido nessas moléculas codificam proteínas participantes da
cadeia respiratória e do mecanismo de tradução (FIDALGO; GILLE, 2011). Entretanto,
essas proteínas representam apenas 5% do total encontrado na mitocôndria. Isso
significa que a maioria das proteínas mitocondriais é codificada por genes nucleares,
traduzidas no citoplasma e posteriormente transportadas para a mitocôndria
(FIDALGO; GILLE, 2011)
16
Figura 4 As principais vias do metabolismo energético em Leishmania major. Reações da glicólise, que ocorrem no glicossomo no citosol e ciclo de Krebs, na mitocôndria. O fluxo de metabólitos entre as duas organelas também é apresentado. Metabólitos são substratos (cinza) ou produtos finais (preto) do metabolismo. Setas grossas representam fluxos metabólicos principais. Vias em azul acreditam-se ser mais importantes em promastiogotas e vias em vermelho acreditam-se ser mais importantes em amastigotas. Abreviações Fru, frutose; GAP, gliceraldeído 3 fosfato; Glc, glicose; H-5-P, hexose 5-fosfato; Man, manose; PEP, fosfoenolpiruvato; PGA, ácido fosfoglicérico; PPP. Enzimas da via pentose-fosfato: 1, hexoquinase; 2, fosfoglicose isomerase; 3, fosfofrutoquinase; 4, frutose bifosfato aldolase; 5, triofosfato isomerase; 6, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; 7, fosfoglicerato quinase; 8, glicerol-3-fosfato desidrogenase; 9, glicerol quinase; 10, adenilato quinase; 11, glicose-6-fosfato deaminase; 12, manose-6-fosfato isomerase; 13, fosfomanomutase; 14, GDP-manose pirofosforilase; 15, fosfoglicerato mutase; 16, enolase; 17, piruvato quinase; 18, fosfoenolpiruvato carboxinase; 19, malato desidrogenase; 20, fumarato hidratase; 21, NADH-dependente fumarato redutase; 22, enzima málica; 23, alanina aminotransferase; 24, aspartato aminotransferase; 25, piruvato fosfato diquinasese; 26, citrato sintase; 27, 2-cetoglutarato desidrogenase; 28, succinil-CoA ligase; 29, succinato desidrogenase; 30, acetato–succinato CoA transferase; 31, piruvate desidrogenase; 32, citrato liase; 33, acetil-CoA sintetase; 34, via de oxidação prolina; 35, via de oxidação da treonina; 36, ribuloquinase; 37, riboquinase; 38, xiloquinase; 39, proteína amilase-semelhante; 40, proteína sucrase-semelhante. Baseado em Opperdoes e Coombs (2007).
17
O modo como a Leishmania produz energia a partir dos nutrientes disponíveis
depende do estádio do parasito, portanto do ambiente onde se encontra. As diferenças
morfológicas entre as formas amastigotas e promastigotas de Leishmania refletem, em
essência, diferenças moleculares e bioquímicas. Essas diferenças são responsáveis pela
adaptação do parasito ao mamífero hospedeiro e ao inseto vetor (ROSENZWEIG et al.,
2008). O sequenciamento do genoma das principais espécies de Leishmania, bem como
análise proteômica de alguns genes permitiram conhecer melhor essas diferenças e
deduzir as adaptações de cada estádio no seu ciclo de vida (OPPERDOES; COOMBS,
2007; ROSENZWEIG et al., 2008). Sabe-se, por exemplo, que as condições físico-
químicas em que vivem ambos os estádios são muito diferentes. As formas
promastigotas vivem no intestino dos flebotomíneos em condições de pH levemente
ácido a neutro, enquanto que as formas amastigotas encontram-se em pH ácido no
vacúolo parasitóforo. Outro aspecto importante é a disponibilidade de oxigênio e de
carbono para ambas as formas. Assim, as diferenças metabólicas entre os dois estádios
estão relacionadas, dentre outros fatores, ao tipo de nutriente disponível e como esse
nutriente é utilizado para gerar energia (OPPERDOES; COOMBS, 2007).
O conhecimento atual sobre o metabolismo energético das formas promastigotas
de Leishmania foi obtido a partir de experimentos realizados in vitro e análise
comparativa com as formas promastigotas de T. cruzi e T. brucei, com as quais guardam
semelhanças (OPPERDOES; COOMBS, 2007). Nessas formas, o processo de geração
de energia envolve a glicólise, ciclo de Krebs e cadeia transportadora de elétrons,
embora haja dúvidas quanto ao ciclo de Krebs ser ou não ativo (OPPERDOES;
COOMBS, 2007; VAN HELLEMOND; VAN DER MEER; TIELENS, 1997). As
formas promastigotas utilizam glicose e aminoácidos, mas mudam para ácidos graxos
durante a transição para formas amastigotas. Apesar de uma pequena quantidade de
glicose ser completamente oxidada a CO2, a maior quantidade é fermentada gerando
como produtos finais: acetato, L-alanina, piruvato e succinato (BRINGAUD; RIVIÈRE;
COUSTOU, 2006; OPPERDOES; COOMBS, 2007). A mudança da predileção de
glicose para ácidos graxos durante a transição não está relacionada à privação do
glicídio no interior do vacúolo parasitóforo, mas às diferenças fisíco-químicas dos dois
meios que provocam expressão diferencial de certos genes (SAUNDERS et al., 2014)
18
Os estudos relacionados ao metabolismo energético das formas amastigotas são
escassos, portanto, muitos aspectos são ainda desconhecidos. Foi demonstrado, no
entanto, que amastigotas obtidas de lesões apresentam baixo consumo de glicose e de
prolina e aumento da β-oxidação de ácidos graxos (OPPERDOES; COOMBS, 2007).
Rozenzweig et al (2008) confirmaram em estudos in vitro que durante diferenciação
tardia de promastigota para amastigota, as enzimas glicolíticas glicossomais aumentam
ligeiramente, enquanto que a expressão de genes codificadores das enzimas citosólicas:
fosfoglicerato mutase, enolase e piruvato quinase sofrem regulação negativa
(ROSENZWEIG et al., 2008).
Por outro lado, as enzimas reguladoras da gliconeogênese, fosfoenolpiruvato
carboxiquinase e frutose 1,6 bifosfatase aumentam significativamente sua expressão,
provando que a gliconeogênese é essencial para a sobrevivência das amastigotas no
vacúolo parasitóforo (ROSENZWEIG et al., 2008). Além disso, tanto as amastigotas
derivadas de lesão quanto às derivadas de cultura acumulam altos níveis de oligômeros
de manose, que funcionam como reserva energética. A liberação desse material tem
papel regulatório nos níveis de glicose-fosfato, no fluxo da glicólise e da via das
pentoses-fosfato (SAUNDERS et al., 2014).
De fato, a β-oxidação é a principal forma de geração de energia nas amastigotas.
Todavia, a Leishmania é incapaz de utilizar ácidos graxos como única fonte de carbono,
por isso utilizam também frutose, manose e glicose. Além disso, o acetil-coA gerado é
co-catabolizado com glicose no ciclo de Krebs que está direcionado para a biossíntese
de glutamato/glutamina (SAUNDERS et al., 2014). Nesse processo, a unidade de dois
carbonos derivada do ácido graxo é combinada com o ácido dicarboxilíco de quatro
carbonos provenientes da fermentação glicossomal do succinato. Isso resulta na
formação de citrato, que é convertido em α-cetoglutarato e glutamato (SAUNDERS et
al., 2014) (figura 5)
Saunders et al (2014) demonstraram também que as amastigotas são altamente
dependentes da síntese mitocondrial de novo de glutamato e glutamina. As amastigotas
utilizam esses aminoácidos para síntese de glutationas/tripanotionas, pirimidinas e
amino glicídios, considerados essenciais para o crescimento e resposta ao estresse do
interior do vacúolo parasitóforo (SAUNDERS et al., 2014).
A compreensão das diferenças metabólicas entre os dois estádios evolutivos de
Leishmania e entre esses estádios e o hospedeiro humano permite identificar potenciais
19
alvos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania. Como
visto anteriormente, a maioria das reações envolvidas na glicólise ocorre no glicossomo,
organela exclusiva dos Kinetoplastídeos. Essas reações são catalisadas por enzimas bem
conhecidas em ambos os estádios promastigotas e amastigotas. Todavia, a atividade
dessas enzimas não é a mesma em ambos os estádios. As enzimas malato
desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e glucose-6- fosfato isomerase, por
exemplo, têm atividade muito maior do que as enzimas hexoquinase, fosfofrutoquinase
e glicose-6-phosfato desidrogenase (OPPERDOES; MICHELS, 2008; SAUNDERS et
al., 2014). Além disso, os nutrientes utilizados por ambos são diferentes, tornando
algumas vias essenciais, como é o caso da gliconeogênese para as formas amastigotas
(OPPERDOES; MICHELS, 2008).
O metabolismo mitocondrial também apresenta alvos específicos para o
desenvolvimento de inibidores seletivos. As enzimas succinil-CoA ligase e
acetato:succinato-CoA transferase, por exemplo, só são encontradas praticamente nos
tripanossomatídeos. Essas enzimas convertem acetil-CoA em acetato, que
posteriormente é utilizado para produzir ATP (VAN HELLEMOND; OPPERDOES;
TIELENS, 1998). Acrescenta-se ao repertório, o complexo I NADH:quinona
oxidoredutase, ausente ou pouco ativa em mamíferos; a fumarato redutase, que converte
succinato em fumarato, encontrada em Leishmania e Trypanossoma (FIDALGO;
GILLE, 2011).
Diferenças observadas no metabolismo energético de mamíferos hospedeiros e
de Leishmania fornecem perspectivas animadoras na busca de fármacos específicos que
atuam contra enzimas do parasito, sem afetar significativamente o metabolismo do
hospedeiro (KAUR et al., 2011; VERLINDE et al., 2001).
20
Figura 5 Metabolismo do carbono de Leishmania mexicana nas formas promastigotas (A) e amastigotas (B). Maior fonte de carbono (azul) e metabólitos produzidos. Abreviações: αKG, α-cetoglutarato; AcCoA, acetil-CoA; Ala, alanina; Asp, aspartato; Cit, citrato; Fum, fumarato; FA, ácido graxo; G6P, glicose-6-fosfato; G3P, gliceraldeído-3-fosfato; Gln, glutamina; Glu, glutamato; Mal, malato; OAA, oxaloacetato; OAc, acetato; PEP, fosfoenolpiruvato; PPP, via pentose fosfato; Pro, prolina; Pyr, piruvato; SCoA, succinil-CoA; Suc, succinato; TCA, ciclo do ácido tricarboxílico. Adaptada de Saunders et al. (2014).
21
1.3 Malária
A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium, com cinco
espécies de importância médica: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P.
knowlesi. A espécie P. falciparum causa a malária grave, sendo responsável pela
maioria das mortes pela doença. O P. vivax, embora cause malária não grave, é de
grande importância em razão de sua ampla distribuição e por apresentar um estádio
dormente chamado hipnozoíto, responsável pelas recaídas de malária. Além disso, o P.
vivax é capaz de sobreviver nos mosquitos anofelinos encontrados em altas altitudes e
temperaturas mais baixas (WHO, 2014). No Brasil, não há casos autóctones de malária
por P. ovale e por P. knowlesi. As ocorrências mais comuns são de P. vivax e P.
falciparum e relatos de casos de P. malariae (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010).
1.3.1 Ciclo biológico do Plasmodium sp
O ciclo do Plasmodium spp requer a participação de dois hospedeiros: um
hospedeiro invertebrado (mosquito) e um hospedeiro vertebrado (aves, répteis ou
mamíferos). Normalmente, o invertebrado é o hospedeiro definitivo, porque nele ocorre
a fase sexuada de reprodução do parasito. Nos tecidos dos vertebrados ocorre a fase
assexuada, por isso são denominados hospedeiros intermediários (ROBERTS, LARRY
S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009).
O ciclo se inicia quando a fêmea anofelina infectada injeta a forma esporozoíta
no hospedeiro humano durante o repasto sanguíneo (figura 6). Em seguida, os
esporozoítos invadem os hepatócitos ou outros órgãos, dependendo da espécie de
Plasmodium. Ao entrar nas células do fígado iniciam o ciclo assexuado denominado
ciclo pré-eritrocítico ou esquizogonia exoeritrocítica primária. No interior dos
hepatócitos, os esporozoítos se transformam em trofozoítos, que passam a se alimentar
do citoplasma da célula hospedeira. Após uma semana, dependendo da espécie, os
trofozoítos sofrem maturação e começam a esquizogonia. Inicialmente, são formados
vários núcleos filhos, transformando o parasito em um esquizonte. Após várias
mudanças no citoplasma e nos núcleos, a esquizogonia termina com a formação dos
22
merozoítos. Essas formas rompem os hepatócitos, invadem as hemácias e iniciam o
ciclo eritrocítico. No interior das hemácias, os merozoítos se transformam novamente
em trofozoítos que passam apresentar uma forma anelar, resultante da formação de um
grande vacúolo alimentar no citoplasma. Na medida em que o trofozoíto cresce, seu
citoplasma se torna menos visível e os grânulos de hemozoína aparecem mais
destacados. A hemozoína é o produto final resultante da degradação da hemoglobina do
hospedeiro (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009).
Os merozoítos se desenvolvem rapidamente em esquizontes ou merontes. Na
esquizogonia eritrocítica, o citoplasma aglutina-se ao redor do núcleo antes da
citocinese ocorrer. Quando a merogonia termina, os merozoítos rompem as hemácias e
resíduos metabólicos, incluindo a hemozoína, são liberados. Esses compostos são
responsáveis pelos principais sintomas agudos da malária. A maioria dos merozoítos é
destruída pelo sistema imunológico do hospedeiro, mas mesmo assim, a parasitemia
continua alta devido à esquizogonia eritrocítica produzir um grande número de novos
merozoítos. Além disso, a hemozoína é tóxica para os macrófagos, diminuindo sua
eficiência fagocitária. Após indeterminadas gerações, alguns merozoítos entram nos
eritrócitos e se transformam em macrogametócito e microgametócito. Essas formas
variam nas diferentes espécies de Plasmodium e são infectantes para o hospedeiro
definitivo. Se não forem ingeridas pelo mosquito, esses estádios morrem e são
fagocitados pelas células de defesa (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN;
SCHMIDT, 2009)
O ciclo começa no mosquito quando os gametócitos são ingeridos juntos com as
hemácias parasitadas do hospedeiro durante o repasto sanguíneo. As hemácias são
digeridas e os gametócitos são liberados e sofrem transformação. O macrogametócito
forma o macrogameta (feminino), enquanto o microgametócito origina o microgameta
(masculino). O processo de maturação do macrogametócito é acompanhado de
mudanças discretas no núcleo, enquanto que a transformação do microgametócito em
microgameta é bem mais expressiva e é denominada exoflagelação. Após se tornar
extracelular, o núcleo do microgametócito se divide e forma seis a oito núcleos filhos,
cada um dos quais está associado com elementos de um axonema desenvolvido. Após
completar todas as mudanças necessárias, o microgameta nada até encontrar o
macrogameta e fertiliza-o. O zigoto formado alonga-se e torna-se oocineto. O oocineto,
então penetra na membrana peritrófica no intestino do mosquito e migra intracelular e
23
extracelularmente até a hemocela próxima ao intestino (ROBERTS, LARRY S;
JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009).
O oocineto evolui para oocisto, que sofre meiose dando origem a massas
nucleares haploides, denominadas esporoblasto. Múltiplas divisões mitóticas do
esporoblasto formam os esporozoítos. Estas formas então migram pelo corpo do
mosquito e quando atingem as glândulas salivares penetram em canais existentes nas
glândulas e podem ser injetados no hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo.
O desenvolvimento do esporozoíto ocorre em um período de dez dias a duas semanas,
dependendo da espécie e da temperatura (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN;
SCHMIDT, 2009). Os mosquitos do gênero Anopheles spp são os principais vetores da
malária humana e uma vez infectados permanecem transmitindo a doença por toda a
vida. O gênero Anopheles abriga cerca de 400 espécies, mas apenas 30 espécies são de
importância epidemiológica. No continente africano, a espécie A. gambiae é a mais
importante na transmissão da doença e no Brasil é a espécie A. darlingi. O Plasmodium
pode também ser transmitido por transfusão de sangue, transplante de órgãos,
compartilhamento de seringas entre usuários de drogas, materno-fetal e acidentes de
laboratório (WHO, 2014).
24
Figura 6 Ciclo biológico do Plasmodium spp. A fêmea do mosquito Anopheles sp adquire o parasito ao alimentar-se de sangue de indivíduos infectados. Após completar o ciclo no mosquito, o protozoário é transmitido para os indivíduos saudáveis nos quais realiza um novo ciclo, passando por vários estádios. Adaptado de http://www.cdc.gov/parasites/malaria/. Página do Centro de Controle de Doenças, governo dos Estados Unidos. Conteúdo de domínio público, conforme política de acesso.
1.3.2 A doença
As manifestações clínicas da malária dependem de fatores relacionados ao
parasito, aos hospedeiros e a fatores geográficos e sociais. Em relação ao parasito são
considerados a resistência aos fármacos utilizados, a taxa de multiplicação, as vias de
invasão, a citoaderência, o polimorfismo antigênico, a variação antigênica e as toxinas
maláricas. Os fatores relacionados aos hospedeiros são: a imunidade, as citocinas pró-
inflamatórias, a idade, a gravidez e a predisposição genética. Acesso ao tratamento,
fatores econômicos e culturais, estabilidade política, intensidade da transmissão na qual
se consideram a espécie transmissora, a sazonalidade e epidemias estão relacionados aos
fatores sociais e geográficos. Todos esses fatores contribuem para as variações clínicas
da malária entre os quadros assintomáticos aos casos mais graves, geralmente fatais
(MILLER et al., 2002).
25
Todas as espécies de Plasmodium que infectam humanos podem causar febre,
cefaleia, mal-estar, dores musculares, tremores e anemia hemolítica. Mas somente P.
falciparum causa as complicações neurológicas, hipoglicemia, acidose metabólica e
dificuldade respiratória. Esses sintomas, se não administrados corretamente, podem
levar o pacientes à morte, principalmente crianças e mulheres grávidas. O P.
falciparum apresenta cepas virulentas capazes de invadir todos os estádios eritrocíticos
e formas não virulentas que infectam um número limitado de eritrócitos, sendo
responsáveis por quadros clínicos menos severos (MILLER et al., 2002).
As manifestações clínicas da malária grave são reconhecidas por afetar vários
órgãos, incluindo o cérebro. A acidose metabólica é a principal causa dessas
manifestações e o fator responsável pela dificuldade respiratória, que pode levar o
paciente a óbito. A acidose é devido à produção de ácido láctico, atribuída a vários
fatores, incluindo aquele produzido pelo parasito, à insuficiência hepática e a redução da
oxigenação tecidual. Além disso, os pacientes com malária grave podem apresentar
desidratação e choque hipovolêmico causados por alterações vasculares. Outro sintoma
inerente à infecção pelo Plasmodium spp é a anemia, causada pela destruição das
hemácias parasitadas e não parasitadas (MILLER et al., 2002).
1.3.3 Epidemiologia e controle
Estima-se que, globalmente, cerca de 3,4 bilhões de pessoas estão sob o risco de
contrair malária. Em 2012, foram relatados 207 milhões de novos casos e
aproximadamente 627 mil pessoas morreram pela infecção. A doença é endêmica em
104 países, com predomínio dos países africanos nos quais também ocorre o maior
número óbitos pela doença, principalmente menores de cinco anos e mulheres grávidas.
No Brasil, 4,5 milhões de pessoas estão sob alto risco de contrair a infecção e cerca de
2,4 milhões de casos suspeitos foram relatados em 2012. Nesse mesmo ano, o número
de casos confirmados foi, aproximadamente, 243 mil casos, com 64 mortes, o maior das
Américas (figura 7) (WHO, 2014).
26
Figura 7 Mapa da população mundial sob-risco de contrair malária. World Health Organization, WHO, 2014.
A principal forma de transmissão da malária é a vetorial. Aproximadamente, 400
espécies de mosquitos do gênero Anopheles são capazes de transmitir a doença.
Entretanto, apenas cerca de trinta dessas espécies são de importância epidemiológica
por serem mais susceptíveis à infecção pelo Plasmodium spp. Na África, a principal
espécie é A. gambiae que compreende um complexo composto de seis espécies
indistinguíveis morfologicamente, mas com comportamentos e ecologia bem distintos.
A espécie A. gambiae stricto sensu é a mais perigosa e competente vetora da malária,
por ser altamente antropofílica e susceptível ao P. falciparum. Além disso, tem hábito
endofílico (ato de permanecer no interior das habitações humanas), se reproduz em
coleções de água limpa, cisternas e poços de água (BAYOH et al., 2010). No Brasil, a
principal espécie vetora é A. darlingi, considerada a mais perigosa da América do Sul,
estendendo-se da Venezuela ao sul do Brasil. O A. darlingi tem hábito exofílico, se
reproduz em água limpa dos escombros e da vegetação. Essa espécie costuma invadir as
casas e tem preferência por sangue humano (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN;
SCHMIDT, 2009).
A malária é uma parasitose prevenível e tratável, desde que as medidas
adequadas sejam adotadas. As estratégias de controle empregam o combate vetorial,
através da aplicação de inseticidas no interior das casas e no ambiente externo;
27
quimioprofilaxia, recomendada para crianças e mulheres grávidas; confirmação da
infecção dos casos suspeitos através do exame parasitológico de sangue e tratamento
adequado dos doentes, por meio da confirmação da espécie causadora e da eventual
resistência dos parasitos aos fármacos utilizados (WHO, 2014).
1.3.4 Tratamento e resistência
O uso apropriado de fármacos para tratar os casos de malária e o uso de
quimioprofiláticos por aqueles que estão sujeitos à infecção são partes integrantes do
controle eficiente da malária nos países endêmicos. Na América do Sul, nativos usavam
chá da casca da Cinchona para aliviar a febre. Descobriu-se depois que esse extrato
continha alcaloides com propriedades antimaláricas eficientes e seguras. O principal
alcaloide extraído da Cinchona foi o quinino, a partir do qual se produziu outros
fármacos antimaláricos (ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, 2009).
Na China, extratos de algumas plantas têm sido usados durante séculos para tratar
pacientes com febre. Na década de 1970, um grupo de cientistas chineses descobriu que
o extrato da Artemisia annua era altamente eficiente contra o P. berghei e o P.
cynomolgi. Mais tarde, esse mesmo grupo identificou o princípio ativo da A. annua, um
terpeno que eles denominaram artemisinina, do qual derivam vários compostos
sintéticos de excelente atividade antimalárica (TU, 2011). Os principais fármacos
atualmente utilizados para tratar a malária pertencem a diferentes classes de compostos
químicos, mas que compartilham modos de ação semelhantes. Esquemas monoterápicos
são desencorajados e os combinados são sempre recomendados. A tabela 2 apresenta os
principais fármacos antimaláricos da atualidade.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda políticas para o tratamento
da malária por região. A terapia de combinação baseada em artemisinina é adotada em
79 dos 88 países nos quais o P. falciparum é endêmico. A cloroquina ainda é utilizada
por alguns países onde não foi detectada resistência, como nas Américas, por exemplo.
Outros 33 países da África e 52 países do globo adotam política de tratamento
preventivo de casos graves com quinina ou arteméter por via intramuscular, ou com
supositórios de artesunato. Para o tratamento de casos graves por P. vivax, 52 dos 58
países com transmissão em curso utilizam primaquina. Outros 13 países, dos 52 citados
28
anteriormente, recomendam testes para a deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase
antes do tratamento com primaquina (WHO, 2014).
Tabela 2 Principais fármacos antimaláricos. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010.
Fármaco Classe Indicação
Artemesinina e
derivados
Endoperóxido
sesqueterpeno lactona
Tratamento das infecções por P.
falciparum; terapias combinadas
orais para malária não complicada;
artesunato intravenoso para doença
grave.
Cloroquina 4-aminoquinolina Tratamento e quimioprofilaxia de
infecção por parasitos sensíveis
Amodiaquina 4-aminoquinolina Tratamento da infecção por
algumas cepas de P. falciparum
resistentes à cloroquina e em
combinação fixa com o artesunato.
Piperaquina Biquinolina Tratamento da infecção por P.
falciparum em combinação fixa
com di-hidroartemisinina.
Quinina Quinolina metanol Tratamento oral e intravenoso das
infecções por P. falciparum.
Quinidina Quinolina metanol Terapia intravenosa das infecções
graves por P. falcipararum.
Mefloquina Quinolina metanol Quimioprofilaxia e tratamento das
infecções por P. falciparum.
Primaquina 8-aminoquinolina Cura radical e profilaxia terminal
das infecções por P. vivax e P.
ovale; quimioprofilaxia alternativa
para todas as espécies.
Sulfodoxina-
piremetamina
Combinação de
antagonistas do folato
Tratamento das infecções por P.
falciparum resistente à cloroquina,
inclusive com combinação com
29
artesunato; terapia preventiva
intermitente nas regiões endêmicas.
Atovaquona-
proguanila
Combinação de quinina-
antagonista do folato
Tratamento e quimioprofilaxia da
infecção por P. falciparum
Doxiciclina Tetraciclina Tratamento (com quinina) das
infecções por P. falciparum e
quimioprofilaxia
Halofantrina Fenantreno metanol Tratamento das infecções por P.
falciparum.
Lumefantrina Aril álcool Tratamento da malária por P.
falciparum em combinação com
arteméter.
No Brasil, o Ministério da Saúde disponibiliza gratuitamente o tratamento da
malária em todo território nacional. Os fármacos recomendados visam aos sintomas
clínicos, matando as formas assexuadas sanguíneas; às recaídas tardias, que agem contra
as formas dormentes do fígado (hipnozoítos); à interrupção da transmissão, que atuam
contra as formas sexuadas sanguíneas. O esquema terapêutico utilizado considera a
idade, a espécie de Plasmodium, a gravidade da doença, as condições associadas
(gravidez) e exposição anterior do paciente ao parasito. Os fármacos mais utilizados
são: cloroquina e primaquina, para a malária não complicada ou arteméter e
lumefantrina; artesunato e mefloquina para infecções por P. falciparum. Ainda são
utilizados clindamicina, quinina e artesunato para formas graves de P. falciparum
(BRASIL, 2010).
As políticas adotadas para o tratamento da malária visam aumentar a eficácia,
reduzir custos e evitar a seleção de cepas resistentes aos fármacos utilizados. Quanto à
resistência, os esforços não têm conseguido evitar o surgimento de cepas resistentes aos
antimaláricos. A seguir são discutidos os mecanismos de ação e de resistência dos
principais antimaláricos.
30
Artemisinina e derivados
A artemisinina é extraída da Artemisia annua utilizada pela medicina popular da
China por milhares de anos para tratar doenças febris, incluindo a malária. A descoberta
se deu na década de 1970, quando um grupo de jovens cientistas chineses, liderados por
Youyou Tu, investigou as propriedades antimaláricas de várias plantas da farmacopeia
chinesa. Após vários ensaios frustrantes, eles identificaram o qinghaosu, Artemisia
annua para os ocidentais, com excelente atividade antimalárica em modelos de malária
animal. Dadas as dificuldades de realizarem ensaios clínicos para novos fármacos,
YouYou Tu e seus colegas ingeriram o extrato para averiguar a segurança para
humanos. Após servirem de cobaias para seus próprios ensaios, eles realizaram testes
em pacientes infectados com P. falciparum e P. vivax e obtiveram excelentes resultados
(TU, 2011).
Encorajados pelos resultados dos ensaios, empreenderam uma busca para
identificar o principio ativo da A. annua. Um ano depois, eles isolaram uma substância
cristalina, incolor de peso molecular de 282 Da, fórmula molecular C15H22O5, com
ponto de fusão entre 156-157 ºC, a qual denominaram artemisinina, o principio ativo do
extrato. A partir desse composto natural, eles produziram ainda outros três compostos
com excelente atividade antimalárica: a di-hidroartemisinina, forma reduzida da
artemisinina; a arteméter, um metil éster solúvel em óleo; e o artesunato, sal
hemissuccinato hidrossolúvel da di-hidroartemisinina (figura 8) (TU, 2011). Desde
então milhões de pessoas com malária na China, Ásia, África e em diversas outras
regiões do mundo têm sido tratadas com a artemisinina e seus derivados semissintéticos
de modo eficiente e seguro.
Figura 8 Fórmulas moleculares da artemisinina e seus derivados.
A artemisinina e seus derivados são esquizonticidas potentes, atuando
rapidamente contra todos os estádios assexuados sanguíneos de todas as espécies de
Plasmodium que afetam humanos. Esses fármacos atuam também direta e indiretamente
Artesunato Di-hidroartemisinina Artemisinina Arteméter
31
contra gametócitos, exoflagelação e produção de oocistos de P. falciparum e contra o
desenvolvimento de esquizontes hepáticos de P. yoelii (DELVES et al., 2012).
A artemisinina e seus derivados são administrados por diferentes vias. A di-
hidroartemisinina é administrada por via oral; o arteméter por via oral ou intramuscular;
a artemisinina por via oral ou supositório; o artesunato por via oral, supositório,
intravenosa ou intramuscular. As formulações orais apresentam absorção rápida,
atingindo concentração plasmática entre uma e duas horas e meia-vida de uma a três
horas após administração. Ao passar pelo fígado a artemisinina, artesunato e arteméter
são convertidos em di-hidroartemisinina, a forma ativa do fármaco (DE REVIERS,
2013; REYBURN, 2010). Esses fármacos são bem tolerados, mas alguns efeitos
colaterais são comumente observados, tais como: tonturas, zumbido, reticulopenia,
neutropenia e anormalidades eletrocardiográficas (REYBURN, 2010).
O uso desses fármacos em esquemas monoterápicos é desencorajado pela OMS,
que preconiza a terapia combinada denominada Terapia de Combinação baseada na
Artemisinina (TCA). Uma das razões é a meia-vida curta desses fármacos, responsável
pelas recidivas pós-tratamento. Além disso, a artemisinina e seus derivados não atuam
contra os esquizontes hepáticos, tão pouco atuam contra os hipnozoítos de P. vivax e P.
ovale. Outro fato relevante é desenvolvimento de resistência, muito comum em
esquemas monoterápicos (REYBURN, 2010). Os esquemas combinados recomendados
pela OMS estão apresentados na tabela 3.
32
Tabela 3 Terapia combinada baseada em artemisinina. World Health Organization. Guideline for the Treatments of Malaria, Genebra, WHO, 2010.
Esquema terapêutico Notas Formulações.
Arteméter-lumefantrina Formulação conjunta;
primeira linha de
tratamento em regiões com
Plasmodium multidroga
resistentes.
20 mg de arteméter mais
120 mg de lumefantrina.
Artesuntato-amodiaquina Formulação conjunta.
Malária não complicada
em regiões epidêmicas.
25/67,5 mg, 50/135 mg ou
100/270 mg.
Artesunato-mefloquina Formulação conjunta;
primeira linha de
tratamento em regiões com
Plasmodium multidroga
resistentes.
50mg de artesunato e 250
mg de mefloquina.
Di-hidroartemisinina-
piperaquina
Formulação conjunta;
primeira de terapia em
países do sudeste da Ásia.
40 mg de di-
hidroartemisinina e 320 de
piperaquina.
Artesunato-sulfadoxina-
pirimetamina.
Primeira linha de
tratamento em alguns
países.
50 mg de artesunato, 500
mg sulfadoxina e 25 mg
pirimetamina.
Artesunato- tetraciclina
ou doxyciclina ou
clindamicina
Segunda linha de
tratamento em alguns
países.
Sem formulações.
A artemisinina e seus derivados atuam inibindo a enzima adenosina cálcio
trifosfatase, PfATPase. Além disso, suspeita-se que a atividade antimalárica desses
fármacos inclui também a clivagem da ligação endoperóxido, na presença do íon
férrico. Quando essa ligação é quebrada, são liberadas formas reativas de radicais de
carbono que danificam biomoléculas importantes do parasito, incluindo proteínas e
fosfolipídios (O’NEILL; BARTON; WARD, 2010). Ao danificar os fosfolipídios da
membrana do Plasmodium, por exemplo, tais compostos poderiam afetar diferentes
33
estádios do ciclo de vida do parasito: formas assexuadas sanguíneas, esquizontes
hepáticos, oocistos e microgametócitos, como discutido anteriormente (WHITE, 1997).
A resistência à TCA é a mais temida pelos programas de erradicação da malária.
E, infelizmente, já foi confirmada em várias regiões. Recentemente, foi demonstrado
forte indício de resistência do P. falciparum ao artesunato usado como monoterápico e
combinado com mefloquina. Os ensaios foram conduzidos na fronteira da Tailândia
com o Camboja, em dois estudos randomizados. Os autores compararam a eficácia de
dois tratamentos para a malária não complicada por P. falciparum em duas localidades
vizinhas, uma situada no oeste do Camboja e a outra no nordeste da Tailândia. Os
resultados demonstraram que a susceptibilidade do P. falciparum ao artesunato está
reduzida na região do Camboja, quando comparada à Tailândia. Além disso, a
resistência ficou caracterizada pela baixa redução da parasitemia nos testes in vivo sem
ser acompanhada de redução nos testes susceptibilidade in vitro (DONDORP et al.,
2012). O surgimento de resistência à artemisinina e seus derivados é desastrosa para os
programas de controle da malária, pois são os mais eficientes fármacos antimaláricos
atualmente utilizados.
Cloroquina
Desde a década de 1940, a cloroquina tem sido utilizada como quimioterápico de
escolha, tanto para tratamento como para prevenção de todos os tipos de malária.
Entretanto, o surgimento de cepas resistentes de P. falciparum restringiu seu uso. A
cloroquina é uma 4-aminoquinolina, um sal de fosfato para uso oral. Ela apresenta alta
taxa de absorção, concentração plasmática máxima em poucas horas e é amplamente
distribuída aos tecidos (DE REVIERS, 2013). A cloroquina atua eficientemente contra
esquizontes sanguíneos e é moderamente gametocida para as espécies de P. vivax, P.
malariae e P. ovale. A sua ação, no entanto, não contempla as formas hipnozoítas
hepáticas e, portanto, não evita recidivas da malária (DE REVIERS, 2013).
O mecanismo de ação da cloroquina consiste na ligação do fármaco a hematina,
impedindo a detoxificação de radicais heme livres. Esse efeito provoca o acúmulo de
monômeros de heme que aumentam a permeabilidade da membrana, resultando na
morte do parasito (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). Atualmente, a
cloroquina é empregada também para o tratamento da artrite reumatoide, lúpus,
34
giardíase e hepatite amebiana. Apesar de ser um fármaco seguro, alguns de seus efeitos
tóxicos podem limitar seu uso em mulheres grávidas, idosos e crianças.
A cloroquina tem meia-vida em torno de 60 dias, por isso tem sido usada
também como quimioprofilático. A OMS recomenda a quimioprofilaxia em regiões nas
quais há maior risco de infecção em determinadas épocas do ano. Essa prática mantém
altas concentrações sanguíneas do fármaco, prevenindo os casos graves de malária
(WHO, 2014).
Os primeiros relatos de resistência à cloroquina vieram da fronteira Tailândia-
Camboja e da Colômbia. Suspeita-se que a resistência à cloroquina chegou até à África
via Sudeste da Ásia por volta de 1970. Além disso, é possível que a resistência tenha
emergido independentemente de focos em Papua Nova Guiné e das Filipinas
(PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O P. falciparum resistente à cloroquina
está presente em praticamente todas as regiões endêmicas e a resistência do P. vivax tem
aumentado ao longo dos anos. O mecanismo proposto para a resistência é uma mutação
no gene que codifica o transportador de cloroquina PfCRT, localizado na membrana do
vacúolo digestivo. A proteína mutante reduz significativamente o afluxo do fármaco
para o vacúolo, diminuindo seu efeito sobre o parasito (FIDOCK et al., 2000). Embora
tenha sido demonstrada a reversibilidade da resistência com uso de verapamil,
desipramina e clorfeniramina, a aplicabilidade clínica dessa estratégia não foi ainda
estabelecida (DE REVIERS, 2013).
A resistência à cloroquina é também atribuída ao gene que codifica o
transportador ABC PfMDR1, possivelmente envolvido na resistência à mefloquina,
lumefantrina, quinina e artemisinina. Foi demonstrado que a redução do número de
cópias desse gene, aumenta a susceptibilidade do P. falciparum a esses fármacos
(SIDHU, 2006). Recentemente, foi sugerido também que a presença da mutação do
gene para o PfCRT e do polimorfismo do gene ABC PfMDR1 existente P. falciparum
podem ser um fator de risco responsável pela redução da eficácia da terapia combinada
arteméter-lumefantrina e artesunato-amodioquina (VENKATESAN et al., 2014).
Amodiaquina e Piperaquina
Amodiaquina é também uma 4-aminoquinolina, semelhante à cloroquina e tem
sido usada por décadas contra a malária. Diferentemente da cloroquina, amodiaquina
35
tem meia-vida curta, em torno de 3 horas apenas. Por essa razão, sua ação antimalárica é
exercida pelo seu metabólito primário, monodesetilamodiaquina, que tem meia-vida
entre 9 a 18 dias (CHURCHILL et al., 1985). Os efeitos tóxicos da amodiaquina como
antimalárico têm sido debatidos ao longo dos anos. Agranulocitose, anemia aplástica e
hepatotóxicidade têm sido os efeitos mais comuns (NEFTEL; WOODTLY, 1986).
Além desses, outros efeitos colaterais tais como: vômitos, cefaleia e febre têm sido
relatados em esquemas únicos ou combinados. Entretanto, ambos os efeitos são dose-
dependente e são mais comuns em esquemas quimioprofiláticos do que em esquemas
terapêuticos (CAIRNS et al., 2010). A amodiaquina substitui muito bem a cloroquina
em regiões onde há relatos de P. falciparum resistente. Além disso, ela é mais barata e,
portanto, economicamente viável para muitos países pobres onde a malária é um sério
problema de saúde pública (HWANG et al., 2006).
A utilização mais frequente da amodiaquina é em esquemas combinados. A
OMS recomenda amodiaquina mais artesunato para tratar malária por P. falciparum
resistentes aos fármacos mais antigos, principalmente em países africanos. De fato, 17
países africanos utilizam esse esquema terapêutico como primeira ou segunda linha de
tratamento (REYBURN, 2010). Entretanto, tem sido sugerido o esquema terapêutico
amodiaquina mais sulfadoxina-piremetamina por ser mais vantajoso no que diz respeito
a maior disponibilidade dos fármacos, ao baixo custo e a maior familiaridade para os
médicos (HWANG et al., 2006).
O mecanismo de ação e de resistência da amodiaquina são os mesmos da
cloroquina. A resistência à amodiaquina e ao seu metabólito primário tem sido relatada
em vários países africanos, alertando às autoridades sobre o risco da utilização de
esquemas terapêuticos inadequados.
A piperaquina pertence à classe das quinolinas, sendo uma biquinolina de alta
atividade antimalárica. Testes clínicos realizados na China nos ano 1970 demonstram
que a piperaquina apresentava boa tolerância, efeitos colaterais leves, alta eficácia
profilática e rápida ação esquizonticida contra P. falciparum. Mais tarde, estudos
comprovaram que a piperaquina era também eficaz contra isolados de P. falciparum
resistentes à cloroquina. Imediatamente esse fármaco substituiu a cloroquina em muitas
regiões da China com resistência comprovada (BASCO; RINGWALD, 2003).
Infelizmente, a utilização da piperaquina em esquema monoterápico levou à seleção de
cepas resistentes de P. falciparum e seu uso foi descontinuado. Todavia, recentemente, a
36
utilização de piperaquina em terapia combinada com di-hidroartemisinina tem sido
fortemente recomendada para o tratamento da malária por P. falciparum resistente à
cloroquina (BASCO; RINGWALD, 2003; FIVELMAN; ADAGU; WARHURST,
2007).
Por ser uma quinolina o mecanismo de ação e de resistência são os mesmos da
cloroquina e da amodiaquina.
Quinina e quinidina
Quinina é um alcaloide extraído de uma árvore sul-americana denominada
Cinchona. É considerado o mais antigo antimalárico, sendo utilizada por nativos do
Peru por séculos. A quinina é usada atualmente para tratar casos graves de malária e
como segunda linha de tratamento em combinação com antibióticos para tratar malária
resistente (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A quinidina é um
estereoisômero dextrorrotatório da quinina de atividade antimalárica semelhante. Seu
uso é recomendado para tratamento de infecções graves por P. falciparum.
A quinina administrada por via oral apresenta alta taxa de absorção
gastrointestinal e alcança níveis plasmáticos elevados após poucas horas. Ela se
distribui amplamente nos tecidos, sendo metabolizada no fígado e excretada na urina. A
meia-vida da quinina varia entre 11 e 18 horas nos controles saudáveis e aqueles com
malária grave, respectivamente.
A quinidina tem meia-vida mais curta do que a quinina em razão da menor
afinidade com proteínas plasmáticas (DE REVIERS, 2013). Em ambos os casos, esse
fato contribui para menor resistência do Plasmodium a esses fármacos. Entretanto, já
existem relatos de resistência em algumas regiões do sudeste asiático, principalmente na
fronteira entre o Camboja e a Tailândia (LIM et al., 2013). Suspeita-se que o
mecanismo de ação da quinina e da quinidina seja semelhante ao da cloroquina, embora
ainda não tenha sido demonstrado. (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). Esses
fármacos atuam contra esquizontes sanguíneos, sendo efetivos contra as quatro espécies
de Plasmodium mais importantes que infectam humanos. Sua ação gametocida, no
entanto, restringe às espécies P. vivax e P. ovale. A quinina e quinidina também não são
efetivas contra os hipnozoítos hepáticos (DE REVIERS, 2013).
37
Embora o mecanismo de resistência à quinina seja complexo, há evidências
claras que três genes estejam envolvidos no processo: PfCRT e PfMDR1, mencionados
anteriormente e o PfNHE1, ambos codificadores de proteínas transportadoras
localizadas no vacúolo digestivo do parasito (PETERSEN; EASTMAN; LANZER,
2011). O aumento da frequência desses genes, e em particular do polimorfismo do gene
PfNHE1 nas diferentes regiões malarígenas pode comprometer seriamente o futuro da
terapia contra a malária (MÉNARD et al., 2013).
Mefloquina
Quimicamente relacionada com a quinina, a mefloquina é uma 4-quinolina
metanol efetiva contra cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina. Ela também é o
fármaco de escolha na quimioprofilaxia de todas as espécies de Plasmodium, apesar de
seus fortes efeitos tóxicos. A administração parenteral da mefloquina não é
recomendada devido à grave irritação local, restringindo sua administração a
comprimidos orais. A mefloquina apresenta alta taxa de absorção intestinal, alcançando
concentrações plasmáticas efetivas em poucas horas. Ela apresenta alta afinidade por
proteínas plasmáticas, distribuindo-se rapidamente pelos tecidos corporais. Por
apresentar baixa taxa de excreção e meia-vida longa (18-20 dias), a mefloquina é
administrada em dose única que varia entre 62,5 mg a 250 mg, dependendo da idade e
da massa corporal do paciente. Essas características farmacológicas fazem da
mefloquina o fármaco quimioprofilático de escolha (DE REVIERS, 2013).
A mefloquina tem forte ação esquizonticida, mas não atua contra gametócitos e
formas dormentes hepáticas. Por essa razão, é recomendada a administração posterior
de primaquina para evitar recidivas (WHO, 2014). Embora o mecanismo de ação da
mefloquina não esteja completamente esclarecido, há evidências de que ela se liga ao
grupo heme no vacúolo digestivo e inibe o mecanismo de detoxificação do parasito.
A resistência à mefloquina está associada ao gene PfMDR1, que codifica a
proteína Pghl localizada na membrana do vacúolo digestivo do P. falciparum. Essa
proteína diminui o efluxo da mefloquina para interior do vacúolo digestivo, impedindo
o encontro do fármaco com seu alvo. A amplificação e superexpressão desse gene têm
sido apontadas como as causas de falhas no tratamento e da resistência in vitro do P.
falciparum à mefloquina (COWMAN; GALATIS; THOMPSON, 1994).
38
Recentemente, foi demonstrado que a amplificação do gene MDR1 também ocorre em
P. vivax (KHIM; ANDRIANARANJAKA, 2014). Esses autores apresentaram também
dados epidemiológicos que confirmam que a amplificação do gene PvMDR1 é menos
frequente nas regiões onde a mefloquina nunca foi utilizada (Mandagascar e Sudão) do
aquelas nas quais (Camboja e Guiana Francesa) a mefloquina foi ou ainda é utilizada
para tratamento ou como quimioprofilático (KHIM; ANDRIANARANJAKA, 2014).
Primaquina
A primaquina é utilizada como quimioprofilático e atua eficientemente contra os
hipnozoítos hepáticos de P. vivax e P. ovale, sendo o único fármaco aprovado para esse
fim. É uma 8-aminoquinolina sintética com boa absorção intestinal, atingindo
concentração plasmática máxima em 1 a 2 horas, mas com meia-vida de 3 a 8 horas
apenas (DE REVIERS, 2013). A primaquina atua contra esquizontes teciduais e
gametócitos das quatro espécies de Plasmodium, mas é pouco efetiva contra as formas
assexuadas sanguíneas. O uso de primaquina, no entanto, não é recomendado para
pacientes com deficiência de G6PD, glicose-6-fosfato desidrogenase, devido ao risco de
anemia hemolítica severa (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A prevalência
desse fenótipo varia muito nas diferentes regiões de malária endêmica. Por essa razão, a
OMS recomenda o teste de deficiência da G6PD antes da terapia com primaquina
(WHO, 2014).
O mecanismo de ação da primaquina é desconhecido, porém há evidências que
esse fármaco se liga ao PfCRT e inibe o transporte de cloroquina, levando a ação
sinérgica dos dois antimaláricos e à reversão da resistência à cloroquina (PETERSEN;
EASTMAN; LANZER, 2011).
A resistência de esquizontes sanguíneos ao fármaco é de pouca importância
clínica devido a sua fraca atuação contra essas formas. No entanto, a resistência de
esquizontes hepáticos, que poderia produzir prejuízos para terapia da malária, não tem
sido seriamente detectada por mais de 50 anos de uso da primaquina (BAIRD;
HOFFMAN, 2004). Tal fato pode estar relacionado à curta meia-vida ou à ação
gametocida do fármaco. Além disso, relatos de resistência ao fármaco podem estar
relacionados à ausência de uma melhor análise dos fatores de confundimento, tais como
êmese da dose, inadequação da terapia prescrita, tolerância do parasito, resistência à
39
cloroquina e reinfecção (BAIRD; HOFFMAN, 2004). Embora seja um assunto
controverso, a resistência do P. vivax à primaquina foi relatada na Nova Guiné, no
sudeste da Ásia e nas Américas Central e do Sul (KRUDSOOD; TANGPUKDEE,
2008; PHILLIPS; KEYSTONE; KAIN, 1996). Por esse razão, as doses usualmente
empregadas para erradicar os hipnozoítos hepáticos tiveram que ser ajustadas. Assim,
atualmente é empregada a dose de 30 mg (padrão 15mg) por dia, por um período de 14
dias.
Para tratamento da malária por P. vivax não complicada emprega-se a cloroquina
combinada com primaquina, para infecções por cepas sensíveis à cloroquina. A
cloroquina elimina as formas sanguíneas e a primaquina mata os esquizontes hepáticos.
Nas regiões onde a prevalência da deficiência de G6PD é moderada, emprega-se dose
de 0,75mg/kg de massa corporal, dada uma vez por semana, durante 8 semanas. Nos
casos de deficiência severa de G6PD a primaquina não é recomendada (REYBURN,
2010). Nas regiões onde é adotada a terapia di-hidroartemisinina mais piperaquina como
primeira linha de tratamento para P. falciparum, pode também ser usada para malária
por P. vivax a combinação com primaquina para a cura radical (REYBURN, 2010).
Sutanto et al (2013) sugeriram a terapia di-hidroartemisina mais piperaquina-
primaquina por apresentar maior tolerabilidade, maior eficácia e maior segurança do
que aquela que emprega a cloroquina (SUTANTO et al., 2013).
Atovaquona
Atovaquona é um análogo da hidroxinaftoquinona estruturalmente relacionado
ao ubiquinol. Embora tenha sido desenvolvido como antimalárico, ela atua também
contra outros parasitos apicomplexa, incluindo Toxoplasma, Theileria e Babesia
(PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). A atovaquona é administrada por via oral,
tem baixa absorção intestinal, mas possui boa afinidade pelas proteínas plasmáticas e
meia-vida de dois a três dias. Devido a seu caráter lipofílico é recomendado que a
administração da atovaquona seja concomitante com o alimento, preferencialmente
gordurosos (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). Ela é excretada principalmente
nas fezes, na forma de fármaco inalterado. Ela atua contra as formas assexuadas
sanguíneas, hepáticas e contra o desenvolvimento dos oocistos no mosquito. O
mecanismo de ação consiste na ligação com o citocromo c, interrompendo a cadeia
40
transportadora de elétrons (DE REVIERS, 2013; PETERSEN; EASTMAN; LANZER,
2011). A atovaquona é um fármaco bem tolerado, embora febre, cefaleia, insônia,
náusea, diarreia e vômitos sejam os efeitos colaterais recorrentes da terapia
(REYBURN, 2010). Recentemente, uma hidroxinaftoquinona sintética denominada N3,
mostrou alta atividade in vitro para P. falciparum e limitada toxidade para células
humanas (SCHUCK et al., 2013).
O uso da atovaquona como monoterápico não é recomendado em razão de sua
baixa eficácia. Entretanto, o efeito combinado da atovaquona com proguanila sobre P.
falciparum é altamente efetiva, tanto para o tratamento como para profilaxia. O uso
como profilático apresenta vantagem em relação à mefloquina devido ao curto período
de tratamento ao qual o indivíduo se submete ao viajar para regiões não endêmicas. Por
outro lado, o maior custo e a facilidade de desenvolver resistência são pontos negativos
da terapia (DE REVIERS, 2013; PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011).
A resistência do P. falciparum à atovaquona está relacionada a polimorfismo de
nucleotídeo único, snp (single nucleotide polymorphism) do gene que codifica o
citocromo b (PfCYTB), alvo molecular da atovaquona. A monoterapia com atovaquona
apresenta uma das mais altas taxas de indução de resistência durante o tratamento, com
a recrudescência para P. falciparum variando entre 30 a 40%. Essa tem sido uma das
razões pelas quais a atovaquona é administrada com proguanila (PLUCINSKI et al.,
2014).
Inibidores do folato
Sulfadoxina, dapsona, pirimetamina e proguanila são fármacos antifolatos
usados na terapia da malária. Os dois primeiros inibem a enzima di-hidropteroato
sintetase de P. falciparum, codificada pelo gene PfDHPS, enquanto que os dois últimos
inibem a enzima di-hidrofolato redutase, codificada pelo gene PfDHFR. A enzima di-
hidropteroato sintetase é necessária para a conversão do PABA a ácido fólico. Como o
ácido fólico é essencial para síntese, reparo e metilação do DNA do P. falciparum, a
falta desse nutriente dificulta a reprodução do parasito (PETERSEN; EASTMAN;
LANZER, 2011). O ácido fólico (ácido di-hidrofólico), formado na reação anterior, é
substrato da enzima di-hidrofolato redutase, que o converte em ácido tetra-hidrofólico.
41
Essa molécula, por sua vez, é precursora das bases nitrogenadas purinas e pirimidinas
(PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011).
A combinação sulfadoxina mais pirimetamina foi introduzida na terapia da
malária após o advento da resistência à cloroquina. As características farmacológicas
das sulfadoxina, incluindo absorção, ligação à proteína, distribuição, excreção e
toxidade não estão disponíveis nos melhores compêndios de Farmacologia (DE
REVIERS, 2013) ou bancos de fármacos (LAW et al., 2014)
A pirimetamina pertence à classe das diazinas e subclasse pirimidina. Ela tem
boa absorção intestinal, alta taxa de ligação às proteínas plasmáticas, metabolismo
hepático e meia via de aproximadamente 4 horas. A pirimetamina e sulfadoxina agem
sinergicamente contra as formas evolutivas do Plasmodium. A pirimetamina atua contra
esquizontes sanguíneos e fracamente contra os gametócitos e esquizontes hepáticos. Já a
sulfadoxina é pouco efetiva contra as formas sanguíneas, mas atua eficazmente contra
os esquizontes hepáticos e gametócitos (DE REVIERS, 2013). A combinação foi
considerada altamente efetiva contra P.falciparum resistente à cloroquina. Por ser uma
combinação barata, bem tolerada e administrada em dose única, a pirimetamina-
sulfadoxina deveria ter se tornado uma combinação perfeita para terapia da malária.
Entretanto, o surgimento de casos de resistência em várias regiões restringiu bastante o
seu uso (EMÍLIA et al., 2007; PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011).
A resistência aos antifolatos está relacionada às mutações nos genes PfDHPS e
PfDHFR, citados anteriormente. Ela ocorre em razão do acúmulo do polimorfismo de
nucleotídeo único nesses genes. No gene PfDHFR ocorre três mutações pontuais
envolvendo os códons 51, 59 e 108, conhecidas como DHFR triplo. Já no gene PfDHPS
ocorrem duas mutações nos códons 437 e 540, conhecida como DHPS duplo. Em
conjunto, elas são conhecidas como mutação quíntupla e estão fortemente associadas
com a resistência in vivo e in vitro à pirimetamina-sulfadoxina bem como a resistência
clínica a esses fármacos na África e na Ásia (EMÍLIA et al., 2007; RAMAN et al.,
2010).
A proguanila é um derivado da biguanida metabolizada no fígado pela enzima
citocromo C 450 a seu metabólito ativo cicloguanila. Administrado oralmente na forma
de sal hidroclorídrico, atinge níveis plasmáticos máximos em 5 horas. Ela tem meia-
vida de 16 horas, por isso quando utilizada como profilático deve ser administrada
diariamente. Aproximadamente 50% do fármaco é excretado na urina, dos quais 60%
42
são eliminados como fármaco inalterado e 30% na forma cicloguanila e o restante é
perdido nas fezes. A cicloguanila atua contra formas sanguíneas e hepáticas, incluindo
esporozoítos e gametócitos. Na terapia convencional, a proguanila é administrada em
associação com a atovaquona, com a qual tem efeito sinérgico. Como os antimaláricos
em geral, a proguanila não é administrada em esquemas monoterápico por desenvolver
resistência rapidamente. (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010). A resistência está
relacionada à mutação do gene PfDHFR, o mesmo que confere resistência a
pirimetamina .
Halofantrina e lumefantrina
A halofantrina é um fenantreno metanol administrada na forma de cloridrato de
halofantrina. Ela tem absorção intestinal variável, atinge níveis plasmáticos máximos
em 16 horas, e tem meia-vida de quatro dias (DE REVIERS, 2013). A excreção ocorre
principalmente pelas fezes. Suspeita-se que o mecanismo de ação seja o mesmo da
mefloquina e quinina, sendo efetiva apenas contra as formas assexuadas sanguíneas. A
halofantrina é efetiva contra a maioria das cepas de P. falciparum, embora seu uso seja
limitado em razão da absorção irregular e toxicidade cardíaca (REYBURN, 2010).
Apesar de ser um fármaco bem tolerado, é comum observar no paciente: dor
abdominal, vômito, diarreia, tosse e exantema. Os efeitos tóxicos mais graves são dose-
dependente e incluem arritmias, que podem levar à morte. Ela é contraindicada para
pacientes que receberam mefloquina e para gestantes (REYBURN, 2010).
A lumefantrina é um aril álcool, semelhante à halofantrina, mefloquina e
quinina, com os quais compartilha o mesmo mecanismo de ação. Ela está disponível
apenas em preparações orais em associação com arteméter, sendo usada eficazmente
contra P. falciparum multidroga resistente (REYBURN, 2010). A absorção da
lumefantrina é variável, mas é aumentada pela ingestão de alimentos gordurosos. A
concentração plasmática máxima é alcançada em 10 horas e o fármaco tem meia-vida
terminal de três a cinco dias. Embora seja semelhante com halofantrina, a lumefantrina
não provoca alterações cardíacas, tão pouco produz efeitos tóxicos significativos. Ela é
bem tolerada e os efeitos colaterais mais comuns são: cefaleia, náuseas, desconforto
abdominal e tonturas (DE REVIERS, 2013).
43
Dois fatores são comumente relacionados à redução da eficácia ao lumefantrina
na África e na Ásia: o polimorfismo do PfMDR1, principalmente a variante N86 e
amplificação do gene pfMDR1 (PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). O
polimorfismo de nucleotídeo único do PfMDR1 resulta na substituição de aminoácidos
na posição 86 (N86Y), 184 (Y184F) e 1246 (D1246Y) e estão relacionados a resistência
da maioria dos antimaláricos, incluindo a terapia combinada baseada em artemisinina.
Recentemente, foi demonstrado que a implementação da combinação lumefandrina-
arteméter como primeira linha de tratamento para P. falciparum na África aumentou a
prevalência da variante N86, incluindo o mutante 184F e do haplótipo triplo N86-184F-
D1246, considerados marcadores moleculares importantes de resistência à terapia
combinada baseada em artemisinina (LOBO et al., 2014). Além disso, ensaios de
campo, in vitro e in vivo sugeriram que a presença do gene selvagem PfCRT em
isolados e cepas de P. falciparum tem sido responsável por falhas no tratamento com
lumefantrina (SISOWATH et al., 2009).
Tetraciclina
As tetraciclinas são antibióticos produzidos por bactérias do gênero
Streptomyces. Na prática clínica são utilizados derivados sintéticos em formulações
orais ou intravenosas, na forma de cloridrato ou fosfatos, ambas solúveis em água. As
tetraciclinas são bacteriostáticos que inibem a síntese proteica, ligando-se ao aminoacil-
RNA. Nesse contexto, elas têm sido usadas para tratar infecções causadas por
Chlamydia, Rickettsia, Mycoplasma, Brucella, Vibrio cholerae. A doxiciclina é um
derivado sintético de meia-vida longa (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010)
Absorção das tetraciclinas é relativamente alta, variando entre 60 a 80% da dose
ingerida. No entanto, a absorção e a atividade do fármaco podem ser comprometidas em
razão da capacidade de quelar íons metálicos bivalentes (DE REVIERS, 2013). Por isso
certos alimentos, incluindo leite podem prejudicar a absorção do fármaco. Por outro, as
formulações em fosfato têm melhor absorção (DE REVIERS, 2013; REYBURN, 2010).
Após absorção, as tetraciclinas apresentam concentração plasmática máxima entre uma
e três horas, taxa de ligação às proteínas em torno de 65% e meia-vida de 8 horas. A
excreção ocorre principalmente pela urina e o restante via secreção biliar e fezes
(REYBURN, 2010).
44
Os efeitos colaterais mais comuns das tetraciclinas são: náusea, vômito e
diarreia. Outras reações tóxicas também são relatadas, tais como boca seca, glossite,
estomatites, disfagia e ulcerações esofágicas. Além disso, as tetraciclinas interferem
com metabolismo do cálcio nos ossos e dentes, comprometendo a formação dessas
estruturas em recém-nascidos e crianças. Por essa razão, as tetraciclinas não são
recomendadas para gestantes, lactantes e crianças menores de oito anos (DE REVIERS,
2013; REYBURN, 2010).
Tetraciclina e doxiciclina são ativas contra as formas assexuadas sanguíneas de
todas as espécies de Plasmodium humana. As combinações recomendadas pela OMS
são: artesunato mais tetraciclina (ou doxiciclina ou clindamicina) e quinina mais
tetraciclina (ou doxiciclina ou clindamicina) usadas como segunda linha de tratamento
da malária não complicada por P. facliparum (REYBURN, 2010). Em 2011, a FDA
aprovou uso de doxiciclina como quimioprofilático para malária por P. falciparum. Ela
é recomendada para viajantes que permanecem por um período de até quatro meses em
regiões onde o P. falciparum é resistente à cloroquina ou pirimetamina-suldoxina (TAN
et al., 2011).
Existem evidências que esses fármacos se ligam à subunidade 16S do RNA
ribossômico do apicoplasto, bloqueando a expressão de seu genoma, resultando na
distribuição de apicoplastos não funcionais aos merozoítos filhos (DAHL et al., 2006).
45
1.3.5 O apicoplasto e terapia antimalárica
Plastídeos são organelas encontradas em plantas e algas, podendo ser verdes,
vermelhos, amarelos, marrons ou incolores. Os plastídeos coloridos participam do
processo fotossintético por conter pigmentos de clorofila ou carotenoides, enquanto que
os incolores são de reserva energética (MCFADDEN; ROOS, 1999). Essas organelas se
originaram a partir da endossimbiose entre um eucarioto não fotossintetizante e
procariotos semelhantes às cianobactérias atuais. As evidências que corroboram essas
suspeitas são: existência membranas duplas, DNA próprio e sistemas transcricionais e
traducionais independentes (MCFADDEN; ROOS, 1999).
Embora houvesse suspeitas da existência de plastídeos em parasitas humanos, a
evidência mais clara foi demonstrada em 1996 por McFadden et al (MCFADDEN et al.,
1996). Esses autores demonstraram que um DNA circular de 35 kb encontrado em P.
falciparum e Toxoplasma gondii pertencia a uma outra organela, que não a mitocôndria.
Eles descreveram nesses organismos uma estrutura ovoide, situada anteriormente ao
núcleo, com duas ou mais membranas e capacidade de replicação (MCFADDEN et al.,
1996). Mais tarde, essa organela foi reconhecida como um plastídeo e denominada
apicoplasto, por ser encontrada em todos os protozoários do filo Apicomplexa, exceto
Criptosporidium spp (MCFADDEN; ROOS, 1999; MCFADDEN, 2011). O
apicoplasto, diferente dos demais plastídeos, originou-se por endossimbiose secundária,
que consiste na transferência lateral entre inúmeros eucariotos durante o curso da
evolução. Nesse processo, o endossimbionte primário contendo o plastídeo é englobado
e mantido por outros eucariotos sem plastídeos (figura 9) (MCFADDEN; ROOS,
1999).
46
Figura 9 Esquema para a origem de todos os plastídeos por endossimbiose primária e secundária. Uma única endossimbiose entre um eucariótico heterotrófico desconhecido (cinza) e uma cianobactéria levou às três linhagens de plastídeos de origem primária (topo). Dois eventos de endossimbiose secundária envolvendo duas diferentes algas verdes e hospedeiros não relacionados levaram aos euglenídeos (azul) e cloraraquiniófitos (amarelo). Uma única endossimbiose entre uma alga vermelha e um hospedeiro heterotrófico levou a todas as algas eucarióticas remanescentes (púrpura). Perda da fotossíntese é comum em muitos dessas linhagens e, nos ciliados, a linhagem inteira não fotossintetizante. Nessas linhagens é desconhecido se os plastídeos se perderam ou se plastídeos ocultos permaneceram. Baseado em Archibald e Keeling (2002).
A evidência da ocorrência de endossimbiose secundária é corroborada pela
existência de quatro membranas, ao invés de duas resultantes da endossimbiose
primária. Todavia, a controvérsia mais difícil de resolver foi a origem do eucarioto
doador do plastídeo (MCFADDEN, 2011). Alguns autores defendiam a origem a partir
47
de uma alga verde (FUNES; DAVIDSON; REYES-PRIETO, 2002), enquanto outros
apostavam na endossimbiose de uma alga vermelha (WALLER et al., 2003). Estudos
realizados com Chromera velia, fotossintetizante unicelular que vive em corais, deram
fim a controvérsia (MOORE et al., 2008). A C. velia pertence ao reino
Chromoalveolata, superfilo Alveolata aos quais pertencem também os apicomplexas e
os dinoflagelados. Esses organismos têm um plastídeo fotossintético envolvido por
quatro membranas, derivado de uma alga vermelha (MCFADDEN, 2011; MOORE et
al., 2008). Foi demonstrado que o plastídeo de C. velia, o apicoplasto e o plastídeo dos
dinoflagelados compartilham o mesmo ancestral (JANOUSKOVEC et al., 2010).
Assim, o apicoplasto é resultado do englobamento de uma alga vermelha adquirida
antes dos apicomplexas e dinoflagelados se divergirem (figura 9) (JANOUSKOVEC et
al., 2010).
As funções do apicoplasto não foram ainda completamente esclarecidas.
Todavia, algumas vias metabólicas têm sido propostas e outras confirmadas, tais como:
biossíntese de ácidos graxos e de isoprenoides, síntese do heme para respiração
mitocondrial e produção de aminoácidos aromáticos (MCFADDEN; ROOS, 1999;
MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). Sejam quais forem as funções dessa
organela, o apicoplasto é indispensável para reprodução e sobrevivência do P.
falciparum (MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004). Interferência farmacológica ou
genética no apicoplasto provoca a morte do parasito (MCFADDEN, 2011; RALPH et
al., 2004). Essencialmente, o apicoplasto é uma bactéria dentro de um protozoário. Por
essa razão, vários antibióticos, tais como tetraciclina, doxiciclina e clindamicina são
efetivos contra os parasitos da malária. O mecanismo de ação desses fármacos
permaneceu desconhecido por muito tempo. Atualmente, sabe-se que esses fármacos
bloqueiam a expressão do genoma do apicoplasto, resultando em parasitos com
apicoplastos inativos (DAHL et al., 2006).
Em razão de sua origem e peculiaridades metabólicas, essa organela tem se
tornado alvo promissor para identificação, desenho e produção de novos fármacos
antimaláricos específicos. Tais fármacos poderiam interferir no metabolismo do P.
falciparum sem causar efeitos tóxicos em humanos. Os alvos metabólicos mais visados
no apicoplasto são a replicação do DNA, a transcrição e processamento do RNA, a
tradução, síntese de ácidos graxos e biossíntese de isoprenoides (MCFADDEN; ROOS,
1999; MCFADDEN, 2011; RALPH et al., 2004).
48
1.4 O reposicionamento in silico de fármacos para as leishmanioses e malária
A terapêutica das leishmanioses e da malária tem enfrentado graves obstáculos,
incluindo a baixa eficácia dos fármacos, a resistência dos parasitos e o alto custo dos
fármacos mais efetivos (NWAKA; HUDSON, 2006). Sendo assim, é urgente a
necessidade de melhorar os fármacos existentes e desenvolver novos fármacos que
garantam a continuidade dos programas de controle dessas endemias.
O processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos, em geral, é lento e
muito caro (ADAMS; BRANTNER, 2006). Visando diminuir os custos e o prazo para o
licenciamento de novos fármacos, bem como melhorar sua segurança e eficiência, as
indústrias farmacêuticas e centros de pesquisa acadêmicos têm adotado a estratégia de
reposicionamento de “velhos” fármacos, dando-lhes outras aplicações (OPREA;
MESTRES, 2012; OPREA et al., 2011). A tabela 4 sumariza alguns fármacos já
reposicionados. O reposicionamento é vantajoso porque tais fármacos já estão
aprovados e, em geral, seus aspectos farmacocinéticos e farmacodinâmicos já são
conhecidos.
No que diz respeito às doenças tropicais negligenciadas o interesse das indústrias
farmacêuticas em produzir novos fármacos é menor ainda. Elas alegam que o custo para
pesquisar e desenvolver novos fármacos é alto e a recuperação do investimento e a
lucratividade são de longo prazo (EKINS et al., 2011). Nos últimos anos, entretanto,
grandes indústrias farmacêuticas, bem como a OMS têm investido milhões de dólares
no reposicionamento de fármacos para tratar doenças parasitárias (EKINS et al., 2011).
Em muitos casos, a descoberta do novo uso de um fármaco ocorreu de modo
fortuito ou inesperado. Os exemplos mais conhecidos são a talidomida, sildenafila
(viagra) , bupropiona e a fluoxetina, que atualmente apresentam novas aplicações além
daquelas para as quais foram originalmente aprovados (EKINS; WILLIAMS, 2011;
SARDANA et al., 2011). Entretanto, a farmacologia tem usado cada vez mais
ferramentas computacionais para reposicionar fármacos e utilizá-los para o tratamento
de diferentes doenças (BRAGA et al., 2014).
49
Tabela 4 Fármacos reposicionados com êxito para novas indicações.
Fármaco Indicação original Nova Indicação
Amantadina Influenza Doença de Parkinson
Anfotericina B Infecções fúngicas Leishmaniose
Aspirina Dor e inflamação Antiplaquetário
Atomoxetina Antidepressivo Déficit de atenção e hiperatividade
Bromocriptina Doença de Parkinson Diabetes mellitus
Bupropiona Depressão Antitabagismo
Colchicina Gota Pericardites recorrentes
Gabapentina Epilepsia Dor neuropática
Metotrexato Câncer Artrite reumatoide, Psoríase
Miltefosina Câncer Leishmaniose
Propranolol Hipertensão Profilaxia da enxaqueca
Ácido retinoico Acne Leucemia promielocítica aguda
Ropinirole Doença de Parkinson Síndrome das pernas inquietas
Zidovudine Câncer HIV/AIDS
Adaptada de Padhy e Gupta, 2011.
A ciência farmacológica sempre dependeu da realização de testes in vitro e in
vivo para descobrir e desenvolver novos fármacos. No entanto, com o avanço da
bioinformática essas atividades foram complementadas pela análise in silico. Assim,
nasceu a farmacologia computacional, terapêutica computacional ou farmacologia in
silico (EKINS; MESTRES; TESTA, 2007). A estratégia in silico utiliza softwares que
capturam, analisam e integram dados biológicos e médicos disponíveis nas variadas
bases de dados de acesso livre da internet ou de outras fontes. Utilizando essa
abordagem é possível construir modelos tridimensionais virtuais ou simulações que
50
permitem ao pesquisador fazer previsões, sugerir hipótese e contribuir para o avanço na
área médica e farmacêutica, incluindo o reposicionamento de fármacos (ANDRADE;
BRAGA, 2014; EKINS; MESTRES; TESTA, 2007).
A bioinformática é considerada ferramenta crucial para a análise genética e
bioquímica com vistas à descoberta, desenho e validação de novos fármacos contra
diversos patógenos. Utilizando essa ciência é possível tornar mais rápido o processo de
descoberta de novos fármacos, identificando os melhores alvos e simulando
virtualmente a interação entre o fármaco e seu alvo (BRAGA et al., 2014; EKINS;
MESTRES; TESTA, 2007). Além disso, é possível identificar um inibidor específico de
uma molécula chave realizando uma busca nas bases de dados de fármacos existentes na
internet, tais como Drug Bank e Therapeutic Targets. Essas bases de dados
disponibilizam milhares de compostos aprovados ou em fase de testes e os alvos
correspondentes ou hipotéticos. A natureza química do alvo pode ser um lipídio, um
carboidrato ou ácido nucléico, todavia os melhores alvos são aqueles de natureza
proteica (OVERINGTON; AL-LAZIKANI; HOPKINS, 2006). A proteína, por sua vez,
pode ser um receptor, um canal ou uma enzima.
O conhecimento de genômica e de metabolômica de parasitos de interesse
médico aumentou muito, fornecendo enorme número de moléculas que podem ser
usadas como alvos quimioterápicos. O desafio da bioinformática é reduzir esse número
e criar uma lista menor de alvos que são essenciais para sobrevivência do estádio do
parasito que causa a doença em humanos (CROWTHER et al., 2010; MAGARIÑOS et
al., 2012). Além disso, é possível comparar as sequências por alinhamento e verificar a
semelhança entre o alvo desejado e o peptídeo correspondente presente no hospedeiro.
Essa busca por similaridade do alvo permite identificar novos usos para velhos
fármacos (OPREA; MESTRES, 2012).
Vários parasitos de interesse médico já tiveram seus genomas sequenciados,
incluindo Trypanosoma cruzi, Plasmodium spp, Leishmania spp, Schistosoma mansoni,
dentre outros. As informações moleculares sobre esses parasitos encontram-se
disponíveis em bases de dados online. Acessando essas bases de dados é possível
identificar o gene de interesse, o peptídeo correspondente, a via metabólica envolvida e
compará-los com outros organismos. A partir daí é possível simular a ação de
inibidores, desenhar novo inibidor ou reposicionar um fármaco (BRAGA et al., 2014;
MAGARIÑOS et al., 2012).
51
O processo de investigação de novos fármacos é altamente complexo e
dispendioso que demandam esforços integrados em muitos aspectos importantes
envolvendo inovação, conhecimento, informação e tecnologia. Por isso, compensa
realizar a análise in silico de proteínas-chaves, como as enzimas do metabolismo
energético e do metabolismo do apicoplasto que possam ser alvos de inibidores
seletivos. Essa análise considera essencialidade, drogabilidade, ensaiabilidade,
especificidade/seletividade e importância para o estádio do ciclo de vida do patógeno de
relevância para a saúde humana (CROWTHER et al., 2010).
52
2 JUSTIFICATIVA
As leishmanioses e a malária são graves problemas de saúde pública em dezenas
de países, incluindo o Brasil. Juntas, essas parasitoses são responsáveis por milhões de
casos, que resultam em deformações, incapacitações e mortes (HOTEZ et al., 2014;
WHO, 2014). Infelizmente, a quimioterapia é praticamente a única forma efetiva de
reduzir a morbidade e a mortalidades provocadas por essas parasitoses. Todavia, o alto
custo, a toxicidade e especialmente a resistência dos parasitos aos principais fármacos
têm sido os maiores desafios enfrentados pela quimioterapia dessas parasitoses
(NWAKA; HUDSON, 2006).
Diante disso, é urgente a necessidade de se desenvolver novos fármacos que
contornem esses problemas. Entretanto, as indústrias farmacêuticas não tem interesse
em investir na pesquisa e na produção de novos fármacos porque os custos são elevados
e o retorno é pouco significativo (ASHBURN; THOR, 2004).
Assim, o reposicionamento de fármacos tem se mostrado uma estratégia valiosa
no sentido de diminuir o tempo e os custos para desenvolvimento de novos fármacos.
No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de reposicionamento in silico que
consiste na busca de fármacos aprovados os quais atuam seletivamente sobre alvos
específicos do metabolismo energético de Leishmania spp e do metabolismo do
apicoplasto de Plasmodium falciparum.
A busca por tais fármacos é mediada por excelência devido à existência de bases
de dados sobre fármacos que disponibilizam ferramentas que permitem encontrar
inibidores baseados na similaridade dos alvos. As bases de dados Therapeutic Targets
(TT), Drug Bank, STITCH e PubChem disponibilizam mais de 28 mil fármacos, sendo
que quase quatro mil são aprovados para uso em humanos. Além disso, essas bases de
dados fornecem informações sobre os alvos, os testes realizados, a toxicidade e outros
dados farmacológicos.
53
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Identificar fármacos aprovados que atuam contra enzimas do metabolismo
energético de Leishmania spp e contra alvos moleculares do metabolismo do
apicoplasto de P. falciparum por meio de uma busca sistemática em bases de dados
sobre fármacos disponíveis.
3.2 Específicos
Identificar na base de dados TDR Targets cada um dos genes
codificadores das enzimas do metabolismo energético, usando como
referência o genoma de Leishmania major;
Obter na base de dados TriTrypDB a sequência peptídica de cada uma
das enzimas do metabolismo energético;
Identificar fármacos anti-leishmania aprovados nas bases de dados
DrugBank e TTD por similaridade do alvo;
Identificar na base dados Gene DB os genes envolvidos no metabolismo
geral do apicoplasto de Plasmodium falciparum;
Obter na base de dados Gene DB e PlasmoDB a sequência peptídica de
cada das proteínas codificadas pelo genoma do apicoplasto;
Buscar nas bases de dados DrugBank, TTD e STITCH fármacos
aprovados que atuam especificamente no apicoplasto de P. falciparum;
Buscar informações adicionais sobre os fármacos aprovados na base de
dados Pubchem.
54
4 MÉTODO(S)
4.1 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo energético de Leishmania
A lista dos alvos hipotéticos foi obtida a partir da base de dados TDR Targets
(http://tdrtargets.org). A base de dados TDR Targets é um projeto da Organização
Mundial da Saúde que prioriza doenças tropicais negligenciadas. Seus dados são de
livre acesso e fornecem informações genômicas de espécies específicas que permitem
ao usuário identificar e priorizar alvos de interesse (ASLETT et al., 2010;
MAGARIÑOS et al., 2012). Na página inicial selecionamos targets, em seguida, na
primeira aba, selecionamos o patógeno de interesse, L. major. Na aba seguinte, foram
fornecidos filtros baseados em: Name/Annotation, Features, Structures, Expression,
Antigenicity, Phylogenetic distribution, Essentiality, Validation data, Druggability,
Assayability e Bibliographic references. Entretanto, limitamos os filtros para aumentar a
chance de nossa busca retornar resultado esperados. Mesmo assim, nem todos os genes
relacionados ao metabolismo energético foram identificados nessa base de dados. Desse
modo, abrimos a aba Name/Annotation e selecionamos em KEGG high-level pathway a
nossa via metabólica de interesse: metabolismo energético. Em seguida abrimos o filtro
Druggability e selecionamos Druggability index ≥ 0,2 (varia de 0 a 1). A página salvou
automaticamente a pesquisa em my history e disponibilizou os dados em uma tabela
para upload.
Utilizando o nome de cada gene obtido na base de dados TDR Targets,
interrogamos a base de dados TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/). Essa base de
dados integra informações genômicas de patógenos da família Trypanosomatidae que
incluem os gêneros Leishmania e Trypanosoma (WISHART et al., 2006). Na página
inicial da TriTrypDB inserimos o nome do gene na caixa Gene ID e clicamos em
search. Conferimos nome e produto de cada gene e extraímos a sequência peptídica
prevista para cada um deles. Nos casos em que o gene codificador de uma enzima
conhecida não fora identificado pela base de dados TDR Targets a busca era feita com o
nome da enzima inserido na caixa Gene Text Search. Cada um dos peptídeos previstos
de Leishmania foi tratado como potencial alvo e sua sequência foi usada para interrogar
duas bases de dados disponíveis na internet que nos forneceram informações básicas
55
sobre os fármacos, seus alvos primários ou hipotéticos: DrugBank (www.drugbank.ca/),
Therapeutic Target Database (bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp).
A base de dados DrugBank é de livre acesso e oferece aos seus usuários
informações sobre fármacos (química, farmacêutica e farmacológica) e seus alvos
(sequência, estrutura e via metabólica). Atualmente base contém, aproximadamente,
8.000 fármacos, incluindo 1.700 aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration)
e 6.000 fármacos experimentais (LAW et al., 2014; WISHART et al., 2006). A base de
dados TTD contém 2.360 alvos, incluindo 388 bem sucedidos, 461 em triagem clínica,
44 descontinuados e 1.331 alvos em investigação. Quanto aos fármacos são 20.667,
incluindo 2.003 aprovados, 3.147 em triagem clínica, 14.853 fármacos experimentais.
Além disso, fornece informações sobre alvos, tais como sequência, função, via
metabólica, validação e estrutura 3D através de links com outras importantes bases de
dados (CHEN; JI; CHEN, 2002; QIN et al., 2013; ZHU et al., 2012)
Nossa estratégia de busca nas duas bases de dados foi baseada no princípio da
similaridade do alvo, no qual cada comando (enzimas do metabolismo energético de
Leishmania) era comparado por similaridade com todos os alvos de fármacos
conhecidos contidos dentro de cada uma das bases de dados citadas anteriormente. No
caso onde foram identificados alvos de fármacos homólogos, todas as proteínas com um
output Expectation value (E-value) menor do que 1e5 para as três bases de dados foram
listados como potenciais alvos (CROWTHER et al., 2010). Dessa lista, selecionamos
aqueles que interagem com compostos já aprovados para uso clínico em humanos.
Informações adicionais sobre cada um das fármacos foram obtidas na base de dados
PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/).
Na base de dados DrugBank escolhemos a opção search, usando sequence
search da barra do menu. A sequência da proteína inquerida foi então introduzida no
formato FASTA e os parâmetros de busca usados foram selecionados automaticamente.
Na página inicial de acesso, selecionamos a opção target similarity search. A
sequência do peptídeo desejado foi introduzida, no formato FASTA, clicando em
seguida no ícone search. Quando os resultados da busca eram positivos, apenas os alvos
com um Expectation value (E-value) menores do que 1e5 foram considerados para
análises adicionais.
Na base de dados PubChem Database escolhemos a aba compound, inserindo
cada uma das fármacos identificadas nas bases de dados Drugbank e TTD citadas
56
anteriormente. Aqui, o objetivo foi obter informações detalhadas sobre cada composto,
tais como: farmacologia, patentes, propriedades físicas e químicas, além de resultados
de testes biológicos e interações biológicas e vias metabólicas.
Após o trabalho de busca de cada uma das enzimas do metabolismo energético de
Leishmania nas duas bases de dados, todas as proteínas com resultados negativos foram
descartadas, enquanto que os demais alvos previstos para cada base de dados foram
compilados para planilha de alvos obtida no TDR Targets. Os seguintes parâmetros
associados com cada hit positivo foi introduzido na planilha Homologous target(s)
name(s) and target ID(s) (DrugBank and TTD), E-value(s) (DrugBank and TTD), Drug
type(s) (DrugBank, and TTD), Drug name(s) (DrugBank and TTD), Drug ID(s)
(DrugBank) and Toxicity (DrugBank), Drug ID(s) e CID (Pubchem).
Além das informações fornecidas pela base de dados PubChen, buscamos na
literatura, usando PubMED, fármacos aprovadas que nunca foram testadas contra
Leishmania. Interrogamos todas os fármacos associadas com cada hit positivo da nossa
lista. Nossa definição de “avaliação” envolvia testes in vivo e/ou in vitro e quaisquer
espécies de parasito da leishmaniose. Portanto, se uma dado fármaco era observado
como “não testado” significava que não havia publicação e assim um dos seguintes
detalhes de busca era introduzido no PubMED: 1. (drug name [MeSH Terms] OR drug
name [All Fields]) AND (Leishmania [- MeSH Terms] OR Leishmania [All Fields]) and
2. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND ( Leishmaniasis [MeSH
Terms] OR Leishmaniasis [All Fields]), ou que o(s) estudo(s) recuperado(s) foi(ram)
insuficientemente informativos para inferir a potencial utilidade da fármaco como
leishmanicida.
4.2 Estratégia para identificação de potenciais alvos terapêuticos do metabolismo do apicoplasto de Plasmodium falciparum
Uma lista de proteínas alvos do apicoplasto foi previamente publicada por Ralph
et al, 2004 (RALPH et al., 2004). Para o presente trabalho, essa lista foi consultada e
cada proteína foi transportada para uma planilha. As proteínas foram agrupadas em
colunas, dependendo de sua função prevista e de acordo com a classificação disponível
na página da internet Malaria Parasite Metabolic Pathways
(http://priweb.cc.huji.ac.il/malaria/). Seus códigos de identificação (ID) foram então
57
recuperados da base dados do P. falciparum do GeneDB e inserido numa coluna
correspondente. Nós checamos a anotação de cada peptídeo previsto e o corrigimos,
quando necessário, de acordo com as anotações atualizadas da base de dados GeneDB.
Em seguida, recuperamos cada sequência de aminoácido prevista e a copiamos para
uma coluna correspondente para cada proteína.
Cada uma das sequências peptídicas previstas de P. falciparum da lista
compilada acima foi tratada como alvo de fármaco hipotético e consequentemente
usado para interrogar três diferentes bases de dados públicas disponíveis na internet.
Essas bases nos forneceram informações básicas dos fármacos e de seus alvos primários
ou hipotéticos: DrugBank (LAW et al., 2014) STITCH (KUHN et al., 2011) e
Therapeutic Target Database (TTD) (QIN et al., 2013). Nossa estratégia de busca nas
três bases de dados foi baseada no princípio da similaridade do alvo, no qual cada
consulta (proteína do apicoplasto de P. falciparum) era comparada por similaridade com
todos os alvos de fármacos conhecidos contidos em cada uma das bases de dados. Nos
casos em que foram identificados alvos de fármacos homólogos, todas as proteínas com
um Expectation value de saída (E-value) menor do que 1e-5 para DrugBank e TTD
foram listados como alvos potenciais. Para a da base dados STICH, uma pontuação
(score) de 0 a 1.0 foi atribuída, ao invés de um Expectation value. Desse modo, apenas
proteínas com uma pontuação acima de 0.7 foram consideradas como alvo. Nós
filtramos um pouco mais todos os alvos positivamente identificados, incluindo numa
lista apenas aquelas proteínas que indicaram interagir com compostos aprovados para
uso clínico em humanos.
Comandos para a base de dados DrugBank
Na página inicial, na opção “search”, selecionamos “sequence search”. Em
seguida, introduzimos a sequência proteica a ser consultada no formato FASTA,
deixando os parâmetros de busca padrão adotados pela base de dados.
58
Comandos para a base de dados STITCH
Na página inicial, selecionamos a opção ‘‘protein sequence’’. A sequência
peptídica a ser consultada foi então introduzida no formato FASTA e em seguida
clicamos em “Go”. Foram considerados para análise apenas alvos positivos com
pontuação acima de 0.7.
Comandos para a base de dados Therapeutic Targets Database
Na página inicial, foi selecionada a opção ‘‘target similarity search’’. A
sequência proteica a ser consultada foi introduzida na caixa do menu de busca e a opção
“search” foi acionada. Quando positivos, somente resultados com E-value menores do
que 1e-5 foram considerados para análise.
A compilação da Lista de Alvos Previstos
Após submeter cada uma das sequências proteicas de P. falciparum nas três
bases de dados, todos os resultados negativos foram excluídos, enquanto que os alvos
previstos de cada base de dados foram compilados em uma planilha Excel,
posteriormente chamada de lista de alvos previstos. Os seguintes parâmetros associados
com cada “hit” positivo foram colocados nessa planilha: Homologous target(s) name(s)
e target ID(s) (DrugBank and TTD), E-value(s) ou score(s) (DrugBank, STITCH e
TTD), Drug type(s) (DrugBank, STITCH e TTD), Drug name(s), (DrugBank, STITCH e
TTD), Drug ID(s) (DrugBank) e Toxicity (DrugBank). Cada um dos hits positivos foi
mais uma vez interrogado na base de dados TDR targets para seus índices de
drogabilidade, que é uma estimativa da chance de uma proteína ser drogável. Esse
índice varia entre 0 e 1, com o valor de aproximadamente 0,2 correspondendo à média
de drogabilidade. Para fazer isso, clicamos no item targets no menu inicial da página da
base de dados, selecionamos Plasmodium falciparum da lista de patógenos . Em
seguida, filtramos os alvos introduzindo o identificador de cada proteína na caixa
correspondente nas opções de busca Filter targets based on. Após clicar no ícone
search a variável acima foi recuperada e registrada na lista de alvos previstos.
59
Lista de fármacos ainda não testados contra malária
Finalmente, realizamos uma busca no PubMED por fármacos aprovados que
nunca foram avaliados contra os parasitos da malária, consultando todos os fármacos
associados com cada “hit” positivo da lista. Nossa definição de avaliação envolvia testes
in vivo e in vitro em qualquer espécie de Plasmodium. Portanto, se um dado fármaco era
tido como não testado, significava que não havia registro de publicação após entrar com
os seguintes detalhes de busca no PubMED 1. (drug name [MeSH Terms] OR drug
name [All Fields]) AND (plasmodium [- MeSH Terms] OR plasmodium [All Fields])
and 2. (drug name [MeSH Terms] OR drug name [All Fields]) AND ( malária [MeSH
Terms] OR malária [All Fields]), ou que o estudo (s) retornado foi (ram)
insuficientemente(s) informativo (s) para inferir o potencial do fármaco como
antimalárico.
60
5 RESULTADOS
5.1 Artigo 1 – In Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for
Alternative Leishmaniasis Treatments
5.2 Artigo 2 – A Systematic in Silico Search for Target Similarity
Identifies Several Approved Drugs with Potential Activity against the
Plasmodium falciparum Apicoplast
Research ArticleIn Silico Search of Energy Metabolism Inhibitors for AlternativeLeishmaniasis Treatments
Lourival A. Silva,1,2 Marina C. Vinaud,2,3 Ana Maria Castro,1,3
Pedro Vítor L. Cravo,2,3 and José Clecildo B. Bezerra2,3
1 Federal Institute of Education, Science and Technology of Goiania, 76300000 Ceres, GO, Brazil2 Goias Network of Research in Biotechnology and Metabolomics of the Host-Parasite Relationship,Goias Research Support Foundation (FAPEG), 74605050 Goiania, GO, Brazil
3 Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, 74605050 Goiania, GO, Brazil
Correspondence should be addressed to Pedro Vıtor L. Cravo; [email protected]
Received 5 July 2014; Revised 8 August 2014; Accepted 14 September 2014
Academic Editor: Suresh Sundaram
Copyright © Lourival A. Silva et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License,which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Leishmaniasis is a complex disease that affects mammals and is caused by approximately 20 distinct protozoa from the genusLeishmania. Leishmaniasis is an endemic disease that exerts a large socioeconomic impact on poor and developing countries.The current treatment for leishmaniasis is complex, expensive, and poorly efficacious. Thus, there is an urgent need to developmore selective, less expensive new drugs. The energy metabolism pathways of Leishmania include several interesting targets forspecific inhibitors. In the present study, we sought to establish which energymetabolism enzymes in Leishmania could be targets forinhibitors that have already been approved for the treatment of other diseases. We were able to identify 94 genes and 93 Leishmaniaenergy metabolism targets. Using each gene’s designation as a search criterion in the TriTrypDB database, we located the predictedpeptide sequences, which in turn were used to interrogate the DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD), and PubChemdatabases.We identified 44 putative targets of which 11 are predicted to be amenable to inhibition by drugs which have already beenapproved for use in humans for 11 of these targets. We propose that these drugs should be experimentally tested and potentiallyused in the treatment of leishmaniasis.
1. Introduction
Leishmaniasis affects 12 million people worldwide, andapproximately 350 million people from 98 countries are atrisk of contracting the disease [1]. Leishmaniasis is caused byapproximately 20 distinct species of Leishmania and is trans-mitted by two genera of phlebotomine sandflies: Phlebotomusin the Old World and Lutzomyia in the New World. From aclinical point of view, leishmaniasis is classified as cutaneous,mucocutaneous, or visceral; the latter is a severe form of thedisease that becomes fatal if left untreated [1, 2]. As effectivevaccines are unfortunately not available for either animals orhumans, prevention is restricted to the combat of vectors,control of reservoirs, and treatment of affected individuals[3, 4].
The drugs currently approved for the treatment of leish-maniasis are directed at various molecular targets. Pentava-lent antimonials interfere with the synthesis of DNA, 𝛽-oxidation of fatty acids, phosphorylation of ADP, and inhi-bition of glycolysis. Amphotericin B exhibits a high affinityfor ergosterol, which is an important component of the cellmembrane in fungi and Leishmania. Miltefosine inducesapoptosis as a consequence of its intracellular accumulation.Although paromomycin inhibits cytochrome C in Candidakrusei, its mechanism of action in Leishmania has not yetbeen elucidated; it is believed that its site of action is in themitochondria, where it possibly interferes with the synthesisof proteins by hindering the translocation and recyclingof ribosomal subunits. Pentamidine appears to reduce themembrane potential and inhibits the enzyme topoisomerase
Hindawi Publishing CorporationBioMed Research InternationalArticle ID 965725
61
ARTIGO 1
2 BioMed Research International
in the mitochondria [5]. However, all of these drugs exhibitserious problems, including drug resistance (antimonials),severe side effects (amphotericin and miltefosine), and aprohibitively high cost for use in a public healthcare setting(paromomycin and miltefosine) [6–8]. For these reasons,there is an urgent need for new drugs against leishmaniasis.
Although drugs may target lipids, nucleic acids, orpolysaccharides, the drugs with the greatest efficacy aredirected against protein targets [9]. The energy metabolismpathways of Leishmania include several protein targets thatare interesting for the development or testing of new drugs[10, 11]. Glycosomes (similar to mammal peroxisomes) andmitochondria are the main sites of energy production inthe promastigote forms of Leishmania. The glycosome isthe site of glycolysis, which consists of seven reactions thatbreak glucose down into two pyruvate molecules, while themitochondria are the sites of the Krebs cycle and oxidativephosphorylation. In addition to glucose, amino acids are alsoimportant sources of energy.The final products of promastig-ote metabolism are carbon dioxide, succinate, pyruvate, D-lactate, alanine, ammonia, andurea [10].The inhibition of oneor more enzymes at each of these metabolic steps representsprogress in the elimination of the parasite.
Prior to targeting a metabolic pathway, its importancefor both the parasite and the host must be taken intoconsideration. The selectivity of inhibitors is also impor-tant, that is, how much they are able to inhibit a para-sitic enzyme without causing any damage to the host [11].Several enzymes in the Leishmania glycolytic pathway havebeen indicated as interesting therapeutic targets, includinghexokinase, fructose-1,6-bisphosphate aldolase, triosephos-phate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, phosphoglycerate kinase, pyruvate kinase, and glycerol-3-phosphate dehydrogenase [11]. However, the followingquestion remains unanswered: which drugs inhibit theseor other enzymes involved in the energy metabolism ofLeishmania?
In general, the strategy for drug development includesboth de novo discovery and the improvement of inhibitorsof individually validated targets. Although this strategy isefficient for the development of new drugs against leishma-niasis, it is time-consuming and expensive. One interest-ing alternative approach is a strategy commonly known asdrug repositioning. Drug repositioning makes use of knowngenomic data to search for drugs already approved for clinicaluse in humans for other diseases and for which the drugtargets are already known. This approach uses the principleof “target homology” and can be put in practice using bioin-formatics drug-target repositories, such as DrugBank [12]andTherapeutic Targets Database [13]. Such chemogenomicsstrategies considerably increase the likelihood of success indrug discovery, cutting down the costs and time spent inthe process of research and development, in comparisonwith “traditional” methodologies. For this reason, pharmaindustries are increasingly using drug repositioning in orderto find alternative applications for their drugs, reducingtime and costs involved in the process of developing newcompounds [14, 15].
In the present study, we used the concept of drugrepositioning to identify new drugs with potential activityagainst Leishmania parasites. We first used genomic datato compile a list of energy metabolism drug targets inLeishmania of possible therapeutic interest. Each of thesepotential targets was then used as query in databases thatinclude information on thousands of therapeutic compoundsactive against specific protein targets, themetabolic pathwaysthat are involved, and the diseases for which they have beentested or for which clinical tests are currently in progress[12, 13, 16–19].
2. Materials and Methods
2.1. Compilation of a List of Potential Leishmania EnergyMetabolismTargets. A list of hypothetic targets was extractedfrom the database TDR Targets (http://tdrtargets.org). TDRTargets is a project of the World Health Organization thatprioritizes neglected tropical diseases.The database has openaccess and provides genomic information on specific speciesthat allows users to identify and prioritize targets of interest[15, 20]. We selected targets on the first page, and in thefirst field, we selected L. major as the pathogenic speciesof interest. The next field provided a filter based on thefollowing: Name/Annotation, Features, Structures, Expres-sion, Antigenicity, Phylogenetic distribution, Essentiality,Validation data, Druggability, Assayability, and Bibliographicreferences. We decided to limit the number of filters toincrease the odds that the search would produce results.Despite this, some of the genes related to Leishmania energymetabolism could not be found in the TDR Targets database.For this reason, we expanded the filter Name/Annotation andchose the option “Energy metabolism” in the field KEGGhigh-level pathway. Next, we expanded the filter Druggabilityand selected a druggability evidence range (which varies fromzero to one) ≥0.2 in the optionDruggability index.This querywas automatically saved in the my history section; the resultswere organized into a table that could be uploaded.
2.2. Identification of Potential Drug Targets in AvailableDrug Databases: General Strategy. We ran searches of thename of each gene identified as TDR Targets in thedatabase TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/), whichcontains genomic information on pathogens of the familyTrypanosomatidae, to which the genera Leishmania andTrypanosoma belong [21]. In the TriTrypDB homepage,we wrote the names of the genes in the field Gene IDand selected the search option. We checked each gene’sname and product and extracted their predicted peptidesequences. In the cases of known enzymes whose encodinggenes could not be identified among the TDR Targets, wewrote the enzyme name in the field Gene Text Search torun the search. Every Leishmania predicted peptide wasconsidered as a potential target, and the sequences wereused to run searches in the online databases DrugBank(http://www.drugbank.ca/) andTherapeutic Target Database(TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp), which
62
BioMed Research International 3
provide basic information on drugs and their primary orhypothetical targets.
DrugBank is an open-access database that provides userswith information on drugs (chemical, pharmaceutical, andpharmacological data) and their targets (sequence, structure,and metabolic pathway). The database currently containsdata on approximately 8,000 agents, including 1,700 drugsalready approved by the FDA (Food and Drug Administra-tion) and 6,000 experimental drugs [12, 17, 22]. The TTDstores information on 2,400 targets and approximately 21,000drugs, of which 2,000 are already approved and 460 arecurrently undergoing clinical testing. In addition, it providesinformation on targets, such as sequence, function,metabolicpathway, and three-dimensional structure, through links toother relevant databases [13, 18, 19].
In both databases, our search strategy was based on thetarget-similarity principle, whereby each command (energymetabolism enzymes in Leishmania) was compared by simi-larity to all known drug targets included in all of the above-mentioned databases. Whenever homologous drug targetswere identified, all of the proteins with an output expectationvalue (𝐸-value) less than 1𝐸 − 5 relative to all three databaseswere included in the list of potential targets [14]. From thislist, we selected the targets that interact with compounds thatare already approved for clinical use in humans. Additionalinformation on each drug was obtained from the PubChemdatabase (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/).
2.3. Compilation of a List of Predicted Targets. Followingthe search of all of the enzymes involved in Leishmaniaenergy metabolism in the two databases, all of the proteinsfor which the search results were negative were discarded.The remaining predicted targets from each database werecompiled for the target spreadsheet provided by the TDRTar-gets. The following parameters associated with each positivehit were introduced in the spreadsheet: “Homologous tar-get(s) name(s) and target ID(s)” (DrugBank and TTD), “𝐸-value(s)” (DrugBank and TTD), “Drug type(s)” (DrugBankand TTD), “Drug name(s)” (DrugBank and TTD), “DrugID(s)” (DrugBank), “Toxicity” (DrugBank), and Drug ID(s)and CID (PubChem).
2.4. List of Drugs for In Vitro Tests against Leishmania spp.In addition to the information gathered from the PubChemdatabase, we performed a literature search of the PubMeddatabase of approved drugs that have not yet been testedagainst Leishmania. We searched for all of the drugs asso-ciated with each positive hit on our list. Our definition of“test” included in vivo and/or in vitro tests and any speciesof Leishmania. Drugs were classified as “untested” when norelated publication could be found. In these cases, one ofthe following search terms was introduced in PubMed: (1)(“drug name”[MeSH Terms] OR “drug name”[All Fields])AND (“Leishmania”[-MeSH Terms] OR “Leishmania”[AllFields]) and (2) (“drug name”[MeSH Terms] OR “drugname”[All Fields]) AND (“Leishmaniasis”[MeSH Terms] OR“Leishmaniasis”[All Fields]). Drugs were also classified as“untested” when the information provided by the located
94 Leishmania energymetabolism targets
94 peptide sequences
44 positive targets
11 remaining targets
11 targets capable ofinteracting with 15 drugsthat have been approved
33 discarded targets
but not yet testedagainst Leishmania
Figure 1: Flowchart depicting the overall strategy and results of thiswork.
study(ies) was insufficient to infer the potential usefulness ofthe drug as a leishmanicidal agent.
3. Results
3.1. Compilation of a List of Predicted Targets. To clarify theprocedure we used for the identification and selection of theenergy metabolism targets, all of the steps are depicted inFigure 1. We identified 94 genes associated with the energyof Leishmania. All of the products of these genes wereconsidered as potential therapeutic targets. The predictedamino acid sequence of all these peptides was searched basedon target similarity in the databases TTD and DrugBank.
A list of 44 positive hits (approximately 47% of thepredicted peptides corresponding to Leishmania energymetabolism) was generated. Two databases were used toavoid missing important targets because the informationthey contained on drug targets was not the same (Figure 1).We identified 26 predicted targets in TTD, four of whichappeared only in this database, and 40 predicted targets in theDrugBank database, 14 of which were exclusive to it. Twelveof the targets are enzymes that participate in glycolysis and/orthe Krebs cycle, 13 participate in oxidative phosphorylation,and 11 participate in amino acid metabolism.
From the list of positive hits, we selected targets thathad been previously tested in any organism and that had acorresponding commercially available drug. Detailed infor-mation on these targets and the corresponding compounds isprovided in Table 1.
3.2. Untested Drugs. To establish which target-related drugshad been previously tested against leishmaniasis, we per-formed a literature search in the PubMed database, as
63
4 BioMed Research International
Table 1: New drug-target associations disclosed in the present study.
Drug (brand names) Drug category(ies) Toxicity Leishmania target(s) ID Identity to (𝐸-value) TDRTdruggability
Lonidamine(Doridamina)
Anticancer,antitrypanosomal NA Hexokinase, putative
LbrM.21.0310Hexokinase D(3𝐸 − 54) NA
POLYSIN Antiprotozoal NAATP-dependentphosphofructokinaseLbrM.29.2480
Pyrophosphate-dependent
phosphofructokinase(2.00𝐸 − 06)
NA
Saframycin A Anticancer NA
Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenaseLbrM.30.2950
Glyceraldehyde3-phosphate
dehydrogenase, muscle2𝐸 − 91
NA
NadideChagas disease,
parasitic diseases, andsleeping sickness
No reports of overdose;however, high doses ofNADH (10mg a day ormore) may causejitteriness, anxiety, andinsomnia
Glycerol-3-phosphatedehydrogenaseLbrM.10.0640
Glycerol-3-phosphatedehydrogenase [NAD+],
cytoplasmic2𝐸 − 31
0.2
Sulfacetamide;sulfanilamide;sulfoxone
Bacterial infections
Oral LD50 mouse:16500mg/kg. Side effectsinclude moderate tosevere erythema(redness) and moderateedema (raised skin),nausea, vomiting,headache, dizziness, andtiredness. Higherexposure causesunconsciousness
Phosphomannoseisomerase (PMI)LbrM.32.1750
Mannose-6-phosphateisomerase3𝐸 − 59
0.6
Morantel tartrate,oxantel pamoate, andthiabendazole
Helicobacter pyloriinfection,Maturegastrointestinal
nematode infections,Trichuris trichiura
infection
Overdosage may beassociated with transientdisturbances of visionand psychic alterations
NADH-dependentfumarate reductaseLbrM.34.0820
Fumarate reductaseflavoprotein subunit2.00𝐸 − 13
0.5
CEPHARANTHINE;CONESSINE
Africantrypanosomiasis;Chagas disease;
Leishmania infections;parasitic diseases;
NATrypanothionereductaseLmjF05.0350
Glutathione reductase,mitochondrial6𝐸 − 65
NA
Aciglut, Glusate,Glutacid, Glutamicol,Glutamidex,Glutaminol, andGlutaton
Antibacterial;antitrypanosomal
Glutamate causesneuronal damage andeventual cell death,particularly when theNMDA receptors areactivated. High dosagesof glutamic acid mayinclude symptoms suchas headaches andneurological problems
Aspartateaminotransferase,putative LbrM.24.0370
Aspartateaminotransferase,mitochondrial8𝐸 − 89
0.3
2-Oxopropanoic acid,pyroracemic acid, andacetylformic acid
Bacterial infections Pyruvate kinaseLbrM.34.0010
Pyruvate kinase1.00𝐸 − 117
NA
Succinic acid(Katasuccin, Kyselinajantarova)
NA Oral rat LD50:2260mg/kg
SuccinatedehydrogenaseLmjF15.0990
Succinate dehydrogenase[ubiquinone] iron-sulfursubunit, mitochondrial2𝐸 − 28
NA
64
BioMed Research International 5
Table 1: Continued.
Drug (brand names) Drug category(ies) Toxicity Leishmania target(s) ID Identity to (𝐸-value) TDRTdruggability
Adenovite,Cardiomone,Lycedan, My-B-Den,Phosaden, andPhosphaden
NA NAAcetyl-coenzyme Asynthetase, putativeLbrM.23.0580
Acetyl-coenzyme Asynthetase, cytoplasmic3𝐸 − 159
0.2
described above. We found that only one of the target-relatedcompounds had been previously tested against leishmaniasis.
4. Discussion
The aim of the present study was to identify drugs thatare specifically active against Leishmania energy metabolismenzymes and have been previously tested against nonparasiticdiseases or other human parasitic diseases. Below, we discussthe identified drugs and their effects on Leishmania energymetabolism.
Lonidamine (Doridamina) (LND, (1-[(2,4-dichloro-phenyl)methyl]-1H-indazole-3-carboxylic acid) was devel-oped as an antispermatogenic agent that proved to be effectiveagainst cells with high metabolic activity, such as cancerand protozoan cells [23, 24]. In tumor cells, LND impairsglycolysis and lactate production by inhibitingmitochondrialhexokinase [23]. This inhibition was achieved with a lethaldose (LD50) of ∼260𝜇M and ∼80𝜇M in L. mexicanapromastigote forms and Trypanosoma cruzi epimastigoteforms, respectively. The mechanism of action of LND wasattributed to inhibition of the energy metabolism [23]. InTrypanosoma brucei, which causes African trypanosomiasis,LND inhibits the enzyme hexokinase in the procyclic formsof the parasite, indicating that hexokinase is a relevanttherapeutic target for LND [25].
Nadide has been approved for the treatment of Parkin-son’s disease, Alzheimer’s disease, and cardiovascular dis-eases (DrugBank data). Recent studies on breast cancerand longevity have revealed the importance of this smallmolecule. Nadide is the commercial form of the NADHmolecule that living organisms produce through the reduc-tion of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD).
Appreciation of the importance of this small moleculehas greatly increased since it was discovered at the beginningof the 20th century. The best-known role of NAD is as anelectron carrier in oxidation-reduction reactions. However,several other functions have been attributed to it, includingsignal transduction and protein and DNA modification [26].Recently, [27] reported that NAD+ homeostasis is crucialfor Leishmania biology and virulence. The authors showedthat nicotinamidase, which catalyzes the conversion of nicoti-namide into nicotinic acid, is the key enzyme for the produc-tion of NAD+ from its precursors.Interestingly, the involved
precursors (nicotinamide, nicotinic acid, and nicotinamideriboside) are derived from the host, and nicotinamidasecannot be found in mammals [27].
Sodium sulfacetamide or sulfacetamide is a bacteriostaticagent that is active against sulfonamide-sensitive Gram-negative and Gram-positive bacteria, including Streptococci,Staphylococci, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonaspyocyanea, Salmonella spp., Proteus vulgaris, and Nocardia,which are usually isolated in secondary infections of the skin.
The LD50 of sulfacetamide for mice is 16,500mg/kgby the oral route. In humans, the side effects include ery-thema, moderate swelling, nausea, vomiting, and headache.In addition to these side effects, the occurrence of Stevens-Johnson syndrome was reported in HIV-positive patientswho received sulfacetamide drops for eye infections. All ofthese side effects, however, are associated with oral admin-istration or high drug absorption through the skin, mucousmembranes, and the conjunctiva, whereas topical use is notassociated with strong side effects, except in the case ofindividuals with a hypersensitivity to sulfonamide.
Sulfacetamide inhibits mannose-6-phosphate isomerase(also known as phosphomannose isomerase (PMI)), whichis considered the key enzyme in kinetoplastid energymetabolism. PMI catalyzes the isomerization of fructose-6-phosphate into mannose-6-phosphate. As the identity of thekinetoplastid PMI with human PMI is low (𝐸-value = 3𝐸 −59), it represents an interesting target on which to test newdrugs.
5. Conclusions
We identified potential inhibitors of Leishmania energymetabolism by searching the information available indatabases based on the target-similarity principle. Althoughapproved for use in humans, none of the drugs identified haveyet been tested against the parasite Leishmania. In vitro and invivo tests may confirm the efficacy of these drugs, potentiallyleading to their use in the treatment of leishmaniasis.
Appendix
Database Details and Commands
DrugBank Database Commands. In this database, the searchwas initiated by selecting the options “search” and then“Sequence Search” from the toolbar menu. The sequence of
65
6 BioMed Research International
each protein investigated was entered in FASTA format inthe appropriate field, and the search parameters were selectedautomatically.
TTD Commands. On the homepage of this database, weselected the option “target similarity search.”The sequence ofthe protein being investigated was entered in FASTA formatin the appropriate field, and the option “search” was selected.In the cases with positive search results, only the targetswith an 𝐸-value less than 1𝐸 − 5 were considered for furtheranalysis.
PubChem Database Commands. In this database, the tab“compound” was selected, and every drug identified inDrugBank and TTDwas entered in the appropriate field.ThePubChem database was searched to gather detailed infor-mation on each compound, including the pharmacology,patents, physical and chemical properties, results of biologicaltests, biological interactions, and metabolic pathways.
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interestsregarding the publication of this paper.
References
[1] J. Alvar, I. D. Velez, C. Bern et al., “Leishmaniasis worldwideand global estimates of its incidence,” PLoS ONE, vol. 7, no. 5,Article ID e35671, 2012.
[2] D. O. Santos, C. E. R. Coutinho, M. F. Madeira et al.,“Leishmaniasis treatment—a challenge that remains: a review,”Parasitology Research, vol. 103, no. 1, pp. 1–10, 2008.
[3] B. Chawla and R. Madhubala, “Drug targets in Leishmania,”Journal of Parasitic Diseases, vol. 34, no. 1, pp. 1–13, 2010.
[4] L.M. Fidalgo and L.Gille, “Mitochondria and trypanosomatids:targets and drugs,” Pharmaceutical Research, vol. 28, no. 11, pp.2758–2770, 2011.
[5] N. Singh, M. Kumar, and R. K. Singh, “Leishmaniasis: currentstatus of available drugs and new potential drug targets,” AsianPacific Journal of Tropical Medicine, vol. 5, no. 6, pp. 485–497,2012.
[6] J. Kaur, R. Tiwari, A. Kumar, and N. Singh, “Bioinformaticanalysis of Leishmania donovani long-chain fatty acid-CoAligase as a novel drug target,” Molecular Biology International,vol. 2011, Article ID 278051, 14 pages, 2011.
[7] M. K. Mittal, S. Rai, A. Ravinder, S. Gupta, S. Sundar, andN. Goyal, “Characterization of natural antimony resistance inLeishmania donovani isolates,”TheAmerican Journal of TropicalMedicine and Hygiene, vol. 76, no. 4, pp. 681–688, 2007.
[8] S. L. Croft, S. Sundar, and A. H. Fairlamb, “Drug resistance inleishmaniasis,” Clinical Microbiology Reviews, vol. 19, no. 1, pp.111–126, 2006.
[9] A. L. Hopkins and C. R. Groom, “The druggable genome,”Nature Reviews Drug Discovery, vol. 1, no. 9, pp. 727–730, 2002.
[10] F. R. Opperdoes and P. A.M.Michels, “Themetabolic repertoireof Leishmania and implications for drug discovery,” in Leish-mania, after the Genome, pp. 123–158, Caister Academic Press,Wymondham, UK, 1st edition, 2008.
[11] C. L. Verlinde, V. Hannaert, C. Blonski et al., “Glycolysis asa target for the design of new anti-trypanosome drugs,” DrugResistance Updates, vol. 4, no. 1, pp. 50–65, 2001.
[12] D. S. Wishart, C. Knox, A. C. Guo et al., “DrugBank: a knowl-edgebase for drugs, drug actions and drug targets,”Nucleic AcidsResearch, vol. 36, no. 1, pp. D901–D906, 2008.
[13] F. Zhu, B. Han, P. Kumar et al., “Update of TTD: therapeutictarget database,”Nucleic Acids Research, vol. 38, no. 1, pp. D787–D791, 2009.
[14] N. A. Bispo, R. Culleton, L. A. Silva, and P. Cravo, “A systematicin silico search for target similarity identifies several approveddrugs with potential activity against the Plasmodium falci-parum apicoplast,” PLoS ONE, vol. 8, no. 3, Article ID e59288,2013.
[15] M. P. Magarinos, S. J. Carmona, G. J. Crowther et al., “TDRtargets: a chemogenomics resource for neglected diseases,”Nucleic Acids Research, vol. 40, no. 1, pp. D1118–D1127, 2012.
[16] C. Knox, V. Law, T. Jewison et al., “DrugBank 3.0: a compre-hensive resource for “Omics” research on drugs,” Nucleic AcidsResearch, vol. 39, no. 1, pp. D1035–D1041, 2011.
[17] V. Law, C. Knox, Y. Djoumbou et al., “DrugBank 4.0: sheddingnew light on drug metabolism,” Nucleic Acids Research, vol. 42,no. 1, pp. D1091–D1097, 2014.
[18] X. Chen, Z. L. Ji, and Y. Z. Chen, “TTD: therapeutic targetdatabase,” Nucleic Acids Research, vol. 30, no. 1, pp. 412–415,2002.
[19] F. Zhu, Z. Shi, C. Qin et al., “Therapeutic target database update2012: a resource for facilitating target-oriented drug discovery,”Nucleic Acids Research, vol. 40, no. 1, pp. D1128–D1136, 2012.
[20] G. J. Crowther, D. Shanmugam, S. J. Carmona et al., “Identifi-cation of attractive drug targets in neglected- disease pathogensusing an in Silico approach,” PLoS Neglected Tropical Diseases,vol. 4, no. 8, article e804, 2010.
[21] M. Aslett, C. Aurrecoechea, M. Berriman et al., “TriTrypDB:a functional genomic resource for the Trypanosomatidae,”Nucleic Acids Research, vol. 38, no. 1, Article ID gkp851, pp.D457–D462, 2010.
[22] D. S. Wishart, C. Knox, A. C. Guo et al., “DrugBank: a compre-hensive resource for in silico drug discovery and exploration,”Nucleic Acids Research, vol. 34, pp. D668–D672, 2006.
[23] A. Floridi, M. G. Paggi, S. D’Atri et al., “Effect of lonidamine onthe energy metabolism of Ehrlich ascites tumor cells,” CancerResearch, vol. 41, pp. 4661–4666, 1981.
[24] E. R. Sharlow, T. A. Lyda, H. C. Dodson et al., “A target-basedhigh throughput screen yields Trypanosoma brucei hexokinasesmall molecule inhibitors with antiparasitic activity,” PLoSNeglected Tropical Diseases, vol. 4, no. 4, 2010.
[25] J. W. Chambers, M. L. Fowler, M. T. Morris, and J. C.Morris, “The anti-trypanosomal agent lonidamine inhibitsTrypanosoma brucei hexokinase 1,”Molecular and BiochemicalParasitology, vol. 158, no. 2, pp. 202–207, 2008.
[26] L. Chen, R. Petrelli, K. Felczak et al., “Nicotinamide adeninedinucleotide based therapeutics,” Current Medicinal Chemistry,vol. 15, no. 7, pp. 650–670, 2008.
[27] E. Gazanion, D. Garcia, R. Silvestre et al., “The Leishmanianicotinamidase is essential for NAD+ production and parasiteproliferation,” Molecular Microbiology, vol. 82, no. 1, pp. 21–38,2011.
66
A Systematic In Silico Search for Target SimilarityIdentifies Several Approved Drugs with Potential Activityagainst the Plasmodium falciparum ApicoplastNadlla Alves Bispo1, Richard Culleton2, Lourival Almeida Silva1, Pedro Cravo1,3*
1 Instituto de Patologia Tropical e Saude Publica/Universidade Federal de Goias/Goiania, Brazil, 2 Malaria Unit/Institute of Tropical Medicine (NEKKEN)/Nagasaki University/
Nagasaki, Japan, 3 Centro de Malaria e Doencas Tropicais.LA/IHMT/Universidade Nova de Lisboa/Lisboa, Portugal
Abstract
Most of the drugs in use against Plasmodium falciparum share similar modes of action and, consequently, there is a need toidentify alternative potential drug targets. Here, we focus on the apicoplast, a malarial plastid-like organelle of algal sourcewhich evolved through secondary endosymbiosis. We undertake a systematic in silico target-based identification approachfor detecting drugs already approved for clinical use in humans that may be able to interfere with the P. falciparumapicoplast. The P. falciparum genome database GeneDB was used to compile a list of <600 proteins containing apicoplastsignal peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted sequence was used tointerrogate three different freely available databases (Therapeutic Target Database, DrugBank and STITCH3.1) that providesynoptic data on drugs and their primary or putative drug targets. We were able to identify several drugs that are expectedto interact with forty-seven (47) peptides predicted to be involved in the biology of the P. falciparum apicoplast. Fifteen (15)of these putative targets are predicted to have affinity to drugs that are already approved for clinical use but have neverbeen evaluated against malaria parasites. We suggest that some of these drugs should be experimentally tested and/orserve as leads for engineering new antimalarials.
Citation: Bispo NA, Culleton R, Silva LA, Cravo P (2013) A Systematic In Silico Search for Target Similarity Identifies Several Approved Drugs with Potential Activityagainst the Plasmodium falciparum Apicoplast. PLoS ONE 8(3): e59288. doi:10.1371/journal.pone.0059288
Editor: Fabio T. M. Costa, State University of Campinas, Brazil
Received November 20, 2012; Accepted February 13, 2013; Published March 26, 2013
Copyright: � 2013 Bispo et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was funded by Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior/PVE of Brazil (http://www.capes.gov.br/). The funders had norole in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction
Malaria remains a serious public health problem in many
tropical countries [1]. As there is still no effective vaccine available,
treatment and prevention of the disease is primarily based on
antimalarial drug administration and anti-vector measures,
respectively. The efficacy of antimalarial drug treatment is
compromised by the malaria parasite’s ability to develop drug-
resistance, and by the dearth of new and effective antimalarials in
the drug-design pipeline. There is, therefore, an urgent need for
the discovery of new antimalarial drugs.
The main antimalarials presently approved for clinical use act
mainly on two parasite metabolic pathways: haemoglobin
degradation and nucleic acid synthesis. However, with the
exception of artemisinin derivatives, parasite resistance has
evolved and become common for the currently used antimalarial
drugs. One of the underlying phenomena contributing to the
emergence of drug resistance, is that resistance to different drugs is
often controlled by similar molecular mechanisms and conse-
quently the evolution of resistance to one particular compound
may impact on the efficacy of others. For instance, resistance to
quinine-derived drugs, such as mefloquine and lumefantrine, as
well as to the structurally unrelated artemisinin derivatives, has
been shown to be modulated by mutations and/or amplification of
the Multidrug Resistance Protein homologue-1, PfMDR1 [2].
Similarly, resistance to drugs that block parasite nucleic acid
synthesis, such as sulfadoxine, pyrimethamine and proguanil, is
largely conferred by point mutations in genes encoding two
enzymes, dihydrofolate reductase (DHFR) and the dihydroptero-
ate synthase (DHPS) [3].
When considering the design of new antimalarial drugs, it is,
therefore, imperative to investigate alternative antimalarial mo-
lecular targets. One such strategy has focused on the apicoplast, a
non-photosynthetic malarial plastid which was first described in
the 1990’s [4,5] and recently confirmed to have been acquired by
secondary endosymbiosis of a plastid-containing red alga [6]. The
apicoplast’s genome is small (<35 kb), and the organelle harbors
several unique metabolic functions, mostly accomplished by
proteins that are nuclear-encoded and later imported into its
lumen [7]. These unique metabolic features represent an attractive
starting point for therapeutic intervention, since they are mostly of
plant/algal origin, a fact that may heighten the target selectivity of
antimalarial drugs and/or reduce the probabilities of toxicity to
humans. Importantly, previous studies have already confirmed
that the apicoplast is vulnerable to drugs that affect its metabolic
functions, such as replication, nucleic acid metabolism, translation,
fatty acid synthesis and isoprenoid biosynthesis [8].
A conventional drug development strategy may involve both de
novo drug discovery and the improvement of inhibitors of
individually validated targets. Although this process represents
an efficient strategy to develop novel antimalarial drugs, it is
PLOS ONE | www.plosone.org 1 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
usually costly and time-consuming. An alternative and/or
complementary approach is to screen existing clinically approved
drugs for previously unidentified antimalarial activity, thus
speeding up the discovery of new therapies. As such drugs are
already approved for use in humans for other purposes, they can
more easily enter human clinical efficacy trials under existing drug
administration guidelines.
There are a number of different publicly available web-based
databases which provide information on thousands of known
therapeutic protein targets, the diseases that they are involved in,
evidence for which pathways they play a role in, and the
corresponding drugs which are directed at each of them. Using
three of these databases, DrugBank [9], STITCH3.1 [10] and
Therapeutic Target Database (TTD) [11], we adopted an in silico
‘‘top-down’’ approach to identify proteins localized to the P.
falciparum apicoplast that may be targeted by drugs which are
already in use in human clinical practice.
Materials and Methods
Compilation of a List of Apicoplast-targeted ProteinsA list of Plasmodium falciparum apicoplast-targeted proteins has
been previously published by Ralph et al, 2004 [7]. The
description of the methods that were used to identify proteins
predicted to contain apicoplast-targeting sequences is detailed in
that paper [7]. For the present work, this list was accessed and
each protein entry was logged on to an Excel file datasheet.
Proteins were grouped consecutively in a datasheet column
depending on their predicted metabolic function and according
to the classification available in the ‘‘Malaria Parasite Metabolic
Pathways’’ web page [12]. Their identification codes (IDs) were
then retrieved from the GeneDB P. falciparum genome database
[13] and logged onto the corresponding column as a clickable
hyperlink. We further checked the annotation of each single
predicted peptide and corrected it, if necessary, according to the
recent updated annotations of the GeneDB database. Next, we
retrieved each individual predicted amino acid sequence and
copied it to the corresponding column for each protein.
Identification of Putative Drug Targets Using PubliclyAvailable Drug Databases Overall Strategy
Each of the P. falciparum predicted protein sequences from the
list compiled above was treated as a putative drug-target and
consequently used to interrogate three different publicly
available web databases that provide synoptic data on drugs
and their primary or putative drug targets: DrugBank [9],
STITCH3.1 [10] and the Therapeutic Target Database (TTD)
[11]. Our search strategy for all three databases was based on
the principle of ‘‘target similarity’’ whereby each query (P.
falciparum apicoplast protein) is compared for similarity with all
known drug targets contained within each of the databases. In
cases where homologous drug targets were identified, all
proteins with an output expectation value (E-value) lower than
1e25 for DrugBank and TTD were listed as potential targets.
In the case of STICH3.1, a score from 0 to 1.0 is given, rather
than an expectation value. Thus, only proteins with a score
above 0.7 were considered potential targets. We further filtered
all positively identified targets through inclusion in the list of
only those proteins that were indicated to interact with
compounds that have already been approved for clinical use
in humans.
Database Commands for DrugBank [9]Starting from the homepage, the option ‘‘search’’ R ‘‘sequence
search’’ was chosen from the toolbar menu. The query protein
sequence was then entered in FASTA format and the remaining
default search parameters were used.
Database Commands for STITCH3.1 [10]Starting from the homepage, the option ‘‘protein sequence’’
from the menu box was clicked. The query protein sequence was
then entered in FASTA format and the ‘‘Go’’ icon was clicked.
When positive results were obtained only targets with a score
above 0.7 were considered.
Database Commands for Therapeutic Targets Database[11]
Starting from the homepage, the option ‘‘target similarity
search’’ from the menu box was clicked. The query protein
sequence was then entered in FASTA format and the ‘‘Search’’
icon was clicked. When positive results were obtained only targets
with an Expectation value (E-value) score lower than 1e25 were
considered for further analyses.
Compilation of the ‘‘Predicted Targets List’’After running each of the P. falciparum protein sequences in the
three databases, all proteins with negative results (negative hits)
were excluded from further analyses, whilst predicted targets from
each database were compiled into a single Excel file, hereafter
named ‘‘predicted targets list’’. The following parameters associ-
ated with each positive hit were entered into the spreadsheet:
‘‘Homologous target(s) name(s) and target ID(s)’’ (DrugBank and
TTD), ‘‘E-value(s) or score(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and
TTD), ‘‘Drug type(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), ‘‘Drug
name(s)’’ (DrugBank, STITCH3.1 and TTD), ‘‘Drug ID(s)’’
(DrugBank) and ‘‘Toxicity’’ (DrugBank).
Each positive hit was further cross-examined in the TDR targets
Database [14] for its ‘‘druggability index’’, which is an estimate of
the likelihood of a protein being druggable and ranges from 0 to
1.0, with a value of <0.2 corresponding to average druggability.
To do this, we clicked on the ‘‘targets’’ item in the web site’s menu
and then ticked ‘‘Plasmodium falciparum’’ from the pathogen species
list. We next filtered targets by entering each protein’s identifier
(ID) in the corresponding box in the ‘‘Filter targets based on’’
search options. After clicking on the ‘‘search’’ icon, the above
variable was retrieved from the target’s page and was subsequently
recorded in the ‘‘predicted targets list’’ file.
List of Drugs Yet to be Tested Against MalariaFinally, we carried out a literature search using PubMED in
order to identify approved drugs that have never been evaluated
against malaria parasites by querying all drugs associated with
each positive hit in the list. Our definition of ‘‘evaluation’’
embraces in vitro and/or in vivo testing and any malaria parasite
species. Therefore if a given drug is noted as ‘‘not tested’’, it means
that no publication records were found after either of the following
search details were entered in PubMED: 1. (‘‘drug name’’[MeSH
Terms] OR ‘‘drug name’’[All Fields]) AND (‘‘plasmodium’’[-
MeSH Terms] OR ‘‘plasmodium’’[All Fields]) and 2. (‘‘drug
name’’[MeSH Terms] OR ‘‘drug name’’[All Fields]) AND
(‘‘malaria’’[MeSH Terms] OR ‘‘malaria’’[All Fields]), or that the
study(ies) retrieved were insufficiently informative to infer the
potential usefulness of the drug as an antimalarial.
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 2 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
Results
Schematic SummaryFor ease of understanding, the overall results of this work are
represented as a flow chart in Figure 1, the detailed results of
which are given in the following sections.
Compilation of the ‘‘Predicted Targets’’ ListEach of the Plasmodium falciparum proteins predicted to contain
an apicoplast target signal was entered into a single Excel file as
described in Materials and Methods. A list of a total 595 candidate
target protein sequences was thus compiled and each was
subsequently allocated either of the following predicted metabolic
functions: ‘‘Replication, Transcription and Nucleic acid metabo-
lism’’, ‘‘Translation’’, ‘‘Fatty acid and Phospholipid Metabolism’’,
‘‘Transport’’, ‘‘Antioxidant’’, ‘‘Protein Folding’’, ‘‘Fe-S Cluster
Production’’, ‘‘Porphyrin Biosynthesis’’, ‘‘Post-translational Mod-
ification and Proteolysis’’ and ‘‘Other/unknown function’’ (Table
S1). Each of these protein sequences in the list was interrogated for
target similarity in the three databases used (DrugBank,
STITCH3.1 and TTD), producing a list of a total seventy-two
(72) ‘‘positive hits’’ (<12% of the total predicted apicoplast
peptides) (Table S2). We decided to use all three databanks
because each of them may contain different drug-target datasets
and, consequently, the probability of targets being missed due to
insufficient screening is reduced. Indeed, no single database was
capable of identifying all 72 predicted targets: DrugBank,
STICH3.1 and TTD identified exclusively 45, 8 and 11 predicted
targets, whilst the remaining 8 targets were identified by two or
three of the databases. Detailed information about the predicted
targets and their associated compounds is provided in Table S2.
Approximately one third of the positively identified targets
(N = 25) were predicted to react with compounds belonging to the
‘‘Dietary supplement/nutraceutical’’ class. Since these compounds
are unlikely to exhibit antimalarial activity, these targets and their
associated compounds were excluded from further analyses. The
distribution of the remainder 47 potential targets according to
their predicted metabolic function is depicted in Figure 2. Eighty
percent (80%, N = 38) of these 47 positive hits are distributed
between four main metabolic function groups: ‘‘Replication,
Transcription and Nucleic acid metabolism’’, ‘‘Translation’’,
‘‘Fatty acid and Phospholipid Metabolism’’ and ‘‘Post-translation-
al Modification and Proteolysis’’.
Previously Untested DrugsIn order to evaluate which of the drugs associated with the
predicted targets had been tested against malaria parasites and
which had not, we ran a literature search in PubMed as described
above. Out of a total of 47 positive hits from the list compiled
above, 32 targets were associated with drugs whose activity has
been previously evaluated against malaria parasites. Examples of
some of these drugs and their corresponding targets are given in
Table 1. However, for 15 of the predicted targets, there were a
total of 13 corresponding drugs that have never been experimen-
tally or clinically tested against malaria or whose evaluation
required further studies (Table 2). The metabolic functions
predicted to be targeted by each of these drugs in the apicoplast
are the following: Replication, Transcription and Nucleic acid
metabolism (5 drugs: azelaic acid, lucanthone, bleomycin,
rifabutin and gemcitabine), Fatty acid and Phospholipid Metab-
olism (3 drugs: ethionamide, nitrofurazone and isoxyl) and post-
translational modification and proteolysis (5 drugs: nitroxoline,
gallium nitrate, sulcrafate, remikeren and aliskeren). Two of these
drugs (azelaic acid and sulcrafate) are predicted to interfere with
more than one peptide and one particular predicted target
(plasmepsin X) is expected to have affinity to more than one drug.
The list of these drugs, their targets, associated toxicity (if any) and
each target’s druggability index is depicted in Table 2.
Discussion
The main objective of this work was to identify drugs that have
been approved for clinical use in humans for conditions other than
malaria, which may have the potential to interfere with the
function of the apicoplast. In validation of our approach, all the
main drugs previously shown to target the apicoplast and their
known targets were identified by our methodology (Table S2,
Table 1) and the following illustrative examples are given. The
Figure 1. Flowchart summarizing the work pipeline and corresponding results. (*denotes the targets that were discarded on the basis ofhaving chemical affinity to dietary supplements/nutraceuticals).doi:10.1371/journal.pone.0059288.g001
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 3 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
antibiotics ciprofloxacin and doxycycline and their respective
targets, the apicoplast’s DNA gyrase and small ribosomal subunits
[8], were correctly pinpointed by our approach. Fosmidomycin, a
drug that is known to target the apicoplast’s 1-deoxy-D-xylulose 5-
phosphate reductoisomerase (DOXP) [15,16], was appropriately
identified. Fusidic acid and its likely target, elongation factor G
[17], involved in the process of translation, were correctly
pinpointed and associated. Consequently, we were confident that
our overall strategy for identifying anti-apicoplast drugs is valid.
Following this precondition, we were able to identify thirteen
drugs that have not yet been evaluated against malaria parasites.
These drugs are supposed to inhibit targets that are involved in
metabolic functions of the apicoplast that have been shown to
render the parasite vulnerable to drugs [8]. For this reason we
suggest that the antimalarial activity of at least some of these
compounds should be investigated further. In the ensuing
paragraphs we refer specifically to five of these drugs that we
suggest may be good candidates for antimalarial testing,
highlighting their advantages but also the constraints that may
limit their direct use in vivo.
Azelaic acid (AA) has been shown to interfere with DNA
synthesis in bacteria [18] and its oral toxicity in mice appears to be
low (.5 g/kg, data from DrugBank). In the present work, our
search suggests that AA may be able to interfere with two targets
involved in DNA repair within the P. falciparum apicoplast: a
peptide with a 59-39 exonuclease, N-terminal resolvase domain
(PF3D7_0203900) and a plastid replication-repair enzyme (PREX)
(PF3D7_1411400). Additionally, according to the data available in
the DrugBank database, AA has a log P value of 1.7, indicating
that the drug may diffuse well through biomembranes [8].
Although this property is not a pre-requisite for the success of
drugs targeting the apicoplast’s biology [8], it may come as a
benefit for apicoplast-targeting drugs, which have to cross a total of
six membranes. However, AA is used commercially in the form of
a topically applied cream and thus the practical aspects of testing it
as an antimalarial may present some challenges.
Lucanthone is one of the earliest described schistosomicides [19]
and was predicted to target the apicoplast’s putative AP-
endonuclease (PF3D7_0305600) in the present work. It was later
replaced largely by hycanthone, its active metabolite. Although
there are no records in the literature about the evaluation of
lucanthone’s antimalarial activity, hycanthone has been hypoth-
esized to possess antimalarial activity in a virtual screen against P.
falciparum with an IC50 value below 5 microM [20]. In the present
day lucanthone is used as an anti-cancer agent where it has been
shown to be well tolerated by humans with no hematological or
gastro-intestinal toxicity at clinically tolerated doses (data from
DrugBank). However, this contrasts with earlier suggestions where
in past shistosomiasis treatment with lucanthone was reported to
produce side effects such hepatotoxicity and gastrointestinal
disturbances following intramuscular injection [21].
Isoxyl (Thiocarlide), a thiourea derivative that was used
successfully for the clinical treatment of TB during the 1960s,
has been shown to display significant antimycobacterial activity
in vitro and is effective against multi-drug resistant strains of
Mycobacterium tuberculosis [22]. In Mycobacteria, isoxyl (ISO) has
been shown to inhibit the synthesis of oleic acid and this effect is
directly attributable to the inhibitory effect of the drug on the
membrane-associated stearoyl-coenzyme A (CoA) (D9) desaturase
DesA3 (Rv3229c) [23]. Results from the present work suggest that
isoxyl may also be able to inhibit the P. falciparum apicoplast
homologue (E-value = 2e252), a putative stearoyl-CoA delta 9
desaturase (PF3D7_0511200). Also, ISO has no known side-effects
[24], which makes it highly appropriate for clinical use in humans.
One likely downside of ISO is the fact that it has a high logP value
of <5.8 (http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.
2272774.html), which makes it virtually insoluble in water with
consequent poor dissolution and bioavailability when it is
delivered exclusively by the oral route [24].
Figure 2. Distribution of the expected apicoplast targetsaccording to their predicted metabolic function in theapicoplast.doi:10.1371/journal.pone.0059288.g002
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 4 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
Nitroxoline (synonym 5-Nitroxin) is an active urinary antibac-
terial agent which has been used since 1962 against susceptible
gram-positive and gram-negative organisms commonly found in
urinary tract infections [25]. It has been suggested that its
antibacterial activity may stem from the metal ion complexation
vital for bacterial growth [26]. More recently, it was discovered
that that nitroxoline has antiangiogenic properties, which also
makes it useful as an anti-cancer drug [27]. We found that
Nitroxoline may be able to interfere with the apicoplast-targeted P.
falciparum putative methionine aminopeptidase 1c
(PF3D7_0804400), which is homologous to the human enzyme
and is expected to be involved in proteolysis within the apicoplast.
Interestingly, nitroxiline was tested in early in vitro studies where it
was shown to display exceptional activity against P. falciparum,
exhibiting an ED50 of approximately 63 nM at 48h post-
exposure, a value which reflected roughly 10X higher potency
than quinine sulfate in that same study, under identical conditions
[28]. In addition to what appears to be a level of high potency
in vitro, nitroxoline displays a logP of 1.9 (data from DrugBank),
which should favor its ability to cross the membranes required to
reach its target. Curiously, the assessment of nitroxoline as a
potential antimalarial for clinical use in vivo appears to have never
been followed-up. For all reasons cited, we argue here that
nitroxoline should be prioritized for further evaluations of its
potential value as an antimalarial drug.
Lastly, we refer to sulcrafate, possibly one of the least obvious
drugs to hold antimalarial activity, due to the fact that it is not an
anti-infective agent per se, but rather an anti-ulcer compound.
Sulcrafate is an approved small molecule, which is a basic
aluminum complex of sulfated sucrose and is orally employed for
prevention and treatment of several gastrointestinal diseases
including gastroesophageal reflux, gastric and duodenal ulcer
[29]. Sucralfate acts, at least partially, through inhibition of the
human pepsin A enzyme [30], which was shown here to be
homologous to four P. falciparum plasmepsins localized to the
apicoplast (plasmepsin X: PF3D7_0808200, plasmepsin I (PMI):
PF3D7_1407900, plasmepsin III,histo-aspartic protease (HAP):
PF3D7_1408100 and plasmepsin VII: PF3D7_1033800). Inter-
estingly, halofantrine, a well-known highly effective antimalarial
has been recently suggested to inhibit plasmepsin X, one of
sulcrafate’s predicted targets [31]. Due to its own therapeutic
nature, sulcrafate is only minimally absorbed from the gastroin-
testinal tract (data from DrugBank) and consequently it is unlikely
to reach systemic therapeutic levels in patients treated orally.
However, since sulcrafate is commercially available in powder
form, it may be tested directly after dilution in an appropriate
vehicle in experimental in vivo models of malaria with administra-
tion via a route other than oral, such as intra-venous or intra-
peritoneal.
Besides the drugs highlighted above, eight further drugs are
predicted to be capable of interfering with apicoplast targets
(Table 2). They were not discussed in detail because we envisage
that some of their inherent properties may render them less
suitable than the above as antimalarial agents. For instance,
bleomycin, gemcitabine and gallium nitrate are three anti-
neoplastic agents and for this reason are more likely to cause
severe side-effects/toxicity in humans in case their direct use is
considered. Indeed, although gallium nitrate’s toxicity parameters
are not available, considerable toxicity is expected from bleomycin
and gemcitabine (Table 2). In other cases, such as those of
rifabutin and ethionamide, we considered that the output
expectation value (E-value) for target homology insufficiently
significant to infer the target’s prediction with a high degree of
confidence. Remikeren and aliskeren are two antihypertensive
agents and for that reason, should present increased challenges as
to their short-term applicability as antimalarials.
ConclusionsWe describe a systematic in silico approach to identify drugs that
have been clinically approved for human use, but have never been
evaluated against malaria parasites based on the principle of
‘‘homologous drug target screening’’. In doing so, we were able to
identify thirteen such drugs that we suggest justify evaluation as
antimalarials. We stress the fact that we have no experimental
evidence to suggest that any of the newly identified drugs will
either display antimalarial activity and/or affect the suggested
targets. It also is possible that their in vivo potencies may be
compromised by absorption, distribution, metabolism, excretion
ad toxicity (ADMET) properties or by lack of appropriate
chemical affinity with their putative target(s). Nevertheless,
primary in vitro drug screens may provide insights into their ability
to inhibit parasite growth and, if any promising activities are
disclosed, they could constitute important leads to the discovery of
novel antimalarials.
Table 1. Examples of drug-target associations previously determined, that were correctly identified in the present study.
Drug(s) P. falciparum target(s) ID Identity to (E-value or score) Pathway Reference(s)
Several quinolones DNA GyrAse a-subunit, putative PF3D7_1223300 DNA gyrase subunit A (P72524 -GYRA_STRPN) (1e250)
Replication [8]
Fusidic acid elongation factor G, putativePF3D7_0602400
Elongation factor G (P13551 -EFG_THETH) (8.7e275)
Translation [17]
Tetracycline apicoplast ribosomal protein S14p/S29eprecursor, putative PF3D7_1137500
30S ribosomal protein S14 (P0AG59 -RS14_ECOLI) (7.5e215)
Translation [32]
Fosmidomycin 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatereductoisomerase PF3D7_1467300
0.99 Isoprenoidbiosynthesis
[16]
Triclosan enoyl-acyl carrier reductase PF3D7_0615100 0.99 Fatty acid synthesis [8]
Geldanamycin heat shock protein 90, putative 0.80 Protein folding [33]
Halofantrine plasmepsin VIII PF3D7_1465700 Plasmepsin-2 (P46925 - PLM2_PLAFA)(9e223)
Proteolysis [31]
(codes in brackets represent the target Identity Code of DrugBank. In the cases of Fosmidomycin, Triclosan and Geldanamycin, there are no homologous targetsrepresented because they were identified using STITCH3.1 which uses an algorithm where homologous targets are not displayed).doi:10.1371/journal.pone.0059288.t001
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 5 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
Ta
ble
2.
Ne
wd
rug
-tar
ge
tas
soci
atio
ns
dis
clo
sed
inth
ep
rese
nt
stu
dy.
Dru
g(b
ran
dn
am
es)
Dru
gca
teg
ory
(ie
s)T
ox
icit
yP
.fa
lcip
aru
mta
rge
t(s)
IDId
en
tity
to(E
-va
lue
)T
DR
TD
rug
ga
bil
ity
Me
tab
oli
cF
un
ctio
n
Az
ela
ica
cid
(Aze
lex,
Eme
rox
11
10
,Em
ero
x1
14
4,
Eme
ry’s
L11
0,
Fin
ace
a,Fi
ne
vin
,Sk
ino
ren
)
An
tin
eo
pla
stic
Ag
en
tsD
erm
ato
log
icA
ge
nts
Ora
lLD
50
inra
t:.
5g
/kg
59-
39
exo
nu
cle
ase
,N
-te
rmin
alre
solv
ase
-lik
ed
om
ain
,p
uta
tive
PF3
D7
_0
20
39
00
DN
Ap
oly
me
rase
I(P
00
58
2-
DP
O1
_EC
OLI
)(2
e2
12
)N
AD
NA
rep
air
pla
stid
rep
licat
ion
-re
pai
re
nzy
me
(PR
EX)
PF3
D7
_1
41
14
00
DN
Ap
oly
me
rase
I(P
00
58
2-
DP
O1
_EC
OLI
)(4
e2
50
)N
AD
NA
rep
air
Lu
can
tho
ne
(Mir
acil
D,
Mir
aco
l,N
ilod
in,
Scap
ure
n,
Tix
anto
ne
)R
adia
tio
n-S
en
siti
zin
gA
ge
nts
An
tica
nce
rA
ge
nts
Sch
isto
som
icid
es
NA
AP
en
do
nu
cle
ase
(DN
A-(
apu
rin
ico
rap
yrim
idin
icsi
te)
lyas
e),
pu
tati
veP
F3D
7_
03
05
60
0
DN
A-(
apu
rin
ico
rap
yrim
idin
icsi
te)
lyas
e(P
27
69
5-
AP
EX1
_H
UM
AN
)(8
e2
24
)
NA
DN
Are
pai
r
Ble
om
yci
n(B
len
oxa
ne
,B
leo
)A
nti
me
tab
olit
es
An
tib
ioti
cs,
An
tin
eo
pla
stic
Exce
ssiv
ee
xpo
sure
may
cau
sefe
ver,
chill
s,n
ause
a,vo
mit
ing
,m
en
tal,
con
fusi
on
,an
dw
he
ezi
ng
.B
leo
myc
inm
ayca
use
irri
tati
on
toe
yes,
skin
and
resp
irat
ory
trac
t.It
may
also
cau
sea
dar
ken
ing
or
thic
ken
ing
of
the
skin
.It
may
cau
sean
alle
rgic
reac
tio
n.
DN
Alig
ase
1P
F3D
7_
13
04
10
0D
NA
ligas
e1
(P1
88
58
-D
NLI
1_
HU
MA
N)
(4e
21
18
)N
AR
ep
licat
ion
Rif
ab
uti
n(A
lfac
id,
An
sam
ycin
,M
yco
bu
tin
)A
nti
-Bac
teri
alA
ge
nts
An
tib
ioti
cs,
An
titu
be
rcu
lar
LD5
0=
4.8
g/k
g(m
ou
se,
mal
e)
DN
A-d
ire
cte
dR
NA
po
lym
era
seal
ph
ach
ain
,p
uta
tive
PF3
D7
_1
30
76
00
DN
A-d
ire
cte
dR
NA
po
lym
era
seal
ph
ach
ain
(P0
A7
Z4
-R
PO
A_
ECO
LI)
(1e
28
)
NA
Re
plic
atio
n
Ge
mci
tab
ine
(DD
FC,
DFD
C,
Ge
mci
n)
Ge
mci
tab
ine
hyd
roch
lori
de
,G
em
tro
,G
em
zar,
GEO
)
An
tin
eo
pla
stic
Ag
en
tsA
nti
vira
lA
ge
nts
Rad
iati
on
-Se
nsi
tizi
ng
Ag
en
tsA
nti
me
tab
olit
es
Enzy
me
Inh
ibit
ors
Imm
un
osu
pp
ress
ive
Ag
en
ts
Mye
losu
pp
ress
ion
,p
are
sth
esi
as,
and
seve
rera
shw
ere
the
pri
nci
pal
toxi
citi
es,
LD5
0=
50
0m
g/k
g(o
rally
inm
ice
and
rats
)
UM
P-C
MP
kin
ase
,p
uta
tive
PF3
D7
_0
11
15
00
UM
P-C
MP
kin
ase
(P3
00
85
-K
CY
_H
UM
AN
)(9
e2
22
)N
AN
ucl
eic
acid
me
tab
olis
m
Eth
ion
am
ide
(Ae
thio
nam
idu
m,
Ae
tin
a,A
eti
va,
Am
idaz
in,
Am
idaz
ine
,A
tin
a,B
aye
r5
31
2,
Eth
imid
e,
Eth
ina,
Etim
id)
Lep
rost
atic
Ag
en
tsA
nti
tub
erc
ula
rA
ge
nts
Fatt
yA
cid
Syn
the
sis
Inh
ibit
ors
Sym
pto
ms
of
ove
rdo
sein
clu
de
con
vuls
ion
s,n
ause
a,an
dvo
mit
ing
en
oyl
-acy
lca
rrie
rre
du
ctas
eP
F3D
7_
06
15
10
0En
oyl
-[ac
yl-c
arri
er-
pro
tein
]re
du
ctas
e[N
AD
H]
(P0
A5
Y6
-IN
HA
_M
YC
TU
)(4
e2
9)
NA
FAS
Nit
rofu
raz
on
e(A
ctin
-N,
Ald
om
ycin
,A
lfu
cin
,A
mif
ur,
Bab
roci
d,
Be
cafu
razo
ne
,B
iofu
raci
na,
Bio
fure
a,C
he
mo
fura
n,
Ch
ixin
)
An
ti-I
nfe
ctiv
eA
ge
nts
An
ti-I
nfe
ctiv
eA
ge
nts
,Lo
cal
Try
pan
oci
dal
Ag
en
tsA
nti
-In
fect
ive
Ag
en
ts,
Uri
nar
y
Rat
LD5
0=
59
0m
g/k
g;
Alle
rgic
con
tact
de
rmat
itis
isth
em
ost
fre
qu
en
tly
rep
ort
ed
adve
rse
eff
ect
,o
ccu
rrin
gin
app
roxi
mat
ely
1%
of
pat
ien
tstr
eat
ed
.
lipo
amid
ed
eh
ydro
ge
nas
e,
pu
tati
veP
F3D
7_
08
15
90
0G
luta
thio
ne
red
uct
ase
(P0
67
15
-G
SHR
_EC
OLI
)(1
e2
18
)0
.3FA
SA
nti
oxi
dan
t
Iso
xy
l(T
hio
carl
ide
)A
nti
-bac
teri
alag
en
tsN
Ast
ear
oyl
-Co
Ad
elt
a9
de
satu
rase
,p
uta
tive
PF3
D7
_0
51
12
00
Acy
l-C
oA
de
satu
rase
(TT
DS0
05
16
)(2
e2
52
)0
.1FA
S
Nit
rox
oli
ne
(Gal
ino
k,Is
ino
k,N
ice
ne
fort
e,
No
xib
iol,
No
xin
)A
nti
fun
gal
Ag
en
tsA
nti
-In
fect
ive
Ag
en
ts,
Uri
nar
y
NA
me
thio
nin
eam
ino
pe
pti
das
e1
c,p
uta
tive
PF3
D7
_0
80
44
00
Me
thio
nin
eam
ino
pe
pti
das
e1
(P5
35
82
-A
MP
M1
_H
UM
AN
)(2
e2
29
)
0.3
Pro
teo
lysi
s
Ga
lliu
mN
itra
te(G
anit
e)
An
tin
eo
pla
stic
Ag
en
tsN
Ap
rote
inp
ho
sph
atas
e,
pu
tati
veP
F3D
7_
14
69
20
0P
rote
in-t
yro
sin
e-p
ho
sph
ata
se(Q
9S4
27
–Q
9S4
27
_9
GA
MM
)(2
e2
16
)
NA
Ph
osp
ho
ryla
tio
n
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 6 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
Supporting Information
Table S1 List of apicoplast-targeted proteins withpredicted aminoacid (AA) sequences.(XLSX)
Table S2 Predicted targets list. (DB: DrugBank; TTD:
Therapeutic Targets Database: DS: dietary supplement or
nutraceutical. TDRT: Tropical Disease Research Targets; Blank
cells denote that no data was available).
(XLSX)
Acknowledgments
The authors wish to thank Professor Jose Clecildo Barreto Bezerra for his
encouragements throughout the course of this work.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: PC. Performed the experiments:
NB RC LAS PC. Analyzed the data: NB RC PC. Wrote the paper: PC
RC.
References
1. World Health Organization (2011) World Malaria Report 2011. WHO:
Geneva. http://www.who.int/malaria/world_malaria_report_2011/
9789241564403_eng.pdf.
2. Woodrow CJ, Krishna S (2006) Antimalarial drugs: recent advances in
molecular determinants of resistance and their clinical significance. Cell Mol
Life Sci 63(14): 1586–96.
3. Le Bras J, Durand R (2003) The mechanisms of resistance to antimalarial drugs
in Plasmodium falciparum. Fundam Clin Pharmacol 17(2): 147–53.
4. Wilson RJ, Williamson DH, Preiser P (1994) Malaria and other Apicomplexans:
the "plant" connection. Infect Agents Dis 3(1): 29–37.
5. McFadden GI, Reith ME, Munholland J, Lang-Unnasch N (1996) Plastid in
human parasites. Nature 381(6582): 482.
6. Moore RB, Obornık M, Janouskovec J, Chrudimsky T, Vancova M, et al. (2008)
A photosynthetic alveolate closely related to apicomplexan parasites. Nature
451(7181): 959–63.
7. Ralph SA, van Dooren GG, Waller RF, Crawford MJ, Fraunholz MJ, et al.
(2004) Tropical infectious diseases: metabolic maps and functions of the
Plasmodium falciparum apicoplast. Nat Rev Microbiol 2004 Mar;2(3): 203–16.
8. Botte CY, Dubar F, McFadden GI, Marechal E, Biot C (2012) Plasmodium
falciparum apicoplast drugs: targets or off-targets? Chem Rev 112(3): 1269–83.
9. Knox C, Law V, Jewison T, Liu P, Ly S, et al. (2011) DrugBank 3.0: a
comprehensive resource for ‘omics’ research on drugs. Nucleic Acids Res
39(Database issue): D1035–41.
10. Kuhn M, Szklarczyk D, Franceschini A, von Mering C, Jensen LJ, et al. (2012)
STITCH 3: zooming in on protein-chemical interactions. Nucleic Acids Res
40(Database issue): D876–80.
11. Zhu F, Shi Z, Qin C, Tao L, Liu X, et al. (2012) Therapeutic target database
update 2012: a resource for facilitating target-oriented drug discovery. Nucleic
Acids Res 40(D1): D1128–1136.
12. Ginsburg, Hagai. ‘‘Malaria Parasite Metabolic Pathways’’ website. Available:
http://priweb.cc.huji.ac.il/malaria/. Accessed 2013 February 25.
13. GeneDB Plasmodium falciparum genome database. Available: http://www.genedb.
org/Homepage/Pfalciparum. Accessed 2013 February 25.
14. The TDR targets Database. Available: http://www.tdrtargets.org/. Accessed
2013 February 25.
15. Jomaa H, Wiesner J, Sanderbrand S, Altincicek B, Weidemeyer C, et al. (1999)
Inhibitors of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis as
antimalarial drugs. Science 285(5433): 1573–6.
16. Umeda T, Tanaka N, Kusakabe Y, Nakanishi M, Kitade Y, et al. (2011)
Molecular basis of fosmidomycin’s action on the human malaria parasite
Plasmodium falciparum. Sci Rep: 1: 9.
17. Johnson RA, McFadden GI, Goodman CD (2011) Characterization of two
malaria parasite organelle translation elongation factor G proteins: the likely
targets of the anti-malarial fusidic acid. PLoS One 6(6): e20633.
18. Galhaup I (1989) Azelaic acid: mode of action at cellular and subcellular levels.
Acta Derm Venereol Suppl (Stockh) 143: 75–82.
19. Archer S (1974) Recent progress in the chemotherapy of schistosomiasis. Prog
Drug Res 18: 15–24.
20. Mahmoudi N, de Julian-Ortiz JV, Ciceron L, Galvez J, Mazier D, et al. (2006)
Identification of new antimalarial drugs by linear discriminant analysis and
topological virtual screening. J Antimicrob Chemother 57(3): 489–97.
21. Shekhar KC (1991) Schistosomiasis drug therapy and treatment considerations.
Drugs 42(3): 379–405.
Ta
ble
2.
Co
nt.
Dru
g(b
ran
dn
am
es)
Dru
gca
teg
ory
(ie
s)T
ox
icit
yP
.fa
lcip
aru
mta
rge
t(s)
IDId
en
tity
to(E
-va
lue
)T
DR
TD
rug
ga
bil
ity
Me
tab
oli
cF
un
ctio
n
Su
cra
lfa
te(A
nte
psi
n,
Ap
o-s
ucr
alfa
te,
Car
afat
e,
Sucr
amal
,Su
lcra
te,
Sulc
rate
Susp
en
sio
nP
lus,
Ulc
ar,
Ulc
erb
an,
Ulc
erl
min
,U
lce
rmin
)
An
ti-U
lce
rA
ge
nts
Acu
teo
ral
toxi
city
(LD
50
)in
mic
eis
.8
00
0m
g/k
g.
Th
ere
islim
ite
de
xpe
rie
nce
inh
um
ans
wit
ho
verd
osa
ge
of
sucr
alfa
te.
Sucr
alfa
teis
on
lym
inim
ally
abso
rbe
dfr
om
the
gas
tro
inte
stin
altr
act
and
thu
sri
sks
asso
ciat
ed
wit
hac
ute
ove
rdo
sag
esh
ou
ldb
em
inim
al.
pla
sme
psi
nX
PF3
D7
_0
80
82
00
Pe
psi
nA
(P0
07
90
-P
EPA
_H
UM
AN
)(7
e2
43
)0
.6P
rote
oly
sis
pla
sme
psi
nI
(PM
I)P
F3D
7_
14
07
90
0P
ep
sin
A(P
00
79
0-
PEP
A_
HU
MA
N)
(5e
24
1)
0.8
Pro
teo
lysi
s
pla
sme
psi
nIII
,his
to-a
spar
tic
pro
teas
e(H
AP
)P
F3D
7_
14
08
10
0P
ep
sin
A(P
00
79
0-
PEP
A_
HU
MA
N)
(2e
23
4)
0.8
Pro
teo
lysi
s
pla
sme
psi
nV
IIP
F3D
7_
10
33
80
0P
ep
sin
A(P
00
79
0-
PEP
A_
HU
MA
N)
(2e
22
5)
0.3
Pro
teo
lysi
s
Re
mik
ire
nA
nti
hyp
ert
en
sive
Ag
en
tsP
rote
ase
Inh
ibit
ors
NA
pla
sme
psi
nX
PF3
D7
_0
80
82
00
Re
nin
(P0
07
97
-R
ENI_
HU
MA
N)
(1e
22
6)
0.6
Pro
teo
lysi
s
Ali
skir
en
(Ras
ilez,
Te
ktu
rna)
An
tih
ype
rte
nsi
veA
ge
nts
Th
em
ost
like
lym
anif
est
atio
no
fo
verd
osa
ge
wo
uld
be
hyp
ote
nsi
on
pla
sme
psi
nX
PF3
D7
_0
80
82
00
Re
nin
(P0
07
97
-R
ENI_
HU
MA
N)
(1e
22
6)
0.6
Pro
teo
lysi
s
(NA
:n
ot
avai
lab
le;
cod
es
inb
rack
ets
rep
rese
nt
the
targ
et
Ide
nti
tyC
od
eo
fD
rug
Ban
k.T
oxi
city
dat
ais
cite
dfr
om
Dru
gB
ank;
FAS:
Fatt
yA
cid
Syn
the
sis;
LD5
0:
dru
gd
ose
that
resu
lts
ind
eat
ho
f5
0%
of
the
anim
als)
.d
oi:1
0.1
37
1/j
ou
rnal
.po
ne
.00
59
28
8.t
00
2
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 7 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
22. Phetsuksiri B, Baulard AR, Cooper AM, Minnikin DE, Douglas JD, et al. (1999)
Antimycobacterial activities of isoxyl and new derivatives through the inhibitionof mycolic acid synthesis. Antimicrob Agents Chemother 43(5): 1042–51.
23. Phetsuksiri B, Jackson M, Scherman H, McNeil M, Besra GS, et al. (2003)
Unique mechanism of action of the thiourea drug isoxyl on Mycobacteriumtuberculosis. J Biol Chem 278(52): 53123–30.
24. Wang C, Hickey AJ (2010) Isoxyl aerosols for tuberculosis treatment:preparation and characterization of particles. AAPS PharmSciTech 11(2):
538–49.
25. Bergogne-Berezin E, Berthelot G, Muller-Serieys C (1987) [Present status ofnitroxoline]. Pathol Biol (Paris). 35(5 Pt 2): 873–8.
26. Pelletier C, Prognon P, Bourlioux P (1995) Roles of divalent cations and pH inmechanism of action of nitroxoline against Escherichia coli strains. Antimicrob
Agents Chemother 39(3): 707–13.27. Shim JS, Matsui Y, Bhat S, Nacev BA, Xu J, et al. (2010) Effect of nitroxoline on
angiogenesis and growth of human bladder cancer. J Natl Cancer Inst 102(24):
1855–73.
28. Scheibel LW, Adler A (1981) Antimalarial activity of selected aromatic chelators.
II. Substituted quinolines and quinoline-N-oxides. Mol Pharmacol 20(1): 218–
23.
29. Rees WD (1991) Mechanisms of gastroduodenal protection by sucralfate.
Am J Med 91(2A): 58S–63S.
30. Jensen SL, Funch Jensen P (1992) Role of sucralfate in peptic disease. Dig Dis
10(3): 153–61.
31. Friedman R, Caflisch A (2009) Discovery of plasmepsin inhibitors by fragment-
based docking and consensus scoring. ChemMedChem 4(8): 1317–26.
32. Wiesner J, Reichenberg A, Heinrich S, Schlitzer M, Jomaa H (2008) The
plastid-like organelle of apicomplexan parasites as drug target. Curr Pharm Des
14(9): 855–71.
33. Shonhai A (2009) Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.
FEMS Immunol Med Microbiol 58(1): 61–74.
Antimalarial Drugs
PLOS ONE | www.plosone.org 8 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59288
75
6 DISCUSSÃO GERAL
No presente trabalho, utilizamos a metodologia de busca sistemática de
alvos de fármacos previstos e hipotéticos do metabolismo energético de Leishmania e
do metabolismo geral do apicoplasto de P. falciparum, visando reposicionar tais
fármacos para o tratamento das leishmanioses e da malária, respectivamente.
Nossa busca baseou-se no principio da similaridade do alvo, que consiste na
identificação de fármacos ou inibidores que atuam contra alvos semelhantes, mas
pertencentes a organismos diferentes. Utilizamos a sequência peptídica de cada alvo
para interrogar as bases de dados: Therapeutic Targets, Drug Bank e STITCH para obter
inibidores ou fármacos aprovados para cada alvo de interesse. Nossa busca resultou em
15 fármacos que atuam especificamente contra enzimas do metabolismo energético
(artigo1) e 13 fármacos inibidores proteicos do metabolismo do apicoplasto de P.
falciparum (artigo 2). Alguns desses fármacos apresentam maior potencial terapêutico e
maior viabilidade para testes in vitro e in vivo, por essas razões, os descrevemos em
detalhes nas seções seguintes.
6.1 Fármacos que atuam no metabolismo energético de Leishmania
spp
A Lonidamina ou Ionidamina (Doridamina) (LND, 1-(2,4-dichlorobenzyl)-1,H-
indazol-3-carboxylic acid) foi desenvolvida como agente antiespermatogênico, mas
provou ser eficaz contra células de alta atividade metabólica, tais como células
cancerígenas e de protozoários (FLORIDI et al., 1981; SHARLOW et al., 2010). Em
células tumorais, LND afeta a glicólise e a produção de lactato pela inibição de uma
hexoquinase ligada à mitocôndria (FLORIDI et al., 1981). Em formas promastigotas de
L. mexicana e epimastigotas de Trypanosoma cruzi, a inibição foi alcançada com LD50
de ~260 M e ~80 M, respectivamente. O mecanismo de ação de LND foi atribuído à
inibição do metabolismo energético (FLORIDI et al., 1981). Em T. brucei, causador da
tripanossomíase africana, foi demonstrado que o LND atua inibindo a hexoquinase de
formas pró-ciclicas desse parasito. Os resultados desse experimento indicam a
76
hexoquinase como um importante alvo terapêutico para lonidamina (CHAMBERS,
2007).
O Nadide é um fármaco aprovado para o tratamento da doença de Parkinson,
doença de Alzheimer, doença cardiovascular (dados do Drugbank). Mais recentemente,
estudos com câncer de mama e de longevidade têm revelado a importância dessa
pequena molécula. Nadide é a forma comercial da molécula de NADH produzida pelos
seres vivos a partir da redução da Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD).
Desde sua descoberta no começo do século XX até os dias atuais, o
conhecimento da importância dessa pequena molécula aumentou muito. O papel mais
conhecido do NAD é o de transportador de elétrons, nas reações de oxi-redução.
Entretanto, outras funções, tais como transdução de sinal, modificação de proteínas e
DNA, são também atribuídas a ela (CHEN et al., 2008). Recentemente, (GAZANION
et al., 2011) demonstraram que a homeostase do NAD+ é essencial para a biologia e
virulência de Leishmania. Esses autores verificaram que a nicotinaminidase, que
converte a nicotinamida em ácido nicotínico, é a enzima chave para gerar NAD+ a
partir de seus precursores. Interessantemente é que os precursores (nicotinamida, ácido
nicotínico, ribosídeo nicotinamida) são derivados do hospedeiro e a referida enzima não
é encontrada em mamíferos (GAZANION et al., 2011).
Sulfacetamida de Sódio ou sulfacetamida é um bacteriostático que atua contra
bactérias Gram positivas e Gram negativas sensíveis à sulfonamida, geralmente isoladas
de infecções secundárias da pele. Os micro-organismos susceptíveis são Streptococci,
Staphylococci, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas pyocyanea, espécies de
Salmonella, Proteus vulgaris, Nocardia. A dose letal oral (LD50) para camundongos é
16500 mg/kg. Para humanos, os efeitos colaterais incluem eritema, edema moderado,
náusea, vômito, cefaleia. Além desses efeitos, a síndrome de Stevens-Johnson foi
relatada em pacientes HIV positivos após receberem gotas de sulfacetamida para
tratamento de infecções oculares. Todos esses efeitos, entretanto, estão relacionados à
administração oral ou alta absorção na pele, mucosas e conjuntivas. O uso tópico da
medicação não produz fortes efeitos colaterais como citados anteriormente, a não ser em
indivíduos com hipersensibilidade à sulfonamida.
A sulfocetamida atua como inibidor da manose-6-fosfato-isomerase (também
conhecida como fosfomanose isomerase, PMI), enzima considerada chave para o
metabolismo energético de Kinetoplastídeos. Essa enzima faz isomerização da frutose-
77
6-fosfato em manose-6-fosfato. A PMI de Kinetoplastideos tem baixa identidade com a
enzima humana (E value de 3E-59) que a torna um alvo interessante para teste com
novas drogas.
6.2 Fármacos que atuam no apicoplasto de P. falciparum
O ácido azelaico (AA) atua na síntese de DNA em bactérias (GALHAUP, 1988)
e apresenta baixa toxicidade em modelos animais. No presente trabalho, nossa busca
sugere que o AA interfere com dois alvos envolvidos no reparo do DNA do apicoplasto
de P. falciparum: uma exonuclease 5’- 3’ , resolvase de domínio N-terminal e uma
enzima de replicação e reparo de plastídeo. Além disso, de acordo com as informações
disponíveis na base de dados DrugBank, o AA tem um valor do coeficiente de partição
(logP) de 1,7 , indicando que o fármaco tem alta capacidade de atravessar as membranas
celulares. Embora essa propriedade não seja um pré-requisito para os fármacos que
interferem na biologia do apicoplasto (BOTTÉ; DUBAR; MCFADDEN, 2011), ela
poderia ser vantajosa para aqueles que agem nessa organela, pois teriam que atravessar
seis membranas até atingir a molécula-alvo. Todavia, o AA está disponível
comercialmente apenas na forma de creme de uso tópico e assim, em termos práticos,
testá-lo como antimalárico poderia apresentar alguns desafios.
O Lucantone foi primeiramente descrito como esquistossomicida (ARCHER,
1974) e supostamente atua contra uma AP-endonuclease, um alvo hipotético do
apicoplasto. Posteriormente foi substituído pelo hicantone, seu metabólito primário.
Embora não haja relato na literatura sobre a avaliação antimalárica do lucantone, o
hicantone apresentou atividade antimalárica em screening virtuais contra P. falciparum
com um IC50 abaixo de 5,0 microM (MAHMOUDI et al., 2006). Atualmente, o
lucantone tem sido testado na terapia anticâncer, apresentando boa tolerância em
humanos sem toxicidade hematológica ou gastrointestinal para doses clinicamente
toleradas. Entretanto, isso contrasta com sugestões anteriores nas quais o tratamento da
esquistossomose com lucantone relatava produzir efeitos colaterais tais como:
hepatoxicidade e distúrbios gastrointestinais após administração intramuscular
(SHEKHAR, 1991).
O isoxil (Tiocarlida), um derivado da tioureia, foi amplamente usado durante os
anos 1960 para tratamento clínico da tuberculose e tem demonstrado ser efetivo em
78
atividade in vitro contra cepas multidroga resistente de Mycobacterium tuberculosis
(PHETSUKSIRI; BAULARD, 1999). Em M. tuberculosis, isonoxil (ISO) atua inibindo
a síntese de ácido oleico e este efeito está diretamente relacionado à ação inibitória do
fármaco a uma desnaturase esteroil-coenzima A associada à membrana, DesA3
(PHETSUKSIRI; JACKSON, 2003). Os resultados do presente trabalho sugerem que o
isoxil é capaz de inibir uma suposta desnaturase esteroil-CoA delta 9 homóloga (valor
de E= 2e252) encontrada no apicoplasto de P. falciparum. Além disso, o ISO não tem
efeitos colaterais conhecidos (WANG; HICKEY, 2010) o que o torna altamente
apropriado para uso clínico em humanos. O aspecto negativo do ISO e que ele tem um
alto valor de logP de aproximadamente 5,8, que o faz virtualmente insolúvel em água
com consequente pobre dissolução e biodisponibilidade quando administrado por via
oral (WANG; HICKEY, 2010)
O nitroxolina (sinônimo 5-Nitroxina) é um agente antibacteriano urinário que
tem sido usado desde 1962 contra organismos gram-positivos e gram-negativos,
comumente encontrados em infecções do trato urinário (BERGOGNE-BEREZIN,
1987). O mecanismo de ação sugerido é a quelação de íons metálicos vitais para o
crescimento bacteriano (PELLETIER; PROGNON; BOURLIOUX, 1995). Mais
recentemente, foi descoberto que a nitroxilina tem propriedades antiangiogênicas, que o
faz útil como fármaco anticâncer (SHIM; MATSUI; BHAT, 2010). Nossos resultados
indicam que a nitroxolina poderia interferir com uma suposta metionina aminopeptidase
1c encontrada no apicoplasto de P. falciparum, que é homóloga da enzima humana e
supõe estar envolvida na proteólise dentro do apicoplasto. Notavelmente, a nitroxilina
demonstrou excepcional atividade in vitro contra P. falciparum exibindo uma Dose
Efetiva (ED50) de aproximadamente 63 nM em 48h pós exposição, um valor que reflete
sensivelmente uma potência 10 vezes mais alta do que o sulfato de quinina neste mesmo
estudo, sob as mesmas condições (SCHEIBEL; ADLER, 1981). Além disso, pelos
resultados observados in vitro, a nitroxilina apresenta um logP de 1.9 o qual poderia
favorecer sua habilidade de atravessar a membrana e alcançar seus alvos. Curiosamente,
a avaliação da nitroxilina como um potencial antimalárico para uso clínico in vivo
parece nunca ter sido investigado. Por essas razões, consideramos que a nitroxilina
poderia ser priorizada para maiores avaliações de seu potencial valor como um fármaco
antimalárico.
79
Por último, referimos ao sucralfato, possivelmente um dos fármacos de menor
atividade antimalárica, em razão de não ser um agente anti-infectivo propriamente dito,
mas um composto antiúlcera. O sucralfato é uma pequena molécula aprovada,
basicamente formada de sulfato de sacarose e hidróxido de alumínio, administrada
oralmente para a prevenção e tratamento de várias doenças gastrointestinais, incluindo
refluxo gastroesofágico, úlcera gástrica e duodenal (REES, 1991). O sucralfato age,
pelo menos parcialmente, através da inibição da pepsina A humana (JENSEN;
JENSEN, 1992), na qual identificamos aqui ser homóloga a quatro plasmepsinas
localizadas no apicoplasto: plasmepsina X, plasmepsina I, plasmepsina III,
histoaspártico protease (HAP) e plasmepsina VII. Interessantemente, foi recentemente
sugerido que o holofantrine inibe a plasmepsina X, um dos alvos previstos do sucralfato
(FRIEDMAN; CAFLISCH, 2009). Devido a sua própria natureza terapêutica, o
sucralfato tem baixa absorção gastrointestinal e, consequentemente, é improvável que
alcance níveis terapêuticos sistêmicos em pacientes tratados por via oral. Entretanto,
visto que o sucralfato está disponível na forma de pó ele poderia ser testado
diretamente, após ser diluído em veículo apropriado, em modelos experimentais in vivo
com via de administração além da oral, tais como a intravenosa ou intraperitoneal.
Além dos fármacos discutidos acima, mais oito fármacos são previstos ser
capazes de interferir com alvos do apicoplasto. Eles não foram discutidos em detalhes
porque consideramos que algumas de suas propriedades intrínsecas poderiam torná-los
menos adequados do que os agentes antimaláricos discutidos acima. Por exemplo,
bleomicina, gemcitabina e nitrato de galium são três agentes antineoplásicos e por essa
razão são mais prováveis causar efeitos colaterais/toxicidade em humanos em caso de
uso direto. Sendo assim, embora os parâmetros de toxicidade do nitrato de galium não
estejam disponíveis, considerável toxicidade é esperada para a bleomicina e
gemcitabina. Em outros casos, tais como aqueles da rifabutina e etionamida, nós
consideramos que o valor esperado (E-value) para a homologia do alvo é
insuficientemente significante para inferir a previsão do alvo com um alto grau de
confiança. O remikeren e aliskeren são dois agentes hipertensivos, por esta razão, a
aplicabilidade a curto prazo desses fármacos como antimaláricos exigiria maiores
desafios.
80
7 CONCLUSÕES GERAIS
Utilizando as bases de dados TDR targets, Gene DB, TriTrypDB e PlasmoDB
fomos capazes de identificar 94 genes relacionados ao metabolismo energético de
Leishmania spp e seus produtos, bem como aproximadamente 600 genes e seus
produtos do metabolismo geral do apicoplasto. A partir da sequência de aminoácidos de
cada alvo, identificamos nas bases de dados DrugBank, Therapeutic Targets e Stitch
fármacos aprovados para uso humano que atuassem seletivamente sobre os alvos de
interesse.
Nossa busca baseou-se no princípio similaridade do alvo de fármacos do
metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P. falciparum. Para o
metabolismo energético de Leishmania spp identificamos 44 alvos capazes de interagir
com moléculas inibidoras e fármacos aprovados. Desse total, 33 alvos foram
descartados por interagir com substância classificadas como nutracêuticas, utilizadas
como suplementos energéticos. Os 11 alvos restantes demonstraram interagir com 15
fármacos aprovados para uso humano e que nunca foram usados para tratamento da
leishmaniose.
Para o metabolismo geral do apicoplasto, 72 alvos apresentaram interação com
inibidores, dos quais 25 foram descartados por apresentar afinidade com suplementos
dietéticos. Os demais 47 alvos foram positivos para fármacos aprovados e não
aprovados e/ou em fase de testes. Desse total, 13 fármacos aprovados para uso humano
demonstraram interagir com 15 alvos do metabolismo geral do apicoplasto.
Nós enfatizamos que não temos evidências experimentais para sugerir que esses
fármacos recém-identificados poderiam apresentar atividade antileishmania ou
antimalárica e/ou afetar os alvos sugeridos. Além disso, é possível que sua efetividade
in vivo pudesse ser comprometida por fatores, tais como: absorção, distribuição,
metabolismo, excreção e toxicidade ou por falta de afinidade química apropriada com
seus supostos alvos. Contudo, triagens de fármacos in vitro poderiam fornecer insights
na sua capacidade para inibir o crescimento do parasito e, se algumas dessas atividades
reveladas forem promissoras, elas poderiam constituir importantes iniciativas para a
descoberta de novos fármacos antileishmania e antimalárico.
81
8 REFERÊNCIAS
ADAMS, C. P.; BRANTNER, V. V. Estimating the cost of new drug
development: is it really 802 million dollars? Health affairs (Project Hope), v. 25, n.
2, p. 420–428, 2006.
ALVAR, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence.
PLoS ONE, v. 7, n. 5, p. e35671, jan. 2012.
AMATO, V. S. et al. Treatment of mucosal leishmaniasis in Latin America:
systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 77,
n. 2, p. 266–274, ago. 2007.
ANDRADE, C. H.; BRAGA, R. C. Editorial: drug metabolism, toxicology
experimental determination and theoretical prediction: challenges and perspectives from
a medicinal chemistry point of view. Current topics in medicinal chemistry, v. 14, n.
11, p. 1323–1324, jan. 2014.
ARCHER, S. Recent progress in the chemotherapy of schistosomiasis. Progress
in Drug Research/Fortschritte der Arzneimittelforschung/Progrès des recherches
pharmaceutiques. Birkhäuser Base, p. 15–24, 1974.
ASHBURN, T. T.; THOR, K. B. Drug repositioning: identifying and developing
new uses for existing drugs. Nature reviews. Drug discovery, v. 3, n. 8, p. 673–683,
ago. 2004.
ASLETT, M. et al. TriTrypDB: a functional genomic resource for the
Trypanosomatidae. Nucleic Acids Research, v. 38, n. Database issue, p. D457–462,
jan. 2010.
BAIRD, J.; HOFFMAN, S. Primaquine therapy for malaria. Clinical infectious
diseases, v. 39, p. 1336–1345, 2004.
BASCO, L. K.; RINGWALD, P. In Vitro Activities of Piperaquine and Other 4-
Aminoquinolines against Clinical Isolates of Plasmodium falciparum in Cameroon In
82
Vitro Activities of Piperaquine and Other 4-Aminoquinolines against Clinical Isolates
of Plasmodium falciparum in Cameroon. Antimicrobial agents and chemotherapy, v.
47, n. 4, p. 1391–1394, 2003.
BAYOH, M. N. et al. Anopheles gambiae: historical population decline
associated with regional distribution of insecticide-treated bed nets in western Nyanza
Province, Kenya. Malaria journal, v. 9, n. 62, p. 1–12, jan. 2010.
BEN SALAH, A. et al. Topical paromomycin with or without gentamicin for
cutaneous leishmaniasis. The New England journal of medicine, v. 368, n. 6, p. 524–
532, 7 fev. 2013.
BERGOGNE-BEREZIN, E. Present status of nitroxoline. Pathologie-biologie,
v. 35, n. 5 Pt 2, p. 873–878, 1987.
BLAKE, R. M.; ADAMS, J. Global Research Report - Neglected Tropical
Diseases. Thomson Reuters Global Research Report, n. June, p. 1–14, 2012.
BOTTÉ, C.; DUBAR, F.; MCFADDEN, G. Plasmodium falciparum apicoplast
drugs: targets or off-targets? Chemical reviews, v. 112, n. 3, p. 1269–1283, 2011.
BRAGA, R. C. et al. Virtual screening strategies in medicinal chemistry: the
state of the art and current challenges. Current topics in medicinal chemistry, v. 14, n.
16, p. 1899–1912, jan. 2014.
BRINGAUD, F.; RIVIÈRE, L.; COUSTOU, V. Energy metabolism of
trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical
parasitology, v. 149, n. 1, p. 1–9, set. 2006.
CAIRNS, M. et al. Amodiaquine dosage and tolerability for intermittent
preventive treatment to prevent malaria in children. Antimicrobial agents and
chemotherapy, v. 54, n. 3, p. 1265–1274, mar. 2010.
CHAMBERS, J. W. ET AL. Chapter Three The Anti-Trypanosomal Agent
Lonidamine Inhibits Trypanosoma Brucei Hexokinase. Studies in the Biochemistry
and Cell Biology of Trypanosoma Brucei Hexokinases, n. December, p. 63, 2007.
83
CHAPPUIS, F. et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis,
treatment and control? Nature reviews. Microbiology, v. 5, n. 11, p. 873–882, nov.
2007.
CHEN, L. et al. Nicotinamide adenine dinucleotide based therapeutics. Current
Medicinal Chemistry, v. 15, n. 7, p. 650–670, jan. 2008.
CHEN, X.; JI, Z. L.; CHEN, Y. Z. TTD: Therapeutic Target Database. Nucleic
Acids Research, v. 30, p. 412–415, 2002.
CHURCHILL, F. C. et al. Amodiaquine as a prodrug: importance of
metabolite(s) in the antimalarial effect of amodiaquine in humans. Life sciences, v. 36,
p. 53–62, 1985.
CONTEH, L.; ENGELS, T.; MOLYNEUX, D. H. Socioeconomic aspects of
neglected tropical diseases. Lancet, v. 375, n. 9710, p. 239–247, 16 jan. 2010.
COWMAN, A. F.; GALATIS, D.; THOMPSON, J. K. linked to amplification of
the pfmdrl gene and cross-resistance. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 91, n. February, p.
1143–1147, 1994.
CROWTHER, G. J. et al. Identification of attractive drug targets in neglected-
disease pathogens using an in silico approach. PLoS Neglected Tropical Dseases, v. 4,
n. 8, p. e804, jan. 2010.
DAHL, E. L. et al. Tetracyclines specifically target the apicoplast of the malaria
parasite Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 50, n. 9,
p. 3124–3131, set. 2006.
DAUMERIE, DENIS; SAVIOLI, L. Working to overcome the global impact of
neglected tropical diseases: first WHO report on neglected tropical diseases. 2010.
DE REVIERS, B. Farmacologia básica e clínica: Lange. [s.l.] AMGH Editora,
2013.
84
DELVES, M. et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle
stages of Plasmodium: a comparative study with human and rodent parasites. PLoS
medicine, v. 9, n. 2, p. e1001169, 2012.
DONDORP, A. M. et al. Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum
Malaria. New England Journal of Medicine, v. 361, n. 5, p. 455–467, 2012.
DORLO, T. P. C. et al. Miltefosine: a review of its pharmacology and
therapeutic efficacy in the treatment of leishmaniasis. The Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, v. 67, n. 11, p. 2576–2597, nov. 2012.
EKINS, S. et al. In silico repositioning of approved drugs for rare and neglected
diseases. Drug discovery today, v. 16, n. 7-8, p. 298–310, abr. 2011.
EKINS, S.; MESTRES, J.; TESTA, B. In silico pharmacology for drug
discovery: methods for virtual ligand screening and profiling. British journal of
pharmacology, v. 152, n. 1, p. 9–20, set. 2007.
EKINS, S.; WILLIAMS, A. Finding promiscuous old drugs for new uses.
Pharmaceutical Research, v. 28, n. 8, p. 1785–1791, 2011.
EMÍLIA, N. et al. Resistência à sulfadoxina-pirimetamina em Maputo ,
Moçambique : presença de mutações nos genes dhfr e dhps do Plasmodium falciparum
Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in Maputo , Mozambique : presence of mutations
in the dhfr and dhps genes of Plasmodiu. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, v. 40, n. 4, p. 447–450, 2007.
FIDALGO, L. M.; GILLE, L. Mitochondria and trypanosomatids: targets and
drugs. Pharmaceutical Research, v. 28, n. 11, p. 2758–2770, nov. 2011.
FIDOCK, D. A. et al. Mutations in the P. falciparum Digestive Vacuole
Transmembrane Protein PfCRT and Evidence for Their Role in Chloroquine Resistance.
Molecular Cell, v. 6, n. 4, p. 861–871, out. 2000.
FIVELMAN, Q. L.; ADAGU, I. S.; WARHURST, D. C. Effects of piperaquine,
chloroquine, and amodiaquine on drug uptake and of these in combination with
85
dihydroartemisinin against drug-sensitive and -resistant Plasmodium falciparum strains.
Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 51, n. 6, p. 2265–2267, jun. 2007.
FLORIDI, A. et al. Effect of Lonidamine on the Energy Metabolism of Ehrlich
Ascites Tumor Cells. Cancer Res, v. 41, p. 4661–4666, 1981.
FRIEDMAN, R.; CAFLISCH, A. Discovery of Plasmepsin Inhibitors by
Fragment Based Docking and Consensus Scoring. ChemMedChem, v. 4, n. 8, p.
1317–1328, 2009.
FUNES, S.; DAVIDSON, E.; REYES-PRIETO, A. A green algal apicoplast
ancestor. Science, v. 298, n. 5601, p. 2155, 2002.
GALHAUP, I. Azelaic acid: mode of action at cellular and subcellular levels.
Acta dermato-venereologica. Supplementum, v. 143, p. 75–82, 1988.
GAZANION, E. et al. The Leishmania nicotinamidase is essential for NAD+
production and parasite proliferation. Molecular Microbiology, v. 82, n. 1, p. 21–38,
out. 2011.
HANNAERT, V. Evolution of energy metabolism and its compartmentation in
Kinetoplastida. Kinetoplastid Biology and Disease, v. 30, p. 1–30, 2003.
HOTEZ, P. J. et al. The global burden of disease study 2010: interpretation and
implications for the neglected tropical diseases. PLoS neglected tropical diseases, v. 8,
n. 7, p. e2865, jul. 2014.
HOTEZ PJ, MOLYNEUX DH, FENWICK A, ET AL. Control of Neglected
Tropical Diseases. The New England Journal of Medicine, v. 357, n. 10, p. 1018–
1027, 2007.
HWANG, J. et al. Chloroquine or amodiaquine combined with sulfadoxine-
pyrimethamine for uncomplicated malaria: a systematic review. Tropical medicine &
international health : TM & IH, v. 11, n. 6, p. 789–799, jun. 2006.
JANOUSKOVEC, J. et al. A common red algal origin of the apicomplexan,
dinoflagellate, and heterokont plastids. Proceedings of the National Academy of
86
Sciences of the United States of America, v. 107, n. 24, p. 10949–10954, 15 jun.
2010.
JENSEN, S.; JENSEN, P. Role of sucralfate in peptic disease. Digestive
Diseases, v. 10, n. 3, p. 153–161, 1992.
KAUR, J. et al. Bioinformatic Analysis of Leishmania donovani Long-Chain
Fatty Acid-CoA Ligase as a Novel Drug Target. Molecular Biology International, v.
2011, p. 278051, jan. 2011.
KHIM, N.; ANDRIANARANJAKA, V. Effects of Mefloquine Use on
Plasmodium vivax Multidrug Resistance. Emerging infectious diseases, v. 20, n. 10, p.
1637–1644, 2014.
KRUDSOOD, S.; TANGPUKDEE, N. High-dose primaquine regimens against
relapse of Plasmodium vivax malaria. The American journal of tropical medicine
and hygiene, v. 78, n. 5, p. 736–740, 2008.
KUHN, M. et al. STITCH 3: zooming in on protein-chemical interactions.
Nucleic Acids Research, v. 40, n. D1, p. D876–D880, 9 nov. 2011.
LAW, V. et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic
Acids Research, v. 42, p. D1091–D1097, 2014.
LIM, P. et al. Ex vivo susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial
drugs in western, northern, and eastern Cambodia, 2011-2012: association with
molecular markers. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 57, n. 11, p. 5277–
5283, dez. 2013.
LOBO, E. et al. Prevalence of pfmdr1 alleles associated with artemether-
lumefantrine tolerance/resistance in Maputo before and after the implementation of
artemisinin-based combination therapy. Malaria journal, v. 13, n. 1, p. 300, jan. 2014.
MAGARIÑOS, M. P. et al. TDR Targets: a chemogenomics resource for
neglected diseases. Nucleic Acids Research, v. 40, n. Database issue, p. D1118–
D1127, jan. 2012.
87
MAHMOUDI, N. et al. Identification of new antimalarial drugs by linear
discriminant analysis and topological virtual screening. The Journal of antimicrobial
chemotherapy, v. 57, n. 3, p. 489–497, mar. 2006.
MASMOUDI, A. et al. Old World cutaneous leishmaniasis: diagnosis and
treatment. Journal of Dermatological Case Reports, v. 7, n. 2, p. 31–41, 2013.
MCFADDEN, G. The apicoplast. Protoplasma, v. 248, n. 4, p. 641–650, 2011.
MCFADDEN, G. I. et al. Plastid in human parasites. Nature, v. 381, n. 6582, p.
482, 1996.
MCFADDEN, G.; ROOS, D. Apicomplexan plastids as drug targets. Trends in
microbiology, v. 7, n. 8, p. 328–333, 1999.
MEHTA, A.; SHAHA, C. Apoptotic death in Leishmania donovani
promastigotes in response to respiratory chain inhibition: complex II inhibition results
in increased pentamidine cytotoxicity. The Journal of biological chemistry, v. 279, n.
12, p. 11798–11813, 19 mar. 2004.
MÉNARD, D. et al. Global analysis of Plasmodium falciparum Na(+)/H(+)
exchanger (pfnhe-1) allele polymorphism and its usefulness as a marker of in vitro
resistance to quinine. International journal for parasitology. Drugs and drug
resistance, v. 3, p. 8–19, dez. 2013.
MILLER, L. H. et al. The pathogenic basis of malaria. Nature Reviews …, v.
415, n. 6872, p. 673–679, 2002.
MINODIER, P.; PAROLA, P. Cutaneous leishmaniasis treatment. Travel
Medicine and Infectious Disease, v. 5, n. 3, p. 150–158, maio 2007.
MISHRA, J.; SAXENA, A.; SINGH, S. Chemotherapy of leishmaniasis: past,
present and future. Current Medicinal Chemistry, v. 14, n. 10, p. 1153–1169, 2007.
MOORE, R. B. et al. A photosynthetic alveolate closely related to apicomplexan
parasites. Nature, v. 451, n. 7181, p. 959–963, 2008.
88
NEFTEL, K.; WOODTLY, W. Amodiaquine induced agranulocytosis and liver
damage. British medical journal (Clinical research ed.), v. 292, n. 6522, p. 721–723,
1986.
NWAKA, S.; HUDSON, A. Innovative lead discovery strategies for tropical
diseases. Nature reviews. Drug discovery, v. 5, n. 11, p. 941–955, nov. 2006.
O’NEILL, P. M.; BARTON, V. E.; WARD, S. A. The molecular mechanism of
action of artemisinin--the debate continues. Molecules (Basel, Switzerland), v. 15, n.
3, p. 1705–1721, mar. 2010.
OLIVEIRA-FERREIRA, J. et al. Malaria in Brazil : an overview. Malaria
Journal, v. 9, n. 115, p. 1–15, 2010.
OPPERDOES, F. R.; COOMBS, G. H. Metabolism of Leishmania: proven and
predicted. Trends in parasitology, v. 23, n. 4, p. 149–158, abr. 2007.
OPPERDOES, F. R.; MICHELS, P. A. M. The metabolic repertoire of
Leishmania and implications for drug discovery. Leishmania, after the genome. Caister
Academic Press, v. 1 ed., p. 123–158, 2008.
OPREA, T. I. et al. Drug Repurposing from an Academic Perspective. Drug
discovery today. Therapeutic strategies, v. 8, n. 3-4, p. 61–69, jan. 2011.
OPREA, T. I.; MESTRES, J. Drug repurposing: far beyond new targets for old
drugs. The AAPS journal, v. 14, n. 4, p. 759–763, dez. 2012.
OVERINGTON, J. P.; AL-LAZIKANI, B.; HOPKINS, A. L. How many drug
targets are there? Nature reviews. Drug discovery, v. 5, n. 12, p. 993–996, dez. 2006.
PELLETIER, C.; PROGNON, P.; BOURLIOUX, P. Roles of divalent cations
and pH in mechanism of action of nitroxoline against Escherichia coli strains.
Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 39, n. 3, p. 707–713, 1995.
PETERSEN, I.; EASTMAN, R.; LANZER, M. Drug-resistant malaria:
molecular mechanisms and implications for public health. FEBS Letters, v. 585, n. 11,
p. 1551–1562, 6 jun. 2011.
89
PHETSUKSIRI, B.; BAULARD, A. Antimycobacterial activities of isoxyl and
new derivatives through the inhibition of mycolic acid synthesis. Antimicrobial agents
chemother, v. 43, n. 5, p. 1043–1051, 1999.
PHETSUKSIRI, B.; JACKSON, M. Unique mechanism of action of the thiourea
drug isoxyl on Mycobacterium tuberculosis. Journal of Biological Chem, v. 278, n. 52,
p. 53123–53130, 2003.
PHILLIPS, E. J.; KEYSTONE, J. S.; KAIN, K. C. Failure of Combined
Chloroquine and High-Dose Primaquine Therapy for Plasmodium vivax Malaria
Acquired in Guyana, South America. Clinical Infectious Diseases, v. 23, n. 5, p. 1171–
1173, 1 nov. 1996.
PLUCINSKI, M. M. et al. Novel Mutation in Cytochrome B of Plasmodium
falciparum in One of Two Atovaquone-Proguanil Treatment Failures in Travelers
Returning From Same Site in Nigeria. Open Forum Infectious Diseases, v. 1, n. 2, p.
ofu059–ofu059, 14 jul. 2014.
QIN, C. et al. Therapeutic target database update 2014: a resource for targeted
therapeutics. Nucleic Acids Research, p. 1–6, 2013.
RALPH, S. A et al. Tropical infectious diseases: metabolic maps and functions
of the Plasmodium falciparum apicoplast. Nature Reviews. Microbiology, v. 2, n. 3, p.
203–216, mar. 2004.
RAMAN, J. et al. Five years of large-scale dhfr and dhps mutation surveillance
following the phased implementation of artesunate plus sulfadoxine-pyrimethamine in
Maputo Province, Southern Mozambique. The American journal of tropical medicine
and hygiene, v. 82, n. 5, p. 788–794, maio 2010.
READY, P. D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro surveillance, v. 15, n.
10, p. 1–13, 2010.
REES, W. Mechanisms of gastroduodenal protection by sucralfate. The
American journal of medicine, v. 91, n. 2, p. S58–S63, 1991.
90
REYBURN, H. ET AL. Guidelines for the treatment of malaria, 2nd edition.
WHO, p. 197p, 2010.
ROBERTS, LARRY S; JANOVY, JOHN; SCHMIDT, G. D. Foundations of
parasitology. 8a edition ed.New York, NY: McGraw-Hill, 2009. p. 150–152
RONET, C.; BEVERLEY, S. M.; FASEL, N. Muco-cutaneous leishmaniasis in
the New World. Virulence, v. Volume 2 I, n. December, p. 547–552, 2011.
ROSENZWEIG, D. et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut
to human macrophage. FASEB journal : Official Publication of the Federation of
American Societies for Experimental Biology, v. 22, n. 2, p. 590–602, fev. 2008.
SANTOS, D. O. et al. Leishmaniasis treatment--a challenge that remains: a
review. Parasitology Research, v. 103, n. 1, p. 1–10, jun. 2008.
SARDANA, D. et al. Drug repositioning for orphan diseases. Briefings in
Bioinformatics, v. 12, p. 346–356, 2011.
SAUNDERS, E. C. et al. Induction of a stringent metabolic response in
intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on
mitochondrial metabolism. PLoS pathogens, v. 10, n. 1, p. e1003888, jan. 2014.
SAVIOLI, D. D. AND L. Accelerating Work to Overcome the Global Impact
of Neglected Tropical Diseases: A Roadmap for ImplementationWorld Health
Organization. [s.l: s.n.].
SCHEIBEL, L.; ADLER, A. Antimalarial activity of selected aromatic chelators
II. Substituted quinolines and quinoline-N-oxides. Molecular pharmacology, v. 20, n.
1, p. 218–223, 1981.
SCHUCK, D. C. et al. Biological evaluation of hydroxynaphthoquinones as anti-
malarials. Malaria journal, v. 12, n. 1, p. 234, jan. 2013.
SHAKED-MISHAN, P. et al. Novel Intracellular SbV reducing activity
correlates with antimony susceptibility in Leishmania donovani. The Journal of
Biological Chemistry, v. 276, n. 6, p. 3971–3976, 9 fev. 2001.
91
SHARLOW, E. R. et al. A target-based high throughput screen yields
Trypanosoma brucei hexokinase small molecule inhibitors with antiparasitic activity.
PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 4, n. 4, p. e659, jan. 2010.
SHEKHAR, K. Schistosomiasis drug therapy and treatment considerations.
Drugs, v. 42, p. 379–405, 1991.
SHIM, J.; MATSUI, Y.; BHAT, S. Effect of nitroxoline on angiogenesis and
growth of human bladder cancer. Journal of the National Cancer Institute, v. 102, n.
24, p. 1855–1873, 2010.
SIDHU, A. Decreasing pfmdr1 copy number in Plasmodium falciparum malaria
heightens susceptibility to mefloquine, lumefantrine, halofantrine, quinine, and
artemisinin. Journal of Infectious Diseases, v. 194, n. 4, p. 528–535, 2006.
SINGH, N.; KUMAR, M.; SINGH, R. K. Leishmaniasis: current status of
available drugs and new potential drug targets. Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine, v. 5, n. 6, p. 485–497, jun. 2012.
SISOWATH, C. et al. In vivo selection of Plasmodium falciparum parasites
carrying the chloroquine-susceptible pfcrt K76 allele after treatment with artemether-
lumefantrine in Africa. The Journal of infectious diseases, v. 199, n. 5, p. 750–757, 1
mar. 2009.
SOLOMON, M. et al. Liposomal amphotericin B in comparison to sodium
stibogluconate for Leishmania braziliensis cutaneous leishmaniasis in travelers. Journal
of the American Academy of Dermatology, v. 68, p. 284–289, 2013.
SUN, T.; ZHANG, Y. Pentamidine binds to tRNA through non-specific
hydrophobic interactions and inhibits aminoacylation and translation. Nucleic Acids
Research, v. 36, n. 5, p. 1654–1664, mar. 2008.
SUNDAR, S. et al. Efficacy and Safety of Paromomycin in Treatment of Post-
Kala-Azar Dermal Leishmaniasis. ISRN Parasitology, v. 2014, n. October 2007, p. 1–
4, 2014.
92
SUNDAR, S.; JHA, T.; THAKUR, C. Injectable paromomycin for visceral
leishmaniasis in India. New England Journal of Medicine, v. 356, n. 25, p. 2571–
2581, 2007.
SUTANTO, I. et al. Randomized, open-label trial of primaquine against vivax
malaria relapse in Indonesia. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 57, n. 3, p.
1128–1135, mar. 2013.
TAN, K. R. et al. Doxycycline for malaria chemoprophylaxis and treatment:
report from the CDC expert meeting on malaria chemoprophylaxis. The American
journal of tropical medicine and hygiene, v. 84, n. 4, p. 517–531, abr. 2011.
TU, Y. The discovery of artemisinin (qinghaosu) and gifts from Chinese
medicine. Nature medicine, v. 17, n. 10, p. 1217–1220, out. 2011.
VAN HELLEMOND, J. J.; OPPERDOES, F. R.; TIELENS, A. G.
Trypanosomatidae produce acetate via a mitochondrial acetate:succinate CoA
transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v. 95, n. 6, p. 3036–3041, 1998.
VAN HELLEMOND, J. J.; VAN DER MEER, P.; TIELENS, A. G. M.
Leishmania infantum promastigotes have a poor capacity for anaerobic functioning and
depend mainly on respiration for their energy generation. Parasitology, v. 114, n. 4, p.
351–360, abr. 1997.
VENKATESAN, M. et al. Polymorphisms in Plasmodium falciparum
Chloroquine Resistance Transporter and Multidrug Resistance 1 Genes: Parasite Risk
Factors That Affect Treatment Outcomes for P. falciparum Malaria After Artemether-
Lumefantrine and Artesunate-Amodiaquine. The American journal of tropical
medicine and hygiene, v. 91, n. 4, p. 833–843, 1 out. 2014.
VERLINDE, C. L. et al. Glycolysis as a target for the design of new anti-
trypanosome drugs. Drug Resistance Updates, v. 4, n. 1, p. 1–14, fev. 2001.
WALLER, R. et al. Comment on“ A green algal apicoplast ancestor”. Science,
v. 301, n. 5629, p. 49–49, 2003.
93
WANG, C.; HICKEY, A. Isoxyl aerosols for tuberculosis treatment: preparation
and characterization of particles. AAPS PharmSciTech, v. 11, n. 2, p. 538–549, 2010.
WHITE, N. J. MINIREVIEW Assessment of the Pharmacodynamic Properties
of Antimalarial Drugs In Vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 41, n. 7,
p. 1413–1422, 1997.
WHO. World malaria report 2013. World Health Organization, 2014. [s.l:
s.n.].
WISHART, D. S. et al. DrugBank: a comprehensive resource for in silico drug
discovery and exploration. Nucleic Acids Research, v. 34, p. D668–D672, 2006.
ZHU, F. et al. Therapeutic target database update 2012: a resource for
facilitating target-oriented drug discovery. Nucleic Acids Research, v. 40, p. D1128–
1136, 2012.
94
9 APÊNDICE
Bases de dados consultadas
TDR Targets Database
TriTrypDB
95
Gene DB
PlasmoDB
96
Therapeutic Target Database
DrugBank Database
97
Stitch Database