universidade de sÃo paulo - sistema de...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Escola de Engenharia de Lorena
FABIO MITSUO KONDO
Implementação de um método analítico para determinação de cálcio em uma
indústria de cereais matinais
LORENA - SP
2014
FABIO MITSUO KONDO
Implementação de um método analítico para determinação de cálcio em uma
indústria de cereais matinais
Trabalho de conclusão de curso
apresentado à Escola de Engenharia
de Lorena da Universidade de São
Paulo como requisito para conclusão
de graduação no curso de Engenharia
Química.
Área de concentração: Controle de
processos químicos, Qualidade e
Produtividade.
Orientador: Prof. Dr. José Roberto
Alves de Mattos
LORENA - SP
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA AFONTE
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Kondo, Fabio Mitsuo IMPLEMENTAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO PARADETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM UMA INDÚSTRIA DE CEREAISMATINAIS / Fabio Mitsuo Kondo; orientador JoséRoberto Alves Mattos. - Lorena, 2014. 60 p.
Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaIndustrial Química - Escola de Engenharia de Lorenada Universidade de São Paulo. 2014Orientador: José Roberto Alves Mattos
1. Verificação analítica quantitativa. 2. Titulaçãofotométrica. 3. Cálcio. 4. Cereais matinais. I.Título. II. Mattos, José Roberto Alves, orient.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha
esposa Ana Paula, por todo amor,
carinho, dedicação e apoio durante
todos esses anos de faculdade
que agora concluo. E também ao
meu filho Gustavo que me deu um
novo sentido a vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado saúde e força para atingir meus
objetivos.
A minha esposa Ana Paula por todos os momentos que já passamos juntos
e por poder compartilhar sua vida comigo.
Ao meu filho Gustavo que sempre me alegra e me dá inspiração para
correr atrás de um futuro cada vez melhor.
Aos meus pais Nabor e Toshico pelo amor, apoio, dedicação, esforço e
sacrifício dispensados durantes todos esses anos de vida, sendo, realmente,
pilares fundamentais para minha formação pessoal.
Aos meus irmãos Marcos, Patrícia e Márcia por sempre poder contar com
vocês e pelo incentivo a sempre seguir em frente. Em especial a Márcia que
ajudou muito neste trabalho.
Aos meus sogros Armelindo e Fátima por todo o suporte dado nestes
últimos anos.
Aos meus amigos e colegas de trabalho, em especial para a Taís
Rabachini, que autorizou a realização deste trabalho, e ao Felipe Lima, que
ajudou na realização dos experimentos.
Ao meu professor e orientador José Roberto Alves de Mattos por todo o
suporte necessário a realização desse trabalho.
A todos meus amigos e colegas de Lorena que me ajudaram e apoiaram
durante todos esses anos de faculdade, em especial ao Calebe Ferrari e Michael
Oda.
A todos os professores da Escola de Engenharia de Lorena que realmente
contribuíram para minha formação acadêmica.
¨Bom mesmo é ir a luta com determinação, abraçar a vida e viver com
intensidade. Perder com classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a
quem mais se atreve e a vida é muito para ser insignificante. Eu faço e abuso da
felicidade e não desisto dos meus sonhos. O mundo está nas mãos daqueles que
tem coragem de sonhar e correr o risco de viver seus sonhos.¨
Charles Chaplin
RESUMO
Kondo,F. Implementação de um método analítico para determinação de
cálcio em uma indústria de cereais matinais. 2014. 61 f. Projeto de Monografia
(Graduação) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo,
Lorena, 2014.
A comercialização de cereais matinais rotulados como fonte de Cálcio necessita
seguir todos os padrões estabelecidos pela Lei RDC 54/2012, emitida pelo
Ministério da Saúde do Governo Brasileiro via Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA). Esta lei prevê que para o uso dos termos “fonte” e “alto teor”
de determinado nutriente em alimentos devem atender a critérios mínimos de
qualidade, visando proteger o consumidor de informações e práticas enganosas.
Os laboratórios de controle de qualidade devem garantir o monitoramento das
análises de cálcio para atender a legislação vigente e as expectativas do
consumidor. Este trabalho de conclusão de curso teve como objetivo fazer a
verificação de um método de titulação fotométrica automática para determinação
da concentração de cálcio previamente validado pela empresa. A metodologia
empregada foi uma pesquisa do tipo quantitativa experimental, focando na
verificação do método de titulação fotométrica automática para determinação de
cálcio em cereais matinais através dos parâmetros linearidade, limite de detecção,
limite de quantificação, precisão, exatidão, incerteza da medida e robustez. As
amostras analisadas foram cereais matinais achocolatados a base de farinha de
milho integral, sais minerais e vitaminas, amostras de material de referência
padrão à base de cereal matinal e Carbonato de Cálcio padrão analítico. O
equipamento utilizado foi um titulador automático, modelo 848 Titrino Plus da
marca Metrohm que tem acoplado a ele um colorímetro digital tipo sonda, modelo
PC-950 da marca Brinkmann. Os dados resultantes foram coletados e analisados
com o auxílio de programas de computador estatísticos. Através de testes
estatísticos, foi possível avaliar o desempenho do método através da linearidade,
robustez, precisão, exatidão, limites de detecção e quantificação, garantindo uma
análise criteriosa do processo de verificação.
Palavras-chave: Titulação Fotométrica, validação de métodos analíticos e
verificação de métodos analíticos.
ABSTRACT
Kondo,F. Implementation of an industrial analytical method to determine
Calcium content in breakfast cereal. 2014. 61 pages. Final Undergraduate
Project – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena,
2014.
Breakfast cereals branded as Calcium source need to obey all standards
established by the law RDC 54/2012, from the Ministry of Brazilian Health through
the Brazilian Health Surveillance Agency “ANVISA”. This law establishes terms
such as “source” and “high content” of certain food nutrient satisfy some minima
quality standards, aiming to protect costumers against false information. Quality
control laboratories must ensure monitoring of Calcium analysis to meet the
legislation and customer expectations. In the present work, the goal was to verify
an auto photometric titration method, previously validated by the company, to
determine Calcium concentration. The method used was a quantitative
experimental analysis focusing on verification of an auto photometric titration to
determine Calcium on breakfast cereals through parameters such as: linearity,
detection limit, quantification limit, precision, trueness, uncertainty measurement
and robustness measurement. Samples analyzed were chocolate breakfast
cereals made from a mixture of corn flour, salts and vitamins and samples of
standard reference material from breakfast cereal and Calcium carbonate
analytical standard. The equipament used was an auto titrator, model 848 Titrino
Plus from Metrohm, with a digital colorimeter probe, model PC-950 from Brinkman.
Data were collected and analyzed by statistical softwares. By applying statistical
tests the method was evaluated through linearity, detection limit, quantification
limit, precision, exactness, uncertainty measurement and robustness
measurement ensuring a discerning analysis of the verification process.
Keywords: Photometric titration, analytical method validation and verification.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Comparação do cálcio em vários alimentos. ........................................ 19
Figura 2 - Esquema de um fotômetro do tipo imersão que emprega uma fibra
óptica. ................................................................................................................... 23
Figura 3 - Influência do pH na titulação de Ca2+ 0,01molL-1 com EDTA0,01molL-1.
.............................................................................................................................. 25
Figura 4 – Regressão linear dos dados analisados. ............................................. 40
Figura 5 – Gráfico dos resíduos ............................................................................ 42
Figura 6 - Gráfico do QQ-plot dos resíduos. ......................................................... 43
Figura 7 - Contribuição das incertezas para o material de referência padrão. ...... 53
Figura 8 - Contribuição das incertezas para o cereal matinal achocolatado. ........ 54
Figura 9 - Gráfico dos efeitos de cada parâmetro na robustez. ............................ 57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Ingestão adequada (IA)* de Cálcio por dia .......................................... 18
Tabela 2 - Massa de CaCO3.................................................................................. 31
Tabela 3 – Avaliação da linearidade em validação de métodos analíticos. .......... 32
Tabela 4 – Coeficiente de variação em função do nível de concentração do
analíto. .................................................................................................................. 33
Tabela 5 – Avaliação do valor p para recuperação do método proposto. ............. 35
Tabela 6 – Recuperação do analíto em função da concentração ......................... 35
Tabela 7 - Diferentes parâmetros e níveis para determinação de robustez
utilizando o teste de Plackett-Burman. .................................................................. 37
Tabela 8 - Tabela de Plackett Burman para realização de experimentos. ............ 37
Tabela 9 - Avaliação da robustez em validação de métodos analíticos. ............... 38
Tabela 10 – Valores de entrada para estudo da linearidade. ................................ 39
Tabela 11 - Dados gerais da titulação para linearidade. ....................................... 39
Tabela 12– Coeficientes do modelo matemático da regressão linear. .................. 41
Tabela 13 – Tabela da Anova. .............................................................................. 41
Tabela 14 - Desvio Padrão dos Resíduos. ............................................................ 42
Tabela 15 – Dados gerais dos QQ (resíduos). ...................................................... 43
Tabela 16 – Dados obtidos para determinação de LOD e LOQ. ........................... 44
Tabela 17 - Valores obtidos para o teste de precisão do material de referência. . 45
Tabela 18 - Resultados do teste de precisão para o material de referência padrão.
.............................................................................................................................. 46
Tabela 19 - Valores obtidos para o teste de precisão do cereal matinal
achocolatado. ........................................................................................................ 47
Tabela 20 - Resultados do teste de precisão do cereal matinal achocolatado. .... 48
Tabela 21 - Resultados do teste de recuperação para o material de referência
padrão. .................................................................................................................. 50
Tabela 22 - Determinação da recuperação individual para o cereal matinal
achocolatado. ........................................................................................................ 51
Tabela 23 - Resultados do teste de recuperação para o cereal matinal
achocolatado. ........................................................................................................ 51
Tabela 24 - Incerteza da medida para o material de referência padrão. ............... 53
Tabela 25 - Incerteza da medida para o cereal matinal achocolatado. ................. 54
Tabela 26 - Resultado do teste de robustez para o material de referência. .......... 55
Tabela 27 - Avaliação do efeito de cada parâmetro para o método de
determinação de robustez. .................................................................................... 56
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA: Análise de Variância
AOAC: Association of Official Analytical Chemist
CaCO3: Carbonato de Cálcio
C: Concentração
CMA: Cereal Matinal Achocolatados
CV: Coefiente de Variação
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
HNO3: Ácido Nítrico
LI: Limite inferior
LS: Limite superior
LOD: Limite de detecção
LOQ: limite de quantificação
MRP: Material de Referência Padrão (feito a base de cereal matinal)
NaOH: Hidróxido de Sódio
P.A.: Padrão Analítico
R: Coeficiente de Correlação
R2: Coeficiente de Determinação
RPM: Rotações Por Minuto
SD: Desvio Padrão
SEC: Desvio Padrão dos Resíduos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 14
1.1 CONTEXTUALIZAÇÃO ..................................................................................................... 14
1.2 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 14
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 15
1.4 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 16
2.1 CEREAIS MATINAIS ......................................................................................................... 16
2.2 CÁLCIO ................................................................................................................................ 16
2.3 VALIDAÇÃO E VERIFICAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS ................................... 19
2.4 TITULAÇÃO FOTOMÉTRICA .......................................................................................... 22
3. METODOLOGIA ........................................................................................................ 26
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 26
3.1.1 Amostras .............................................................................................. 26
3.1.2 Reagentes ............................................................................................ 27
3.1.3 Materiais ............................................................................................... 27
3.1.4 Equipamentos ...................................................................................... 27
3.2 MÉTODO ANALÍTICO ....................................................................................................... 28
3.2.1 Preparação da matriz de Cereal Matinal Achocolatado (CMA) ........ 28
3.2.2 Procedimento para determinação do teor Cálcio por titulação fotométrica em cereal matinal ..................................................................... 29
3.2.3 Equação para quantificação de Cálcio na amostra no Titulador Automático .................................................................................................... 30
3.3 VERIFICAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO 30
3.3.1 Linearidade .......................................................................................... 31
3.3.2 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ) ............ 32
3.3.3 Precisão ................................................................................................ 33
3.3.4 Exatidão / Recuperação ...................................................................... 34
3.3.5 Incerteza da medida ............................................................................ 36
3.3.6 Robustez .............................................................................................. 36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 38
4.1 LINEARIDADE .................................................................................................................... 38
4.2 LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) E LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) .................. 44
4.3 PRECISÃO .......................................................................................................................... 45
4.3.1 Precisão do material de referência padrão ....................................... 45
4.3.2 Precisão do cereal matinal achocolatado ......................................... 47
4.4 EXATIDÃO / RECUPERAÇÃO ......................................................................................... 49
4.4.1 Exatidão / Recuperação do material de referência padrão .............. 49
4.4.2 Exatidão / Recuperação do cereal matinal achocolatado ................ 50
4.5 INCERTEZA DA MEDIDA ................................................................................................. 52
4.5.1 Incerteza da medida para o material de referência padrão .............. 52
4.5.2 Incerteza da medida para o cereal matinal achocolatado ................ 54
4.6 ROBUSTEZ ......................................................................................................................... 55
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 58
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 59
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 CONTEXTUALIZAÇÃO
Os cereais matinais constituem um dos principais itens no café da manhã
em muitos países, principalmente na América do Norte. Esses produtos foram
introduzidos no Brasil a partir da década de 1960 (TAKEUCHI, 2005).
A indústria alimentícia, buscando atender a demanda dos consumidores
por produtos mais saudáveis e nutricionalmente adequados utiliza a adição de
vitaminas e sais minerais aos seus produtos para conquistar estes consumidores,
como por exemplo a adição do cálcio em cereais matinais (MORESCHI, 2006).
A comercialização de cereais matinais rotulados como fonte de Cálcio
necessita seguir todos os padrões estabelecidos pela Lei RDC 54/2012, emitida
pelo Ministério da Saúde do Governo Brasileiro via Agencia Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA). Esta lei prevê que o uso dos termos “fonte” e “alto teor” de
determinado nutriente em alimentos deve atender a critérios mínimos de
qualidade, visando proteger o consumidor de informações e práticas enganosas
como, por exemplo, o uso de alegações de fonte de proteína em alimentos que
contenham proteínas incompletas e de baixa qualidade.
Segundo essa resolução, todos os alimentos produzidos a partir de 1º de
janeiro de 2014 devem seguir as novas normas.
Para os laboratórios de controle de qualidade de indústrias alimentícias,
responsáveis pela verificação do teor de cálcio nos cereais matinais, é essencial
que os métodos, além de confiáveis e robustos, sejam rápidos e reprodutíveis
(MORESCHI, 2006).
1.2 OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo principal fazer a verificação analítica
quantitativa de um método para determinação de cálcio em cereais matinais
previamente validado pela empresa para que seja utilizado rotineiramente como
15
monitoramento, a fim de garantir conformidade com a tabela nutricional dos
produtos terminados, visando uma maior satisfação dos consumidores.
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar as análises do material de referência padrão à base de
cereal matinal, da matriz de cereal matinal achocolatado e de Carbonato de
Cálcio P.A. através de um método de titulação fotométrica automático seguindo
procedimento previamente validado pela empresa;
• Analisar e avaliar todos os dados obtidos em termos de linearidade,
limites de detecção, limites de quantificação, precisão, exatidão, robustez e
incerteza de medição com o auxílio de dois programas de computador estatístico.
1.4 JUSTIFICATIVA
A fim de garantir que os produtos oferecidos aos consumidores atendam os
padrões estabelecidos por Lei, torna-se necessário a verificação do método
analítico e o monitoramento do teor de cálcio presente nos cereais matinais,
seguindo procedimentos internos da empresa.
A eficiência na implementação de métodos de análises do produto
aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e garantia de um produto em
conformidade com sua composição para atender os requisitos previstos por Lei e
também às expectativas do consumidor.
16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CEREAIS MATINAIS
Os cereais matinais foram desenvolvidos por um médico psiquiatra, chefe
de um sanatório nos Estados Unidos, junto a seu irmão em 1894, com o intuito de
proporcionar uma alimentação mais saudável para seus pacientes. Os pequenos
flocos de milho ou arroz envoltos por açúcar se popularizaram e passaram então
a preencher as prateleiras dos supermercados do mundo inteiro
(BLOGMUNDODASMARCAS, 2014).
No Brasil, o consumo de cereais matinais tem aumentado muito nos
últimos anos devido à necessidade de se obter produtos prontos ou de preparo
rápido, devido à falta de tempo da vida moderna (TAKEUCHI, 2005). Além da
praticidade, o consumo de cereais matinais tem sido alvo de diversos estudos,
que relacionam sua ingestão a benefícios para a saúde como redução no
consumo total de gorduras, diminuição nos níveis de colesterol sérico e índice
glicêmico; aumento no consumo de fibras, de magnésio e vitamina E
(TRANCOSO, 2010).
Tecnicamente, os cereais matinais podem ser definidos como produtos
extrusados de alto teor de proteína, carboidratos e fibras, podendo ser
enriquecidos com vitaminas e sais minerais aumentando seu valor nutritivo
(TAKEUCHI, 2005). Esse incremento no produto pode ter um impacto positivo
para a alimentação no que se refere ao acesso a alimentos modificados, fontes
alimentares e/ou enriquecidos com nutrientes que possam contribuir também para
melhorar o valor nutritivo, principalmente da dieta infantil (NESTAL, 1993).
2.2 CÁLCIO
O Cálcio é o quinto elemento em abundância na crosta terrestre (1,6% em
massa) e é o mineral mais abundante no corpo humano (cerca de 1000 g em
homem adulto) onde desempenha importantes papéis biológicos,
aproximadamente 99% do cálcio presente no corpo estão estocados nos ossos e
dentes e 1% restante está localizado no plasma, no líquido extracelular e nos
17
tecidos atuando em funções tais como contração vascular e vasodilatação, função
muscular, transmissões nervosas, sinalização intracelular e secreção hormonal
(FAVUS, 2008).
O metabolismo do Cálcio no corpo humano é estritamente regulado, o
Cálcio circulante no soro, plasma e tecidos não muda em função do tipo de dieta
do individuo, sendo o tecido ósseo a reserva e fonte de cálcio. O tecido ósseo por
sua vez sofre constante remodelamento com a deposição e retirada de Cálcio.
Esse balanço de retirada/reposição de Cálcio no tecido ósseo muda com a idade,
sendo que a reabsorção é maior em crianças e adolescentes, relativamente igual
em adultos, enquanto que em pessoas idosas e mulheres pós-menopausa há
uma maior retirada de Cálcio resultando em perda de massa mineral óssea
(FAVUS, 2008).
Um déficit de Cálcio no organismo pode resultar inicialmente em
hipocalcemia, que não produz sintomas em curto prazo, pois como observado
anteriormente, o nível de cálcio circulante no sangue é altamente regulado.
A hipocalcemia ocorre mais comumente devido a problemas médicos ou
tratamentos, incluindo falha renal, remoção cirúrgica de estomago ou uso de
certos medicamentos (tais como diuréticos). Dentre os sintomas de hipocalcemia
incluem enrijecimento dos dedos, músculos, convulsões, letargia, falta de apetite
e arritmia cardíaca (WEAVER, 2006).
Em longo prazo, a ingestão inadequada de Cálcio pode causar osteopenia,
que se não for tratada pode levar a osteoporose, aumentando o risco de fraturas,
especialmente em pessoas idosas (ROSS, 2011).
A necessidade de ingestão recomendada de Cálcio na dieta varia de
acordo com fatores como idade e sexo, tendo como referência os seguintes
valores estimados na tabela a seguir:
18
Tabela 1 - Ingestão adequada (IA)* de Cálcio por dia
Idade Homens Mulheres gestantes lactantes
0–6 meses* 200 mg 200 mg
7–12 meses* 260 mg 260 mg
1–3 anos 700 mg 700 mg
4–8 anos 1000 mg 1000 mg
9–13 anos 1300 mg 1300 mg
14–18 anos 1300 mg 1300 mg 1300 mg 1300 mg
19–50 anos 1000 mg 1000 mg 1000 mg 1000 mg
51–70 anos 1000 mg 1200 mg
71+ anos 1200 mg 1200 mg
Fonte: Food and Nutrition Board, Institute of Medicine-National Academy of Sciences. Dietary
Reference Intakes: Recommended levels for individual intake (1998).
O Cálcio está presente em diversos alimentos, sendo que leite e derivados
são as principais fontes. Vegetais como brócolis, couve e repolho também provem
Cálcio, já a maioria dos grãos não possui grande quantidade de Cálcio, a menos
que enriquecidos, porém devido ao seu grande consumo na alimentação acabam
contribuindo como fonte de Cálcio (ROSS, 2011).
A figura a seguir exemplifica a quantidade que deve ser consumida para se
obter 300mg de Cálcio nos diversos tipos de alimentos:
19
Figura 1 - Comparação do cálcio em vários alimentos.
Fonte: http://dietanutricao.wordpress.com/category/orientacoes-nutricionais/page/7
Com o intuito de tornar alguns produtos populares mais saudáveis, os
fabricantes de alimentos têm adicionado Cálcio a esses produtos. Esses itens são
chamados de alimentos enriquecidos com cálcio, por exemplo: cereais matinais e
barras de cereais, suco de laranja, leite de soja, pão, biscoitos entre outros.
2.3 VALIDAÇÃO E VERIFICAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Validação pode ser definida como o processo que confere validade a um
método analítico, instrumento ou equipamento, cujas especificações são aceitas
como corretas, conferindo confiabilidade aos resultados obtidos. A validação de
metodologias analíticas é o primeiro passo para a garantia da qualidade em um
laboratório. A garantia da qualidade analítica é o conjunto completo das medidas
que um laboratório deve assegurar, a fim de conseguir dados de alta qualidade.
Além do uso da validação e/ou das metodologias padronizadas, há outras
medidas que devem ser seguidas, como: procedimentos eficazes de controle de
qualidade internos (uso de materiais de referência, calibração de equipamentos,
controle de documentos, etc.); participação em testes de proficiência, e
20
acreditação a um organismo internacional, normalmente NBR ISO/IEC 17025
(ABNT, 2000; TAVERNIERS, 2004; SILVA, 2006).
Um resultado validado significa que o procedimento, que inclui desde as
condições de operação do equipamento até toda a sequência analítica, é aceito
como correto. Para isso, estabelecem-se níveis de exigência que podem definir a
aprovação do produto ou espécie em estudo.
Para tanto, é fundamental que os laboratórios disponham de meios e
critérios objetivos para demonstrar que os métodos que utilizam conduzem a
resultados confiáveis, que garantam qualidade, idoneidade e credibilidade de
seus produtos e/ou serviços. Quando houver qualquer alteração de métodos
normalizados implica-se em revalidar o método (LEITE, 2002).
O laboratório, ao empregar métodos de ensaios químicos emitidos por
órgão de normalização, organizações reconhecidas na sua área de atuação ou
publicados em livros e/ou periódicos de grande credibilidade na comunidade
científica, necessita demonstrar condições de aplicar de maneira adequada esses
métodos normalizados, dentro das condições específicas existentes nas suas
instalações antes de implantá-los (ABNT, 2000; SILVA, 2006)
Uma vez que os métodos normalizados são validados, não há necessidade
de realizar o processo completo de validação, desde que não ocorram alterações
significativas dos mesmos. Faz-se necessário também verificar as condições reais
de uso para a conformidade dos métodos normalizados. É responsabilidade do
laboratório verificar se as características de desempenho prescritas no método
oficial podem ser obtidas (ABNT, 2000; SILVA, 2006).
A validação deve ser efetuada após seleção, desenvolvimento, e
otimização dos métodos. A documentação da validação deve conter ainda,
especificação dos requisitos, características de desempenho obtidas, critérios de
aceitação dos valores obtidos das características de desempenho em
comparação com os requisitos, e a afirmação da validade dos resultados quanto
ao atendimento das necessidades do problema analítico (ABNT, 2000; SILVA,
2006).
No intuito de tornar as decisões menos subjetivas e fazer com que o
processo de validação de métodos analíticos seja mais objetivo, mais fácil de
demonstrar e implementar, utilizam-se testes estatísticos adequados (t de
21
Student, Fisher, Cochran, Grubbs, ANOVA, testes de hipóteses) (BARROS,
2002).
Em uma validação, algumas variáveis são comuns para as técnicas
analíticas e devem ser levadas em consideração (LEITE, 2002):
• Seletividade/Especificidade: A seletividade corresponde à
capacidade de um método em determinar o analíto na presença de outras
substâncias prováveis de interferirem na determinação.
O termo especificidade se refere a um método específico para um único
analíto, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de
várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.
• Recuperação: Verificação percentual da quantidade de analíto que
pode ser isolado da amostra por alguma ação química, físico-química ou
biológica, para garantir um processo analítico. A recuperação avalia a eficiência
do método de tratamento da amostra. Toda amostra que recebe tratamento de
análise indireta (extração) deve ter calculado experimentalmente a perda do
analíto decorrente desse tratamento. A recuperação expressa a variação de
resposta obtida entre a quantidade de analíto adicionada antes da extração e
aquela decorrente da adição da mesma quantidade do analíto após o processo de
extração.
• Limites de detecção: Verificação da quantidade mínima do analíto
presente na amostra que pode ser detectado, porém não necessiariamente
quantificado.
• Limites de quantificação: Verificação da quantidade mínima do
analíto presente na amostra que pode ser quantificado com uma certa precisão e
tendência
• Linearidade (curva de resposta): A linearidade é a capacidade de
um método analítico gerar resultados proporcionais à concentração da espécie
em análise, dentro de uma faixa analítica especificada. A linearidade é
determinada pela análise de uma série de calibradores (amostras adicionadas
com diversas concentrações conhecidas do analíto), abrangendo a faixa de
concentração de interesse no trabalho. Com essas análises realiza-se a curva de
calibração.
22
• Precisão: A precisão é o parâmetro que avalia a proximidade entre
várias medidas efetuada em uma mesma amostra. A medida de precisão deve
levar em conta: condições de repetibilidade, reprodutibilidade intermediária ou
reprodutibilidade.
Repetibilidade – representa a variabilidade dos resultados quando um método é
avaliado por um único analista, num mesmo equipamento em um curto espaço de
tempo.
Reprodutibilidade intermediária – representa a variabilidade dos resultados
independentes obtidos por analistas diferentes, em dias diferentes, usando
mesmo equipamento num mesmo laboratório.
Reprodutibilidade – representa a variabilidade dos resultados independentes
obtidos em laboratórios diferentes, em dias diferentes, com analistas diferentes,
com calibrações diferentes e equipamentos diferentes.
• Exatidão: A exatidão é a diferença entre o valor real presente na
amostra e o valor obtido na análise. É avaliada através da inexatidão, ou seja, o
afastamento entre os valores esperado e obtido.
• Robustez: A robustez é a capacidade do resultado de um método
permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e
ambientais, como temperatura do ambiente, pH, materiais de diferentes
procedências etc. Para a verificação da robustez pode ser utilizado o design de
experimento Plackett-Burman. Este teste, publicado por R.L Plackett e J.P.
Burman, permite que os efeitos principais de cada variável sejam determinados
individualmente, admitindo-se que os efeitos de interação sejam desprezíveis
(Plackett e Burman, 1946).
• Critérios de aceitabilidade: Verificação do enquadramento dos
resultados obtidos dentro do protocolo de qualidade da instituição.
2.4 TITULAÇÃO FOTOMÉTRICA
O termo fotômetro é empregado para designar um instrumento para
medida de absorção no qual o olho humano serve como detector usando um ou
mais padrões de comparação de cor, ele consiste de uma fonte, de um filtro e de
23
um transdutor fotoelétrico, bem como de um processador de sinal e de um
amostrador. Os fotômetros de filtro estão comercialmente disponíveis para
medidas de absorção na região do ultravioleta, do visível e infravermelho, bem
como para emissão e fluorescência nas duas primeiras regiões de comprimento
de onda. A figura 2 mostra um esquema de um fotômetro do tipo imersão que
emprega uma fibra óptica para transmitir a luz da fonte para a solução localizada
entre a selagem de vidro na ponta da fibra e um espelho (HOLLER; SKOOG;
CROUCH,2009).
Figura 2 - Esquema de um fotômetro do tipo imersão que emprega uma fibra óptica.
Fonte: HOLLER; SKOOG; CROUCH,2009.
A radiação refletida por este espelho passa por um detector de fotodiodo
através de uma segunda fibra de vidro. O fotômetro usa um amplificador com um
modulador eletrônico sincronizado com a fonte de luz (HOLLER; SKOOG;
CROUCH,2009).
Os fotômetros são providos com diversos filtros, e cada um deles transmite
uma porção diferente do espectro visível, a seleção do filtro apropriado para uma
determinada aplicação é muito importante, pois a sensibilidade da medida
depende diretamente dessa escolha. O filtro escolhido é aquele que mais
combina com o comprimento de onda de máxima absorção. A escolha pode ser
feita lembrando que a cor da luz absorvida é o complemento da cor da própria
solução. Por exemplo, uma solução parece vermelha porque transmite a porção
24
vermelha do espectro, mas absorve a verde. É a intensidade da radiação verde
que varia com a concentração e, assim, um filtro vermelho deve ser usado. Em
geral o filtro mais apropriado deve ser aquele com a cor complementar à solução
do que está sendo analisado (HOLLER; SKOOG; CROUCH,2009).
Medidas fotométricas são úteis para localizar o ponto estequiométrico de
uma titulação desde que o analíto, o reagente ou o produto da titulação absorva
radiação. Como alternativa, um indicador absorvente pode gerar a mudança de
absorbância necessária para localizar o ponto estequiométrico (HOLLER;
SKOOG; CROUCH,2009).
As titulações fotométricas frequentemente fornecem resultados mais
exatos que as análises fotométricas diretas, uma vez que os dados de diversas
medidas são usados para determinar o ponto final. O ponto final fotométrico é
usado com grande vantagem nas titulações com EDTA (ácido
etilenodiaminotetraacético) e outros agentes complexantes (HOLLER; SKOOG;
CROUCH,2009).
O EDTA é um composto muito usado em análise quantitativa, que forma
complexos estáveis com a maioria dos íons metálicos na proporção 1:1
(metal:EDTA). A principal aplicação do EDTA é como agente complexante capaz
de se ligar fortemente a íons metálicos, sendo que praticamente todos os
elementos da tabela periódica podem ser determinados quantitativamente pelo
EDTA através da titulação direta ou indiretas (HARRIS, 2012).
A técnica mais comum para detectar o ponto final em titulações com EDTA
é usar um indicador para íons metálicos. Eles são compostos cuja cor varia
quando se ligam a um íon metálico. Para que um indicador funcione de forma
eficaz, ele deve se ligar ao metal mais fracamente que o EDTA (HARRIS, 2012).
Um típico exemplo de análise quantitativa é a titulação com Ca2+ com
EDTA, em pH 12,75 usando indicador hidroxinaftol azul.
CaIn + EDTA → CaEDTA + In
Vermelho incolor incolor Azul
25
No início do experimento, uma pequena quantidade de indicador (In) é
adicionada à solução incolor de Ca2+ para formar um complexo vermelho. Quando
o EDTA é adicionado, ele reage primeiro com o Ca2+ livre, incolor. Quando todo o
Ca2+ livre é consumido, o último EDTA adicionado antes do ponto de equivalência
desloca o indicador do complexo, CaIn. A mudança do vermelho do CaIn para o
azul do In não ligado sinaliza o ponto final da titulação. Como a cor do indicador
livre é dependente do pH, a maioria dos indicadores pode ser usada apenas em
certas faixas definidas de pH (HARRIS, 2012).
A figura 3 fornece as curvas de titulação para os íons cálcio a uma
concentração 0,01molL-1 titulados com EDTA 0,01molL-1 em soluções
tamponadas a vários valores de pH. A constante de equilíbrio menos favorável
leva à menor variação do pCa na região do ponto de equivalência. Observe que o
ponto final se torna menos nítido quando o pH diminui porque a reação de
formação do complexo é menos completa sob essas circunstâncias. O ponto final
adequado na titulação do cálcio requer um pH 8 ou maior (SKOOG et.al, 2010).
Figura 3 - Influência do pH na titulação de Ca2+ 0,01molL-1 com EDTA0,01molL-1.
Fonte: HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009
26
3. METODOLOGIA
A metodologia empregada foi uma pesquisa do tipo quantitativa
experimental, focando na verificação do método de titulação fotométrica
automática para determinação de cálcio em cereais matinais, previamente
validada pela empresa. As amostras escolhidas foram cereais matinais
achocolatados à base de farinha de milho integral, amostras de material de
referência padrão de cereal matinal, utilizada em análises interlaboratoriais. O teor
de cálcio das amostras foi determinado em um titulador automático, modelo 848
Titrino Plus da marca Metrohm que tem acoplado a ele um colorímetro digital tipo
sonda, modelo PC-950 da marca Brinkmann.
Os parâmetros utilizados na verificação analítica foram linearidade, limites
de detecção, limites de quantificação, precisão, exatidão, incerteza da medida e
robustez. Para a realização de toda a verificação analítica foi seguido uma
instrução técnica exclusiva da empresa, que é um guia para validação e
verificação de métodos analíticos. Os dados resultantes foram coletados e
analisados com o auxílio do software estatístico Q-stat que é exclusivo da
empresa e também do software estatístico Action que é gratuito.
Toda a parte experimental foi realizada no laboratório físico-químico de
uma empresa de cereais matinais localizada na cidade de Caçapava-SP.
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Amostras
- Cereal Matinal Achocolatado (CMA)
- Carbonato de Cálcio (CaCO3) P.A.
- Material de Referência Padrão (MRP) feito à base de cereal matinal.
27
3.1.2 Reagentes
• Ácido nítrico (HNO3) 65% P.A.
• Hidróxido de sódio (NaOH) em lentilhas, pureza >99%
• Ácido etilenodiamino tetra- acético (EDTA) 0,1M
• Hidroxinaftol azul sal dissódico
• Carbonato de cálcio (CaCO3) P.A, pureza 99,7%
• Água deionizada
3.1.3 Materiais
• Béqueres de 100mL e 150mL
• Bastão magnético
• Dispensadores volumétricos
• Pipeta de 5mL volumétrica e pipeta de 50mL volumétrica
• Papel de filtro GF/A
• Funil de plástico
• Erlenmeyer de 125 mL
• Balão volumétrico de 1L e 2L
3.1.4 Equipamentos
• Processador de alimentos da marca Wallita
• Triturador blender da marca Oster
• Balança analítica, modelo MS da marca Mettler Toledo
• Agitador magnético, modelo 751 da marca Fisatom
• Centrífuga, modelo Q222TM2 da marca Quimis
• Titulador automático, modelo 848 Titrino Plus da marca Metrohm
• Colorímetro tipo sonda, modelo PC 910 da marca Brinkman
• Filtro de 620nm para ser acoplado ao colorímetro
28
3.2 MÉTODO ANALÍTICO
A metodologia utilizada para fazer a determinação de Cálcio em cereais
matinais é de uso exclusivo da companhia de alimentos responsável pela sua
fabricação, por motivos de sigilo não serão mencionadas as concentrações exatas
das soluções.
As análises de limite de detecção, limite de quantificação e linearidade foram
determinadas com o CaCO3 P.A.
As análises de precisão, exatidão e incerteza do método foram realizadas
com Material de Referência Padrão (MRP) de cereal matinal e Cereal Matinal
Achocolatado (CMA).
As análises de robustez foram realizadas com Material de Referência Padrão
(MRP) de cereal matinal.
3.2.1 Preparação da matriz de Cereal Matinal Achocolatado (CMA)
Uma caixa de CMA foi coletada no intervalo de uma hora, totalizando 8 caixas
ao final de 8 horas. De cada caixa, retirou-se 270 g do cereal matinal, fazendo-se
a mistura com amostras de todas as caixas coletadas. Essa mistura de cereais foi
triturada em 2 etapas, a primeira no processador Wallita que tem como objetivo
obter uma amostra representativa e a segunda no triturador Oster para obtenção
de uma amostra homogênea. Após a etapa de trituração a matriz foi guardada em
um frasco plástico fechado.
29
3.2.2 Procedimento para determinação do teor Cálcio por titulação
fotométrica em cereal matinal
1. Pesar em balança analítica 2± 0,01g de cereal matinal previamente triturado
ou material de referência padrão em um béquer de 150mL.
2. Com o auxílio de um dispensador volumétrico, adicionar 40mL de HNO3
diluído, colocar um bastão magnético na solução, agitar a solução por 2
minutos em um agitador magnético.
3. Centrifugar a solução por 2 minutos a 2092,5 x g (3000 RPM) com o auxílio
de uma centrífuga de bancada.
4. Filtrar a fase líquida da solução com auxílio de um erlenmeyer, funil de
plástico e filtro GF/A.
5. Retirar uma alíquota de 5mL do filtrado com o auxílio de uma pipeta
volumétrica de 5mL e dispensar num béquer de 100mL.
6. Adicionar à alíquota entre 0,1 e 0,2g de indicador hidroxinaftol azul sal
dissódico e 40mL de solução de NaOH.
7. Posicionar o béquer de 100mL no agitador magnético do titulador automático
da Metrohm e adicionar um bastão magnético. A ponteira do titulador e a fibra
óptica do colorímetro devem estar imersas na solução.
8. Ligar o colorímetro, zerar a absorbância e iniciar a titulação apertando o botão
start do titulador. A solução é titulada com EDTA diluído e termina em 1 mL
após o ponto de equivalência.
9. Anotar os resultados do teor de Cálcio em mg/100g e do volume gasto de
EDTA em mL.
1 - Pesagem 2 - Extração 3 -Centrifugação 4 - Filtração
5 - Diluição6 - Adição de
NaOH e indicador
7,8 e 9 -Titulação
Fotométrica
30
3.2.3 Equação para quantificação de Cálcio na amostra no Titulador
Automático
O cálculo para quantificar o Cálcio na amostra está configurado no Titulador
Automático 848 Titrino Plus segundo a fórmula abaixo e todos os resultados estão
na unidade de medida mg/100g.
Abaixo está a fórmula utilizada:
���� � �100� = ���
�� ∗ [����] ∗ 40,078 ∗ 405 ∗ 100
Onde: Vol. = Volume gasto (mL) para titular a solução
Wt.= Massa da amostra
[EDTA] = Concentração da solução titulante de EDTA
40,078 = Massa molecular do Cálcio
40 = fator de diluição: volume da solução de extração (mL)
5 = Alíquota da solução (mL)
100 = Fator de conversão para mg/100g
3.3 VERIFICAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE
CÁLCIO
Para verificação do método analítico quantitativo proposto no trabalho, foi
utilizada como referência uma instrução técnica da empresa de uso exclusivo da
mesma, que é um guia para validação e verificação de métodos analíticos.
A seguir está descrito a metodologia proposta para cada item analisado:
31
3.3.1 Linearidade
Medir 6 níveis de concentração do analíto em triplicata utilizando o CaCO3
P.A.. Segue abaixo a tabela das estimativas das massas de CaCO3 definidas para
o experimento.
Tabela 2 - Massa de CaCO3.
Massa
CaCO3(mg)
2,5
5
10
20
40
80
Fonte: Próprio autor
Utilizar os programas de computador estatísticos Q-Stat e Action para
avaliar os resultados obtidos das triplicatas de cada nível de concentração.
Avaliar a linearidade a partir da tabela a seguir:
32
Tabela 3 – Avaliação da linearidade em validação de métodos analíticos.
Etapas Avaliação Objetivo
1 Avaliação visual do gráfico da regressão linear
Os pontos devem estar distribuídos uniformemente ao longo da regressão linear.
2 Avaliação visual do gráfico de resíduos
Os pontos devem estar aleatoriamente em torno da linha y=0.
3 Avaliação visual do gráfico QQ-plot dos resíduos
Os pontos devem estar distribuídos ao longo da linha central
4 Avaliar a tabela da ANOVA O distribuição F deve ter valores muitos altos e o valor-p tendendo a 0.
5 inclinação da reta O intervalo de confiança não deve conter o 0.
6 Interceptação
Checar se o intervalo de confiança contém o 0. Se sim, a curva de calibração para pela origem, se não, a curva de calibração não passa pela origem.
7 Coeficiente de determinação R2
R2 tem que ser o mais próximo de 1 possível.
8 Desvio padrão dos resíduos, também chamado de erro padrão da calibração (SEC)
O desvio padrão dos resíduos tem que ser o mais baixo possível.
Fonte: Adaptado do Guia de Validação e Verificação de métodos analíticos exclusivo da empresa.
3.3.2 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)
Medir 6 replicatas de uma concentração muito baixa do analítico utilizando o e
Carbonato de Cálcio P.A. A massa de CaCO3 utilizada foi de 2,5 mg.
Calcular a média e o desvio padrão das concentrações de cálcio resultantes
da titulação.
Verificar os limites de detecção e quantificação a partir das seguintes fórmulas:
LOD= 3*SD(amostras) e LOQ= 10*SD(amostras)
33
3.3.3 Precisão
Para determinar a precisão do método foi escolhida a condição de
reprodutibilidade intermediária, uma vez que o experimento foi realizado num
único laboratório com o mesmo equipamento, por analistas diferentes em datas
diferentes, com reagentes preparados em dias diferentes, cobrindo o máximo de
variáveis possíveis.
Durante 6 dias, realizar determinações da concentração de Cálcio na matriz
de cereal matinal achocolatado (CMA) e no Material de Referência Padrão (MRP).
A cada dia, um analista diferente deve medir em duplicata uma das amostras.
Utilizar o software estatístico Q-Stat para auxiliar na avaliação do teste de
desvios padrão suspeitos e teste das médias suspeitas.
Para avaliação da precisão do método é utilizada a tabela a seguir como
referência. Segundo (WOOD, 1999), o coeficiente de variação (ou desvio-padrão
relativo) está relacionado com o nível de concentração do analíto na amostra,
definido pela equação: CV(%) = 2(1-0,5logC), na qual C é a concentração do analíto.
Desse modo, substituindo-se os níveis de concentração nessa equação obtém os
valores CV apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 – Coeficiente de variação em função do nível de concentração do analíto.
Concentração do analito (%)
Coeficiente de Variação (%)
1 (100%) 2 10-1 2,8
10-2 (1%) 4 10-3 5,6 10-4 8 10-5 11
10-6 (ppm) 16 10-7 23 10-8 32
10-9 (ppb) 45 Fonte: WOOD, 1999.
34
O método será considerado preciso quando apresentar níveis de variações
dentro do aceitável para cada nível de concentração conforme apresentado na
tabela 4.
3.3.4 Exatidão / Recuperação
A recuperação do material de referência padrão (MRP) foi determinada
através da comparação da média obtida na análise de precisão com o valor real,
obtido através do resultado do teste interlaboratorial da empresa, onde 12
laboratórios espalhados pelo mundo realizam as mesmas análises com o mesmo
método.
Para calcular a recuperação do material de referência padrão, a seguinte
fórmula foi utilizada:
.��/0�.�ÇÃ3 (%) = ��é6�7 �86�67�98:89ê<��7 ∗ 100
Onde C= Concentração.
Para a matriz de cereal matinal achocolatado, foi adicionada uma
concentração extra (fortificação) de 600mg de Cálcio/100g de cereal matinal.
Durante 6 dias foram realizadas determinações de concentração de Cálcio desta
amostra fortificada. A cada dia, 1 analista diferente mediu o teor de cálcio da
amostra em duplicata.
Para calcular a recuperação da amostra de cereal matinal achocalatado, a
seguinte fórmula foi utilizada:
.��/0�.�ÇÃ3 (%) = ��é6�7 ���7� �86�67 − ��é6�7 <7�>97��:�9��:��767 ∗ 100
Onde C= concentração.
35
Utilizar o software estatístico Q-Stat para auxiliar na avaliação do valor-p para
a análise de recuperação dos materiais de referência padrão e cereal matinal
achocolatado. Segue abaixo a tabela de avaliação do valor-p:
Tabela 5 – Avaliação do valor p para recuperação do método proposto.
Condição Critério
Se o valor-p ≥ 0,05 A recuperação NÃO é diferente de 100% (no intervalo de confiabilidade de 95%)
Se o valor-p ≤ 0,05 A recuperação é diferente de 100% (no intervalo de confiabilidade de 95%)
Fonte: Adaptado do Guia de Validação e Verificação de métodos analíticos exclusivo da empresa.
Para avaliação da recuperação também podemos utilizar a tabela a seguir
como referência, que foram definidos pelo manual de políticas e procedimentos
da Association of Official Analytical Chemist (AOAC), Peer-Verified Methods
Program, Manual onPolicies and Procedures (1998) AOAC INTERNATIONAL,
Gaithersburg,MD.
Tabela 6 – Recuperação do analíto em função da concentração
Concentração do analíto (%)
Intervalo de Recuperação Aceito(%)
1 (100%) 98-102 10-1 98-102
10-2 (1%) 97-103 10-3 95-105 10-4 90-107 10-5 80-110
10-6 (ppm) 80-110 10-7 80-110 10-8 60-115
10-9 (ppb) 40-120 Fonte: AOAC,1998.
36
3.3.5 Incerteza da medida
Os dados dos resultados dos experimentos de precisão e
exatidão/recuperação foram utilizados para calcular a incerteza padrão e
expandida.
Segue abaixo as fórmulas para calcular as incertezas padrão e expandida:
?<�89�8@7 A769ã�: > = �86�7<7 ∗ D��(�.)E + .G�(.8�)E
?<�89�8@7 8HA7<6�67: / = 2 ∗ >
(J>8 98K>��7 8� >� <�L8� 68 ��<:�7<ç7 68 ~95%)
Onde:
CV(iR)= coeficiente de variância intermediária, determinado no teste precisão do
método.
RSD(Rec)= desvio padrão relativo da recuperação, determinado no teste de
exatidão/recuperação do método.
3.3.6 Robustez
A robustez foi avaliada através do planejamento de experimentos Plackett-
Burman verificando-se o efeito de sete parâmetros diferentes sobre o método.
Foram realizados 8 ensaios em diferentes condições em duplicata. Cada
parâmetro possui 2 níveis diferentes (alto e baixo).
Segue abaixo a tabela dos parâmetros que foram analisados, bem como a
definição dos níveis para cada parâmetro.
37
Tabela 7 - Diferentes parâmetros e níveis para determinação de robustez utilizando o
teste de Plackett-Burman.
Parâmetro Valores
Letra Nome Nível alto Nível baixo
A Massa pesada 2,01g (A) 1,99g (a)
B HNO3 – Marca Merck (B) Química Moderna (b)
C Tempo de extração 3 minutos (C) 2 minutos (c)
D Utilização de centrífuga Não (D) Sim (d)
E Tipo de Filtro quant. - ref 41 (E) fibra de vidro (e)
F Quantidade de indicador 0,2g (F) 0,1g (f)
G pH da solução de NaOH 12,71 (G) 12,9 (g)
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
A seguir está a tabela dos 8 ensaios utilizados para analisar a robustez do
método de determinação de cálcio.
Tabela 8 - Tabela de Plackett Burman para realização de experimentos.
Número do experimentos
Parâmetro 1 2 3 4 5 6 7 8
A/a A A A A a a A a
B/b B B b b B B B b
C/c C c C c C c C c
D/d D D d d d d D D
E/e E E E E E E E E
F/f F f f F F f F F
G/g G g g G G G G g
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Os resultados dos experimentos foram analisados através do software Q-stat
verificando se cada parâmetro individualmente tem efeito significativo ou não para
o método de determinação de Cálcio.
38
Avaliar a robustez do método a partir da tabela abaixo:
Tabela 9 - Avaliação da robustez em validação de métodos analíticos.
Item Avaliação Objetivo
1 Diferença entre o nível alto e baixo para cada parâmetro
Checar se o parâmetro tem efeito significante para a performance do método.
2 Gráfico das diferenças
Parâmetros que tem um efeito significativo na performance do método mostram uma diferença maior do que a diferença crítica.
Fonte: Adaptado do Guia de Validação e Verificação de métodos analíticos exclusivo da empresa.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 LINEARIDADE
Para avaliação da linearidade 18 amostras de CaCO3 foram pesadas em 6
diferentes faixas de concentrações e tituladas com EDTA de acordo com o
descrito nos itens 3.3.1 e as etapas 2, 5, 6, 7, 8 e 9 do item 3.2.2 .
A tabela a seguir mostra as massas de CaCO3 , os volumes de EDTA
necessários para titular as amostras, os valores ajustados, limite inferior (LI),
limite superior (LS) e desvio padrão do intervalo de Predição:
39
Tabela 10 – Valores de entrada para estudo da linearidade.
Intervalo de Predição
Amostra Massa CaCO3
Volume EDTA
Valor Ajustado LI LS
Desvio Padrão
1 0,0026 0,5895 0,5625 0,4960 0,6289 0,0314
2 0,0027 0,5999 0,5862 0,5198 0,6525 0,0313
3 0,0024 0,5183 0,5150 0,4483 0,5817 0,0315
4 0,0050 1,1164 1,1319 1,0683 1,1955 0,0300
5 0,0049 1,0113 1,1082 1,0445 1,1719 0,0301
6 0,0049 1,1952 1,1082 1,0445 1,1719 0,0301
7 0,0104 2,4010 2,4132 2,3553 2,4712 0,0273
8 0,0099 2,2116 2,2946 2,2362 2,3530 0,0276
9 0,0104 2,4010 2,4132 2,3553 2,4712 0,0273
10 0,0197 4,7648 4,6200 4,5685 4,6714 0,0243
11 0,0197 4,6042 4,6200 4,5685 4,6714 0,0243
12 0,0203 4,7860 4,7623 4,7112 4,8135 0,0241
13 0,0401 9,4029 9,4605 9,4043 9,5167 0,0265
14 0,0396 9,4010 9,3419 9,2860 9,3977 0,0263
15 0,0400 9,3546 9,4368 9,3806 9,4929 0,0265
16 0,0800 18,9947 18,9280 18,8164 19,0396 0,0526
17 0,0795 19,0010 18,8094 18,6986 18,9201 0,0522
18 0,0797 18,6153 18,8568 18,7457 18,9679 0,0524
Fonte: Adaptado do software Action
Na tabela 11, estão demonstrados alguns dados gerais das massas de
CaCO3 e volume de EDTA gastos na titulação.
Tabela 11 - Dados gerais da titulação para linearidade.
Variáveis
independentes
Massa CaCO3 (g)
Variáveis
dependente
Vol. EDTA (mL)
Número de amostras 18 18
Valor mínimo 0,0024 0,5183
Valor Máximo 0,080 19,001
Média 0,026 6,165
Desvio Padrão Clássico 0,028 6,582
Mediana 0,015 3,503
Desvio Padrão Robusto 0,02 4,83
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
40
A figura 4 representa o gráfico da regressão linear obtida através dos
dados obtidos, em que o eixo x é massa de CaCO3 (g) e no eixo y o volume de
EDTA (mL) e também os valores dos limites inferior (LI) e limites superior (LS) nos
valores de predição.
Figura 4 – Regressão linear dos dados analisados.
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Segundo o item 1 da tabela 3, avaliação visual do gráfico de regressão
linear, pode-se comprovar que todos os pontos estão distribuídos uniformemente
ao longo da regressão linear e estão muito próximos da linha de predição.
Na tabela a seguir estão os valores dos coeficientes do modelo matemático
da regressão linear, respectivos desvios padrão e testes estatísticos.
41
Tabela 12– Coeficientes do modelo matemático da regressão linear.
Coeficientes
Preditor Estimativa LI (95%
confiança) LS (95%
confiança) SD Estat.t Valor-p Intersecção -0,054 -0,124 0,015 0,033 -1,656 0,117
Inclinação da reta 237,281 235,426 239,136 0,875 271,196 9,836E-31 Fonte: Adaptado do software Action
Sendo a equação matemática da regressão linear:
Y = 237,281X - 0,054
Ao avaliar a tabela 12, podemos verificar que a curva de calibração passa
pela origem, uma vez que em um intervalo de confiança em 95% a intersecção
contém o valor zero, atendendo ao item 6 da tabela 3.
Avaliando a inclinação da reta em um intervalo de confiança de 95%,
podemos afirmar que não contém zero, atendendo ao item 5 da tabela 3.
Segue abaixo a tabela de análise de variâncias (ANOVA) do experimento
de linearidade.
Tabela 13 – Tabela da Anova.
Tabela da Anova
Fatores G.L. Soma de
Quadrados Quadrado
Médio Estat. F Valor-p
Massa CACO3 1 736,2958 736,2958 73547,4738 9,836E-31 Resíduos 16 0,1602 0,0100
Fonte: Adaptado do software Action
O valor da distribuição F encontrada na tabela acima é extremamente alto,
enquanto o valor do valor-p tende a zero. Esses valores indicam uma baixa
probabilidade de ocorrência aleatória e atendem plenamente ao item 4 da tabela
3.
42
A tabela abaixo mostra os valores dos desvios padrões dos resíduos, os
graus de liberdade, coeficientes de determinação (R2) e R2 ajustado.
Tabela 14 - Desvio Padrão dos Resíduos.
Desvio Padrão dos Resíduos (SEC) SEC Graus de Liberdade R2 R2 Ajustado
0,10006 16 0,99978 0,99977 Fonte: Adaptado do software Action
Através dos dados estatísticos obtidos da tabela acima, verifica-se o valor
de 0,10006 para o SEC, que é um valor baixo, atendendo ao item 8 da tabela 3.
O valor de 0,99978 para o coeficiente de determinação R2 é um valor
excelente, uma vez que está muito próximo de 1, atendendo ao item 7 da tabela
3.
O gráfico dos resíduos abaixo tem no eixo x a massa de CaCO3 e no eixo y
os valores dos resíduos de todas as amostras analisadas.
Figura 5 – Gráfico dos resíduos
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
43
Verificando os pontos do gráfico, pode-se verificar que todos estão
distribuídos aleatoriamente em torno da linha y=0, tanto com valores acima como
abaixo de zero, atendendo o item 2 da tabela 3.
A tabela 15 e o gráfico da figura 6, representam os dados gerais obtidos
estatisticamente da análise exploratória dos resíduos.
Tabela 15 – Dados gerais dos QQ (resíduos).
Análise exploratória (resíduos) Mínimo 1 Quantil Média Mediana 3 Quantil Máximo
-0,2415 -0,0471 -0,0045 -1,446E-18 0,0511 0,1916 Fonte: Adaptado do software Action.
Figura 6 - Gráfico do QQ-plot dos resíduos.
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Ao avaliar visualmente o gráfico do QQ-plot pode-se observar que os
pontos devem estar distribuídos ao longo da linha central, atendendo ao item 3 da
tabela 3.
Com base nos resultados obtidos, observa-se que o método proposto
apresenta linearidade uma vez que atendeu todos os itens da avaliação da tabela
3, concluindo-se que essa é uma regressão significativa, sendo portanto, o
parâmetro linearidade validado.
44
4.2 LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) E LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ)
Os limites de detecção e de quantificação da metodologia proposta foram
determinados e os resultados obtidos são mostrados na tabela 16. Esta análise foi
realizada através de 6 replicatas em uma concentração muito baixa do analíto
utilizando o Carbonato de Cálcio P.A.. A massa de CaCO3 utilizada foi de
aproximadamente ± 2,6mg.
Tabela 16 – Dados obtidos para determinação de LOD e LOQ.
Amostra
Massa
CACO3(g)
Volume EDTA
(mL)
Conc.
Ca(mg/100g)
1 0,0026 0,5895 47
2 0,0027 0,5999 48
3 0,0024 0,5183 41
4 0,0026 0,6010 48
5 0,0027 0,6010 48
6 0,0026 0,5913 47
Média 0,0026 0,5835 47
SD 0,0001 0,0323 2,5878
Fonte: Próprio autor
Aplicando as equações citada no item 3.3.2, temos os seguintes valores de
LOD e LOQ para a concentração de cálcio em mg/100g:
LOD= 3*SD(amostra) LOQ= 10*SD(amostra)
LOD= 8mg de Cálcio/100g amostra LOQ= 26mg de Cálcio/100g amostra
45
4.3 PRECISÃO
4.3.1 Precisão do material de referência padrão
O teste de precisão foi realizado através de 12 determinações de Cálcio da
amostra de referência padrão. Segue abaixo a tabela dos resultados obtidos,
médias e desvio padrão:
Tabela 17 - Valores obtidos para o teste de precisão do material de referência.
Material de referência - Conc. Ca (mg/100g)
Dia Analista Rep 1 Rep 2 Média SD
1 A 434 431 432,5 2,12
2 B 422 433 427,5 7,78
3 C 435 433 434 1,41
4 D 435 438 436,5 2,12
5 E 425 422 423,5 2,12
6 F 430 424 427 4,24
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
A tabela 18 mostra os resultados obtidos através do software estatístico Q-
Stat.
46
Tabela 18 - Resultados do teste de precisão para o material de referência padrão.
Material de Referência Padrão Robusto Clássico
Média das análises de cálcio (mg/100g) 430 430,17
Desvio Padrão das médias das replicatas (SD(b)) 7,16 4,94
Resultados da Repetibilidade
Desvio Padrão da Repetibilidade SD(r) 3,15 3,96
Desvio Padrão Relativo da Repetibilidade RSD(r) ou CV(r) 0,70% 0,90%
Limite da Repetibilidade em 95% (r) para resultados em duplicata 8,72 10,97
Limite Relativo da Repetibilidade em 95% (r%) para resultados em
duplicata 2,00% 2,60%
Resultados da Repetibilidade Intermediária
Desvio Padrão da Repetibilidade Intermediária SD(iR) 7,49 5,67
Desvio Padrão Relativo da Repetibilidade Intermediária RSD(iR) or CV(iR) 1,70% 1,30%
Limite da Repetibilidade Intermediária em 95% (iR) para resultados em
duplicata 20,77 15,73
Limite Relativo da Reprodutibilidade Intermediária em 95% (r%) para
resultados em duplicata 4,80% 3,70%
Estatística robusta é analisada através dos dados obtidos pela mediana e estatística clássica é obtido através da media. Fonte: Adaptado do software Q-stat.
O teste dos desvios padrão suspeitos foi realizado através do limite de
intervalo de tolerância, utilizando a estatística robusta com 99% de confiabilidade,
em que o limite de tolerância robusta em 99% é igual a 8,10mg/100g. Através do
teste dos desvios padrão suspeitos conclui-se que não existem valores suspeitos
em termos de desvios padrão.
Para o teste de médias supeitas, foram aplicados o teste de normalidade
(teste de Shapiro-Francia) e o teste das médias suspeitas através do limite de
tolerância robusta com 99% de confiabilidade.
O resultado do teste de normalidade Shapiro-Francia foi que a população
segue uma lei de distribuição normal (5% nível de significância).
Para o limite de tolerância robusta em 99%, os limites são de
401,15mg/100g até 458,85mg/100g e o resultado do teste das médias suspeitas é
que não existem valores suspeitos em termos de média.
De acordo com resultados dos testes obtidos acima, pode-se utiilizar tanto
a estatística robusta quanto a clássica para avaliar os resultados de precisão.
47
Se considerar o valor da média das análises de cálcio da estatística
robusta na tabela 18, 430mg/100g de cálcio, e substituí-lo na equação:
CV(%)=2(1-0,5logC), encontra-se o CV(%)= 4,54% que é considerado o nível de
variação aceitável para a concentração de 430mg/100g de cálcio. Ao verificar na
tabela 18 o resultado do CV(iR) para estatística robusta é 1,7%, portanto menor
do que 4,54%, atendendo ao critério proposto no item 3.3.3. Com isso podemos
concluir que o método proposto está validado para o parâmetro precisão.
4.3.2 Precisão do cereal matinal achocolatado
O teste de precisão para o cereal matinal achocolatado foi realizado da
mesma forma que o material de referência padrão e os dados obtidos são
apresentados abaixo:
Tabela 19 - Valores obtidos para o teste de precisão do cereal matinal achocolatado.
Cereal Matinal Achocolatado - Conc. Ca (mg/100g)
Dia Analista Rep 1 Rep 2 Média SD
1 A 646 646 646 0
2 B 640 636 638 2,83
3 C 624 641 632,5 12,02
4 D 657 652 654,5 3,54
5 E 641 646 643,5 3,54
6 F 625 639 632 9,9
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
A tabela a seguir mostra os resultados obtidos através do software estatístico Q-Stat.
48
Tabela 20 - Resultados do teste de precisão do cereal matinal achocolatado.
Cereal Matinal Achocolatado Robusto Clássico
Média das análises de cálcio (mg/100g) 640,75 641,08
Desvio Padrão das médias das replicatas (SD(b)) 13,12 8,67
Resultados da Repetibilidade
Desvio Padrão da Repetibilidade SD(r) 5,24 6,78
Desvio Padrão Relativo da Repetibilidade RSD(r) ou CV(r.) 0,80% 1,10%
Limite da Repetibilidade em 95% (r) para resultados em duplicata 14,53 18,78
Limite Relativo da Repetibilidade
em 95% (r%) para resultados em duplicata 2,30% 2,90%
Resultados da Repetibilidade Intermediária
Desvio Padrão da Repetibilidade Intermediária SD(iR) 13,63 9,9
Desvio Padrão Relativo da Repetibilidade Intermediária RSD(iR) or CV(iR) 2,10% 1,50%
Limite da Repetibilidade Intermediária em 95% (iR) para resultados em
duplicata 37,79 27,46
Limite Relativo da Reprodutibilidade Intermediária em 95% (r%) para
resultados em duplicata 5,90% 4,30%
Estatística robusta é analisada através dos dados obtidos pela mediana e estatística clássica é
obtido através da media. Fonte: Adaptado do software Q-stat.
O teste dos desvios padrão suspeitos foi realizado através do limite de
intervalo de tolerância, utilizando a estatística robusta com 99% de confiabilidade,
em que o limite de tolerância robusta em 99% é igual a 13,50mg/100g. Através do
teste dos desvios padrão suspeitos conclui-se que não existem valores suspeitos
em termos de desvios padrão.
Para o teste de médias supeitas, foram aplicados o teste de normalidade
(teste de Shapiro-Francia) e o teste das médias suspeitas através do limite de
tolerância robusta com 99% de confiabilidade.
O resultado do teste de normalidade Shapiro-Francia foi que a população
segue uma lei de distribuição normal (5% nível de significância).
Para o limite tolerância robusta em 99%, os limites são de 587,85mg/100g
até 693,65mg/100g e o resultado do teste das médias suspeitas é que não
existem valores suspeitos em termos de média.
De acordo com resultados dos testes obtidos acima, pode-se utiilizar tanto
a estatística robusta quanto a clássica para avaliar os resultados de precisão.
49
Se considerar o valor da média das análises de cálcio da estatística
robusta na tabela 20, 640,75mg/100g de cálcio, e substituí-lo na equação:
CV(%)=2(1-0,5logC), encontra-se o CV(%)= 4,28% que é considerado o nível de
variação aceitável para a concentração de 640,75mg/100g de cálcio. Ao verificar
na tabela 20 o resultado do CV(iR) para estatística robusta é 2,1%, portanto
menor do que 4,28%, atendendo ao critério proposto no item 3.3.3.
O teste de precisão para o cereal matinal achocolatado mostrou-se
satisfatório, uma vez que todos os testes estatísticos foram aprovados.
4.4 EXATIDÃO / RECUPERAÇÃO
4.4.1 Exatidão / Recuperação do material de referência padrão
Para determinação da recuperação obteve-se o valor real do material de
referência padrão através da média e incerteza do programa de testes
interlaboratoriais.
Parâmetros da amostra de referência:
Valor Real= 446mg/100g
Incerteza da medida =10,41
A seguir está a tabela geral dos resultados da recuperação do material de
referência padrão.
50
Tabela 21 - Resultados do teste de recuperação para o material de referência padrão.
Material de referência padrão Robusto Clássico
Mediana / média dos resultados 430 430,17
Desvio Padrão 7,16 4,94
Recuperação 96,41% 96,45%
Desvio padrão da recuperação SD (Rec.) 0,02 0,02
Teste t 1,53 1,55
Valor-p 0,19 0,18
Desvio padrão da recuperação corrigida SD(Rec. Corr) 0,02 0,02
Desvio padrão da recuperação relativa corrigida
RSD(Rec) 2,43% 2,38%
Estatística robusta é analisada através dos dados obtidos pela mediana e estatística clássica é
obtida através da media. Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Ao avaliar o valor-p da tabela acima, tanto para a estatística robusta quanto
para a clássica, pode-se concluir que de acordo com a tabela 5 a recuperação
não é diferente de 100% para o intervalo de confianbilidade dos dados em 95%.
De acordo com a tabela acima o resultado da Recuperação foi de 96,41%
para a estatística robusta e de 96,45% para clássica. Ao comparar esses valores
com a Tabela 6 – Recuperação do analíto em função da concentração, para a
recuperção do analíto na faixa de concentração 10-3 ou 0,1%, o intervalo de
recuperção aceito é de 95-105%. Pode-se concluir que valores estão dentro do
intervalo de recuperação aceito.
Com base nos resultados obtidos, observa-se que o método proposto
apresenta exatidão uma vez que atendeu os critérios de avaliação da
recuperação do item 3.3.4.
4.4.2 Exatidão / Recuperação do cereal matinal achocolatado
Foram realizadas análises de cereal matinal achocolatado de acordo com o
item 3.3.4 e os resultados obtidos são mostrados na seguinte tabela:
51
Tabela 222 - Determinação da recuperação individual para o cereal matinal achocolatado.
Cereal matinal achocolatado - Conc. Ca (mg/100g)
Dia Analista Rep 1 Rep 2 Média Concentração
nativa
Média da
fortificação
1 A 1234 1238 1236 641 595
2 B 1225 1230 1227,5 641 586,5
3 C 1217 1231 1224 641 583
4 D 1232 1237 1234,5 641 593,5
5 E 1242 1248 1245 641 604
6 F 1215 1229 1222 641 581
Fonte: Próprio autor.
Foi determinado o valor da fortificação como valor real e a incerteza da
medida foi definida como zero, pois a incerteza da fortificação é insignificante,
comparada a variabilidade do método.
Valor Real= 600mg/100g
Incerteza da medida= 0
Na tabela 23 estão os resultados gerais da recuperação do cereal matinal
achocolatado.
Tabela 233 - Resultados do teste de recuperação para o cereal matinal achocolatado.
Cereal Matinal Achocolatado Robusto Clássico
Mediana / média dos resultados 590 590,5
Desvio Padrão 12,52 8,65
Recuperação 98,33% 98,42%
Desvio padrão da recuperação SD (Rec.) 0,01 0,01
Teste t 1,96 2,69
Valor-p 0,11 0,04
Desvio padrão da recuperação corrigida SD(Rec. Corr) 0,01 0,01
Desvio padrão da recuperação relativa corrigida
RSD(Rec) 0,87% 1,00%
Método robusto é analisado através dos dados obtidos pela mediana e método clássico é obtido
através da media. Fonte: Adaptado do software Q-stat.
52
Ao avaliar o valor-p da tabela 23 para a estatística robusta pode-se concluir
que de acordo com a tabela 5 a recuperação não é diferente de 100% para o
intervalo de confianbilidade dos dados em 95%. Já para o valor-p da estatísica
clássica o valor 0,04 está abaixo de 0,05, conclui-se que a recuperação é
diferente de 100% utilizando a estatística clássica.
De acordo com a tabela 23, o resultado da Recuperação foi de 98,33%
para a estatística robusta é de 98,42% para clássica. Ao comparar esses valores
com a Tabela 6 – Recuperação do analíto em função da concentração, para a
recuperção do analíto na faixa de concentração 10-3 ou 0,1%, o intervalo de
recuperção aceito é de 95-105%. Pode-se concluir que valores estão dentro do
intervalo de recuperação aceito.
Com base nos resultados obtidos, observa-se que o método proposto
apresenta exatidão, mesmo que tenha atendido parcialmente a avaliação do
valor-p da estatística clássica, porém ao analisar a recuperação do analíto em
função da concentração, foi obtido valor dentro do intervalo.
4.5 INCERTEZA DA MEDIDA
Para verificação da incerteza da medida são utilizados valores obtidos nos
testes de precisão e recuperação.
4.5.1 Incerteza da medida para o material de referência padrão
A tabela a seguir mostra os valores da incerteza da medida para o material
de referência padrão.
53
Tabela 244 - Incerteza da medida para o material de referência padrão.
Material de Referência Padrão
Mediana 430
Contribuição da Precisão: CV(iR) 0,0174 ou 1,74%
Contribuição da Recuperação: RSD(Rec)corrigida 0,0243 ou 2,43%
Incerteza padrão: u 12,86
Incerteza Relativa Padrão: Relativa u 0,0299 ou 2,99%
Incerteza Expandida : U 430,00 ± 25,72
Incerteza Expandida Relativa: Relativa U 430,00 ± 5,98%
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
A figura 7 mostra as contribuições da precisão CV(iR) e recuperação
RSD(Rec)corrigida para a incerteza da medida do material de referência padrão.
Figura 7 - Contribuição das incertezas para o material de referência padrão.
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
54
4.5.2 Incerteza da medida para o cereal matinal achocolatado
Segue abaixo a tabela com os valores da incerteza da medida para o
cereal matinal achocolatado.
Tabela 255 - Incerteza da medida para o cereal matinal achocolatado.
Cereal Matinal Achocolatado
Mediana 590
Contribuição da Precição: CV(iR) 0,0223 ou 2,23%
Contribuição da Recuperação: RSD(Rec)corrigida 0,0087 ou 0,87%
Incerteza padrão: u 14,13
Incerteza Relativa Padrão: Relativa u 0,0 39 ou 2,39%
Incerteza Expandida : U 590,00 ± 28,25
Incerteza Expandida Relativa: Relativa U 590,00 ± 4,79%
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
A figura abaixo mostra as contribuições da precisão CV(iR) e recuperação
RSD(Rec)corrigida para a incerteza da medida do cereal matinal achocolatado.
Figura 8 - Contribuição das incertezas para o cereal matinal achocolatado.
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
55
4.6 ROBUSTEZ
O teste de robustez foi realizado com o material de referência padrão à
base de cereais matinais em duplicata, totalizando 16 experimentos.
A tabela 26 mostra o resultado da média do planejamento de experimento
Plackett Burman:
Tabela 266 - Resultado do teste de robustez para o material de referência.
Número de experimentos
Parâmetro 1 2 3 4
5 6 7 8
A/a A A A A a a a a
B/b B B b b B B b b
C/c C c C c C c C c
D/d D D d d d d D D
E/e E e E e e E e E
F/f F f f F F f F F
G/g G g g G g G G G
Rep 1 437 438 432 433 422 429 437 434
Rep 2 435 433 433 436 432 435 434 422
Média 436 435,5 432,5 434,5 427 432 435,5 428
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Segue abaixo o desvio padrão, retirado da estatística robusta tabela 18 e
os graus de liberdade em termos de repetibilidade para experimento,
considerando os 16 resultados obtidos:
Desvio padrão da repetibilidade SD(r) = 3,15
Graus de Liberdade correspondente para SD(r)= 1
A tabela 27 mostra a avaliação se cada parâmetro analisados tem
significativo efeito para a performance do método.
56
Tabela 277 - Avaliação do efeito de cada parâmetro para o método de determinação de
robustez.
Parâmetro Média Nível
Alto
Média Nível
Baixo
Diferença
Di
Resultado (teste-t com 95% de
Confiabilidade)
O parâmetro tem significativo efeito para
a performance do método?
A 434,625 430,625 4,00 Não
B 432,625 432,625 0,00 Não
C 432,750 432,500 0,25 Não
D 433,750 431,500 2,25 Não
E 432,125 433,125 -1,00 Não
F 431,375 433,875 -2,50 Não
G 434,500 430,750 3,75 Não
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Através de testes estatísticos com confiabilidade de 95% foi encontrada a
diferença crítica de 28,3016, que será utilizada na tabela a seguir. Caso algum
parâmetro ultrapasse esse valor da diferença crítica, é considerado como um
efeito significativo para o método e deverá ser evitada sua utilização no nível que
ultrapassou a diferença crítica, pois pode levar a resultados inexatos e imprecisos.
A partir dos resultados da tabela acima e da figura 9, pode-se verificar que
nenhum parâmetro teve significativo efeito sobre a performance do método, e
afirmar também que diante das variações pequenas o método é considerado
robusto.
57
Figura 9 - Gráfico dos efeitos de cada parâmetro na robustez.
Fonte: Adaptado do software Q-stat.
Ao avaliar os resultados das diferenças de alguns parâmetros, podemos
observar que os parâmetros que exercem maior influência sobre o método de
determinação de Cálcio são a massa pesada (A) e o pH da solução de NaOH (G).
Entretanto, os que menos influenciam a robustez são a marca do fabricante do
HNO3 e o tempo de extração da amostra.
58
5. CONCLUSÃO
Neste trabalho foi apresentado a verificação da metodologia de
determinação de Cálcio em cereais matinais através da técnica de titulação
fotométrica. Este método apresenta como vantagem a fácil execução e o baixo
custo.
Através de testes estatísticos, foi possível avaliar o desempenho do
equipamento e validar o método através da linearidade, robustez, precisão,
exatidão, limite de detecção e quantificação, garantindo uma análise criteriosa do
processo de verificação.
Os dados obtidos durante a verificação do método mostraram que este é
confiável por ser de boa reprodutibilidade intermediária apresentando baixo
desvio padrão nos testes estatísticos realizados.
Por fim, conclui-se que o teor de Cálcio analisado no presente trabalho
está de acordo com o apresentado na tabela nutricional do produto respeitando as
normas da RDC 54/2012 emitida pela ANVISA, expostas no item 1.1 deste
trabalho.
59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABNT. NBR ISO/IEC 17025:2001. Requisitos Gerais para a Competência de
Laboratórios de Calibração e de Ensaios. A. R. Brasil, 2002.
AOAC. Peer-Verified Methods Program, Manual on Policies and Procedures
AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg,MD, 1998.
BARROS, C. H., Y. Apostila do Curso Estimativa da Incerteza nas Medições
Laboratoriais - Rev.02 C. S. P. SP, 2002.
BLOGMUNDODASMARCAS.
Disponível em: <http://mundodasmarcas.blogspot.com.br/2006/05/kelloggs-o-
planeta-dos-ereais.html> Acesso em:10/04/2014.
FAVUS, M. J. G., D. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of
Mineral Metabolism. Regulation of calcium and magnesium. A. S. f. B. a. M.
Research. Washington, DC, USA: 104–108, 2008.
HARRIS,D.C. Análise química quantitativa 8ªed. Rio de Janeiro: LTC, 2012.
HOLLER,F.J.;SKOOG,D.A.;CROUCH,S.R. Príncipios de análise instrumental.
6ª ed. Porto Alegre:Bookman, 2009.
LEITE, F. Validação em análise química, 2002.
MORESCHI, E.C.P. Desenvolvimento e validação de métodos
cromatográficos e avaliação da estabilidade de vitaminas hidrossolúveis em
alimentos. 2006. Dissertação (Doutorado), Universidade de São Paulo, 2006.
NESTAL, P. Fortificación de los alimentos en los países em desarrollo,
Washington (DC): Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional,
1993.
60
Plackett, R.L. and Burman, J.P. The Design of Optimum Multifactorial
Experiments, Biometrika 33 (4), pp. 305-25, 1946
ROSS, A. C. T., C.L.; YAKTINE, A.L; DEL VALLE, H.B Committee to Review
Dietary Reference Intakes for Vitamin D and Calcium. Food and Nutrition
Board. C. T., 2011.
ROSS, C.L.; YAKTINE, A.L; DEL VALLE, H.B. Washington DC, USA, Institute of
Medicine, US, Committee to Review Dietary Reference Intakes for Vitamin D
and Calcium, 2011.
SILVA, A. P. A. M. C. Como iniciar a validação de métodos analíticos, 2006.
SKOOG, et al. Fundamentos de química analítica. 8ª ed. São Paulo:Cengage
Learning, 2010.
TAKEUCHI, K. P. S., E.; CUNHA R.L. Análise das propriedades mecânicas de
cereais matinais com diferentes fontes de amido durante o processo de
absorção de leite." Ciencia e Tecnologia de Alimentos 25(1): 78-85, 2005.
TAVERNIERS, I. L., M. D.; BOCKSTAELE, E. V. "Trends in quality in the
analytical laboratory, II. Analitical method validation and quality assurance.
Trends in Analytical Chemistry 23(8): 535-550, 2004.
TRANCOSO, S. C. C., S.B.; PROENÇA, R.P.C. "Café da manhã:
caracterização, consumo e importância para a saúde." Revista de Nutrição
23(5): 859-869, 2010.
WEAVER, C. M. H., R.P. Calcium. Modern Nutrition in Health and Disease. M.
E. S. SHILS, M.; ROSS, AC.; CABALLERO, B., COUSINS, R.J. Baltimore, MD,
USA, Lippincott Williams & Wilkins: 194-210, 2006.
WOOD,R. How to validate analytical methods. Trends Anal. Chem., v.18, p. 624-
632,1999.