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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
RAFAELA LEITE MARÇAL
Elaboração de uma bebida alcoólica lupulada e carbonatada a partir de arroz
preto do tipo IAC-600 (Oryza sativa)
Lorena, 2014
RAFAELA LEITE MARÇAL
Elaboração de uma bebida alcoólica lupulada e carbonatada a partir de arroz preto
do tipo IAC-600 (Oryza sativa)
Trabalho de Graduação apresentado à
Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Engenheiro
Bioquímico.
Orientador: Prof. Dr. João Batista de
Almeida e Silva
Lorena, 2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO Serviço de Biblioteca Escola de Engenharia de Lorena
Marçal, Rafaela Leite
Elaboração de uma bebida alcoólica lupulada e carbonatada a partir de
arroz preto do tipo IAC-600 (Oryza sativa)/ Rafaela Leite Marçal. - Lorena,
2014.
58p.
Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do Curso
de Graduação de Engenharia Bioquímica - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo.
Orientador: João Batista de Almeida e Silva.
1. Arroz preto 2. Leveduras 3. Açúcar 4. Compostos fenólicos. I.Almeida
e Silva, João Batista, Orient.
kokk
À Ana, Newton e Mariana,
minha família. Dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço,
À Deus, por todas as oportunidades dadas.
Aos meus pais, pelos acertos, erros, pelo amor e dedicação às filhas. Por tudo!
À minha amada irmã, por não me deixar esquecer a coisa mais importante na vida, nossa
família.
Ao Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva, pelo apoio, instrução e oportunidade.
Ao meu amigo Orerves, pelo auxílio, socorro, paciência e por todos os conhecimentos
transmitidos durante a elaboração deste trabalho.
À todos os professores da Escola de Engenharia de Lorena e aos seus ensinamentos, pelo
conhecimento transmitido.
Aos amigos que fiz na Microcervejaria e no Probióticos: Waldir, Mateus, Aline, Ludmila,
Flávio, Cláudio e Daniel.
Aos queridos amigos que fiz em durante a graduação, pelo apoio intelectual e psicológico.
Ao meu querido amigo José Renato, pelo incentivo e apoio, por me fazer esquecer as
tristezas. Obrigada!
Aos meus amigos Maria Eulália e Ércio, pelo teto e atenção, sem eles não poderia
concluir esta etapa.
Agradeço ao Lucas pela amizade e ajuda.
Às minhas amigas e companheiras Bruna, Isabela e Lígia, pela paciência.
RESUMO
MARÇAL, R. L.; Elaboração de uma bebida alcoólica lupulada e carbonatada a
partir de arroz preto do tipo IAC-600 (Oryza sativa). 2014. 58f. Trabalho de conclusão
de curso - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.
Este trabalho teve por objetivo a utilização de quirera de arroz preto do tipo IAC-600
(Oryza sativa), na elaboração de uma bebida fermentada utilizando os mesmos
procedimentos empregados na elaboração de cervejas. Inicialmente foram feitos 5 ensaios,
para estudo do comportamento dos grãos de arroz quando submetidos ao tratamento
térmico para hidrólise enzimática por diferentes tempos e escalas, três ensaios com 2,5L e
dois com 10. Posteriormente, foi feito um ensaio em duplicata para avaliar o uso dos de
açúcares fermentescíveis, obtidos após a sacarificação completa do amido do arroz,
obtendo-se uma bebida fermentada e carbonatada com teor alcoólico de 3,0% (v/v). Os
ensaios em escala piloto foram feitos para obtenção de 100 litros de bebida. Foram
utilizados 26 kg de quirera de arroz hidrolisados com a enzima α-amilase, Thermamyl
120L. Os ensaios foram conduzidos na Planta Piloto da Escola de Engenharia de Lorena,
da Universidade de São Paulo. Os cálculos, considerando as perdas, rendimentos e
proporções de amido no arroz, levaram a resultados que proporcionaram obter um mosto
com 12°P de extrato original e uma perda significativa de 34,72% durante o processo. A
fermentação foi conduzida a 10°C por 7 dias e maturada a 0°C por 14 dias. A bebida
obtida contém teor alcoólico de 1,9% (v/v), 31,15g/L de açúcares redutores, 9,85% de
massa seca, pH 4,4 e coloração 18,6EBC. A produção desta bebida poderá ser tanto uma
alternativa para pessoas com intolerância a glúten (pela ausência de glúten no arroz),
quanto uma alternativa para o aproveitamento de quirera de arroz preto que não possui
valor no mercado.
Palavras-chave: Arroz preto. Amilase. Levedura. Açúcares. Compostos fenólicos
ABSTRACT
MARÇAL, R. L. Preparation of a hoppy and carbonated alcoholic beverage from
black rice type IAC-600 (Oryza sativa). 2014. 58f. Undergraduate Work in Biochemical
Engineering – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.
This study aimed to use black rice grits type IAC - 600 ( Oryza sativa ) for the preparation
of a fermented beverage using brewer techniques. Initially, five tests were made to study
the behavior of rice grains when subjected to heat treatment for enzymatic hydrolysis for
the evaluation of rice grains behavior when subjected to thermal treatment with enzymatic
hydrolysis with different times and scales, three with 2.5 L and two with 10L. Afterwards,
tests were made to evaluate the concentration of fermentable sugars achieved after the
complete saccharification of the rice’s starch, which fermentation generated a beverage
with an alcohol content of 3% (v/v). The tests in pilot scale were made to produce 100
liters of this beverage, using 26 kg of rice grits hydrolyzed by a commercial α-amilase,
Thermamyl 120L. These tests were conducted at the pilot plant of beverages in Escola de
Engenharia de Lorena. The calculation made, considering the losses, yields and the content
of starch in the rice, resulted in a 12°P original extract wort, and a significant loss of
34,72% throughout the process. Fermentation was conducted at 10°C for 7 days and
maturated at 0°C for 14 days. The finished beverage had an alcohol content of 1.9% (v / v),
31.15 g / L of reducing sugars, 9.85% dry weight, pH 4.4 and 18.6 EBC color. The
production of this beverage can be either an alternative as a gluten-free drink as well as a
feasible destination of black rice grits, which has no commercial value.
Keywords: Black Rice. Amylase. Yeast. Sugars. Phenolic Compounds.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Arroz preto (Oryza sativa) e Arroz Selvagem (Zizania sp.). ....................................... 20
Figura 2. Esquema representativo da via metabólica dos compostos fenólicos.......................... 22
Figura 3. Estrutura de uma molécula de amilose ........................................................................ 25
Figura 4. Estrutura de uma molécula de amilopectina ................................................................ 25
Figura 5. Metabolismo da glicose por S. cerevisiae. Fermentação alcoólica.............................. 32
Figura 6. Representação gráfica do tratamento térmico do arroz nos diferentes ensaios ........... 40
Figura 7. Teste de Iodo ................................................................................................................ 40
Figura 8. Representação gráfica do tratamento térmico do arroz na Planta Piloto ..................... 43
Figura 9. Gráfico de concentração de açúcares redutores pelo tempo de fermentação (consumo
de substrato). ........................................................................................................................ 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição nutricional, teor de compostos fenólicos e valor calórico de
diferentes tipos de arroz (base seca) .................................................................................... 20
Tabela 2. Enzimas derivadas de animais e plantas usadas na indústria alimentícia ............ 27
Tabela 3. Principais enzimas amilolíticas comerciais .......................................................... 29
Tabela 4. Composição química do lúpulo em flor ............................................................... 33
Tabela 5. Características físicas químicas da água do poço artesiano da EEL. ................... 36
Tabela 6. Relação massa de arroz e tempo de fervura durante o experimento para avaliação
de melhor condição de hidrólise. ......................................................................................... 39
Tabela 7. Relação massa arroz, tempo de fervura e tempo de exposição do amido à enzima
durante sacarificação ............................................................................................................ 46
Tabela 8. Média dos valores de concentração de açúcares redutores observados durante a
fermentação e de amino nitrogênio livre lidos no início e fim da fermentação. .................. 47
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 13
2. OBJETIVO ................................................................................................................... 15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 17
3.1. Matérias Primas ..................................................................................................... 17
3.1.1. Água ............................................................................................................... 17
3.1.2. Arroz Preto ..................................................................................................... 18
3.1.3. Enzimas ................................................................................................................. 27
3.1.4. Levedura ........................................................................................................ 31
3.1.5. Lúpulo ............................................................................................................ 32
3.2. Processo Cervejeiro (Adaptado) ........................................................................... 34
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 36
4.1. Materiais ................................................................................................................ 36
4.1.1. Água ............................................................................................................... 36
4.1.2. Arroz .............................................................................................................. 37
4.1.3. Lúpulo ............................................................................................................ 37
4.1.4. Levedura ........................................................................................................ 37
4.1.5. Enzima ........................................................................................................... 37
4.2. Métodos ................................................................................................................. 38
4.2.1. Preparação da Água de Hidrólise ................................................................... 38
4.2.2. Moagem do arroz ........................................................................................... 38
4.2.3. Preparo do inoculo ......................................................................................... 38
4.2.4. Escala Laboratorial ........................................................................................ 39
4.2.5. Escala Piloto .................................................................................................. 41
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 46
5.1. Avaliação da melhor condição de hidrólise .......................................................... 46
5.2. Avaliação dos açúcares fermentescíveis do mosto ............................................... 46
5.3. Fermentação em escala piloto ............................................................................... 48
6. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 50
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................. 51
ANEXO A ............................................................................................................................ 55
ooo
13
1. INTRODUÇÃO
O arroz é um dos principais cereais nos países em desenvolvimento e uma
importante fonte de alimento básico de mais da metade da população mundial. Apesar de
amplamente consumido por arroz branco, há muitas cultivares especiais de arroz que
contêm cores (pigmentos), tais como arroz preto e arroz vermelho. O Sudeste da Ásia é a
principal área de produção agrícola desta cultura e habitantes desta região têm uma longa
história de consumo de arroz preto (HU, et al. 2003).
Cultivado na China há mais de quatro mil anos, com fama de produto afrodisíaco e
exótico, o arroz preto era chamado de “Arroz Proibido”, pois era consumido apenas pelo
Imperador, cabendo a seus súditos somente a produção dos grãos. A partir da década de 80,
a China intensificou o melhoramento para arroz preto e hoje existem mais de 50 variedades
modernas cultivadas naquele país. Este tipo especial de arroz tornou-se a sensação entre
chefs e gourmets, a começar pela cor – na verdade, lilás, que de tão forte se assemelha ao
preto -, com aroma leve de castanha e pelo sabor único. Depois de cozido, segundo opinião
de consultores gastronômicos, o grão de formato arredondado e curto fica “al dente” sem
perder a textura macia e permanece inteiro. Considerado uma iguaria na Europa e nos
Estados Unidos, o arroz preto demorou a chegar ao Brasil. As notícias desse grão
extremamente aromático, de sabor especial, ficaram restritas aos amantes da alta
gastronomia até 15 anos atrás, quando os primeiros pacotes passaram a ser encontrados em
lojas especializadas. No Brasil, a pesquisa teve início em 1994, desenvolvida pelos
pesquisadores do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), órgão da Secretaria de
Agricultura do Estado de São Paulo, para as características de solo e de clima paulista, e
batizado com o nome de IAC-600.
Comparado ao arroz polido e integral, o arroz preto possui mais proteínas e fibras,
dez vezes mais compostos fenólicos (antioxidantes), além de maciez, aroma e sabor
acastanhados, apresentando valor calórico inferior ao arroz branco. O arroz preto não
atinge a mesma produtividade obtida por variedades tradicionais, pois durante o
beneficiamento de seus grão - que é vendido apenas na qualidade gourmet - os produtores
observam perdas de 25 a 35% (GODOY 2005). Esses valores de produtividade reduzidos
são em parte pela formação de um subproduto, caracterizado por grãos partidos e
esfarelados, sem valor de mercado e descartados pelo produtor. Os grãos quebrados
14
receberam, por sua vez, um olhar diferenciado por pesquisadores da Escola de Engenharia
de Lorena (EEL), como uma oportunidade para obtenção de uma bebida com sabor
diferenciado e tonalidade acastanhada - algo entre a cerveja “bock” e a puro malte -
buscando agregar valor ao produtor de arroz e oferecer uma nova opção de chope aos
apreciadores.
15
2. OBJETIVO
Este trabalho tem por objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma bebida alcoólica
fermentada e carbonatada de arroz preto da linhagem IAC-600, utilizando a tecnologia
empregada para produção de cervejas. Assim, dando continuidade aos trabalhos iniciados
na Escola de Engenharia de Lorena no beneficiamento do arroz preto para produção de
bebidas alcoólicas.
16
17
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Matérias Primas
3.1.1. Água
A água é a matéria-prima mais importante na fabricação de bebidas, pois contribui
diretamente como um ingrediente. Assim sendo, as suas características físicas e químicas
serão de fundamental importância para obtenção de um produto de boa qualidade
(MADRID 1996)
A água utilizada no processo de fabricação de bebidas tem que ser potável, podendo
sofrer correções químicas de acordo com a sua composição. A sua importância é tanta que
ela é um dos fatores decisivos na escolha do local para a instalação de uma fábrica, pois
requer tratamento minucioso para que se enquadre nos parâmetros de qualidade
necessários para ser usada no processo, o que irá resultar em um aumento no custo do
produto final. Então é necessário que a fábrica esteja instalada próxima a uma fonte
abundante de água de boa qualidade (VENTURINI FILHO e CEREDA 2001)
No processo cervejeiro, podem ser usados dois tipos de água, a de superfície,
proveniente de rios e lagos, e a água subterrânea, proveniente de poços. As águas de
superfície estão sempre sujeitas a maiores variações na qualidade e na composição, devido
à exposição ao ambiente, poluição, contaminação por efluentes orgânicos e inorgânicos. As
águas subterrâneas apresentam melhor qualidade em relação à superficial, e por este
motivo são as mais utilizadas em cervejarias. Estas águas percolam através do solo e
apresentam menos partículas suspensas e menor chance de contaminação por
microrganismos (TAYLOR 2006).
Dependendo da origem da água, todas ou apenas algumas das seguintes operações são
efetuadas na planta:
- Aeração: oxidação para remover odores;
- Clarificação: adição de produtos químicos para a aglomeração ou coagulação de
material em suspensão, que será decantado ou filtrado;
- Filtração: remoção de sólidos em suspensão, filtrando-se sobre a areia;
- Cloração: para eliminação de microrganismos;
18
- Desmineralização: para a remoção de sais em águas que contenham alto teor de sais
dissolvidos (MADRID 1996).
Um controle sobre o pH da água é fundamental, pois um pH alcalino poderá
ocasionar a dissolução de materiais existentes nos grãos, que são indesejáveis no
processamento. O ideal é que se tenha uma relação ácida facilitando a atividade
enzimática, com um consequente aumento no rendimento de açúcares fermentescíveis, e
um maior teor alcoólico.
Outro parâmetro primordial na qualidade da água é sua dureza, que se conceitua
como o teor de íons cálcio e magnésio presentes na água. Outros íons possivelmente
presentes em qualquer bebida apresentam influência direta na qualidade sensorial, fazendo
com que ela apresente gosto salgado, amargo, doce ou azedo, dependendo do íon e sua
concentração (TAYLOR 2006).
3.1.2. Arroz Preto
O arroz é uma importante cultura de cereal nos países em desenvolvimento e uma
importante fonte de alimento básico para mais da metade da população mundial. Embora o
arroz branco seja mais consumido (cerca de 85%), há muitas cultivares de arroz especiais
que contém pigmentação, como o arroz preto e vermelho . O Sudeste Asiático (20-28°
latitude) é a principal área de produção para esta safra agrícola, e seus habitantes têm longa
história de consumo de arroz preto.
Na medicina tradicional chinesa, o arroz pigmentado tem sido usado como alimento
nutritivo, fortalecendo a função renal, tratando anemia, promovendo a circulação
sanguínea, eliminando a estagnação do sangue, melhorando o fluxo sanguíneo, tratando
diabetes e melhorando a visão (Ma 2000). Publicações revelam propriedades
medicamentosas dessa variedade (ANDRADE 2007)
O arroz preto contém uma grande variedade de flavonas, taninos, compostos
fenólicos, esteróis, tocóis, γ-oryzanols, aminoácidos, e os óleos essenciais. (DENG, et al.
2013) As antocianinas, um grupo de flavonóides púrpura avermelhada, solúveis em água,
são tidos como os principais componentes funcionais do arroz pigmentado. O arroz preto e
vermelho tem sido usado como alimento funcional e seus extratos são também utilizados
19
como corantes alimentares em pão, sorvete e licor, em substituição aos corantes artificiais.
(ZHANG, ZHANG e ZHANG 2010)
3.1.2.1. IAC 600 (Oryza sativa)
Em 1994 o Instituto Agronômico de Campinas iniciou um programa de
melhoramento genético com o objetivo de desenvolver variedades de arroz com tipos
especiais de grãos para atender a demanda de nichos de mercado destinados à culinária
mundial. Dentre esses novos produtos destacam-se aqueles com película colorida, caso
específico do arroz com película preta, tipo bem difundido na Europa e nos Estados
Unidos, oriundo da China, onde é produzido há mais de 4.000 anos.
A partir da década de 80, a China intensificou o melhoramento para arroz preto e
hoje existem mais de 50 variedades modernas cultivadas naquele país. Com as pesquisas
iniciadas em 1994, o Instituto Agronômico colocou à disposição dos orizicultores de São
Paulo, a IAC 600, primeira cultivar de arroz preto lançada no Brasil, para atender a
demanda da cadeia produtiva de arroz.
A cultivar IAC 600 originou-se de seleção massal realizada em 1994, em uma
população da variedade chinesa Wang Xue Ren apresentava segregação para várias
características agronômicas e culinárias.
Dessa seleção originaram aproximadamente 150 linhagens com diferentes tipos de
grãos, panículas e porte de planta, até que no ano agrícola de 1996/1997 a linhagem IAC
1762 apresentou boa estabilidade agronômica e com potencial produtivo adequado para o
padrão de tipos especiais, adaptando-se aos sistemas de plantio irrigado e terras altas com
irrigação suplementar.
Essa cultivar, IAC 600, é Oryza sativa, e não deve ser confundida com o chamado
arroz selvagem que é outra gramínea (Zizania sp.). Ambos podem ser vistos na Figura 1:
20
Figura 1. Arroz preto (Oryza sativa) e Arroz Selvagem (Zizania sp.).
FONTE: Ruzene, s.d.
Testes de qualidade culinária realizados nos Estados Unidos revelaram um aroma
acastanhado e teor de compostos fenólicos altos, dando a essa linhagem características
específicas. A partir de 2001, iniciou-se a purificação de sementes e os experimentos
avançados nas regiões produtoras do Estado de São Paulo para estimar o Valor de Cultivo
e Uso (VCU).
A película que envolve o grão do arroz integral preto é rica em: hidratos de
carbono, óleos, proteínas, compostos fenólicos, fibras, cobalto, vitaminas: A, B1, B2, B6,
niacina, ácido nicotínico, ácido pantatênico, pró-vitaminas C e E. (RUZENE s.d.)
A Tabela 1 apresenta a composição centesimal do arroz preto IAC-600 em
comparação com arroz integral e arroz polido, segundo diferentes fontes.
.
Tabela 1. Composição nutricional, teor de compostos fenólicos e valor calórico de diferentes tipos de arroz
(base seca)
Componentes IAC 600** arroz
integral***
arroz
polido****
umidade (%)* 8,8 9,77 9,8
cinza (%) 1,3 1,1-1,7 0,3-0,9
gordura (%) 2,3 1,9-3,2 0,3-0,6
proteína bruta (%) 7,2 8,3-9,6 7,3-8,2
fibra (%) 3,78 0,7-1,1 0,2-0,6
carboidrato (%) 74,0 85-88 77-89
valor calórico (Kcal) 346,00 404,25 367,05
teor de aroma (ng/g
de 2-AP) 980 91,8 nd
compostos fenólicos
(mM trolox/g) 825 79 nd
Fonte: * IAC, 2004 ;** Ruzene, s.d; *** BASSINELO, et al., 2008
A variedade apresenta dez verse mais compostos fenólicos que o arroz integral.
Estudos recentes demonstraram que o arroz pigmentado tem uma vasta gama de atividades
21
biológicas, incluindo a melhoria da anemia por deficiência de ferro do corpo, antioxidante,
anticancerígeno, antiesclerose, antialérgico. (DENG, et al. 2013)
3.1.2.2. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos fazem parte de uma classe de compostos que abrangem
uma grande diversidade de estruturas, simples e complexas, que apresentam pelo menos
um grupo fenol, sendo um grupo hidroxila em um anel aromático. Aproximadamente
10.000 compostos formam este grupo quimicamente heterogêneo de metabólitos vegetais
secundários. Os metabólitos secundários, embora não sejam imprescindíveis, contribuem
para o desenvolvimento de plantas, por favorecerem a adaptação das mesmas nas relações
planta-planta, planta-animal e planta-microrganismo. Estes metabólitos, por serem
bioativos, protegem contra a radiação ultravioleta e inibem a herbivoria, atraindo animais
dispersores de sementes, entre outras funções (TAIZ e ZEIGER 2004).
Apresentam ação antipatogênica e contribuem na pigmentação e são importantes
para o crescimento e reprodução dos vegetais. Nos alimentos proporcionam aroma, cor,
estabilidade oxidativa e adstringência. Estão presentes no grupo de antioxidantes naturais,
apresentando características antioxidantes por retardar ou inibir a oxidação de outras
moléculas, seja na iniciação ou na propagação das reações de oxidação em cadeia.
Os compostos fenólicos são biossintetizados através de diferentes rotas. As que
merecem mais destaque são a rota do ácido malônico, sendo a primeira rota a de maior
importância para o reino vegetal. A primeira rota realiza a conversão dos precursores de
carboidratos, resultantes da glicólise e da rota de pentose fosfato, em aminoácidos
aromáticos. Eles podem ser encontrados facilmente em plantas e correspondem a um grupo
com uma ampla variedade de fitoquímicos oriundos da tirosina e fenilalanina (SILVA
2013).
22
Figura 2. Esquema representativo da via metabólica dos compostos fenólicos
FONTE: TAIZ e ZEIGER, 2004
Está bem documentado que o consumo de farelo de arroz pode produzir um efeito
hipocolesterolêmico, bem como a atividade antioxidante, atribuído, em grande parte, à
presença de c-orizanol e tocotrienóis. Alimentando arroz preto de roedores no lugar de
arroz branco resultou num aumento das concentrações de lipoproteínas de alta densidade
em coelhos hipercolesterolêmicos, o que correspondia a uma redução no tamanho das
lesões ateroscleróticas nos mesmos animais. Um relatório recente mostrou que a
suplementação de dietas aterogênicas com arroz preto pigmentado acarretou na redução de
stress oxidativo e inflamação, além de modulação de lesões ateroscleróticas em ratinhos
deficientes em apolipoproteína E. Estes resultados indicam que os compostos presentes no
arroz preto pigmentado e, ausentes em arroz branco, proporcionam proteção cardiovascular
em adição aos componentes solúveis em lipídios presentes no farelo de arroz. (HU, et al.
2003)
Os compostos fenólicos do arroz incluem derivados de ácidos benzóicos e
hidroxicinâmicos, principalmente o ácido ferúlico e diferulatos, e nos genótipos
pigmentados ainda são encontrados antocianinas e proantocianidinas (DENG, et al. 2013).
Nas culturas de arroz preto, pigmentos estão localizados na camada de aleurona, que é
23
caracterizado como púrpura a cor preta escura e representa provavelmente uma mistura de
antocianinas (HU, et al. 2003), estes compostos fazem parte da família de flavonóides. Os
benefícios à saúde relacionados à ingestão de flavonóides estão ligados a duas
propriedades:
(i) inibição de certas enzimas tais como xantina oxidase e aldose redutase (AR). A AR
cataliza a redução do NADOH de vários açúcares, derivando compostos carbonil
para o respectivo açúcar (ex. sorbitol) que age contribuindo para complicações no
diabetes;
(ii) atividade antioxidante (ANDRADE 2007).
3.1.2.2.1. Influência dos compostos fenólicos na microbiota fermentativa
Alguns estudos encontrados na literatura demonstram, num meio de crescimento, a
atividade antimicrobiana obtida de diferentes extratos de compostos fenólicos, a partir de
produtos enológicos, tais como sementes de uva e vinhos tinto e branco, contra bactérias
patogênicas. Os compostos fenólicos contendo principalmente ácidos fenólicos têm sido
descritos por serem mais ativos contra bactérias do que contra leveduras, sugerindo que as
leveduras têm maior resistência à ação destes compostos (GARCÍA-RUIZ, et al. 2008)
Esses compostos bioativos com função antimicrobiana além de isentar resíduo de
antibióticos ou produtos químicos, não geram resistência às bactérias, não afetam a
levedura. Geralmente, é utilizado um único produto, podendo reduzir o consumo de ácido
sulfúrico. A toxicidade apresentada pelos antimicrobianos naturais sobre alguns
microrganismos pode ser atribuída à alta complexidade de sua formula química. Os
agrupamentos alcoóis, fenóis, ésteres, ácidos, aldeídos e terpeno podem explicar sua ação
bacteriostática e/ou bactericida (NOVACOSK e TORRES 2006)
Como mencionado anteriormente, a eficácia dos compostos fenólicos como agentes
antimicrobianos contra bactérias do ácido lático em vinhos, depende da estrutura do
composto e é dependente da dose. Em geral, o efeito antimicrobiano parece ocorrer em
doses mais elevadas do que aquelas geralmente encontradas em vinhos (GARCÍA-RUIZ,
et al. 2008).
24
3.1.2.3. Amido
O amido é o produto final do processo fotossintético e constitui reserva de carbono
nas plantas. Sua formação ocorre devido à atividade combinatória de algumas enzimas,
tanto nas organelas fotossinteticamente aivas, onde o amido é uma reserva temporária,
quanto nos amiloplastos (órgãos de reserva).
O amido é a substância que proporciona de 70 a 80% das calorias consumidas pelos
seres humanos. As mais importantes fontes potenciais do amido são os grãos de cereais (40
a 90% do seu peso seco), legumes (30 a 70% do seu peso seco) e os tubérculos (65 a 85%
do seu peso seco). O amido, na natureza, é encontrado como grânulos ou grãos. Estes são
relativamente densos ou insolúveis e se hidratam deficientemente em água fria. As
matérias amiláceas e feculentas são fermentadas após uma hidrólise, denominada
sacarificação, através da qual o amido infermentescível é transformado em açúcares
fermentescíveis. Neste caso, amido pode ser facilmente hidrolisado usando enzimas
amilolíticas, sendo que essas enzimas podem ser facilmente produzidas por micro-
organismos. (RIBEIRO 2011)
3.1.2.3.1. Estrutura do amido
O amido é um polissacarídeo formado apenas por unidades de α-D-glicose,
podendo ser considerado uma homoglucana (ou homopolissacarídeo). O polímero se
apresenta na forma de grânulos com formato e tamanho diferentes dependendo da sua
fonte botânica. É composto basicamente por duas formas de macromoléculas: amilose e
amilopectina (BILIADERIS 1991), sendo que a maioria dos amidos contém
aproximadamente 25% de amilose (WURZBURG 1986).
A amilose (Figura 3) é uma molécula essencialmente linear formada por unidades
de D-glicose ligadas em α-(1→4), com um pequeno numero de ramificações, cerca de uma
em cada 180-320 unidades, ou 0,3 – 0,5% (BULÉON, et al. 1998) . A massa molar desse
polímero é variável conforme a fonte e as condições de processamento empregadas na
extração do amido, podendo conter de 200 a 2000 unidades de glicose. Em uma das
extremidades da cadeia polimérica a unidade terminal de glicose apresenta uma hidroxila
25
primária e duas secundárias, assim como um grupamento aldeído redutor na forma de um
hemiacetal interno, sendo denominado de final redutor da molécula (WURZBURG 1986).
Figura 3. Estrutura de uma molécula de amilose
FONTE: Adaptada de ANDRADE, 2007
A amilopectina (Figura 4) é uma molécula ramificada formada por unidades D-glicose
ligadas em α-(1→4) com 5 a 6% de ligações α-(1→6) nos pontos de ramificação (BULÉON, et al.
1998). Apresentam o comprimento das ramificações variável, mais comum entre 20-30 unidades de
glicose (WURZBURG 1986). Em presença de iodo a amilopectina apresenta coloração
avermelhada e é estável em soluções aquosas diluídas.
Figura 4. Estrutura de uma molécula de amilopectina
FONTE: Adaptada de ANDRADE, 2007
As proporções das moléculas de amilose e amilopectina variam entre os amidos de
diferentes espécies vegetais e, mesmo entre amidos provenientes da mesma espécie,
variam de acordo com o grau de maturação das plantas e influem na viscosidade e no poder
de gelificação do amido (BOBBIO e BOBBIO 2003).
O amido representa aproximadamente 74% do arroz, em base seca, sendo os
produtos de sua hidrólise responsáveis pela grande parte do extrato do mosto.
26
3.1.2.3.2. Gelificação do amido
O fenômeno de gelificação ou gelatinização do amido é extremamente importante
para vários alimentos. Os grânulos de amido são insolúveis em água abaixo da sua
temperatura de gelificação.Eles expandem um pouco em água fria (10-20%), devido à
difusão e absorção de água dentro das regiões amorfas, entretanto, esta expansão é
reversível pela secagem (BILIADERIS 1991). A água quando penetra nas áreas amorfas
do grânulo, forma ligações de hidrogênio com os grupos hidrófilos livres da molécula de
amido. Essas ligações são fracas, mas o número de ligações é tão alto que impede sua
dissolução. Quando o amido é aquecido progressivamente em presença de água, o grânulo
começa a se hidratar e inchar irreversivelmente. Este processo, associado à ruptura da
estrutura granular é chamado de gelificação. A gelificação é a perda da ordem molecular
no grânulo, associado a mudanças irreversíveis nas propriedades do amido, tais como,
absorção de água, inchaço granular, aumento da viscosidade da mistura e solubilização do
amido, entre outros. Este processo é o primeiro passo para a hidrólise, pois facilita a ação
das enzimas amilolíticas (BeMILLER e WHISTLER 2009).
A temperatura de gelificação é alterada pela razão amilose/amilopectina do amido,
o amido com baixo conteúdo de amilose tem menos regiões amorfas e mais cristalinas, o
que aumenta a temperatura de gelificação e a entalpia endotérmica.
O teor de amilose influencia não apenas a temperatura de gelificação, mas também
fornece informações sobre as mudanças que ocorrem durante o processo de cocção. O
arroz com alto teor de amilose, normalmente, apresenta grãos secos, soltos e com tendência
à retrogradação. Os tipos com baixo teor de amilose apresentam grãos macios e pegajosos
no cozimento. O arroz com teor intermediário apresenta grãos enxutos, soltos e macios,
mesmo após o resfriamento.
Nakazawa, et al. (1984) estudaram o comportamento da gelificação do amido de
arroz em diferentes proporções de água/arroz por Calorimetria Exploratória Diferencial
(DSC), e observaram que o aumento da temperatura de conclusão da gelificação (Tc) é
proporcional ao aumento da proporção de arroz. Segundo Santos (2011) o arroz preto IAC
600, à uma proporção arroz:água de 1:4 a tem uma Tc de 78,68°C.
27
3.1.3. Enzimas
As enzimas são muitas vezes consideradas prejudiciais pela indústria de
processamento de alimentos, geralmente precisando ser destruídas por tratamento térmico.
O efeito negativo dessas enzimas se baseia nas alterações indesejáveis na textura, cor,
sabor, aroma e nas características nutricionais que podem ocorrer na colheita e
armazenamento de alguns alimentos. No entanto, a utilização de enzimas na fabricação de
cerveja, na elaboração do queijo, no amaciamento da carne, no cozimento e hidrólise de
proteínas é bem conhecida, tendo sido utilizado há muitos anos.
Enzimas são um grupo de substâncias orgânicas de natureza geralmente protéica
com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras de reações químicas que,
sem a sua presença, aconteceriam a uma velocidade demasiado baixa. A utilização de
enzimas em processos industriais pode muitas vezes eliminar a utilização de altas
temperaturas, solventes orgânicos e extremos de pH, enquanto que, ao mesmo tempo
proporcionam o aumento da especificidade da reação, a pureza do produto e reduz o
impacto ambiental (MARTÍNEZ 2014). Isso é alcançado através do abaixamento da
energia de ativação necessária para que se dê uma reação química, resultando no aumento
da velocidade da reação e possibilitando o metabolismo dos seres vivos. A capacidade
catalítica das enzimas as torna adequadas para aplicações industriais, sendo uma delas, na
indústria alimentícia.
As enzimas são denominadas de acordo com o substrato sobre o qual atuam, portanto,
o termo amilase indica a ação sobre o amido (AQUARONE, et al. 2001) . Destacam que as
enzimas podem ser obtidas de fontes animais (pancreatina, pepsina, renina, catalase), de
fontes vegetais (papaína, bromelina, ficina, amilases do malte) ou a partir de micro-
organismos.
Tabela 2. Enzimas derivadas de animais e plantas usadas na indústria alimentícia
Enzimas Origem Ação nos alimentos Aplicação em alimentos
α-amilase Semente de cereal e.g.
trigo, cevada
Goma hidrolisada de
oligossacarídeos Fabricação de pão
β-amilase Batata doce Goma hidrolisada de maltose Alta produção de xarope de malte
Papaína Látex da fruta de
mamão verde
Proteína hidrolisada em
alimentos e bebidas
Tenderização de carne, prevenção de
neblina em cerveja
Bromelina Suco do talo de
abacaxi
Proteína hidrolisada do músculo
e tecido músculo e tecido
conjuntivo
Tenderização de carne
28
Ficina Látex do figo Idem a bromelina Idem a bromelina e a papaína mas não
usada extensamente devido ao custo
Tripsina Pâncreas bovino/suino Proteína alimentícia hidrolisada
Produção hidrolisada para condimentos
alimentícios (atualmente substituído por proteinases microbianas)
Quimosina Abomasso (bucho) de
bezerro kappa-caseína hidrolisada
Coagulação de leite na fabricação de
queijo
Pepsina Abomasso (bucho)
bovino
Idem a quimosina, porém com
mais caseína hidrolisada de
queijo
Normalmente presente com a
quimosina como parte do abomaso
(bucho)
Lipase/Esterase Garganta de cabra e
cordeiro; abomasso
Hidrólise de trigliverídeo
(gordura) (bucho de bezerro;
pâncreas de porco
Aroma em produtos de queijo;
modificação da função gordurosa por
interesterificação
Lipoxigenase Grão de soja Oxidação de ácidos grãos não saturados
Melhora da massa do pão em farinha
Lisozima Ovo de galinha
branco
Hidrólise de polissacarídeos da
parede de células bacteriana
Prevenção de defeitos no queijo por
esporos formados de bactérias
Lactose roxidase Soro de queijo;
colostro bovino
Oxidação do íon de tiocianato
para hipotiocianato bactericida Esterilização do leite frio
FONTE: Adaptada da Revista-fi (2011)
As enzimas responsáveis pela degradação do amido estão amplamente distribuídas na
natureza. A seguir são apresentadas as principais enzimas amilolíticas classificadas
brevemente conforme sua ação de acordo com SUMERLY, et al. (2003)
A α-amilse ou 1,4- α -D-glucano gluconoidrolase (EC 3.2.1.1)1 é uma endo-enzima
que cliva moléculas de amilose e amilopectina internamente, hidrolisando ligações α(1-4),
tranformando o amido em α-dextrinas de alto peso molecular. A α-amilse é considerada
uma enzima liquificante, porque reduz drasticamente a viscosidade de pastas gelificadas de
amido.
A β-amilase ou 1,4-a-D-glucano maltoidrolase (EC 3.2.1.2)1catalisa especificamente a
hidrolise de ligações glicosídicas α-(1-4) do amido, a partir de uma extremidade não
redutora (exo enzima) produzindo apenas maltose, açúcar composto de duas unidades de
glicose unidas por ligações α-(1-4), com apenas uma extremidade redutora. A ação da β-
amilase sobre a amilose produz apenas maltose. A β-amilase é considerada uma enzima
sacarificante porque produz açúcares de baixo peso molecular a partir do amido.
A ação conjunta de α e β-amilase sobre a amilopectina, com a impossibilidade de
hidrolisar as ligações α-(1-6), produz as dextrinas-limites, designação genérica para um
conjunto de dextrinas de diferentes pesos moleculares, nas quais todas as extremidades
possuem uma unidade de glicose, ou uma unidade de maltose ligada por ligações α(1-6).
1 IUBMB Enzyme Nomenclarute
29
A glucoamilase ou glucan 1,4-α-glucosidase (EC 3.2.1.3)1 é uma enzima tanto
liquificante quanto sacarificante, que hidrolisa completamente o amido em glicose a partir
de uma extremidade redutora. É a única capaz de hidrolisar ao mesmo tempo as ligações
α(1-4) e α(1-6) do amido. O resultado da conversão enzimática do amido por glucoamilase
é a transformação total em unidades de glicose.
As principais enzimas amilolíticas comerciais e os microrganismos produtores, os
pontos de ataque durante a hidrólise e sua utilização estão apresentados na Tabela 3:
Tabela 3. Principais enzimas amilolíticas comerciais
Nome
Comercial Enzimas
Microrganismo
Produtor Ataque de Ligações Utilização
THERMAMYL
120L
α-amilase termo estável
Bacillus licheniformes
α-(1-4) da amilose e da amilopectina
Liquefação do amido e produção de maltodextrinas
BAN 120L α-amilase Bacillus
anmyloliquefaciens
α-(1-4) da amilose e
da amilopectina
Produção de
maltodextrinas
AMG 300L Amiloglicosidase Aspergillus niger α-(1-4) e α-(1-6) do
amido liquefeito
Sacarificação do amido na
produção de glicose
TERMOLASE α-amilase termo
estável
Bacillus
licheniformes
α-(1-4) da amilose e
da amilopectina
Produção de
maltodextrinas
PROLASE α-amilase Não informado Não informado Produção de maltodextrinas
PANZYN GA Amiloglicosidase Não informado Não informado Não informado
PANZYN FA
100 Amilses fúngicas Não informado Não informado
Produção de dextrinas e açúcares fermenteíveis
OPTITHERM
L-340
α-amilase termo
estável
Bacillus
licheniformes
α-(1-4) da amilose e
da amilopectina
Liquefação do amido e
produção de maltodextrinas
TENASE
L-680 α-amilase Bacillus subtilis
α-(1-4) da amilose e
da amilopectina
Liquefação do amido e
produção de maltodextrinas
OPTIDEX
L-300 Amiloglicosidase Aspergillus niger
α-(1-4) e α-(1-6) do
amido liquefeito
Sacarificação do amido na
produção de glicose
FUNGAMYL Sacarificante Aspergillus oryzae α-(1-4) da amilose e
da amilopectina
Produção de maltose,
maltotriose e glicose
FONTE: Adaptado de SUMERLY, et al. (2003)
3.1.3.1. Thermamyl
Thermamyl é um preparado enzimático líquido e concentrado, a base de α-amilase
termoestável procedente de fermentações a partir de uma cepa selecionada de Bacillus
licheniformis não patogênica. Estas enzimas são adequadas em hidrólise de amido
conduzida a temperaturas elevadas, por exemplo, para a liquefação de amido para a
produção de adoçantes, assim como na produção de bebidas alcoólicas e de cerveja. A
30
enzima é subsequentemente purificada, concentrada, e formulada às características
desejadas pelo fabricante (MARTÍNEZ 2014).
A fonte resalta as condições desta enzima para trabalhar em temperaturas elevadas (90-
105° C2), ampla faixa de pH (6-8
2) e baixa concentração de Ca
++ no meio (30-60mg/kg
2)
(SUMERLY, et al. 2003). Na indústria de amido, a Termamyl é usada para liquefação
contínua de amido em equipamentos que operam em temperaturas de até 105-110°C,
demonstrando a capacidade desta enzima para agir em temperaturas altas. Na indústria do
álcool de cereais, a enzima é utilizada para a hidrólise do amido em um meio com baixa
concentração de Ca+, o que evita depois, possível problema de incrustação na coluna de
destilação. Na elaboração de cerveja, a Thermamyl é usada para liquefação de adjuntos.
Devido à estabilidade ao calor extremo da enzima, o programa de mosturação pode ser
simplificado, com a possibilidade de aumentar a proporção de adjuntos no processo
(MARTÍNEZ 2014).
Segundo SUMERLY (2003) tem-se para esta enzima as seguintes características:
Aplicações:
- Indústria alimentícia: açúcares, álcool, bebidas e cerveja;
- Indústria de fermentação: vitaminas, aminoácidos, antibióticos, etc;
- Indústria têxtil e adesivos.
Características:
- Aparência: Líquido não viscoso de grau alimentício;
- Cor: marrom escuro;
- Densidade: 1,2 g/mL.
Propriedades segundo o fornecedor:
- Atividade: 120 KNU / g (1 KNU: quantidade de enzimas que hidrolisa 5,26g de
amido por hora, avaliado pelo o método standard da Novozymes A/S).
Parâmetros ótimos:
- pH: 6 – 8.
- Temperatura: 90 - 105ºC.
- Cálcio: 30 – 60 mg/kg.
2 Parâmetros ótimos
31
3.1.4. Levedura
As leveduras são organismos unicelulares pertencentes ao reino Fungi, que se
reproduzem vegetativamente por brotamento. O preparo do inoculo é feito a partir desses
micro-organismos, que irão fazer a fermentação.
Culturas selecionadas de Saccharomyces cerevisiae têm recebido atenção especial por
apresentarem qualidades, principalmente para elaboração de bebidas que normalmente não
estão presentes em outros processos de fermentação. Algumas características desejáveis
envolvem:
- rápida iniciação da fermentação;
- conversão eficiente de açúcares fermentescíveis a etanol;
- estabilidade genética durante vários ciclos contínuos;
- manutenção das células por todo o período de fermentação;
- tolerância ao etanol;
- viabilidade durante a estocagem;
- resistência ao dióxido de enxofre;
- formação de componentes do buquê;
- serem capazes de produzir um meio de fermentação livre de quantidades de
metabólitos indesejáveis responsáveis por sabores de enxofre, fenólicos ou de alcoóis
amílicos;
- ser facilmente removidas do meio de fermentação por floculação, centrifugação;
- ser suficientemente viáveis, e depois da recuperação possa ser re-inuculada no
mosto, apresentando um mínimo de autólise e um máximo de confiança.
As Saccharomyces apresentam algumas características indesejáveis, como sintetizar
derivados sulfitados ou mercaptanas, produzir excesso de acetaldeído, ácido acético e
alcoóis superiores, capacidade de formar espuma e produção de uréia, a qual pode ser
convertida a carbonato de etila, que tem ação tóxica ao organismo humano (VENTURINI
FILHO e CEREDA 2001).
O metabolismo das leveduras pode ser tanto respiratório quanto fermentativo (Figura
5), dependendo da presença ou ausência de O2. Quando na presença de oxigênio, a
levedura tende a respirar, metabolizando a glicose pela Via Glicolítica e, posteriormente,
oxidando o ácido pirúvico resultante pela via do ácido cítrico, gerando como subprodutos,
32
CO2, H2O e energia suficiente para que a célula sobreviva e se divida. Em anaerobiose, a
célula metaboliza a glicose pela Via Glicolítica e oxida os produtos pela via fermentativa
alcoólica, gerando etanol, CO2 e energia o suficiente para sua sobrevivência.
Figura 5. Metabolismo da glicose por S. cerevisiae. Fermentação alcoólica.
FONTE: Adaptato de SANTOS (2011)
3.1.5. Lúpulo
O lúpulo (Humulus lupulus L.) é uma planta pertencente à familia Cannabinaceae,
que apesar do parentesco com a Cannabis, não contém substâncias alucinógenas. Tem
caráter dióico, ou seja, apresenta flores masculinas e femininas em indivíduos diferentes,
não havendo, assim, planta hermafrodita.
O interesse industrial recai sobre a planta feminina, mais precisamente sobre as
flores, na forma de cone, e seus frutos. Estas inflorescências são utilizadas na indústria
cervejeira para conferir amargor e aroma à cerveja, proveniente de óleos essenciais e
resinas amargas contidas nas glândulas de lupulina.
ALMEIDA E SILVA (2005) destaca como as substâncias mais importantes os
óleos essenciais, as resinas amargas, os polifenóis e as substâncias minerais. O autor
comenta que apesar de serem altamente voláteis, ocorrendo perdas de 96 a 98% no decorrer do
processo cervejeiro, os óleos essenciais conferem ao mosto e à cerveja o caráter aromático do
33
lúpulo. Os polifenóis são ricos em substâncias tânicas, protetoras da cerveja. As resinas brandas do
lúpulo, representadas pelos α-ácidos ou pelas humulonas que após isomerização, tornan-se solúveis
e responsáveis pelo amargor. KROTTENTHALER, et al. (2009) destacam que em 2005, o lúpulo
era cultivado em mais de 50 países, mas o cultivo vem sendo reduzido devido à preferência do
ponto de vista global, de diminuição do amargor nas cervejas.
Tabela 4. Composição química do lúpulo em flor
CARACTERÍSTICAS PORCENTAGEM (%)
Resinas amargas totais 12 – 22
Proteínas 13 – 18
Celulose 10 – 17
Polifenóis 4 – 14
Umidade 10 – 12
Sais minerais 7 – 10
Açúcares 2 – 4
Lipídeos 2,3 – 3,0
Óleos essenciais 0,5 – 2,0
Aminoácidos 0,1 – 0,2
FONTE: ALMEIDA E SILVA (2005)
O nível de amargor da cerveja é medido em unidades internacionais de amargor
(IBU, International Biterness Unit). Muitas vezes, para simplificar se menciona
simplesmente como BU. O IBU é uma medida de concentração de iso-α-ácidos em partes
por milhão, ou seja um miligrama de iso-α–ácidos por litro de cerveja .A fonte comenta
alguns dos fatos que influenciam uma boa extração do lúpulo:
- tempo e a força da fervura. Quanto maior o tempo e a força, maior a possibilidade
de transformar os α-ácidos em isso-α-ácidos;
- forma de lúpulo utilizada. Podem ser utilizados pellets ou cones inteiros secos. É
mais fácil extrair os α-ácidos dos pellets porque se decompõem mais rápido.
- densidade do mosto na tina de fervura. Quanto mais elevada a densidade do
mosto, menor será a extração dos compostos do lúpulo.
- quantidade de lúpulo a utilizar. Quanto maior é a quantidade de lúpulo colocada
na fervura, menor será a transformação dos α-ácidos.
34
3.2. Processo Cervejeiro (Adaptado)
O processo utilizado na confecção da bebida fermentada de arroz preto foi uma
adaptação do processo cervejeiro tradicional. Levando em consideração a ausência de
enzimas nos grãos de arroz, é utilizada uma enzima exógena termorresistente para a
sacarificação do amido.
a. Moagem do Grão: O arroz é enviado para os moinhos que possuem como função
promover uma diminuição dos grãos de arroz, promovendo a diminuição do
tamanho da partícula do amido, aumentando assim, ocasionando um aumento na
velocidade de hidrólise do amido.
b. Hidrólise Enzimática: Após ser moído o arroz é enviado até os tanques de
hidrólise, é misturado com água e submetido a aquecimento. É importante que a
temperatura ultrapasse 78°C pois esta é a temperatura de gelificação do arroz preto
IAC 600 (SANTOS 2011). É neste momento que será adicionada a enzima
amilolítica que fará liquificação e sacarificação do amido presente no grão.
c. Filtração de mosto: A mistura obtida, também chamada de mostura, atravessa um
sistema de filtros que tem por função separar mosto da mistura. Na torta formada
ainda existem frações de açucares que poderão ser utilizados na fermentação. Após
filtrada, a hidrólise passa a denominar-se mosto.
d. Fervura: Em seguida o mosto é adicionado a um tanque e recebe a adição de
lúpulo. A mistura é fervida por volta de 1 hora, é durante esse intervalo que ocorre
a extração e isomerização de alguns óleos essenciais extraídos do lúpulo.
e. Resfriamento: Após o processo de fervura, o mosto acrescido de lúpulo é resfriado
por trocadores de calor, com o objetivo de receber a levedura que irá promover a
fermentação.
f. Fermentação: Fase em que as leveduras irão consumir os açúcares fermentescíveis,
se reproduzir e produzir álcool e dióxido de carbono, além de alguns ésteres,
ácidos e alcoóis superiores que irão transmitir propriedades organolépticas à
35
bebida. A fermentação ocorre em tanques fechados, revestidos por uma camisa
externa que permite a passagem de fluído refrigerante (mistura de água com
etanol), para manter o sistema na temperatura desejada, que pode variar de 10 a
25ºC de modo geral.
g. Maturação: Terminada a fermentação a bebida, é enviada aos tanques de maturação
onde é mantida por períodos variáveis a temperaturas de aproximadamente 0ºC. É
nessa fase que ocorre a sedimentação de partículas em suspensão e desencadeiam
reações de esterificação que irão produzir aromatizantes essenciais.
h. Filtração da bebida: Nessa etapa, é acrescido terra diatomácea à cerveja, com o
objetivo de remover as partículas em suspensão e adsorver as substâncias que
conferem coloração desagradável.
i. Acabamento: Após a filtração, a bebida passa por uma fase de acabamento onde irá
receber dióxido de carbono e outras substâncias que irão garantir a qualidade da
bebida e aumentar seu tempo de prateleira, como estabilizantes e antioxidantes.
j. Engarrafamento: Nessa etapa, a bebida acabada é engarrafada, recebendo garrafas
limpas com solução de Ácido Peracético 0,1%(v/v);
k. Pasteurização: O objetivo da pasteurização é eliminar alguns microrganismos que
irão prejudicar as características originais da bebida. Costuma ser realizada a
temperaturas por volta de 62ºC por 20 minutos, de modo que essa seja a
temperatura letal dos microrganismos em questão.
36
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais
A fabricação da bebida fermentada e as análises físico-químicas foram realizadas
na Planta Piloto de Bebidas da Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São
Paulo. A Planta Piloto conta com uma microcervejaria, construída em aço inoxidável, pela
Harmo Darin (Mec Bier), empresa fabricante e fornecedora de equipamentos para cervejas
e microcervejarias, sediada na cidade de Pompéia/SP.
As matérias primas a serem utilizadas neste projeto, ordenadas de acordo à ordem
de maior quantidade, foram: água, arroz preto IAC 600 e lúpulo. Foi utilizado, como
inóculo, uma levedura S. cerevisiae de baixa fermentação e, como catalizador para as
reações de hidrólise, uma enzima α-amilase termoestável.
4.1.1. Água
A água utilizada nos experimentos foi procedente do poço artesiano localizado na
EEL. A Tabela 10 apresenta os resultados das análises da água feita de acordo com a
STANDARD METHODS e descrita por AIZEMBERG (2012):
Tabela 5. Características físicas químicas da água do poço artesiano da EEL.
CARACTERÍSTICAS RESULTADOS POSSÍVEL AFETAÇÃO
pH 6.66 Corrosão ou inibição das enzimas
Odor Poucos odores Defeito sensorial (olor)
Sabor Livre Defeito sensorial (teste)
Aspecto Limpo Defeito sensorial (visual)
Turbidez 0.54 UNT Defeito sensorial (visual)
Cor < 5 mg PI/L Defeito sensorial (visual)
Dureza total 26 mg/L Depende do tipo de cerveja a elaborar
Cloretos 1.2 mg/L Corrosão e sabor salgado
Nitratos 0.19 mg/L Câmbios na fermentação (elaboração e sensorial)
Ferro 0.055 mg/L Detecção sensorial (teste e turbidez)
Fonte: (AIZEMBERG 2012)
37
4.1.2. Arroz
A quirera de arroz preto do tipo IAC-600, em sacos de 50 kg, com 13,9% de
umidade e 74% de rendimento, doado pelo IAC – Pólo regional de Pindamonhangaba/SP
4.1.3. Lúpulo
O lúpulo utilizado foi doado pela AmBev, unidade de JACAREI-SP. Foi utilizado
lúpulo em péletes da variedade amarga Zeus (11,9% alfas ácidos).
4.1.4. Levedura
Para o desenvolvimento do projeto foi utilizada uma estirpe de levedura S.
cerevisiae, denominada PPB-01 e classificada como levedura cervejeira, tipo lager ou
levedura de baixa fermentação. Em estudos, foi classificada como tolerante a alta
concentração de álcool e é ótima para a fermentação de mostos concentrados. (ABREU, et
al. 2004)
4.1.5. Enzima
E enzima utilizada durante todo o processo de hidrólise do amido foi a
THERMAMYL 120L, uma alfa amilase termorresistente cedida pelo Instituto de
Investigaciones para la Industria Alimenticia de Cuba.
38
4.2. Métodos
O trabalho teve como objetivo a utilização de quirera de arroz preto do tipo IAC
600 na elaboração de uma bebida fermentada, lupulada e carbonatada, utilizando a
tecnologia do processo cervejeiro. A fabricação da bebida e as análises foram realizadas na
Planta Piloto de Bebidas da Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São
Paulo. A Planta Piloto conta com uma microcervejaria construída em aço inoxidável pela
Harmo Darin (Mec Bier), empresa fabricante e fornecedora de equipamentos para cervejas
e microcervejarias, com capacidade para elaborar 2hL de mosto.
4.2.1. Preparação da Água de Hidrólise
À água utilizada na hidrólise foram adicionados 1,26g CaCl2/kg de arroz para
tamponamento (ALMEIDA E SILVA 2005) e o pH ajustado até 5,5 com ácido lático 85%.
4.2.2. Moagem do arroz
O objetivo da moagem é expor o interior do grão e assim proporcionar seu contato
com água formando o mosto. No projeto, os equipamentos da microcervejaria utilizados
para obter o mosto incluem um moinho de rolo da Mec Bier (com distância de 0,7mm) e
um tanque de filtração.
4.2.3. Preparo do inoculo
O cultivo da levedura selecionada foi transferido de um tubo de ensaio para um
meio líquido e depois para outros meios líquidos aumentando a cada transferência o
volume de cultivo. O procedimento foi desenvolvido segundo a técnica de transferência
39
asséptica descrita por Madigan et al. (2010), e o meio de cultura utilizado foi mosto puro
de arroz com uma concentração de 10°Brix, onde foi adicionado 5g/L de sacarose,
previamente esterilizado. As células foram cultivadas pelo método de inoculações
sucessivas em frascos Erlenmeyer de 100, 500, 1000 e 5000mL, e o volume de mosto em
cada caso foi o 50% da capacidade do envase. Em cada passo o meio foi mantido sob
agitação rotatória de 300rpm a 30˚C por um tempo mínimo de 24h, em uma incubadora
refrigerada marca CLENTEC.
4.2.4. Escala Laboratorial
4.2.4.1. Avaliação da melhor condição de hidrólise
Foi realizada uma avaliação da melhor condição de hidrólise, variando o tempo de
fervura para liquefação do amido e o tempo de exposição do arroz à enzima até a
sacarificação total. Todos os ensaios foram conduzidos em panelas de 5L e 15L em um
fogão a gás industrial.
Foram colocados no recipiente de hidrólise: água, arroz moído e uma alíquota da
solução de enzima para auxiliar na fervura da mistura; após a fervura foi colocado outra
alíquota de enzima e mantido a 90°C até sacarificação total. Os ensaios estão enumerados
na tabela abaixo, onde está representada a massa de arroz, volume de água, volume de
enzima antes e depois da fervura e tempo de fervura:
Tabela 6. Relação massa de arroz e tempo de fervura durante o experimento para avaliação de melhor
condição de hidrólise.
Ensaios marroz
(kg)
Vágua
(L)
Volume
enzima antes
(mL)
Volume
enzima depois
(mL)
Tempo de
fervura (h)
1 0,5 2,0 0,15 0,5 0,5
2 0,5 2,0 0,15 0,5 1
3 0,5 2,0 0,15 0,5 2
4 2,0 8,0 0,6 2,0 1
5 2,0 8,0 0,6 2,0 2
40
Figura 6. Representação gráfica do tratamento térmico do arroz nos diferentes ensaios
O método de hidrólise utilizado foi o de somente uma rampa, onde a temperatura
foi aumentada até a fervura para liquefação do amido e mantida sob fervura durante o
tempo estipulado e, logo após o desligamento da fonte de calor, adicionado outra alíquota
de extrato enzimático para o início da sacarificação, mantendo a mistura a 90-95°C. O
parâmetro avaliado neste experimento foi o tempo de exposição da segunda alíquota de
enzima durante a sacarificação. Para confirmar a sacarificação foi usada uma solução de
iodo a 0,2N, de acordo com a Figura 7, onde confirma a completa hidrólise do amido, pela
ausência da coloração roxo-azulada característica da reação com a solução de iodo (em
temperatura ambiente).
Figura 7. Teste de Iodo
FONTE: ANDRADE (2007)
0 50 100 150 200 250 300
50
100
Te
mp
era
tura
(°C
)
tempo (min)
ensaios 3 e 5
ensaios 2 e 4
ensaio 1
41
4.2.4.2. Avaliação dos açúcares fermentescíveis do mosto
Foram avaliadas as fermentações limites visando conhecer a porcentagem de
açúcares fermentescíveis, com estes dados foi possível o cálculo da quantidade de levedura
a ser inoculada na etapa. A relação de levedura/açúcares fermentescíveis utilizada foi de
0,1186g de levedura/1 g de açúcar fermentescível (CARRILLO, CARRILLO e
MARTÍNEZ 2011).
Os microrganismos utilizados na fermentação são estirpes de leveduras S.
cerevisiae, as que utilizam a via metabólica da fermentação alcoólica para ganhar energia,
transformando os açúcares do mosto em etanol e CO2. Além disso, durante o processo de
fermentação ocorre a formação de subprodutos que têm um efeito importante sobre o perfil
sensorial da bebida.
Foi realizado um ensaio (ensaio 5) de 3,0L por duplicata. Os fermentadores
utilizados foram feitos com garrafas PET de 3,5L, inoculados com cepas de PPB-01 e
incubados em geladeira a (10±1)°C durante uma semana; após este período, a temperatura
foi ajustada a (0±1)°C e mantida por duas semanas para maturação.
Durante o período da primeira fermentação foram coletadas amostras a cada 24h e
48h durante a maturação. Foi determinada a concentração de açúcares redutores (AR) de
acordo com MILLER (1959) para todas as amostras coletadas; a concentração de
nitrogênio amínico livre, FAN, (Free Amino Nitrogen) para as amostras do início e do fim
da fermentação, conforme EBC (2002); e para a bebida produzida foi determinado teor
alcoólico por destilação, segundo EBC (2004).
4.2.5. Escala Piloto
4.2.5.1. Cálculo das massas de arroz e lúpulo para volume e °Plato de mosto
Estimando a produção de 130L de mosto com 12°Plato e a produção de uma bebida
com 15IBU (ou BU) de amargor, fazendo algumas considerações de rendimento, realizou-
se os seguintes cálculos:
42
a. Cálculo da massa de arroz:
extrato seco mosto
*12°P = 12,56kg/hl (dado retirado da tabela de Goldiner Et Klemann)
Logo:
amido
Assumindo que o grão de arroz tenha 74% de amido (massa seca) temos:
arroz
Considerando a eficiência entre hidrólise e filtração de 85%** temos:
arroz
**Esta eficiência foi determinada levando em consideração as perdas durante a
filtração, perdas que consistem no açúcar residual presente no bagaço.
A partir foi estipulado que para uma produção de 130L de mosto deveriam ser
utilizados 26kg de arroz e 104L de água (proporção ideal arroz:água é de 1:4 segundo
SANTO C. D. O. (2011).
b. Cálculo da massa de lúpulo
A unidade de amargor é tida como mg de iso-a-ácidos/L. Tendo como volume final
de mosto 140L e querendo 15IBU, temos que serão necessários 2100mg de isso-a ácidos;
considerando que o rendimento de extração é de 30% e a % de a-ácidos no lúpulo é de
11%, teremos como massa de lúpulo a ser usada igual a 63,6g.
4.2.5.2. Preparo do inoculo
O inoculo foi prepara de acordo com o item 4.2.3
43
4.2.5.3. Preparo do mosto
Foram pesados 26 kg de arroz preto e moídos em moinho de rolos, com distância
de 0,7 mm entre os rolos. No tanque de mosturação, da marca Mec Bier, foram
adicionados o arroz e 104L de água ajustada como descrito no item 4.2.1. No início do
aquecimento adicionou-se 7,8mL do extrato enzimático Thermamyl 120L para ajudar na
fervura e liquefazer o amido, iniciando sua dextrinização e facilitando a fervura. Quando o
tanque atingiu 96°C (temperatura máxima atingida pelo equipamento) levou-se a mistura
fervendo durante uma hora, para liquefazer o máximo de amido. Após este tempo, foram
adicionados 26 mL de enzimas e, deixado sob 90°C durante 4 horas, mesmo não havendo
sacarificação total do amido, o experimento foi levado para a próxima etapa.
Figura 8. Representação gráfica do tratamento térmico do arroz na Planta Piloto
4.2.5.4. Filtração do mosto doce
O mosto preparado com arroz preto foi submetido à filtração em tanque de aço inox
com capacidade para 120L contendo: agitador, disco filtrante ranhurado Pak Screens,
bomba centrífuga e isolamento térmico. A camada filtrante, denominada “torta”, formada
pela massa não hidrolisada do arroz, foi lavada com 50 L (30L + 20L) de água a 78 °C.
0 100 200 300 400
40
50
60
70
80
90
100
Te
mp
era
tura
(°C
)
Tempo (min)
1ª aliquota de enzima
2ª aliquota de enzima
curva de mostura
44
4.2.5.5. Fervura do Mosto
Posteriormente à fervura, mosto doce foi submetido à fervura em tanque de fervura
encamisado, com capacidade para 250 L, provido de aquecimento elétrico e isolamento
térmico, até que fosse corrigida a concentração de açúcares no mosto em 12 °P. Durante os
60 minutos de fervura foram adicionados 63,6 g de lúpulo em pellets.
Logo após a fervura, o mosto foi submetido à recirculação tangencial por cerca de
20 minutos para permitir a precipitação de proteínas e polifenóis. Durante este tempo, o
mosto foi resfriado por meio da troca da água da camisa por água fria corrente. O volume
recuperado desta etapa foi de 140L.
Após a recirculação, o mosto foi mantido em repouso por 24 horas, sob
resfriamento a 20°C. Ao final deste período, foi retirado o sedimento de proteínas e
polifenóis, denominado “trub”, e o mosto transferido para o tanque de fermentação.
4.2.5.6. Fermentação
Após o resfriamento e remoção do trub, foram recuperados 130L de mosto. A
fermentação foi conduzida em tanque de fermentação de 200 L, equipado com controlador
e indicador digital de temperatura e registro para retirada de amostra.
Depois da transferência do mosto para o fermentador, iniciou-se a aeração manual
do meio por recirculação durante 10 minutos. Após este tempo, foi adicionado o inóculo e
a temperatura regulada em 10°C. Foram retiradas amostras a cada 12horas e feitas
determinações dos teores de álcool e de extratos por meio do analisador de bebidas Anton
Paar, modelo Beer Analyzer 2 (como o equipamento está calibrado para análises de
cervejas Pilsen e não há padrão para a bebida em questão, ele só foi utilizado para
determinação do ponto final da fermentação).
Subsequente à constatação d o término da fermentação, o excesso de leveduras foi
retirado pelo fundo do fermentador e a temperatura ajustada em 0 °C para o início da
maturação, permanecendo assim por 14 dias.
45
4.2.5.7. Filtração/Carbonatação/Pasteurização
Ao término da maturação, a bebida obtida foi filtrada em um filtro de platôs da Mec
Bier, tendo como auxiliar de filtração, terra perlítica Dicamex 427, sob pressão de 2
kgf/cm2. Depois de filtrada, a bebida foi armazenada em tanque para carbonatação que foi
feita com injeção de CO2 a 2 kgf/cm2 durante 3 dias. Feito isso, a bebida foi engarrafada
em garrafas âmbar limpas, esterilizadas com Ácido Peracético 0,1%v/v e pasteurizadas a
62°C por 20min.
4.2.5.8. Análises físico-químicas da bebida
Foram determinados: teor alcoólico por destilação (EBC, Beer 2004); pH, medido
no aparelho da marca Marconi, modelo MA-522; massa seca (LUTZ 2008) e coloração
EBC (EBC, Wort 2002).
46
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Avaliação da melhor condição de hidrólise
O tempo total de hidrólise foi determinado utilizando diferentes ensaios onde houve
variação dos tempos de fervura e da escala do processo. Os tempos para hidrólise total do
amido para cada ensaio pode ser observado na Tabela 7:
Tabela 7. Relação massa arroz, tempo de fervura e tempo de exposição do amido à enzima durante
sacarificação
Ensaios marroz (kg) Tempo de
fervura (h)
Tempo para
hidrólise total (h)
1 0,5 0,5 4
2 0,5 1 1,5
3 0,5 2 1,5
4 2 1 5
5 2 2 3
A partir dos resultados obtidos, pode ser visto a influência da fervura na liquefação,
havendo uma diminuição do tempo de exposição da enzima para sacarificação do amido;
isso se aconteceu porque utilizados grãos integrais quebrados3 ao invés de farinha,
necessitando de uma energia cinética maior, no caso a fervura, para um aumento da
pressão interna dos grãos de amido, os “explodindo”, facilitando a solubilização e posterior
quebra dos grânulos. Pôde-se também observar um aumento no tempo requerido para
hidrólise com aumento de escala; isso se deu pela dificuldade de homogeneização e de
manutenção da temperatura acima de 90°C.
5.2. Avaliação dos açúcares fermentescíveis do mosto
No ensaio para avaliação de açúcares fermentescíveis foi utilizado o método de
DNS, segundo Miller (1959), para análise de cada amostragem feita. O cálculo de açúcares
3 Não foi utilizado farinha pois se precisava da formação de uma torta filtrante após a mostura, presença de
farinha acarretaria no entupimento do tanque de filtração
47
fermentescíveis é a diferença entre açúcares redutores (AR) contidos no início e no final da
fermentação.
Foi quantificada a concentração de amino nitrogênio livre (FAN), segundo EBC
(2002), do início e do final da fermentação. Verificação feita para avaliar a existência de
fontes de nitrogênio suficientes para fermentação total dos açúcares provenientes da
sacarificação, visto que não houve utilização de proteases, nem suplementação do mosto.
Avaliando a necessidade do emprego de etapa complementar à sacarificação
Tabela 8. Média dos valores de concentração de açúcares redutores observados durante a fermentação e de
amino nitrogênio livre lidos no início e fim da fermentação.
Tempo
(dias)
Concentração
de AR (g/L)
FAN
(mg/L)
0 57,96 29,32
1 53,2 -
2 49,45 -
3 47,35 -
4 43,85 -
5 40,65 -
6 37,12 -
7 35,11 -
8 33,57 -
10 32,4 -
12 32,02 -
14 30,51 -
16 27,56 -
18 27,01 -
20 26,51 -
21 27,14 9,35
Figura 9. Gráfico de concentração de açúcares redutores pelo tempo de fermentação (consumo de substrato).
0 5 10 15 20 25
25
30
35
40
45
50
55
60
Co
nce
ntr
açã
o d
e A
R (
g/L
)
Tempo (dias)
pontos experimentais
curva ajustada
48
Analisando os dados foi verificado que, para as condições empregadas durante a
hidrólise do amido, foram liberados 29,32 mg/L de FAN. O FAN contido na mistura foi
suficiente para alimentação do metabolismo celular do agente fermentativo utilizado para
consumo de 30,82g/L de açúcares porém é inconclusivo para avaliar se o agente limitante
da fermentação é a quantidade de açúcares. Havendo a necessidade de outros ensaios com
suplementação de nitrogênio, seja ele com adição de uma protease (ex.: papaína), durante o
tratamento térmico dado ao arroz, ou agente de natureza química.
O teor alcoólico obtido a partir da fermentação foi quantificado por destilação,
segundo EBC (2002), foi de 3% (v/v). Durante a quantificação de alcoóis há recuperação
de alcoóis superiores, etanol e inferiores, não podendo utilizar este valor para cálculos de
rendimento da fermentação. Devido à falta de recursos para quantificação de açúcares e
etanol e impossibilidade de quantificação de células, devido à alta capacidade de
floculação da cepa utilizada e do meio não ser agitado para evitar aeração, não foram feitos
estudos da cinética de fermentação.
5.3. Fermentação em escala piloto
Considerando o valor calculado de açúcares consumidos no item 5.2 como açúcares
fermentescíveis totais recuperados no mosto, e o FAN recuperado durante a hidrólise como
suficiente para fermentação foi conduzida a produção da bebida em escala piloto.
No início da fermentação o mosto tinha concentrações de com 53,75g/L de AR e
32,92mg/L de FAN, no final, foi obtido um fermentado com 31,15g/L de AR e 10,54mg/L
de FAN. Houve uma queda significativa do pH, de 5,4 a 4,4, devido provavelmente à
produção de ácido, como previsto por ANDRADE (2007) e SANTOS (2011).
Observou-se a coloração do mosto e do fermentado, onde houve uma perda na
intensidade, sendo que a primeira foi roxa e a segunda avermelhada. Isso ocorre porque
diferentes linhagens de leveduras tem se mostrado capazes de adsorver antocianinas na
parede celular. O mecanismo envolve interações hidrofóbicas, considerando que
antocianinas com alto grau de metoxilação são mais propícias do que as hidroxiladas, além
de diferentes polaridades e porosidades da parede celular (MORATA, et al. 2003). Fato
que pode ser comprovado pela coloração da levedura que, após a fermentação, ficou lilás.
49
No processo foi obtido 1hL de uma bebida com teor alcoólico de 1,9%
(v/v), pH4,4, coloração 18,6 unidades EBC ou 9,44ASBC, 9,85% de massa seca.
Sensorialmente pode-se dizer que a bebida carregou tanto sabor quanto odores
característicos do arroz preto e apresentou coloração avermelhada.
Com o término da produção da bebida pôde-se fazer o cálculo de rendimento desde
a moagem até a chegada do mosto no fermentador:
Onde,
50
6. CONCLUSÃO
De acordo com os dados experimentais obtidos durante a realização deste trabalho
pôde-se avaliar as dificuldades encontradas durante a sacarificação do amido, onde a
fervura antes da hidrólise e a homogeneização do sistema são fundamentais para o
processo. É importante ressaltar que a não escolha de outros tipos de enzimas amilolíticas
no processo se deu para obtenção uma bebida final adocicada, podendo, assim, mascarar
sutilmente o sabor e odores acentuados e incomuns do produto final.
As limitações na hidrólise, as dificuldades encontradas durante a filtração do mosto
e a grande quantidade de trub retirados depois da fervura, justificam a perda de 34,72% no
processo. Perda que pode ser minimizada com a adição outra etapa de hidrólise utilizando
diferentes enzimas amilolíticas ou utilização de uma fonte alternativa de açúcares e a
adaptação do sistema de filtração do mosto, visto que o arroz cozido forma uma torta de
filtração pegajosa, dificultando a melhor recuperação dos açúcares.
A bebida produzida possui baixo teor alcoólico, 1,9%v/v, e é isenta de glúten,
fatores que a qualificam ideal para celíacos. O emprego deste processo poderá contribuir
para o desenvolvimento de uma tecnologia de produção de bebidas alcoólicas e aproveitar
as quireras de arroz que não possuem valor no mercado.
51
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55
ANEXO A
LAUDO DE ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DO ARROZ INTEGRAL IAC 600
PRODUZIDO POR FRANCISCO RUZENE
56
57
58