hidrolisados protéicos de peixe: caracterização e proposta de uso

Ficha CatalográficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Neves, Renata Alexandra Moreira dasN514h Hidrolisados protéicos de pescado: caracterização e proposta de uso

como suporte nutricional/Renata Alexandra Moreira das Neves. -- SãoPaulo, 2000.

83p.

Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticasda Universidade de São Paulo. Departamento de Alimentos eNutrição Experimental.

Orientador: Marquez, Ursula Maria Lanfer

1. Bioquímica dos alimentos 2. Peixes: Ciências dosalimentos I. T. n. Marquez, Ursula Maria Lanfer, orientador.

641.1 CDD

RENATA ALEXANDRA MOREIRA DAS NEVES

HIDROLlSADOS PROTÉICOS DE PESCADO:CARACTERIZAÇÃO E PROPOSTA DE USO COMO SUPORTE

NUTRICIONAL

Comissão julgadora

Dissertação para obtenção do grau de

MESTRE

Profa. Ora. Ursula M. Lanfer M~hQ€iêz

Orientadorl Presidente

Profa. Ora Vera Lúcia Signoreli Baldini

10 Examinador

Prof. Dr. Alfredo Tenuta Filho20 Examinador

/.: fJl,V . .. '1 rJ, . ..~ t?vuie I dO dt. fV(./(LUC(/ w;JOUl

" Se nesta vida, para poder sobreviver I

o homem pudesse viver daquilo que sente prazer em fazer,

o mundo seria bem mais diferente,

o mundo seria bem mais feliz. "

J aeci Cavalcanti das Neves

Dedico este trabalho,

Aos meus pais, Jaeci e Edna, por serem e terem sido ao

longo da minha existência meus primeiros incentivadores.

Agradecimentos,

À professora Ursula Maria Lanfer Marquez pela orientação, exemplo decompetência, confiança e apoio durante a realização deste trabalho;

Às amigas Andréa Moura e Ana Vládia por terem me apoiado nosmomentos difíceis, pelas palavras de carinho e estímulo;

Aos colegas de laboratório, pela companhia, colaboração, amizade e pelosmomentos de alegria;

À Inês, pela ajuda prestada no decorrer da elaboração deste trabalho epelo carinho;

Ao professor Alfredo Tenuta, agradeço o apoio recebido quandonecessitei utilizar o seu laboratório e equipamentos necessários aelaboração deste trabalho;

À todos os alunos e funcionários do Departamento de Alimentos eNutrição Experimental, que direta ou indiretamente participaram daelaboração deste trabalho;

Ao Luiz pela ajuda na utilização dos recursos de informática;

Aos bibliotecários Ângelo e Adriana pela amizade e boa vontade;

Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos;

Em especial, à toda a minha família (pais, irmãos, tios e avós), que sempre

estiveram ao meu lado, se preocupando e torcendo por mim e ao Laerte

pelo amor e paciência.

SUMÁRIO

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Resumo

Abstract

i-Introdução .

2- Revisão da Literatura .

2.1-Hidrolisados protéicos .

2.1.1- Aplicação dos hidroJisados em pacientes alérgicos ou com desordens

metabólicas .

2.1.2- Processos de hidrólise .

2.1.3- Fontes de proteína ..

2.1.4- Caracterização do hidrolisado protéico ..

2.1.5- Fracionamento dos peptídeos e caracterização química como

acompanhamento da produção de hidroJisados protéicos .

2.16- Propriedades físico-químicas e funcionais dos hidroJisados protéicos .

2.2- Suporte nutricional na fenilcetonúria (PKU) ..

2.2.1- Diagnóstico e tratamento ..

2.2.2- PKU maternal .

2.2.3- Tratamento da PKU .

2.2.4- Necessidades nutricionais dos fenilcetonúricos .

2.2.5- Composição de aminoácidos .

2.2.6- Mistura de aminoácidos livres ..

2.3- Suporte nutricional na encefalopatia hepática .

2.3.1- Tratamento da encefalopatia hepática ..

3- Objetivos ..

4- Materiais e Métodos .

4.1- Materiais .

4.1.1- Amostras .

4.1.2- Reagentes .

Renata Alexandra Moreira das Neves

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4.2- Métodos................................................................................................. 43

4.2.1- Preparação do hidrolisado protéico 43

4.2.2- Determinação do grau de hidrólise 45

4.2.3- Separação das frações peptídicas por faixa de peso molecular................ 46

4.2.4- Métodos Analíticos............................................................................ 46

4.2.4.1- Análise do teor de a-aminonitrogênio 46

4.2.4.2- Análise de aminoácidos 47

4.2.4.3- Análise da composição química dos hidrolisados 48

5- Resultados e Discussão 49

5.1- Composição química do "MINCED" e dos hidrolisados 49

5.2- Rendimento dos hidrolisados enzimáticos 51

5.3- Composição em aminoácidos dos hidrolisados e comparação com

requerimentos da FAO............................................................................. 53

5.4- Relação de Fischer nos hidrolisados.......................................................... 56

5.5- Distribuição percentual dos peptídeos com diferentes pesos moleculares 57

5.6 - Perfil de aminoácidos das frações peptídicas dos diversos hidrolisados 59

6- Conclusões 65

7 R" A " S"bl" , f" 67- e.erenclas I logra Icas .


LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS

I

Figura 1 - Metabolismo da fenilalanina indicando o bloqueio metabólico, o 24qual leva ao acúmulo de fenilalanina e produção de fenilcetonas,adaptado de Francis, 1987

Figura 2 - Fluxograma do processo de preparação do hidrolisado de peixe 43

Figura 3 - Distribuição do peso molecular dos peptídeos nos hidrolisados 57enzimáticos

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

li

Tabela 1 - Fórmulas baseadas em hidrolisados protéicos 05

Tabela 2 - Composição em aminoácidos essenciais de vários substratos 10protéicos

Tabela 3 - Perfil do peso molecular de diferentes classes de hidrolisados 12protéicos

Tabela 4 - Propriedades Físico-químicas e Funcionais dos hidrolisados 20protéicos em produtos nutricionais

Tabela 5 - Enzimas utilizadas na obtenção dos hidrolisados 42

Tabela 6 - Sistemas enzimáticos utilizados para a obtenção dos 44hidroJisados e seus respectivos graus de hidrólise.

Tabela 7 - Composição centesimal do "minced" e dos seis hidrolisados 49protéicos após liofilização

Tabela 8 - Recuperação protéica nos seis hidrolisados enzimáticos 51

Tabela 9 - Conteúdo de aminoácidos do "minced" e dos hidrolisados 55obtidos e os requerimentos de aminoácidos essenciais, FAO1991

Tabela 10 - Relação de Fischer nos hidrolisados enzimáticos de 56"minced"

Tabela 11 a - Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e 60nas frações peptídicas obtidas a partir dos hidrolisados H1(Pepsina 1:1 O.OOO/Bromelina), H2 (Pepsina 1:60.000/Bromelina) e H3 (Pepsina 1:1O.OOO/Quimotripsina)

Tabela 11 b - Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e 61nas frações peptídicas obtidas a partir dos hidrolisados H4(Pepsina 1:10.000/AspergiJIusoryzae), H5 (Pepsina 1:60.000/Streptomyces griseus) e H6 (Pepsina 1:10.000/Streptomycesgriseus)

Tabela 12 - Perfil de distribuição da fenilalanina nos hidrolisados totais e 62nas frações peptídicas obtidas a partir desses hidrolisados


RESUMO

RESUMO

Hidrolisados enzimáticos e aminoácidos livres têm sido reportados como

fontes adequadas de proteína para o tratamento clínico de pacientes que por

diversas razões, não conseguem digerir a proteína intacta. Os hidrolisados

enzimáticos têm sido preferidos por fornecer peptídeos de composição bem

definida, promovendo uma absorção mais efetiva pelo organismo. Isto se deve

ao fato de que di e tripeptídeos podem ser diretamente absorvidos por sistemas

independentes daqueles usados pelos aminoácidos, e a taxa máxima de

captação na absorção de di e tripeptídeos é maior do que a dos aminoácidos

livres. As proteínas do leite, soja e peixe são as mais utilizadas, devido ao alto

valor nutricional, disponibilidade comercial e custo moderado. Em nosso trabalho,

caracterizamos seis hidrolisados enzimáticos de "minced" sob o ponto de vista

químico, físico-químico e nutricional, visando atender grupos populacionais que

necessitem de uma alimentação especial. A composição química (proteína,

lípides, umidade e o conteúdo de resíduo mineral) e o perfil de aminoácidos dos

hidrolisados foram determinados. A caracterização do peso molecular destes

hidrolisados protéicos foi realizada por ultrafiltração em membranas de exclusão

molecular de 30, 10 e 3Kd. Os seis hidrolisados apresentaram um rendimento

variando entre 63,4 e 94,2%, dependendo do sistema enzimático utilizado. Os

hidrolisados liofilizados continham teores protéicos semelhantes entre si, em

média 74,2% e um teor lipídico muito reduzido, da ordem de 1,2%. Todos os

hidrolisados apresentaram uma composição em aminoácidos semelhantes entre

si e que atende as recomendações da FAO 1991, para crianças entre 3 e 8 anos

e para adultos. Os hidrolisados 1 (pepsina 1:10.000/bromelina) e 4 (pepsina

1:10.000/Aspergillus oryzae) são indicados para o tratamento de pacientes com

encefalopatia hepática, pois apresentaram uma relação de Fischer elevada de

3: 1. O processo de ultrafiltração mostrou ser um método de baixo custo e

eficiente para separar as frações peptídicas com diferentes pesos moleculares e

pouco interferiu na distribuição dos aminoácidos. No hidrolisado 5 (pepsina


RESUMO IV

1:60.000/Streptomyces griseus) , a fração com peso molecular menor que 3 KDa,

apresentou uma porcentagem elevada (57%) de peptídeos com baixo peso

molecular, podendo ser utilizada no tratamento de pacientes com alergias

alimentares. Esta mesma fração apresentou uma elevada concentração de

fenilalanina livre, sugerindo o emprego de um processo de remoção deste

aminoácido, para posterior formulação de dietas para pacientes fenilcetonúricos.

Renata Alexandt'a Moreira das Neves

RESUMO

ABSTRACT

v

Protein hydrolysates and free amino acids have been used for the

nutritional management of individuais who are not able to digest intact protein.

Studies within the past two decades have shown that dipeptides and tripeptides

may serve efficiently and safely to improve protein nutrition and that in certain

instances they may be superior to free amino acids. Owing to their superior

nutritional quality, hydrolysates of cow's milk protein, soy protein and fish protein

are the most widely usado In our work, a minced fish was hydrolyzed, employing

six different systems of two sequential enzymes. lhe resultant fish protein

hydrolysates (FPH) were characterized for protein, fat, dry matter and ash

contents and their amino acid composition was analyzed either. lhe six FPH

were submitted to an ultrafiltration through a series of membranes with

molecular cut-offs (MWCO) of 30, 10 and 3 KDa. lhe results showed yields of

protein hydrolysates using different proteolytic enzymes varying from 63,4 to

94,2%. lhe protein contents on a dry basis of the six hydrolysates were similar,

on average, 74,2%. lhe lipid contents of the six hydrolysates were low (mean of

1,2%). Although decreases of some amino acids were observed after hydrolysis,

adequate amounts of essential amino acids in relation to the reference pattern of

FAO (1991) were found for children from 3-8 years and adults. lhe hydrolysates

1 . (pepsin 1:10.0001 bromelain) and 4 (pepsin 1:1O.OOOIAspergillus oryzae)

present a high Fischer ratio (molar ratio of VaI + Leu + lIe to lyr + Phe) and

seem to be interesting for clinicai treatment of patients with liver diseases. lhe

separation of peptides with different molecular weights by ultrafiltration seems to

be a low cost and efficient method and does not interfere substantially with the

amino acids distribution. lhe hydrolysate 5 (pepsin 1:60.000IStreptomyces

griseus) contained a high percentage of low molecular weight peptides (57%),

lower than 3 KDa. lhe same fraction contains a high free phenylalanine content,

suggesting the removal of this amino acid in order to formulate diets for PKU

patients.


INTRODUÇÃO

1-INTRODUÇÃO

Hidrolisados protéicos e misturas de aminoácidos livres são utilizados

como suporte nutricional para tratamento clínico de pacientes com desordens

gastrointestinais, má nutrição associada à câncer, disfunções metabólicas e

alergias alimentares.

Os hidrolisados enzimáticos têm sido preferidos por fornecer peptídeos

de composição bem definida, promovendo uma absorção mais efetiva pelo

organismo, pela facilidade de uso e pelo menor custo. Misturas de

aminoácidos sintéticos são dispendiosas, apresentam propriedades

organolépticas desagradáveis e elevada osmolalidade que pode acarretar

disfunção intestinal.

O peso molecular dos peptídeos do hidrolisado irá definir a sua

utilização. Em fórmulas infantis hipoalergênicas é necessário que o

hidrolisado apresente peptídeos com baixo peso molecular, pois pequenas

quantidades de peptídeos de alto peso molecular podem causar

complicações em pacientes alérgicos.

Por outro lado, peptídeos com alto peso molecular (mais que 20

resíduos de aminoácidos) estão associados com uma melhor funcionalidade.

Hidrolisados enzimáticos, com baixo teor de fenilalanina, podem em

particular, serem utilizados por pacientes fenilcetonúricos, como uma

alternativa à alimentação e aos inconvenientes causados pelas misturas de

aminoácidos.


INTRODUÇÃO 2

Para pacientes com encefalopatia hepática seria desejável

desenvolver hidrolisados enzimáticos protéicos com alto teor de aminoácidos

de cadeia ramificada e um baixo conteúdo de aminoácidos aromáticos.

As proteínas do leite, soja e peixe são as mais utilizadas, devido ao

alto valor nutricional, disponibilidade comercial e custo moderado.

O interesse pela hidrólise de proteínas de peixe iniciou-se por volta

dos anos 60: são proteínas relativamente abundantes, e consideradas

excelentes para alimentação humana. A predominancia de pequenos

peptídeos garante fácil digestão e absorção.

Estudos prévios realizados em nosso laboratório com hidrolisados

enzimáticos de "minced" de pescado (produzido a partir da mistura de

pescados de água salgada: "Maria-Luíza", "Perna-de-Moça" e Camarão),

sugerem o uso de hidrolisados protéicos à base de pescados, para a

alimentação humana.

Pretendemos neste trabalho, dando continuidade a esta linha de

pesquisa, caracterizar os hidrolisados obtidos em nosso laboratório, em

trabalho anterior, sob o ponto de vista químico, físico-químico e nutricional,

indicando uma possível utilização dos mesmos, visando a alimentação de

grupos populacionais que necessitam de uma alimentação especial.


REVISÃO DA LITERATURA 3

2- REVISÃO DA LITERATURA

2.1- HIDROLlSADOS PROTÉICOS

Proteínas são componentes essenciais para a nutrição humana, como

fonte de aminoácidos e energia. A qualidade nutricional das proteínas

depende do perfil de aminoácidos e da utilização fisiológica destes, depois da

digestão e absorção, que por sua vez está relacionada com a fonte protéica,

a forma de preparo do alimento e a presença de outros componentes da dieta

(CLEMENTE et ai., 1999; FRIEDMAN, 1996).

Hidrolisados enzimáticos protéicos, ricos em di e tripeptídeos, têm sido

reportados como fontes adequadas de proteína para a nutrição humana

devido a excelente absorção gastrointestinal, sendo melhor utilizados pelo

organismo do que as proteínas intactas ou os aminoácidos livres

(SIEMENSMA etal., 1993; ZIEGLER et ai., 1990).

As propriedades funcionais e nutricionais destes hidrolisados, os

tornam uma fonte atrativa de proteínas, tanto para uso em dietas especiais

como para o consumo em geral (CALDERÓN DE LA BARCA et ai., 2000;

FROKJAER, 1994; MAHMOUD, 1994; LAHL e BRAUN, 1994).

Os hidrolisados têm sido empregados no melhoramento da textura

alimentar promovendo um aumento da capacidade de absorção de água; em

fortificação de bebidas ácidas; no desenvolvimento de fórmulas infantis com

reduzida alergenicidade ou para erros inatos do metabolismo e na formulação

de produtos nutricionais especiais para adultos, com função gastrointestinal

prejudicada, ou mesmo em doenças orgânicas específicas, como renal e



hepática (CHIANG et aI., 1995; MAHMOUD, 1994; CORDLE, 1994).

2.1.1- APLICAÇÃO DOS HIDROLlSADOS EM PACIENTES

ALÉRGICOS OU COM DESORDENS METABÓLICAS

o tratamento clinico de pacientes com desordens no trato

gastrointestinal, se estendendo a pacientes com má nutrição associada com

câncer, queimaduras e traumas, crianças com diarréia aguda ou crônica,

alergias alimentares, ou desordens no metabolismo dos aminoácidos é

baseado na utilização de fórmulas sintéticas baseadas em hidrolisados

protéicos e aminoácidos livres (ZARRABIAN et ai., 1999; SCHMIDL et aI.,

1994; MEREDITH et aI., 1990; BUZINCO et ai., 1989; KNIGHTS, 1985;

MILLA et ai., 1983).

O desenvolvimento de fórmulas enterais utilizadas para a alimentação

de pacientes hospitalizados com distúrbios vários incluíndo a alergia alimentar

foi um avanço na ciência e na medicina durante os últimos 40 anos. Em 1991,

foi estimado que há mais de 5 milhões de pacientes que são alimentados com

fórmulas enterais nos E.U.A. e que esses alimentos têm um valor no mercado

excedendo 1 bilhão de dólares (FASEB, 1991).

De acordo com a fonte protéica e o grau de hidrólise podemos

encontrar diversas fórmulas baseadas em hidrolisados protéicos, como as

apresentadas na tabela 1. Produtos à base de soja hidrolisada, elaborados

para suprir as necessidades nutricionais de um indivíduo, são os mais

frequentemente utilizados para crianças alérgicas ao leite de vaca. Bebês que

não toleram os produtos da soja podem ser alimentados com uma fórmula à



base de caseína hidrolisada, como o Nutramigen (HALKEN, 1995; TRAHMS,

1991). O Comitê de Nutrição da Academia Americana de Pediatria,

responsável pela composição de fórmulas infantis patenteadas, estabeleceu

padrões para estes produtos, baseados na composição do leite de uma mãe

sadia.

Tabela 1 - Fórmulas baseadas em hidrolisados protéicosa

FORMULA FONTE DE PROTEINA GRAU DE HIDROLl8E

EXTENSO PARCIALNutramigen Caseína Bovina *Pregestimil Caseína Bovina I *Alimentum Caseína Bovina t *Alfa-Ré Soro Bovino I *Profylac Soro Bovino I *Pepti-Junior Soro Bovino I *Nan HÁ, Beba HÁ Soro Bovino I *Nidina HÁ Soro Bovino I *Nutrilon Pepti Soro Bovino I *Nutrilon Pepti Plus Soro Bovino I *Aptamil HÁ Caseína e Soro

I *Pregomin Soja e Soro Bovino *

aAdaptado de Halken, 1995.

O grau de hidrólise da proteína determina a sua aplicação: proteínas

altamente hidrolisadas, compostas por peptídeos com pesos moleculares

inferiores a 5000 daltons (os produtos disponíveis no comércio normalmente

apresentam peso molecular menor que 1200 daltons) são utilizadas no

controle de alergias alimentares, de modo que, a necessidade de controlar a

alergia alimentar é uma das forças direcionais para o desenvolvimento

tecnológico de hidrolisados protéicos (MALDONADO et aI., 1998; CORDLE,

1994).



A alergia alimentar é mais freqüente em crianças, onde cerca de 0,5 a

10% das crianças desenvolvem algum tipo de alergia, e é mais séria em

adultos. Nas crianças, a alergia ao leite de vaca é a mais comum,

provavelmente devido a sua grande utilização na alimentação infantil

(CORDLE, 1994).

Proteínas parcialmente hidrolisadas apresentam uma certa proporção

de proteínas intactas e peptídeos com pesos moleculares entre 5000 a 20000

daltons. Não são adequadas no tratamento de alergias alimentares, mas

podem ser utilizadas como fonte de proteínas por indivíduos que possuem

necessidades nutricionais e fisiológicas específicas. Podem ser úteis,

também, como suplemento nutricional para pacientes que não consomem

grandes quantidades de alimentos convencionais, ou ainda, podem substituir

as misturas de aminoácidos sintéticos, utilizadas no tratamento de desordens

do metabolismo dos aminoácidos (MALDONADO et aI., 1998; HALKEN et aI.,

1995; MAHMOUD, 1994).

O uso de hidrolisados nos casos de desordens no metabolismo dos

aminoácidos tem sido recomendado por diversos pesquisadores. Alimentos

protéicos, parcialmente hidrolisados por uso de enzimas, liberando a

fenilalanina, vem sendo utilizados na produção de peptídeos com baixo teor

desse aminoácido, para pacientes com intolerância à fenilalanina (ARAI et aI.,

1986).

Freqüentemente nota-se a formação de peptídeos amargos durante o

processo de hidrólise. Um estudo da seqüência de aminoácidos mostrou que

os peptídeos amargos possuem um ou mais aminoácidos hidrofóbicos



(PEDERSEN, 1994). A remoção da fenilalanina, um aminoácido hidrofóbico,

de um hidrolisado destinado à fenilcetonúria, pode estar contribuindo também,

para uma melhora no sabor do produto final, apesar da remoção

concomitante e indesejável, da tirosina e do triptofano.

O carbono ativo e polifosfatos são descritos na literatura como capazes

de diminuir o sabor amargo apresentado pelos hidrolisados, pela adsorção de

peptídeos e aminoácidos hidrofóbicos liberados durante o processo de

hidrólise (PEDERSEN, 1994; LOPEZ-BAJONERO et aI., 1991; COGAN et aI.,

1981).

Quanto aos aminoácidos que são removidos, a tirosina e o triptofano,

podem ser reincorporados, por uma reação de condensação peptídeo

peptídeo denominada reação de plasteína (YAMASHITA et ai., 1976).

Após a hidrólise enzimática da proteína, o hidrolisado, em altas

concentrações, pode ser incubado com enzimas proteolíticas. A hidrólise é,

portanto, revertida, e o produto dessa reação é conhecido como plasteína.

Peptídeos de baixo peso molecular são os melhores substratos para a

síntese da plasteína. Esta reação pode ser empregada para mascarar o

sabor amargo pela condensação com outros peptídeos, ou mesmo para

reincorporar a tirosina e o triptofano (MONTECALVO et ai., 1984; ARAI et ai.,

1975).

2.1.2- PROCESSOS DE HIDRÓLlSE

A hidrólise protéica pode ser alcançada com enzimas, ácidos ou

alcális, mas a hidrólise enzimática é a preferida para a produção de


REVISÃO DA LlTERATURA 8

hidrolisados em aplicações nutricionais. Esta tem a vantagem de ser

realizada sob condições brandas, mantendo a qualidade nutricional dos

aminoácidos, produzindo hidrolisados com um perfil de peptídeos bem

definidos (LAHL e BRAUN, 1994; SIEMENSMA et aI., 1993).

A hidrólise ácida ou alcalina resulta na hidrólise completa da proteína,

sem nenhuma seletividade no rompimento das ligações peptídicas, podendo

haver formação de estereoisômeros, não utilizáveis pelo organismo, com

conseqüente redução da biodisponibilidade (LAHL e BRAUN, 1994; LAHL e

GRIDSTAFF, 1989).

O processo de hidrólise pode ser controlado através de diversos

parâmetros, como tipo de enzima, temperatura, tempo de hídrólise e pH

(LAHL e BRAUN, 1994).

A temperatura utilizada geralmente é em torno de 30° - SO°C. O pH

está relacionado com o pH ótimo para a atividade máxima de uma

determinada enzima. O tempo de hidrólise está diretamente relacionado com

o grau de hidrólise e a escolha da enzima, numa combinação de eficácia é

custo. Dentro dos limites adequados de temperatura e pH, uma alta

concentração de enzima pode ser utilizada para acelerar o processo de

hidrólise.

O crescimento de microorganismos também deve ser controlado,

realizando assim o processo de hidrólise sob condições sanitárias

adequadas. Um processo de hidrólise mais rápido pode ser um meio de evitar

o desenvolvimento de microorganismos.



o sabor dos hidrolisados pode ser controlado pela escolha da enzima.

ADLER-NISSEN (1986) observou que hidrolisados produzidos com alcalase

ou outras enzimas com especificidade para o grupo terminal dos aminoácidos

hidrofóbicos podem ser responsáveis por um menor sabor amargo. Desta

forma, os aminoácidos hidrofóbicos livres poderão ser adsorvidos

posteriormente, por diversos processos, como o emprego de carvão ativado.

Os métodos preferidos para a interrupção do processo de hidrólise

são: alteração do pH e da temperatura, de modo a anular a atividade

enzimática, finalizando a hidrólise. A temperatura alta, no entanto, deve ser

mantida por pouco tempo, porque tempos prolongados podem destruir

nutrientes e produzir reações indesejáveis, como a reação de Maillard, ou

estimular o aparecimento de compostos desconhecidos no produto final. A

inativação ácida das enzimas não é utilizada comercialmente com freqüência,

pois pode levar a um acúmulo excessivo de sais no hidrolisado. Membranas

de ultrafiltração também são utilizadas para finalizar o processo de hidrólise,

com a vantagem de eliminar proteínas residuais, peptídeos de alto peso

molecular e enzimas utilizadas durante a hidrólise (MALDONADO et aI., 1998;

LAHL e BRAUN, 1994).

2.1.3- FONTES DE PROTEíNA

As proteínas mais comumente usadas para a produção de hidrolisados

protéicos são as derivadas do leite (caseína, lactoalbumina e proteína do

soro), da soja, e a do peixe, devido ao alto valor nutricional, disponibilidade

comercial em grandes quantidades e custo moderado. Outras têm sido



também utilizadas, incluindo a gelatina, proteína do arroz, batata e a albumina

do ovo (LAHL e BRAUN, 1994; FREITAS et ai., 1993). Observa-se, portanto,

que proteínas de origem vegetal são utilizadas na formulação de alimentos

como uma alternativa às proteínas de origem animal.

A composição de aminoácidos essenciais de algumas destas fontes

protéicas é apresentada na tabela 2, em comparação às necessidades em

aminoácidos da FAO, 1985 e 1991.

Tabela 2 - Composição em aminoácidos essenciais de vários substratosprotéicos3

Aminoácidos Mincedb Caseína Carne Soro Gelatina Soja FAO

essenciais de leite (3-10) (3-8)c d

meses anosg de aas/100 g de proteína

Histidina 2,87 2,92 3,41 2,05 0,76 2,87 2,6 1,9Isoleucina 4,70 5,41 4,82 6,92 1,70 4,90 4,6 2,8Lisina 10,01 8,12 8,90 11,20 5,74 6,18 6,6 5,8Leucina 8,56 9,51 8,11 14,01 3,36 8,01 9,3 6,6Metioninal 4,08 3,15 3,98 5,15 0,82 2,42 4,2 2,5CistinaTirosinal 7,55 11,06 8,0 7,32 2,56 8,31 7,2 6,3FenilalaninaTreonina 4,62 4,66 4,59 6,18 2,27 3,43 4,3 3,4Triptofano n.d. 1,68 1,54 2,60 ° 1,07 1,7 1,1ValiDa 5,03 6,74 5,01 6,42 2,63 5,28 5,5 3,5

<li 1'\ ~ ri

Adaptado de Adler-Nissen,1986, W DE MIRA et aI, 2000; "FAO,1985; "FAO,1991.

A proteína do peixe possui um alto valor biológico, apresentando um

perfil de aminoácidos balanceado, particularmente daqueles que costumam

ser limitantes em proteínas de origem vegetal, tais como metionina e cistina,

e uma alta sensibilidade à hidrólise proteolítica, sendo assim, fácil e

completamente digerível. Uma outra vantagem do uso de peixe como

matéria-prima para a obtenção de hidrolisados é o fato de que os peixes

normalmente utilizados são aqueles pouco adequados para o filetamento e

portanto de menor valor comercial.



o interesse por hidrolisados protéicos de peixe surgiu na década de 60

e continua sendo objeto de pesquisa até os dias de hoje. Entretanto, muitos

trabalhos têm sido direcionados para uso como ração animal por problemas

com o sabor e aparecimento de off-flavors (OLIVA-TELES et ai., 1999;

MACKIE, 1982).

GÁLVEZ et ai. (1985) estudaram a utilização de hidrolisados

enzimáticos de peixe em sopas instantâneas, conferindo-lhes um alto valor

nutritivo, razão protéica líquida de 79% em relação a caseína e um índice de

aceitação satisfatório.

Hidrolisados enzimáticos de peixe com baixo teor de gordura,

deficientes em triptofano e valina, mas com elevado teor de lisina foram

obtidos por MORALES de LEÓN et ai. (1990), utilizando-os como

suplementos em refeições ricas em cereais e devido a alta solubilidade

apresentada, podem ser utilizados também em alimentos líquidos.

L1CEAGA-GESUALDO e L1-CHAN (1999) concluíram que algumas

propriedades funcionais dos hidrolisados de peixe foram melhoradas em

relação à proteína original, podendo ser utilizados na indústria de alimentos

como alternativa para outras fontes protéicas.

2.1.4- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLl8ADO PROTÉICO

LAHL E BRAUN (1994) estabeleceram critérios de avaliação para

hidrolisados levando em consideração o custo, o paladar, o valor nutricional,

antigenicidade, solubilidade e funcionalidade dos mesmos. Algumas

características podem ser úteis para avaliar a funcionalidade do hidrolisado,



tais como, o grau de hidrólise (GH) e o peso molecular dos peptídeos

(TOSSAVAINEN et aI., 1997).

A determinação do GH é considerado o meio mais prático e

conveniente de controlar o processo de hidrólise e é utilizado como um

indicador para comparação de diversos hidrolisados protéicos entre si. Pode

ser expresso de várias maneiras, como a relação entre o nitrogênio presente

no hidrolisado e o nitrogênio total presente na proteína, ou como a % de

ligações peptídicas quebradas (LAHL e BRAUN, 1994; MAHMOUD et aI.,

1992; ADLER-NISSEN, 1986).

o peso molecular das frações peptídicas costuma ser inversamente

proporcional ao grau de hidrólise, ou seja, hidrolisados protéicos contendo

peptídeos com pesos moleculares menor que 500 daltons serão obtidos

quando o grau de hidrólise for elevado, de acordo com a tabela 3,

apresentada por MAHMOUD em 1994.

Tabela 3 - Perfil do peso molecular de diferentes classes de hidrolisadosprotéicosa

.

Peso molecularfrações (Oalton)

das Grau de hidrólise % em cada fraçãoBaixo Médio Alto

< 500500 - 1000

1.000 - 2.0002.000 - 5.000

> 5.000aAdaptado de Mahmoud, 1994

3,81,11,83,789,7

9,813,513,716,646,4

90,25,52,91,40,0

Métodos rápidos para caracterizar os pesos moleculares dos peptídeos

devem ser instrumentos valiosos na otimização dos processos de hidrólise e

também no controle da qualidade dos produtos.



o peso molecular dos hidrolisados protéicos é um dos mais

importantes fatores na produção de hidrolisados com propriedades funcionais

desejáveis. Pensando nisso, CALDERÓN DE LA BARCA ei aI., 2000 e JEON

et aI., 1999 utilizaram um processo de ultrafiltração (UF), através de

membranas de exclusão molecular de 30, 10, 5 e 3KDa para obter

hidrolisados ou frações peptídicas com peso molecular e propriedades

funcionais desejáveis.

A ultrafiltração com membranas de exclusão molecular apresentou

algumas vantagens incluindo produção em larga escala de frações protéicas

com características desejáveis, simplificação no processo de separação e

redução dos custos de produção quando comparado à processos

cromatográficos.

PEREA et aI. (1993) fracionaram hidrolisados protéicos em diferentes

grupos de peptídeos com peso molecular definido por ultrafiltração, com uma

série de membranas de exclusão molecular de 10, 5, 3 e 1 KDa. As frações

obtidas foram analisadas quanto ao teor protéico, sendo assim determinada a

distribuição percentual dos peptídeos com diferentes pesos moleculares em

cada fração.

Frações protéicas contendo peptídeos com baixo peso molecular foram

obtidas por BAUTISTA et aI. (1996). Os hidrolisados foram clarificados por

um processo de microfiltração com uma membrana de 0,3 mm (Filtron). O

filtrado foi fracionado em duas frações, por ultracentrifugação com membrana

de exclusão molecular de 30 KDa. A primeira fração, o ultraconcentrado (UC

30) com peso molecular maior que 30 KDa e a segunda fração, o ultrafiltrado



(UF-30), composto de peptídeos com peso molecular menor que 30 KDa. O

UF-30 foi separado novamente, com membranas de exclusão molecular de 5

KDa, em duas frações: ultraconcentrado (UC-5), compostos por peptídeos

com peso molecular entre 5-30 KDa e o ultrafiltrado (UF-5), composto por

peptídeos com peso molecular menor que 5 KDa. Essas frações foram,

então, caracterizadas quanto ao perfil de aminoácidos.

A possibilidade de separar os peptídeos de um hidrolisado protéico de

soro com membranas de ultrafiltração e nanofiltração foi estudada por

POULlOT et aI., 1999. Inicialmente, o hidrolisado foi centrifugado utilizando

uma membrana de exclusão molecular de 10 KDa, com o objetivo de remover

as enzimas e o material não hidrolisado. Posteriormente, membranas de

nanofiltração (NF), que separam os peptídeos baseando-se, ou na carga ou

no tamanho molecular, foram aplicadas ao hidrolisado, mostrando ser

possível fracionar os peptídeos de um hidrolisado, quando o objetivo é uma

caracterização dos mesmos.

2.1.5- FRACIONAMENTO DOS PEPTíDEOS E CARACTERIZAÇÃO

QUíMICA COMO ACOMPANHAMENTO NA PRODUÇÃO DE

HIDROLlSADOS PROTÉICOS

Métodos imunoquímicos como ELISA ou radioimunoensaios (RIA) são

freqüentemente usados para detectar resíduos de proteínas nos hidrolisados

e peptídeos de maior peso molecular (MÂKINEN-KlLJUNEN e SORVA, 1993;

KNIGHTS, 1985).

Cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-

HPLC) ou Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantesRenata Alexandra Moreira das Neves


(SDS-PAGE) têm sido empregadas para identificar o peso molecular dos

hidrolisados, mas eles não permitem uma separação precisa (SILVESTRE,

1997). Ambos os métodos fracionam bem os peptídeos, quando as amostras

contêm proteínas e peptídeos de alto peso molecular, mas não são

suficientemente sensíveis para peptídeos com peso molecular menor que 3

KDa, podendo dar resultados significativamente incorretos (TOSSAVAINEN

et ai., 1997; MOLLÉ e LÉONIL, 1995; BINDELS e BOERMA,1994; VAN et

al.,1994; LEMIEUX et ai., 1991; VISSER et ai., 1992).

SILVESTRE et ai. (1994) observaram que a Cromatografia líquida de

alta eficiência de exclusão molecular em coluna de 2-hidroxietil-aspartamida

(SE-HPLC/ PHEA) foi eficiente para separar peptídeos de hidrolisados de

caseína, especialmente os peptídeos que apresentavam peso molecular

menor que 1KDa. Porém, devido a baixa resolução e a interação dos solutos

com a fase estacionária (concentrações de sais maiores que 0,005 M

afetaram a separação dos peptídeos), não foi possível determinar

corretamente os pesos moleculares.

Cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (RP

HPLC) foi eficiente na caracterização parcial de hidrolisados protéicos, dando

algumas indicações sobre a hidrofobicidade e hidrofilicidade dos peptídeos.

No entanto, o critério de separação dessas fases, baseado na hidrofobicidade

ou na carga dos peptídeos não é adequado para caracterização dos

hidrolisados protéicos do ponto de vista nutricional, uma vez que a qualidade

deles está associada com o tamanho do peptídeo (TOSSAVAINEN et a/.,

1997; VIJAYALAKHSMI et a/., 1986).



Hidrolisado de caseína eluído em SE-HPLC, mostrou peptídeos e

proteínas com peso molecular variando entre 0,24 (Ala-Pro-Gly) a 43

(ovoalbumina) KDa. As frações coletadas do SE-HPLC foram eluídas em RP

HPLC. O tamanho destes peptídeos, comparados com os obtidos por

espectrometria de massa utilizando rápido bombardeio atômico (FAB-MS),

mostrou que a separação por SE-HPLC seguida por RP-HPLC não foi

completa (LEMIEUX et ai., 1991).

Proteínas com peso molecular superior a 200 KDa podem ser

detectados por espectrometria de massa utilizando "spray" de elétrons (ESI

MS), com uma precisão melhor que, por exemplo, eletroforese em gel de

poliacrilamida (CARR et ai., 1995; MOLLÉ e LÉONIL, 1995). LEONIL et aI.

(1995) obtiveram resultados para proteínas do leite com uma precisão de

0.01% comparada ao peso molecular teórico. Apenas uma quantidade de

amostra da ordem de picomoles foi necessária para a análise espectrométrica

em massa.

Espectrometria de massa fornece apenas uma identificação do peso

molecular dos peptídeos com alto peso molecular, porém ao utilizar RP-HPLC

com espectrometria de massa utilizando rápido bombardeio atômico (ESI

MS) foram obtidos resultados precisos em relação à peptídeos menores,

onde estes são bem separados e simultaneamente a detecção por

espectrometria de massa é possível (TOSSAVAINEN et ai., 1997; MOLLÉ e

LEONIL, 1995).

Espectrometria de massa têm se tornado um método indispensável

para analisar a estrutura de peptídeos e proteínas, sendo capaz de resolver



problemas estruturais que não são facilmente resolvidos pelas técnicas

convencionais (CARR et aI., 1991).

Portanto, podemos observar que para identificar peptídeos menores no

hidrolisado protéico com mais precisão é necessário trabalhar com dois ou

mais métodos, simultaneamente, onde possamos fracionar os peptídeos para

depois identificá-los.

Entretanto, a separação de pequenos peptídeos ainda não é

satisfatória, sendo necessário desenvolver novas técnicas para fracionar os

hidrolisados protéicos. É importante continuar pesquisando um método

eficiente, capaz de separar esses peptídeos devido principalmente a

qualidade nutricional desejada para os hidrolisados estar parcialmente

relacionada ao conteúdo de di- e tripeptídeos.

O perfil do peso molecular dos hidrolisados protéicos também pode ser

determinado por cromatografia em gel (GPC). Porém, esse método apresenta

algumas desvantagens, pois apenas hidrolisados puros podem ser analisados

corretamente. Outros constituintes alimentares como, carboidratos, Iipídeos,

minerais e vitaminas de alto peso molecular, interferem com o ensaio. A

quantificação exata por espectrometria ultravioleta é dificultada e a resolução

das colunas GPC disponíveis comercialmente é baixa para peptídeos com 1 à

10 aminoácidos na cadeia peptídica (ACHOURI et aI., 1999; SIEMENSMA et

aI., 1993; KNIGHTS, 1985).

Esses processos de cromatografia não são comumente utilizados em

escala industrial devido a baixa rentabilidade e alto custo (POULlOT et aI.,

1999).



Todos OS métodos citados anteriormente para fracionamento dos

peptídeos podem ser utilizados, não diretamente para a determinação do

peso molecular, mas para separar o material em frações com características

similares.

Após o fracionamento os peptídeos podem ser caracterizados

quimicamente por vários métodos como: determinação da composição e

seqüência dos aminoácidos (CHEN et aI., 1995; ADACHI et aI., 1991); análise

do N-terminal usando um sequenciador de proteína (MACEDO et aI., 1993);

espectrometria de massa (CHEN et aI., 1995) ou espectrometria de massa

por rápido bombardeio atômico (FAB-MS) (PUCCI et aI., 1992).

Os peptídeos produzidos durante o processo de hidrólise protéica do

peixe podem ser utilizados como ingredientes protéicos pelas características

nutricionais e baixo custo em relação às outras fontes de proteína, embora

poucas informações estejam disponíveis na literatura científica sobre o

tamanho das cadeias peptídícas e as suas propriedades funcionais

(MORALES de LEON et aI., 1990; GÁLVEZ et aI., 1985).

2.1.6- PROPRIEDADES FISICO-QUIMíCAS E FUNCIONAIS DOS

HIDROLlSADOS PROTÉICOS

Durante a Segunda Guerra Mundial, ocorreu uma grande falta de ovos

para uso industrial. Começou, então, a procura por outros alimentos que

tivessem características similares. Entre os poucos produtos que puderam

ser utilizados para obter propriedades funcionais semelhantes à proteína do

ovo, encontrava-se o hidrolisado protéico da soja, obtido por uma reação de



hidrólise com pepsina. Este hidrolisado exibiu uma propriedade espumante

única, substituindo parcialmente os ovos na indústria de alimentos (ADLER

NISSEN, 1986).

Em 1970, surgiu o interesse por outras fontes de proteínas de

utilização não-convencional para a alimentação humana. Nos países em

desenvolvimento, a hidrólise enzimática era vista como um caminho para

obtenção de alimentos protéicos mais atrativos e viável à população.

Entretanto, algumas dificuldades que iam surgindo durante o processo

de hidrólise, precisavam ser controladas, como a formação de produtos com

sabor amargo, rendimento inadequado e uma falta de controle da reação

proteolítica. Atualmente, com o avanço tecnológico e várias pesquisas nessa

área, têm sido possível desenvolver processos de hidrólise onde os produtos

da hidrólise possuem características funcionais, organolépticas e nutricionais

bem definidas (LAHL e BRAUN, 1994; ADLER-NISSEN, 1986; ADLER

NISSEN et aI, 1983).

CHOBERT et aI. (1988) e FOX et aI. (1982) demonstraram que após a

hidrólise protéica, além de apresentarem peptídeos com pesos moleculares

menores e modificações nas estruturas protéicas, são esperadas mudanças

nas propriedades funcionais dos hidrolisados, como aumento da solubilidade

perto do ponto isoelétrico, diminuição da viscosidade e mudanças

significativas na capacidade espumante, gelificante e emulsificante quando

comparadas às proteínas nativas.

POUR-EL (1981) definiu funcionalidade protéica como sendo alguma

propriedade do alimento ou ingrediente alimentar, exceto nutricional, que



afeta o seu emprego. Essa definição é também útil no conhecimento do uso

alimentar do hidrolisado protéico. Deve- se ampliar a definição de

propriedades funcionais de hidrolisados de proteínas para poder incluir

àquelas propriedades físico-químicas que afetam o processamento,

estabilidade de armazenamento, qualidade organoléptica, e a eficácia

nutricional ou biológica do produto final (Tabela 4).

Tabela 4 - Propriedades Físico-químicas e Funcionais dos hidrolisadosprotéicos em produtos nutricionaisa

.

Propriedades Químicas e Físico - Químicas Propriedades Funcionais

Tamanho Molecular AlergenicidadeSolubilidade

OsmolalidadeHidrofobicidade Viscosidade

GelatinizaçãoEmulsificação

TurbidezInteração carboidrato Flavor

Capacidade EspumanteEscurecimento Maillard

Formação de corInteração mineral Estabilidade Térmica

aAdaptado de Mahmoud, 1994

As principais propriedades funcionais dos hidrolisados, isto é,

solubilidade, viscosidade, capacidade de emulsificação, capacidade

espumante, gelatinização e flavor, são comuns às proteínas intactas, mas

elas diferem destas, devido a hidrólise enzimática. Essas propriedades

dependem da extensão do grau de hidrólise, ou seja, do tamanho molecular

das frações peptídicas (MAHMOUD et aI., 1992; ADLER-NISSEN, 1986).

As propriedades funcionais dos hidrolisados protéicos são também

influenciadas pela especificidade das enzimas proteolíticas utilizadas, pela

natureza química e física das proteínas intactas e pelas condições de



hidrólise.

PHILLlPS e BEAUCHALT (1981) mostraram que a quebra das

estruturas primárias da proteína provoca uma série complexa de eventos que

alteram a funcionalidade.

Com a hidrólise das ligações peptídicas, costumam ocorrer as

seguintes alterações: Aumento no número de grupos ionizáveis (carboxilas e

aminas) com aumento concomitante na hidrofilicidade; diminuição no peso

molecular da cadeia polipeptidíca com a diminuição da antigenicidade e,

alteração da estrutura molecular levando a exposição do interior dos grupos

hidrófobos ao ambiente aquoso.

Condições como pH, força iônica, e concentração de solutos orgânicos

afetam a habilidade dos hidrolisados protéicos de interagir através de forças

de atração e repulsão. A presença de hidrocolóides, emulsificantes, proteínas

intactas, carboidratos, e suas interações com os hidrolisados, são fatores

importantes que alteram a funcionalidade dos hidrolisados. Altas

temperaturas utilizadas durante o processamento e esterilização podem

promover interações hidrófobas (peptídeo-peptídeo ou peptídeo-proteína) e

influenciar fortemente na estabilidade desses hidrolisados (MAHMOUD,

1994).

Certas propriedades funcionais desempenham funções mais

importantes que outras, direcionando a aplicação dos hidrolisados para um

uso específico final. Hidrolisados hipoalergênicos devem permitir que as

crianças que possuem alergia à proteína intacta possam consumí-Ios.

Uma das mais importantes propriedades físico-química e funcionais



dos hidrolisados protéicos é a solubilidade numa ampla faixa de pH,

temperatura, concentração de nitrogênio e condições iônicas. Muitos

trabalhos têm demonstrado que quanto maior a hidrólise protéica, maior a

solubilidade, principalmente próximo ao ponto isoelétrico da proteína original

(MAHMOUD, 1994; ADLER-NISSEN, 1986). Hidrolisados com uma alta

solubilidade são freqüentemente utilizados na suplementação de suco de

frutas, implementando a qualidade nutricional.

Quanto a capacidade de emulsificação, observa-se que quanto maior a

hidrólise, menor a capacidade emulsificante (ADLER-NISSEN, 1986).

Peptídeos pequenos e aminoácidos livres são menos eficientes na redução

da tensão superficial devido a impossibilidade de se orientar na interface

como ocorre com as proteínas. Assim, pequenos peptídeos podem ser

deslocados da interface por peptídeos maiores com forte tendência à

adsorção (PHILLlPS e BEAUCHALT, 1981).

Muitos estudos têm sugerido um tamanho molecular ou um

comprimento da cadeia polipeptídica superior a 20 resíduos de aminoácidos

como sendo ideal, para que o hidrolisado apresente uma boa capacidade

emulsificante. Amido de milho modificado com anidrido octenil succiníco têm

sido adicionado a formulações altamente hidrolisadas, na tentativa de

melhorar a capacidade emulsificante (ADLER-NISSEN, 1986).

A osmolalidade é uma propriedade funcional de particular importância

para os hidrolisados, uma vez que a sua maior aplicação é em fórmulas

infantis e em fórmulas especiais para adultos com a função gastrointestinal

prejudicada.



Soluções com alta osmolalidade, e portanto hipertônicas, atraem uma

grande quantidade de água para dentro do intestino delgado, causando

diarréia, possível desidratação e rompimento do balanço eletrolítico, bem

como induzem náusea, vômito e distensão abdominal.

Portanto, podemos observar que as propriedades físico-químicas e

funcionais dos hidrolisados protéicos precisam ser conhecidas para uma

futura aplicação em processos tecnológicos de produtos alimentares.

2.2- SUPORTE NUTRICIONAL NA FENILCETONÚRIA (PKU)

A fenilcetonúria clássica ou simplesmente PKU, é uma desordem

autossomal recessiva, devido a um erro congênito do metabolismo da

fenilalanina causada pela deficiência de uma enzima, a fenilalanina

hidroxilase hepática (PAH), responsável pela conversão do aminoácido

essencial fenilalanina em outro aminoácido, tirosina. A atividade enzimática

da PAH apresenta-se bastante reduzida, menos que 2% da atividade normal

(FREITAS et aI., 1999).

Aproximadamente, 90% dos casos apresentam deficiência da enzima

fenilalanina hidroxilase em maior ou menor grau; os 10% remanescentes têm

defeito nas vias associadas, seja na atividade da diidropteridina redutase

(deficiência de OHPR) ou na síntese de biopterina (BH4).

Esta anormalidade congênita, descoberta em 1934, pelo médico e

bioquímico norueguês Asborn Folling, resulta em altos níveis de fenilalanina

no sangue, incrementando a atividade das vias metabólicas alternativas,

produzindo quantidades anormais de ácido fenilpirúvico, fenilláctico e



fenilacetato que são excretados em grande quantidade na urina (FRANCIS,

1987). A figura 1 ilustra o bloqueio metabólico.

+FENILACETIL-GLUTAIvIINA

Q?H2

CH2 NH2

FENILE TILf>MINA

+.QCH';lICOOH

ÁCIDO *FENILACÉTICO

.....-fIl--'yCH2ICOICOOH

ÁCIDO *FENILP IRÚV IC O

~ÁCIDO

O-HIDROXIFENILACÉTICO

yCH2I

CHOHICOOH

ÁCIDO*FENILACTA TO

EXCRETADO NA PKU

PROTEINA DIETETICA

/ PAR '\.

~ ~CH2CHNH2COOH -+B- OCH2CHNH2COOH--+-

TIROSINA ~FENILALANINA~

PROTEÍNA DO TECIDO

*

...-H- BLOQUEIO METABÓUCO

FIGURA 1. Metabolismo da fenila1anina indicando o bloqueio metabólico, o qua1leva ao acúmulode fenilalanina e produção de fenilcetonas, adaptado de Francis, 1987.

o excesso de fenilalanina é tóxico para o sistema nervoso central e

causa problemas severos normalmente associados com PKU, onde o retardo

mental é a manifestação clínica mais severa (PIETZ et aI., 1997; WOO,

1989).

Uma conseqüência da falta de metabolização da fenilalanina, é uma

deficiência de tirosina, que passa a ser um aminoácido essencial para esses

indivíduos. °paciente fenilcetonúrico passa a depender da tirosina da dieta e

tende a ter uma concentração normal baixa ou reduzida deste aminoácido no



sangue (ROHR et aI., 1998). Essa deficiência de tirosina na PKU sugere que

ela também seja a causa do prejuízo intelectual observado nesses pacientes.

Na cidade de São Paulo, a incidência se situa na mesma ordem de

grandeza: 1: 12.000 a 1:15.000 recém-nascidos, de acordo com a única

estimativa a partir do levantamento realizado em postos de Saúde e berçários

da capital em 1987 por SCHMIDT et ai., 1987.

No Brasil, a partir de 1990, tornou-se obrigatório, em todo o território

nacional (Lei 8069 de 13/07/90 - Estatuto da Criança e do Adolescente), o

diagnóstico neonatal (teste do pezinho), a partir de 48 horas após o

nascimento, tendo-se reconhecido a importância da identificação correta e

precoce desta doença, como prevenção de uma doença mental grave.

2.2.1- DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO

O diagnóstico clínico é realizado apenas por volta do 6° mês de vida,

devido ao atraso no desenvolvimento e/ou convulsão e outras anormalidades

como lesões na pele e pigmentação reduzida por serem sintomas comuns a

diversas outras enfermidades (HEININGER et ai., 1986).

A fenilcetonúria não é curável, mas as suas conseqüências podem ser

prevenidas a partir de um tratamento com uma alimentação específica, desde

que a doença seja diagnosticada precocemente, nas primeiras semanas de

vida até o 3° mês de vida, antes da instalação dos danos irreversíveis,

levando a um desenvolvimento normal das crianças, tornando-as adultos

produtivos (SMITH, 1994; DEBENHAM,1992).

Esse tratamento visa basicamente reduzir os níveis plasmáticos da



fenilalanina das crianças fenilcetonúricas (2 1200 J.!moI/L), para uma

concentração semelhante à encontrada em crianças sadias (60-160 J.!moI/L).

A suplementação da dieta com tirosina é necessária para manter a

concentração plasmática deste aminoácido em nível normal (ACOSTA et aI.,

1999).

o diagnóstico de uma concentração de fenilalanina na circulação

superior a 1200 J.!mol/L (20 mg/dL), acompanhada de uma concentração de

tirosina menor que 118 J.!mollL, sugere a realização de um novo teste

laboratorial, confirmatório, após um período de 48 horas de vida, tempo

suficiente para que o recém nascido tenha mamado no peito ou na

mamadeira (MABRY, 1990).

2.2.2- PKU MATERNAL

Uma elevada concentração de fenilalanina no sangue de mulheres

fenilcetonúricas, da ordem de 1200 J.!moIlL, exerce um efeito teratogênico

sobre o desenvolvimento do feto, principalmente durante o período de

organogênese (primeiro trimestre da gravidez).

Pequenas elevações de fenilalanina no sangue materno já são

suficientes para causar danos ao feto, sendo que quanto mais alto o nível,

mais grave será o defeito (KOCH, 1994; LUKE, 1994; ROHR et a/., 1987;

COLLlNS e LEONARD, 1985; LENKE e LEVY, 1980).

As anormalidades no feto incluem baixo peso ao nascer, microcefalia,

retardo mental e doenças cardíacas congênitas nos fetos, ou complicações

que podem resultar em aborto espontâneo (FREITAS et aI., 1999; ROUSE,



1997; ACOSTA, 1995; LEWe GUAVANI, 1996; LENKE e LEW, 1980).

LENKE e LEW (1980) observaram que de 524 gestações em 155

gestantes com fenilcetonúria não tratadas, a freqüência de retardo mental,

microcefalia, doenças cardíacas congênitas e um crescimento intra-uterino

atrasado, foi significantemente mais alto que na população normal. É

interessante salientar que 99% das mães com concentração de fenilalanina

no sangue de 20 mg/dL ou mais, tiveram pelo menos um filho com retardo

mental.

O controle dos níveis sangüíneos de fenilalanina pode diminuir os

riscos para o feto, mas o sucesso não pode ser assegurado. Estudos têm

demonstrado que o nível de fenilalanina sangüíneo permitido durante a

gestação para diminuir e ou evitar os efeitos deletérios sobre o feto seria de

100-300 I-lmol/L (BRENTON, 1996); 120 - 360 I-lmol/L (KOCH, 1994; ROUSE

et aI., 1990) e 60- 120 I-lmollL (SMITH, 1990). Concentrações menores que

60 I-lmollL devem ser evitadas, pois uma deficiência de fenilalanina pode levar

a perda muscular materna e reduzido crescimento fetal (BRENTON e

L1LBURN, 1996; ACOSTA, 1995).

Suplementação da dieta com L-tirosina também é recomendada.

ROHR et aI. (1998) estudando a resposta da suplementação com L-tirosina

em cinco grávidas com PKU maternal, observaram que uma única dose de

1,3 g dessa substância foi suficiente para aumentar a concentração de

tirosina no plasma, de 34 I-lmollL para uma concentração acima da

recomendada (45 I-lmoIlL), por cerca de um período de 3 horas, mantendo um

suporte adequado de proteínas e síntese normal de catecolaminas.



Muitos pesquisadores, estão de acordo que a fenilcetonúria maternal

precisa ser controlada na gravidez e o controle dietético deve começar antes

mesmo da concepção. Recomenda-se manter o nível de fenilalanina no

sangue abaixo de 360 /-lmoIlL, mas não inferior a 60 /-lmollL (BRENTON e

L1LBURN, 1996; ACOSTA, 1995; KOCH, 1994).

Portanto, são necessários programas de orientação realizados por

profissionais especializados durante a gestação, conscientizando a mãe da

importância da dieta para a sua saúde e para o desenvolvimento normal do

feto.

2.2.3- TRATAMENTO DA PKU

Desde a descoberta dos efeitos benéficos da dieta restrita em

fenilalanina sobre o estado neurológico da criança com PKU, o tratamento

dietético destes pacientes, iniciado dentro das primeiras semanas de vida,

tem sido uma medida rotineira em diversos países (ENDRES, 1998).

Essa dieta visa reduzir e controlar a concentração plasmática de

fenilalanina em limites suficientes apenas para o crescimento e

desenvolvimento adequado da criança, sendo uma quantidade miníma

essencial para a síntese e regeneração de proteínas e enzimas (KRAUSE e

MAHAN, 1995). O resultado deste tratamento depende do rigor e do controle

da alimentação oferecida à criança durante o seu desenvolvimento.

Acreditava-se que o desenvolvimento normal dos pacientes com PKU

poderia estar garantido se a dieta fosse mantida apenas durante os primeiros

anos de vida. Porém, muitos pesquisadores, médicos, nutricionistas,



psicólogos e mesmo os pacientes fenilcetonúricos e seus familiares mais

próximos acreditam que a dieta restrita em fenilalanina deve ser continuada

durante a adolescência ou até mesmo por toda a vida (ENDRES, 1998).

HOLTZMAN et aI. (1986) demonstraram em estudo com 119 crianças

entre 8 e 10 anos de idade, com controle pouco rigoroso da dieta, uma

diminuição acentuada do 0.1., em comparação com aquelas que não

relaxaram a dieta. Animais de laboratório com altos níveis de fenilalanina no

plasma têm apresentado inibição da síntese de mielina, pelo aumento do

turnover desta (ROBISON et aI., 1986; TAYLOR et aI., 1983; HOMMES et aI.,

1982), assim como inibição da síntese de catecolaminas e serotonina

(TAYLOR et aI., 1983); portanto, os autores sugerem que a dieta seja

mantida por toda a vida em pacientes com PKU.

2.2.4- NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS FENILCETONÚRICOS

Os teores de fenilalanina em proteínas alimentares variam entre 4 e

6%, não existindo nenhuma proteína natural isenta deste aminoácido.

Portanto, é necessário uma redução no consumo de proteínas no tratamento

dietético.

Vegetais, frutas e outros alimentos com baixo conteúdo de proteínas,

poderão fazer parte do cardápio dos fenilcetonúricos, procurando assim,

manter a ingestão de fenilalanina nos limites de tolerância individual. Os

vegetais são boas fontes de vitaminas, minerais e de fibras alimentares

disponíveis em número elevado de tipos e variedades, sendo este um

privilégio dos brasileiros que possuem frutos tropicais bastante saborosos e



diversificados.

No entanto, a ingestão de misturas de aminoácidos livres, vegetais,

frutas e um baixo consumo de alimentos contendo proteínas de alto valor

biológico, repercute diretamente na diminuição do aporte de energia bem

como de ácidos graxos, vitaminas e minerais que então devem ser acrescidos

à dieta na forma de suplementos (BREMER et aI., 1996).

Além disso, a predominância de alimentos de origem vegetal contendo

fibras, fitatos, oxalatos e taninos, entre outros fatores, pode levar a uma

redução da biodisponibilidade de nutrientes como ferro, zinco, cálcio, selênio,

vitaminas A, complexo B entre outras (ACOSTA, 1996; GIOVANNINI et

al.,1996; HANLEY et aI., 1996; LOMBECK et aI., 1996; GROPPER et aI.,

1993).

Os resultados desses estudos comprovam que as dietas para

adolescentes fenilcetonúricos são nutricionalmente inadequadas, sendo

necessários mais estudos relativos às necessidades nutricionais e uma

revisão na composição das misturas de aminoácidos, especialmente no que

se refere à suplementação com minerais.

2.2.5- COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS

O conhecimento sobre a composição de aminoácidos de alimentos

usados nos cardápios para os pacientes fenilcetonúricos é de particular

importância devido a restrição que esses pacientes possuem à fenilalanina.

Poucos são os alimentos que tem a sua composição de aminoácidos

conhecida. Várias são as razões: falta de interesse em quantificar os



aminoácidos quando o alimento não é fonte protéica; elevado custo da

análise; metodologia pouco precisa ou ultrapassada (LANFER MARQUEZ,

1996). Freqüentemente, a quantificação é baseada em cálculos a partir dos

teores de nitrogênio total, sem levar em consideração a presença de

nitrogênio não-protéico (BREMER et ai., 1996).

O consumo permitido de proteínas e aminoácidos (250 e 500 mg por

dia) depende do nível de fenilalanina no sangue, o qual depende da atividade

remanescente da fenilalanina hidroxilase no fígado. Essa atividade, pode

variar desde a ausência de atividade, acarretando uma concentração de

fenilalanina ~ 1200 IlmollL, até 5% ou mais de atividade residual, que resulta

em concentrações de fenilalanina no plasma, semelhante às encontradas em

pessoas sadias (40-100 Ilmol/L) (LANFER MARQUEZ, 1996; MONCH et ai.,

1996; SOTO, 1993; CLARK, 1992).

Nem todas as crianças possuem o mesmo grau de deficiência dessa

enzima, portanto, algumas apresentam alguma atividade enzimática

possibilitando uma dieta menos rigorosa, enquanto outras devem ter uma

dieta bastante restrita.

Pacientes fenilcetonúricos alimentados com misturas de aminoácidos,

hidrolisados e alimentos com baixo teor de proteína podem ter os

requerimentos protéicos e energéticos aumentados (ACOSTA, 1996).

PRZYREMBEL (1996) recomenda que seja prescrito o consumo de proteína

recomendado pela FAOIWHO/UNU (1985), corrigido pela digestibilidade e

pelo escore de aminoácidos, e com um adequado consumo de energia.



Deve ser controlada a ingesta do aminoácido envolvido para que não

ultrapasse os níveis sangüíneos considerados seguros (100 I-lmollL), porém

ao mesmo tempo, o aporte deve ser suficiente para chegar aos

requerimentos nutricionais da criança, permitindo manter um bom estado

nutricional, um adequado crescimento físico e um desenvolvimento mental

normal (COLLlNS e LEONARD, 1985; O'BRIEN, 1979; AMERICAN

ACADEMY OF PEDIATRICS, 1976).

2.2.6- MISTURA DE AMINOÁCIDOS LIVRES

A dieta com restrição em fenilalanina é planejada em torno do uso de

formulações à base de misturas de aminoácidos isentos de fenilalanina ou de

hidrolisados protéicos, sendo permitida a ingestão de alimentos de baixo teor

protéico, frutas, vegetais e pequenas quantidades de cereais e grãos

(BREMER et ai., 1996).

As fórmulas mais comumente utilizadas no mercado são Lofenalac,

95% livre de fenilalanina, produzida pela Mead Johnson e Co, usada para

lactentes e Phenyl - Free, uma fórmula 100% livre de fenilalanina, também

produzida pela Mead Johnson e Co, para crianças e adolescentes (TRAHMS,

1991 ).

Diversos novos produtos têm também sido introduzidos. PKU 1, PKU 2

e PKU 3 são módulos metabólicos especiais da produzidos pela MILUPA AG

e distribuídos pela Mead Johnson. A PKU 1 é designada para lactentes,

enquanto que a PKU 2 é para crianças e a PKU 3 é utilizada na PKU



maternal. Maxamaid XP (crianças) e Maxamum XP (mulheres) são

distribuídas pelo Ross Laboratories.

Esses produtos possuem uma quantidade reduzida ou são isentos de

fenilalanina, mas deveriam ser nutricionalmente balanceados quanto aos

outros aminoácidos. No entanto, uma análise mais aprofundada destes

produtos comerciais sob ponto de vista nutricional, demonstra não estarem de

acordo com as recomendações da FAOIWHO, algumas vezes encontram-se

excedendo os valores, ou apresentam quantidades inferiores as

recomendadas (ACOSTA, 1996; KRAUCH et aI., 1996).

Estas fórmulas contendo mistura de aminoácidos livres como fonte de

nitrogênio oferecem facilidade na prescrição e distribuição aos pacientes,

porém resultam em uma dieta dispendiosa, monótona e pouco palatável

(PRINCE et aI., 1997). Originam soluções hipertônicas, podendo acarretar

disfunção intestinal, resultando em um quadro de diarréia, devido a presença

de substâncias de baixo peso molecular (ADISI, 1989; ARAI et aI., 1986).

O f1avor desagradável dificulta a sua aceitabilidade. Desse modo, a

ingestão que deveria ocorrer em pequenas quantidades durante o dia é

freqüentemente realizada em uma única vez.

MONCH et aI., 1996 observaram que administrando a mistura de

aminoácidos em uma dose única a nove pacientes com PKU, estes

apresentavam um quadro clínico de vômitos, vertigem, náusea, dores de

cabeça e diarréia; diminuição dos níveis sangüíneos de glicose e lactose e

aumento dos níveis de insulina, levando a um estado de hipoglicemia pós

prandial e níveis altos de uréia no sangue.



Esses estudos sugerem que a mistura de aminoácidos deve ser

ingerida em pequenas porções durante o dia, sempre com outros alimentos

que contenham gordura e carboidratos. Quando os aminoácidos são

consumidos em grande quantidade, uma vez por dia, eles são utilizados

principalmente como fonte de energia e não para a síntese de proteínas

(FREITAS et aI., 1999; MONCH et aI., 1996; HERRMANN et aI., 1994).

Inicialmente, todas as fórmulas dietéticas definidas tinham aminoácidos

na forma livre como fonte de nitrogênio. A razão para isso é o conceito

clássico de absorção de proteína, o qual mantêm que as proteínas são

completamente hidrolisadas para aminoácidos livres no lúmen intestinal e que

apenas estes são transportados pela mucosa intestinal. Isso é bastante

discutido e há vários trabalhos que demonstram que esse conceito não é

válido (ADACHI etal., 1991; ADIBI, 1989).

Peptídeos podem ser melhor e mais rápido absorvidos do que

aminoácidos ou proteínas intactas de acordo com estudos em humanos e

animais. De fato, parece que depois de uma refeição protéica, os

constituintes das proteínas são absorvidos não como aminoácidos livres, mas

como dipeptídeos e tripeptídeos (SIEMENSMA et aI., 1993; ADIBI, 1989;

COOK, 1973).

Estudos em laboratórios, realizados com técnicas de perfusão

intestinal, têm mostrado que a taxa de absorção de aminoácidos de soluções

contendo dipeptídeos é muito maior em relação as que contêm aminoácidos

livres (ADIBI, 1989).



Isto se deve ao fato de que di e tripeptídeos podem ser diretamente

absorvidos no intestino por sistemas independentes daqueles usados pelos

aminoácidos, e a taxa máxima de captação na absorção de di e tripeptídeos é

maior do que o sistema transportador de aminoácidos (ROBERTS et aI.,

1999; TRAHMS, 1991; ADIBI, 1989; MATTHEWS, 1977; ADIBI, 1976).

Estudos têm mostrado que ratos crescem mais rapidamente quando

alimentados com dietas peptídicas, quando comparados à dietas com

proteína intacta, ou baseada em aminoácidos livres (ZALOGA et aI., 1991).

Portanto, a administração de produtos a base de pequenos peptídeos,

como hidrolisados protéicos enzimáticos, parece beneficiar clinicamente os

pacientes com PKU (CORDLE, 1994).

Os peptídeos são menos hipertônicos que as misturas de aminoácidos

livres, e a administração destes na alimentação enteral, como fonte de

nitrogênio, melhora a taxa de absorção e reduz problemas osmóticos (ADIBI,

1989).

Outra vantagem para o uso de hidrolisados protéicos é uma

aceitabilidade melhor que as misturas de aminoácidos livres, no que diz

respeito ao flavor (SILK et aI., 1982). Hidrolisados protéicos também

apresentam um potencial antigênico reduzido (SIEMENSMA et a/., 1993).

Além disso, a presença de carboidratos no lúmen intestinal interfere bem

menos no transporte dos dipeptídeos que no dos aminoácidos livres

(COOK,1972).



Portanto, é de interesse desenvolver hidrolisados protéicos com

peptídeos de alto peso molecular e de baixo teor de fenilalanina em

substituição à mistura de aminoácidos livres.

2.3- SUPORTE NUTRICIONAL NA ENCEFALOPATIA HEPÁTICA

A encefalopatia hepática ou também designada coma hepático, ou

encefalopatia portossistêmica é uma doença encontrada em pacientes com o

fígado gravemente danificado, particularmente naqueles que apresentam

cirrose avançada ou desvios vasculares entre os sistemas da veia porta e

cava. Pode ter curso agudo, reversível ou crônico. Casos de maior gravidade

podem levar ao coma irreversível e morte (SCHARSCHMIDT, 1997).

A etiologia da encefalopatia ainda é desconhecida. O fator significativo

na fisiopatologia da doença é o mau funcionamento das células hepáticas. A

inadequada remoção dos compostos nitrogenados e outras substâncias do

trato gastrointestinal e o desvio do sangue para a circulação sistêmica são

responsáveis pela origem do termo encefalopatia portossistêmica.

Os sinais de encefalopatia ou coma hepático incluem confusão mental,

apatia, mudanças de comportamento, contrações musculares, como asterixe

(tremor das mãos quando estendidas à frente do tórax) e espasticidade.

Durante a doença hepática, a capacidade de tolerância a glicose e aos

Iípides encontra-se diminuída, provavelmente pela disfunção hormonal, e a

intolerância à proteína é principalmente manifestada nos casos de

encefalopatia hepática (FISCHER e BOWER, 1981).



Hiperamonemia e a presença de falsos neurotransmíssores, como

octopamina, podem ser responsáveis pela encefalopatia hepática.

Quando o nível de amônia sérica está elevado, esta entra na circulação

sistêmica, aumentando a amônia do sangue e causando intoxicação do

Sistema Nervoso Central, porém a sua correlação com o grau de encefalopatia

ainda é pequeno (FISCHER e BOWER, 1981).

Uma outra proposta na exploração da etiologia da encefalopatia

hepática envolve os neurotransmissores no cérebro, como acetilcolina,

serotonina e catecolaminas e aqueles aminoácidos que são seus precursores.

Níveis anormalmente altos de aminoácidos aromáticos levam à

formação de falsos neurotransmissores, responsáveis pelo agravamento do

quadro neurológico e psiquiátrico. Estes aminoácidos dependem do fígado

para o seu catabolismo. Não sendo metabolizados, acumulam-se,

atravessando a barreira hematoencefálica, agindo como falsos

neurotransmissores (FISCHER et aI., 1976).

Outros produtos do metabolismo podem contribuir para o

desenvolvimento da encefalopatia hepática, tais como metilmercaptano,

composto derivado do metabolismo intestinal da metionina, ácidos graxos de

cadeia curta e compostos fenólicos (AUGUSTO, 1993).

2.3.1- TRATAMENTO DA ENCEFALOPATIA HEPÁTICA

O suporte nutricional é uma importante etapa no tratamento para manter

a função hepática e promover a regeneração do tecido.



Os objetivos do cuidado nutricional na encefalopatia hepática visam a

regeneração do fígado, focalizando os seguintes pontos: a) evitar o

catabolismo protéico para não haver aumento de amônia; 2) diminuir o

substrato para a formação de falsos neurotransmissores e 3) diminuir o

substrato para a síntese da uréia (AUGUSTO et aI., 1993).

O aporte protéico é diminuído e quando não há sinais de coma, é

importante uma avaliação da amônia sérica (limite superior 8J.tg/mL sangue).

Quando há sinais e sintomas de intoxicação por amônia (asterixe), a ingestão

de proteínas deve ser reduzida para 30 a 40 g/dia ou mesmo totalmente

eliminada. Quando o paciente começa a melhorar, eleva-se gradualmente a

ingestão protéica (TRAHMS, 1991).

Outro protocolo de conduta para a encefalopatia é a administração, oral

ou enteral, de soluções que contenham uma alta quantidade de aminoácidos

de cadeia ramificada (AACR), valina, leucina e isoleucina e sejam pobres em

aminoácidos aromáticos (AAA), fenilalanina e tirosina (FISCHER e BOWER,

1981; FISCHER et aI., 1976).

Segundo FISCHER e BOWER, 1981, os AACR melhoram o quadro de

encefalopatia hepática pela: promoção da síntese de proteína pelo músculo,

aumento da captação e incorporação de aminoácidos aromáticos pelo

músculo, diminuição dos níveis de aminoácidos aromáticos intracerebral

através da competição pelo sistema de transporte comum da barreira

hamatoencefálica e aumento na síntese hepática.

A relação AACRlAAA na proteína da dieta mostrou uma excelente

correlação com o grau de encefalopatia. FISCHER et aI. (1976) observaram



que quando a relação AACR/AAA era igual a 3,0 ou 3,5, havia uma melhora na

encefalopatia.

Proteínas parcialmente hidrolisadas, com alto teor de AACR e um

conteúdo baixo de AAA, vem sendo estudadas para serem utilizadas por

pacientes com encefalopatia. Enzimas específicas para AAA, com a finalidade

de liberá-los da proteína, membranas de ultrafiltração e géis com

características hidrófobas foram utilizados para diminuir a quantidade de AAA

nos hidrolisados (BAUTI8TA et aI., 1996; ADACHI et ai., 1991; TANIMOTO et

ai., 1991).


OBJETIVOS 40

3- OBJETIVOS

o nosso estudo teve a finalidade de:

• Caracterizar os hidrolisados enzimáticos de peixe, quanto aos

aspectos químicos, físico-químicos e nutricionais;

• Propor a aplicação desses hidrolisados, visando atender grupos

populacionais que necessitem de uma alimentação especial.


MATERIAIS E MÉTODOS 41

4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4.1- MATERIAIS

4.1.1- AMOSTRA

Foram utilizados hidrolisados enzimáticos de "minced" produzidos a

partir da mistura de pescados de água salgada: Maria-Luíza (Paralonchurus

brasiliensis) , Perna-de-Moça (Pescada do gênero Cynoscion) e Camarão

(Penaus brasiliensis e Penaus pauliénsis), desossados, sem pele e vísceras,

lavados, prensados para remoção da água, sem adição de crioprotetores,

obtidos de acordo com procedimentos padronizados em trabalho anterior (DE

MIRA, N.V.M. et aI, 2000).

As amostras de "minced" de cerca de 2 Kg/mês, durante hum ano

(Junho/97-Maio/98), foram gentilmente doadas pela empresa TAKAKI Cia.

Ltda. localizada em Suzano, Estado de São Paulo. As amostras recebidas

foram homogeneizadas em triturador, liofilizadas e congeladas até o momento

de uso.



4.1.2 - REAGENTES

Enzimas: As enzimas relacionadas na tabela 5 foram adquiridas da

Sigma Chemical Company, St. Louis.

- dos hidrolisadbttilizadTabela 5- E em'!ENZIMA ATIVIDADE ESPECIFICIDADE

Protease fúngica de Aspergillus oryzae 0,6 unidades Ampla especificidade,tipo 11 (P-4755) Img sólido principalmente Arg-,

Leu-COOHPepsina da mucosa de estômago de 2100-2800porco, 1:60000 (P-7012) unidades/mg Grupos -COOH e -NHz

sólido dos aas aromáticos, ePepsina da mucosa de estômago de 800-2500 Leu-, Asp-, Glu- COOHporco, 1:10000 (P-7000) unidades/mg

proteínaProtease bacteriana de Streptomyces 4 unidades I mg Ampla especificidadegriseus, tipo XIV (C-5147) de sólido

a-Quimotripsina de pâncreas bovino, 40-60 unidades I Phe-, Tyr-, Trp-COOHtipo /I (C-4129) mg de proteína

Bromelina, extraída do abacaxi (B-2252) 1190 unidades I Lys-, Arg-, Phe-, Tyr-mg de sólido COOH

Todos os reagentes e padrões para cromatografia foram obtidos da

Beckman Inst., Paio Alto, CA.

Materiais especiais: Filtros com membranas de exclusão por peso

molecular (Centricon concentrators - AMICON, INC., Beverly, MA);

Membrana de filtração com poros de 0,22 Ilm da Millipore Corporation.

Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.



4.2 - MÉTODOS

4.2.1- PREPARAÇÃO DO HIDROLlSADO PROTÉICO

o processo de obtenção dos hidrolisados protéicos foi realizado

conforme procedimento padronizado em nosso laboratório em trabalho

anterior, apresentado na figura 2.

Figura 2- Fluxograma do processo de preparação do hidrolisado de pescado.

"MINCED" DE PESCADOLIOFILIZADO

IRESSUSPENSÃO EM

ÁGUA

ITRATAMENTO TÉRMICO

(95°C, 30 MIN)

IHIDRÓLISE COM SISTEMA SEQUENCIAL DE

ENZIMAS (CONDIÇÕES ÓTIMAS, 5HS)

IINATIVAÇÃO ENZIMÁTICA

(AQUECIMENTO À 95°C, 10 MIN)

ICENTRIFUGAÇÃO

(13.292 x 9, 40 MIN)

ISOBRENADANTE

(HIDROLISADO PROTÉICO DE "MINCED"


IPRECIPITADO


Foi utilizada uma relação substrato/água de 2,5 g "minced"

liofilizado/50 ml de água na preparação do hidrolisado. Essas amostras

foram aquecidas por 30 minutos em água fervente, para desnaturação das

proteínas, e resfriadas em banho de gelo.

A hidrólise foi realizada utilizando um sistema seqüencial de duas

enzimas, com especificidades diferentes, de modo que pelo menos uma das

enzimas apresentasse especificidade para aminoácidos aromáticos

(pepsina, bromelina e a-quimotripsina), com a finalidade de liberar a

fenilalanina presente no substrato, conforme apresentado na tabela 6.

Tabela 6 - Sistemas enzimáticos utilizados para a obtenção dos hidrolisados- ____ • --.---- ..... -- ,""",o -..-.. ___ ••• _. _ •• ___

Ensaio Sistema Condições das reaçõesEnzimático E:S pH T (OC) Tempo(h) GH

(p/p) Enzima1/Enzima2

H1 Pepsina 1:10.000/ 1:100 / 2,0/ 45 3/2 8,1%Bromelina 1:100 4,5

H2 Pepsina 1:60.000/ 1:100/ 2,0/ 45 3/2 9,3%Bromelina 1:100 4,5

H3 Pepsina 1:10.000/ 1:100/ 2,0/ 37 3/2 9,8%Quimotripsina 1:100 8,0

H4 Pepsina 1:10.000/ 1:1001 2,01 37/ 3/2 7,8%Asper.qi/lus oryzae 1:100 8,0 45

H5 Pepsina 1:60.000/ 1:100 1 2,0/ 37 3/2 33,3%Streptomyces 1:100 6,0griseus

H6 Pepsina 1:10.000/ 1:100/ 2,0/ 37 3/2 17,2%Streptomyces 1:200 6,0qriseus

Todos os ensaios foram realizados nas condições ótimas de pH e

temperatura de cada enzima (o pH foi corrigido com soluções de NaOH 1 N

ou Hei 1N), por um período de cinco horas.



Durante o período da hidrólise, as amostras foram mantidas sob

agitação constante. Após cinco horas, os hidrolisados foram aquecidos à

95°C por 10 min para inativação enzimática.

Obtivemos o sobrenadante e o precipitado, por centrifugação, à 13292

x g, por 40 min, separando o resíduo insolúvel (precipitado) do hidrolisado

(solúvel). O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi liofilizado para

análise da composição química.

4.2.2 - DETERMINAÇÃO DO GRAU DE HIDRÓLlSE

O grau de hidrólise foi considerado como sendo o número de

aminoácidos livres formados durante o rompimento das ligações peptídicas

em relação ao número total de aminoácidos existentes na amostra.

Teoricamente, 19 de proteína origina pela hidrólise 1118,9 mg de

equivalentes de leucina. O valor encontrado foi considerado como 100% de

hidrólise, ou seja:

11gproteína =1118,9 mg equivalentes de leucina =100%1

O cálculo é o seguinte:

19 proteína = (131,2 x n1) + 18 x(n1- 1) = 100%

Onde:n1 =1000 mg proteína =7,62 x 10-3

131,2

131,2 = peso molecular da leucina

18,0 = peso molecular da água



4.2.3 - SEPARAÇÃO DAS FRAÇÕES PEPTíDICAS POR FAIXA DE

PESO MOLECULAR

o isolamento das frações peptidícas por faixa de peso molecular foi

realizado por ultracentrifugação em membrana de exclusão por peso

molecular, utilizando "Centricon concentrators" (Amicon), de acordo com as

instruções do fabricante.

Peptídeos maiores que 30, entre 30 e 10 e 10 e 3 e menores que 3

KDa foram obtidos, utilizando membrana de exclusão molecular de 30 Kd, 10

Kd e 3 Kd, respectivamente.

4.2.4- MÉTODOS ANALíTICOS

4.2.4.1- ANÁLISE DO TEOR DE u-AMINONITROGÊNIO

A quantidade de nmoles de equivalentes de leucina nas amostras foi

obtida segundo método descrito por HOLT e SOSULSKI,1981, com algumas

modificações. A reação baseia-se na formação de uma coloração azul pela

reação da ninhidrina com compostos que possuem grupos amina livres. Para

a análise, acrescenta-se a 0,1 mL da amostra, 1,0 mL de solução de

ninhidrina. Os tubos são fechados com papel alumínio, para impedir a

evaporação e levados a banho-maria fervente por exatamente 20 minutos,

sendo resfriados em banho de gelo. Adiciona-se 5,0 ml de etanol 50%,

agitando os tubos vigorosamente. A absorbância é lida à 570 nm em

espectofotômetro (Beckman DU-70®) contra um branco, até 30 minutos após

a adição de etano!. Utiliza-se uma curva padrão de L-Leucina nas



concentrações de 0.5 mM; 1,0 mM; 1,5 mM e 2,0 mM. Os resultados são

expressos em nmoles de equivalentes de leucina por 9 de proteína.

4.2.4.2- ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS

o perfil de aminoácidos foi determinado nos hidrolisados e nas frações

peptídicas isoladas.

A análise de aminoácidos foi realizada após hidrólise ácida das

amostras com HCI 6 N por 22 horas à 110°C, em ampolas seladas à vácuo.

Evaporou-se os hidrolisados para remoção do HCI em dessecador à vácuo

contendo pastilhas de NaOH. O resíduo seco foi ressuspenso em tampão

citrato pH 2.2 (Na-S, Beckman Instr., Paio Alto, CA). As amostras foram

filtradas por membranas de 0.22 !J.m e convenientemente diluídas com

tampão citrato (SPACKMAN et aI., 1958).

Os aminogramas foram obtidos por cromatografia em troca iônica em

autoanalisador de aminoácidos marca Beckmam modelo 7300, acoplado a

uma interface analógica Beckman, modelo 406 (Goldsystem) e equipado com

coluna de 200 mm de comprimento contendo resina de troca iônica de sódio e

operando em condições definidas pelo fabricante, para hidrolisados protéicos.

A reação dos aminoácidos com a ninhidrina ocorre pós - coluna,

sendo a intensidade de cor medida em colorímetro. As áreas dos picos do

aminograma foram comparadas as áreas dos picos de uma mistura padrão de

aminoácidos.



4.2.4.3- ANÁLISE DA COMPOSiÇÃO CENTESIMAL DOS

HIDROLlSADOS

A composição química foi determinada de acordo com métodos padrão

AOAC, 1995. A análise do teor de nitrogênio foi realizada de acordo com o

método de micro-Kjeldahl e o resultado multiplicado por 6,25 para conversão

em proteína. A umidade foi determinada por secagem em estufa à 105°C, até

peso constante. As cinzas, foram determinadas, por incineração em mufla a

550°C. Lipídeos foram determinados pela extração com solventes orgânicos,

como éter etílico, num extrator intermitente como o aparelho de Soxhlet.


RF~TTTTAnn~ E DISCUSSÃO

5· RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1- COMPOSiÇÃO QUíMICA DO "MINCED" E DOS

HIDROL/SADOS

A composição dos seis hidrolisados, liofilizados, é apresentada na

tabela 7. Comparativamente é apresentada a composição do "minced" de

pescado homogeneizado e liofilizado.

AMOSTRA COMPOSiÇÃO QUíMICA

Proteína Lípides Umidade Cinzas(9/1009 amostra seca)

Tabela 7 - Composição química do "minced" e dos seis hidrolisadosprotéicos após liofilização.

"MINCED" 90,3 0,8 0,3 2,9

H1 Pepsina 1:10.000/ 71,6 ± 0,4 0,9 ± 0,1 4,5 ± 0,2 14,2 ± 0,0Bromelina

H2 Pepsina 1:60.000/ 74,6 ± 0,1 1,0 ± 0,0 5,7 ± 0,1 16,2 ± 0,4Bromelina

H3 Pepsina 1:10.000/ 75,7 ± 0,8 1,7 ± 0,2 4,1 ± 0,3 14,1 ± 0,0Quimotripsina

H4 Pepsina 1:10.000/ 72,2 ± 0,1 0,8 ± 0,2 4,4 ± 0,3 17,3 ± 0,3Aspergil/us oryzae

H5 Pepsina 1:60.000/ 72,9 ± 0,0 1,3 ± 0,2 4,1 ± 0,1 17,9 ± 0,2Streptomyces griseus

H6 Pepsina 1:10.000/ 77,9 ± 0,4 1,6 ± 0,4 4,3 ± 0,1 10,2 ± 0,3Streptomyces griseus

Resultados correspondem a média dos valores obtidos em triplicata.

O teor de proteína (N x 6,25) apresentou-se alto, variando entre 71,6

(H1) a 77,9% (H6) e tanto o "minced" quanto os hidrolisados apresentaram

um baixo teor de Iípides, que é um aspecto favorável para minimizar a

oxidação Iipidica, aumentando a estabilidade desses hidrolisados ao

armazenamento e mantendo a qualidade sensorial por mais tempo. Da

mesma forma, um alto teor Iipidíco poderia prejudicar também a sua


RESULTADOS E DISCUSSÃO 50

utilização em algumas formulações de produtos (SYNOWIECKI,2000;

SHAHIDI,1995; MACKIE, 1982).

A baixa concentração lipídica, inferior ao teor original dos peixes que

deram origem ao "minced" é devida aos ciclos de lavagens empregados no

processamento do "minced" para remoção das proteínas sarcoplasmáticas,

gordura e outras substâncias indesejáveis como sangue e outros pigmentos

(PARK,1997).

Após a secagem, o teor residual de umidade nas amostras foi baixo,

variando entre 4,1 (H3 e H5) a 5,7% (H2). O conteúdo de resíduo mineral

fixo nos hidrolisados variou de 10,2 (H6) a 17,9% (H5). Esse elevado teor

em relação ao "minced", pode ser explicado pela adição de soluções como

HCI ou NaOH, para controle do pH da reação de hidrólise (L1ASET et ai,

2000; L1CEAGA-GESUALDO, 1999; DINIZ, 1997).



5.2- RENDIMENTO DOS HIDROL/SADOS ENZIMÁTICOS

A recuperação do nitrogênio nos hidrolisados, em relação ao conteúdo

de nitrogênio no "minced", foi utilizada para descrever o rendimento do

hidrolisado. A tabela 8 mostra a variação na quantidade de proteína

recuperada após os seis ensaios enzimáticos realizados.

. hidrolisadt' .R- - . ------ .... -.-y---- r-----'--- ---- ---- -- -- ._.... -----Hidrolisado % Proteína I % Proteína I%GH

insolúvelsolúvel lNx6 25)

H1 Pepsina I Bromelina 75,7±O,9 24,4 ±0,9 8,1

H2 Pepsina I Bromelina 63,4 ±4,8 36,6 ±4,8 9,3

H3 Pepsina I Quimotripsina 84,2 ±O,1 15,8 ±0,1 9,8

H4 Pepsina I AspergJ1lus oryzae 63,7 ±2,4 36,4 ±2,4 7,8

H5 Pepsina I Streptomyces griseus 94,2 ±O,8 5,9 ±0,8 33,3

H6 Pepsina I Streptomyces griseus 89,0 ±O,6 11,0 ± 0,6 17,2

Tabel

Resultados correspondem a média dos valores em triplicata.

A porcentagem de proteína recuperada variou de acordo com o

sistema enzimático empregado no processo de hidrólise. Os hidrolisados 5 e

6, obtidos pela ação das enzimas pepsinalStreptomyces griseus

apresentaram rendimento elevado, onde o resíduo insolúvel representou no

máximo 11 % da proteína original.

Os hidrolisados 1,2 e 4 provenientes da ação da pepsinalbromelina, ou

da enzima pepsinalAspergillus oryzae, resultaram numa recuperação de

apenas 64 a 76% da proteína original.

O hidrolisado 3, obtido pela ação da pepsina/quimotripsina, apresentou

uma boa recuperação de proteína solúvel, da ordem de 84%, quando

comparado com os hidrolisados 1, 2 e 4, indicando que, apesar da enzima



quimotripsina ter sido responsável por um reduzido grau de hidrólise, resultou

na solubilização de grande parte da proteína original.

Segundo L1ASET (2000), LAHL e BRAUN (1994) e MAHMOUD (1994),

o grau de hidrólise está positivamente relacionado a solubilidade da proteína.

Foi observado que o aumento no grau de hidrólise resultou em maior

solubilidade da proteína hidrolisada, embora o hidrolisado 2 tenha

apresentado uma diminuição da solubilidade em relação ao hidrolisado 1, que

talvez possa ser explicado por uma reação da plasteína.



5.3- COMPOSiÇÃO EM AMINOÁCIDOS DOS HIDROLlSADOS E

COMPARAÇÃO COM REQUERIMENTOS DA FAO

Na tabela 9 estão apresentados os dados relativos a composição em

aminoácidos essenciais da amostra de "minced" e de todos os hidrolisados

obtidos, em comparação ao padrão da FAO (3-8 anos), 1991.

O perfil de aminoácidos essenciais do "minced" atende aos valores

recomendados pela FAO para crianças na idade pré-escolar (3-8 anos) e pela

FAO, 1990 para adultos, apresentando elevado conteúdo dos principais

aminoácidos essenciais. O "minced" também mostrou ser grande fonte de

metionina e lisina.

Observamos algumas variações nos perfis de aminoácidos dos

hidrolisados em relação ao "minced" que parece ser decorrente da

distribuição variável dos aminoácidos entre o hidrolisado e o resíduo protéico

insolúvel.

A separação da fração protéica insolúvel da fração solúvel do

hidrolisado, resultou em uma diminuição no conteúdo de certos aminoácidos

como a arginina, fenilalanina, histidina, metionina, prolina, serina, tirosina e

treonina, embora este decréscimo, parece não ter problema, pois a

concentração de aminoácidos essenciais continua atendendo às

necessidades da FAO. A redução da concentração de fenilalanina pode até

ser benéfica, quando o objetivo é obter um hidrolisado para pacientes

fenilcetonúricos.


RESULTAnOS E DISCUSSÃO 54

Por outro lado, os hidrolisados apresentaram enriquecimento no

conteúdo de aminoácidos como a alanina, ácido aspártico, glicina e

glutâmico, quando comparados com a proteína original.

O aquecimento ao qual foi submetido o hidrolisado para inativação

enzimática, no final da hidrólise, também pode ter sido responsável pela

modificação na distribuição dos aminoácidos entre a fração solúvel e insolúvel

(NETTO e GALEAZZI, 1998).


Tabela 9 - Conteúdo de aminoácidos do "minced" e dos hidrolisados obtidos e os requerimentos de aminoácidosÃJ

~~ essenciais, FAO 1990 e 1991.5.... C/.lo

AMINOÁCIDOS FAOb ~). "MINCED" H1 H2 H3 H4 H5 H6~ >-lx (9 aminoácidos I 100 9 proteína) (3-8 anos) Adultos ~o:3c- o...

Alanina 6,1 6,9 6,8 6,5 7,1 6,5 6,8o C/.l3= t'I1o

Arginina 7,6 6,8 6,5 6,2 6,3 6,2 6,3 tl...~

~r.....

Aspártico -1,3 10,5 10,6 10,9 11,1 10,8 11,0C/.l(jc- c::o

li>

Fenilalanina 4,2 3,1 3,3 3,6 2,9 3,8 3,4 C/.lz C/.l~ ;l>'~ Glicina 3,4 4,4 4,2 4,0 4,2 4,2 4,2 o

Glutâmico 14,7 19,6 19,5 19,5 21,1 18,9 19,8Histidina ~~, 1 2,2 2,2 2,2 2,1 2,1 2,1 1,9 1,6Isoleucina 4,8 4,1 4,4 4,7 4,4 5,0 4,8 2,8 1,3Leucina 8,8 8,5 8,6 8,6 8,7 8,7 8,7 6,6 1,9

Usina 10,3 10,6 10,4 9,9 10,2 9,8 10,1 5,8 1,6Metionina 3,5 3,0 3,1 3,1 2,3 3,0 2,6 2,Sa 1 7 a,Prolina 6,7 3,5 3,4 3,2 3,1 3,3 3,3Serina 4,2 3,9 3,9 3,9 3,9 4,0 3,9Tirosina 4,0 2,9 3,3 3,5 2,7 3,6 3,2Triptofano n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1,1 O,STreonina 6,1 4,7 4,7 4,8 4,8 4,8 4,9 3,4 0,9

Valina 5,3 5,2 5,2 5,3 5,1 5,4 5,1 3,S 1,3Tirosina IFenilalanina 8,2 6,0 6,6 7,1 5,6 7,4 6,6 6,3 1,9

aEsse valor corresponde a metionina + cistina; bFAO, 1991; Resultados correspondem a média dos valores obtidos em duplicata.II

VlV'l


5.4- RELAÇÃO DE FISCHER NOS HIDROLlSADOS

Os hidrolisados 1 e 4 apresentaram uma relação de Fischer de 3,0 e

3,3, respectivamente, sendo de interesse especial para a utilização clínica no

tratamento de pacientes com encefalopatia hepática. Estes pacientes se

beneficiam com proteínas contendo peptídeos curtos e uma alta relação de

Fischer (teor total aminoácidos de cadeia ramificada I teor total aminoácidos

aromáticos). A partir dos primeiros sintomas de melhora do paciente,

recomenda-se um aumento gradual na ingestão de proteínas por via oral,

porém mantendo por algum tempo uma relação de Fischer, de 2: 1. Os

hidrolisados 2, 3, 5 e 6 atenderam à essas necessidades, apresentando uma

relação 2:1 (FISCHER et aI., 1976).

Tabela 10- Relação de Fischer nos hidrolisados enzimáticos de "minced"H1 H2 H3 H4 H5 H6

(g aminoácido 1100 g proteína)

Aminoácidos deCadeia ramificada(AACR)

Isoleucina 4,1 4,4 4,7 4,4 5,0 4,8Leucina 8,5 8,6 8,6 8,7 8,7 8,7Valina 5,2 5,2 5,3 5,1 5,4 5,1

Aminoácidosaromáticos (AAA)

Fenilalanina 3,1 3,3 3,6 2,9 3,8 1 3,4Tirosina 2,9 3,3 3,5 2,7 3,6 3,2

AACR totais 17,8 18,2 18,6 18,2 19,1 18,6

AAA totais 6,0 6,6 7,1 5,6 7,4 6,6

Relação de

Fischer3,0 2,8 2,6 3,3 2,6 2,8

Resultados correspondem à média dos valores em duplicata.



5.5- DISTRIBUIÇÃO PERCENTUAL DOS PEPTíOEOS COM

DIFERENTES PESOS MOLECULARES

O tamanho molecular dos peptídeos resultantes da hidrólise foi

avaliado por um processo de ultrafiltração com membranas de exclusão

molecular de 30, 10 e 3 KDa. As frações isoladas foram hidrolisadas em meio

ácido e foi determinado o teor total de aminogrupos existentes em cada

fração. A distribuição percentual em cada hidrolisado é apresentada na figura

3.

Figura 3- Distribuição do peso molecular dos peptídeos nos hidrolisadosenzimáticos

~ 70:. 60o ... 50'O IVo :i 40!lU (.)

.~ ~ 30~ o~ :e 20...'tii 10c O~o

H1 H2 H3 H4 H5 H6

o> 30 KDa

.30 -10 KDa

10 - 3 KDA

Hidrolisados

Resultados correspondem à média dos valores obtidos em triplicata.

Os hidrolisados 1 e 2 mostraram perfis bastante semelhantes, com

predominância de peptídeos com pesos moleculares inferiores a 10 KDa.

Nesses hidrolisados, 78 e 68% dos peptídeos, respectivamente,

apresentaram pesos moleculares inferiores a 10 KDa, apesar do reduzido

grau de hidrólise.

No hidrolisado 3, correspondente à ação da pepsina seguida de

quimotripsina, a distribuição de peso molecular foi completamente diferente;



devido à especificidade das duas enzimas, houve predominância de

peptídeos grandes, sendo que 40% possuíam peso molecular igualou

superior a 30 KDa.

O hidrolisado 4, pepsinalAspergíllus oryzae apresentou pesos

moleculares extremos: 62% de peptídeos com peso molecular inferior a 10

KDa, e 35% de peptídeos com peso molecular igualou superior a 30 KDa.

Como era de se esperar, o hidrolisado 5, obtido pela ação da Pepsina

seguida da enzima de Streptomyces griseus, além do elevado grau de

hidrólise, apresentou também a maior porcentagem de pequenos peptídeos e

de aminoácidos livres, sendo que 86% do hidrolisado correspondeu a pesos

moleculares inferiores a 10 KDa e destes, 58% a pesos moleculares inferiores

a 3 KDa.

Devido ao elevado custo da enzima, proveniente de Streptomyces

griseus, testamos uma menor concentração da mesma, utilizando uma

relação enzima:substrato de 1:200, correspondente ao hidrolisado 6. O perfil

de distribuição dos pesos moleculares, quando comparado ao hidrolisado 5

não foi mantido, observando-se uma distribuição equitativa entre as diversas

faixas de pesos moleculares testados.

O conhecimento do peso molecular dos peptídeos dos hidrolisados é

essencial para o desenvolvimentos de fórmulas nutricionais. Peptídeos com

pesos moleculares acima de 5KDa podem ser responsáveis por algum tipo de

alergia alimentar. Todos os hidrolisados apresentaram peptídeos com pesos

moleculares maiores que 30 KDa, não podendo ser utilizados, como um todo,

por pacientes com alergias alimentares.



5.6- PERFIL DE AMINOÁCIDOS DAS FRAÇÓES PEPTíDICAS DOS

DIVERSOS HIDROLlSADOS

Foi determinada a distribuição percentual de cada aminoácido nos

hidrolisados de 1 a 6, bem como das frações de diferentes pesos moleculares

destes hidrolisados, com o objetivo de verificar se houve uma variação no

perfil de aminoácidos, causada pela separação das frações.

Podemos verificar que a distribuição dos aminoácidos nas diversas

frações com pesos moleculares distintos assemelha-se ao perfil de

aminoácidos do hidrolisado total., conforme apresentado nas tabelas 11a e 11

b.

No entanto, em relação à histidina e a metionina foram observadas

variações cuja extensão deverá ser avaliada, ainda sob o ponto de vista de

significância nutricional, se as frações forem utilizadas individualmente.


1<3l'l

~~

~::sO-a~o...l'l

~r

azl'l

~

Tabela 11 a- Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e nas frações peptídicas obtidas a partir dos

hidrolisados H1 (Pepsina 1:10.000/Bromelina), H2 (Pepsina 1:60.000/Bromelina)e H3 (Pepsina 1:10.000/Quimotripsina) 1.

H1 H2 H3(Pepsina 1:10.000/ (Pepsina 1:60.000/ (Pepsina 1:10.000/ Quimotripsína)

Bromelina) Bromelinal

Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa

H1 >30 30 10 10 ~ <~ I-l? >~n ~n .1n 1n .3 < ~ H1 >30 30 10 10 3 <3

Aminoácidos % nmoles % nmoles % nmolesAlanina 9,9 9,7 8,9 9,8 10,3 9,8 9,3 9,5 9,4 10,5 9,5 9,6 7,8 10,3 8,8

Arginina 5,0 5,0 4,0 5,0 4,9 4,8 4,9 4,6 5,0 4,9 4,6 4,6 4,4 5,1 4,8

Aspártico 10,2 10,3 9,7 10,6 9,2 10,3 10,4 10,3 10,6 9,5 10,7 10,3 11,0 11,5 9,1

Fenilalanina 2,4 2,4 2,1 2,4 2,6 2,6 2,6 2,5 2,6 2,9 2,8 2,6 2,4 2,8 4,1

Glicina 7,6 7,5 7,5 7,6 7,3 7,2 7,1 7,6 6,6 7,0 6,8 7,1 5,9 7,8 5,6

Glutamina 17,2 17',2 15,8 17,0 17,0 17,1 17,1 16,6 16,9 17,3 17,2 16,3 18,3 18,6 13,6

Histidina 1,8 1,4 - 2,4 4,6 1,8 1,4 5,0 0,3 1,6 1,9 4,0 2,6 - -lsoleucina 4,1 3,9 3,5 3,8 3,7 4,4 4,2 4,0 4,2 4,0 4,6 4,0 4,6 4,4 4,1

Leucina 8,3 8,1 7,1 8,0 8,7 8,4 8,3 7,8 8,4 9,3 8,5 7,9 8,6 8,5 9,3

Usina 9,4 9,2 8,5 9,2 7,8 9,1 9,0 8,7 9,5 7,7 8,8 8,6 8,7 8,8 6,4

Metionina 2,6 2,6 2,0 2,8 3,0 2,6 2,"1 2,6 2,7 3,1 2,6 1,7 4,4 3,1 3,8

Prolina 4,0 5,3 4,4 4,8 3,4 3,8 5,2 4,0 6,4 3,6 3,6 5,9 3,7 1,5 -Serina 4,8 5,1 4,8 4,8 4,9 4,8 5,2 4,4 5,3 5,1 4,8 5,1 5,0 4,1 6,1

Tirosina 2,1 2,3 2,0 2,2 2,4 2,3 2,4 2,4 2,4 2,7 2,5 2,4 2,5 2,7 3,6

Treonina 5,1 4,8 4,5 4,7 4,8 5,1 4,9 4,7 4,6 5,1 5,2 4,9 4,1 5,3 5,1

Valina 5,7 5,3 5,4 5,1 5,5 5,7 5,4 5,3 5,3 5,7 5,8 5,0 6,0 5,3 5,8

Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100:r---

Resultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo total de aminoácidos na fração analisada.

~V2

~E;oV2

tIlt:l......V2(j

CV2V2;J>lo

0\o

fó»~

~::oQ.

Ó3:o~ã'Q.

"'"z~

~

Tabela 11 b- Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e nas frações peptídicas obtidas a partir dos

hidrolisados H4 (Pepsina 1:10.000/Aspergillus oryzae), H5 (Pepsina 1:60.000/Streptomyces griseus) e H6 (Pepsina

1:10.000/Streptomyces griseus) 1.

H4 H5 H6(Pepsina 1:10.000/ (Pepsina 1:60.000/ Streptomyces (Pepsina 1:10.000/

Aspergillus oryzae) griseus) Streptomyces griseus )

Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa

H1 >:\0 :\0-10 10-3 <3 H1 >30 ::\0 -10 10 3 < 3 H1 >30 30 -10 10 3 <3Aminoácidos % nmoles % nmoles % nmolesAlanina 10,2 9,8 10,3 9,7 9,6 9,4 8,5 9,1 9,3 9,4 9,9 9,0 9,7 9,9 9,4

Arginina 4,6 5,0 5,0 4,8 5,1 4,6 4,8 4,6 4,4 4,6 4,7 4,8 4,9 4,6 4,7

Aspártico 10,8 10,5 10,1 11,8 10,4 10,5 13,0 10,7 10,8 9,9 10,7 11,1 10,6 10,1 9,4

Fenilalanina 2,3 2,2 1,0 2,5 2,7 2,9 2,7 2,6 2,5 3,3 2,6 2,7 2.3 2,4 3,5

Glicina 7,1 8,0 8,6 6,7 7,8 7,2 7,0 7,6 7.9 6,9 7,1 7,2 7,3 7,1 6,0

Glutamina 18,5 18,8 19,0 18,3 18,7 16,6 15,1 16,9 17,3 16,3 17,4 16,6 18,1 16,4 15,2

Histidina 1,8 1,6 3,4 0,5 1,8 1,8 1,6 2,2 4,6 1,7 1,7 3,8 1,2 1,7 3,9

Isoleucina 4,3 3,8 2,9 4,2 3,8 4,9 4,5 4,9 4,5 5,2 4,7 4,1 4,2 4,0 4,5

Leucina 8,6 7,8 7,6 8,4 8,1 8,6 7,9 7,9 7,4 9.7 8,6 8,1 7,7 7,5 10,3

Usina 9,0 9,6 11,2 9,6 10,0 8,6 8,6 8,5 8,1 8,6 8,9 8,6 8,6 8,6 8,1

Metionina 1,9 2,3 2,5 2,0 1,8 2,6 1,5 2,6 2,4 3,1 2,2 1,6 2,6 3,5 2,8

Prolina 3,4 4,2 3,1 3,9 ' 3,7 3,7 6,6 6,5 3,5 4,0 3,6 5,0 6,1 6,3 3,4

Serina 4,8 4,9 4,8 4,9 4,7 4,9 5,1 4,1 4,5 4,2 4,8 5,1 4,9 5,6 5,0

Tirosina 1,9 2,0 1,9 2,1 1,8 2,5 2,4 1,5 2,3 2,1 2,3 2,5 2,2 2,2 3,0

Treonina 5,2 4,6 4,3 5,2 4,6 5,2 5,0 4,5 4,9 4,5 5,3 5,2 4,6 4,2 5,1

Valina 5,6 5,0 4,1 5,4 5,4 6,0 5,4 5,9 5,6 6,5 5,7 4,9 5,1 5,9 5,6

Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

1 Resultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo total de aminoácidos na fração analisada.

§C/)

c

~oC/)

tno.....C/)

8C/)C/)

>.o

0\>-'


A distribuição da fenilalanina nos hidrolisados e em suas frações

isoladas, foi de interesse no nosso estudo, sendo apresentada na tabela 12.

Tabela 12 - Perfil de distribuição da fenilalanina nos hidrolisados totais e nas~

frações peptídicas obtidas a partir desses hidrolisados r

Peso Molecular (KDa)Total >30 30-10 10-3 <3

Hidrolisado % Fenilalanina (nmoles)H1 2,4 2,4 2,1 2,4 2,6H2 2,6 2,6 2,5 2,6 2,9H3 2,8 2,6 2,4 2,8 4,1H4 2,3 2,2 1,0 2,5 2,7

H5 2,9 2,7 2,6 2,5 3,3H6 2,6 2,7 2,3 2,4 3,5

'IResultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo totalde aminoácidos na fração analisada

As frações com pesos moleculares < 3KDa, dos hidrolisados 1 e 2

apresentaram uma pequena elevação da concentração de fenilalanina, em

relação ao hidrolisado total, possivelmente devido ao baixo grau de hidrólise

(8 e 9%), respectivamente.

Observamos que o hidrolisado 3 apresentou uma maior concentração

de fenilalanina (4,1%) e de tirosina (3,6%) na fração com peso molecular

inferior a 3 KDa, em relação ao hidrolisado total. A quimotripsina, uma das

enzimas utilizadas para a obtenção do hidrolisado 3, possui uma maior

afinidade por aminoácidos aromáticos, o que explica a liberação destes

aminoácidos aromáticos, apesar do baixo grau de hidrólise (9,8%), mostrando

que essa enzima é a mais indicada para liberar a fenilalanina. Este fato é

especialmente importante quando se procura remover a fenilalanina do

hidrolisado.



Infelizmente, devido ao reduzido grau de hidrólise. esta fração «3

KDa) representa apenas 10% do hidrolisado total, não justificando. nestas

condições. um processo tecnológico para a remoção da fenílalanina.

A fração com peso molecular entre 30 e 10 KDa do hidrolisado 4

também apresentou uma concentração reduzida de fenilalanina, em relação

ao hidrolisado total e o rendimento protéico dessa fração também foi muito

reduzido, em torno de 4%.

Os hidrolisados 5 e 6 apresentaram a fração menor que 3KDa com

uma elevada concentração de fenilalanina em relação às demais frações.

Neste caso, ao contrário do que ocorreu nos hidrolisados 3 e 4, o elevado

grau de hidrólise (33 e 17%) parece ter sido responsável pela liberação da

fenilalanina. A fração < 3KDa, correspondeu a 57 e 28%, respectivamente, do

hidrolisado total.

Eventualmente, essa fração poderia ser submetida a um processo de

remoção da fenilalanina, para se tornar útil como fonte protéica para

pacientes fenilcetonúricos. Nesse caso, a cromatografia em gel (GPC) por

exclusão do peso molecular com Sephadex-G15, por exemplo, poderia ser

utilizada para remover a fenilalanina livre. Devido a natureza hidrofóbica do

Sephadex-G15, a fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com

características hidrofóbicas) sofrerão um retardo durante a eluição, levando a

uma marcada redução no conteúdo destes aminoácidos (BAUTISTA et aI.,

1996; ADACHI et aI., 1991; TANIMOTO et aI., 1991; ARAI et aI., 1986;

YAMASHITA et aI., 1976).

Apesar do carvão ativo ser considerado um adsorvente inespecífico.



ele têm sido descrito na literatura como um meio de adsorção para separar as

moléculas hidrofóbicas, reduzindo o sabor amargo do hidrolisado, removendo

impurezas e clarificando o hidrolisado, tornando-se próprio para este tipo de

aplicação. Posteriormente, o carvão poderia ser removido, por exemplo, por

técnicas de filtração (SYNOWIECK e AL-KHATEEBI, 2000; PEDERSEN,

1994; LOPEZ-BAJONERO et aI., 1991).


CONCLUSÕES 65

6- CONCLUSÕES

~ Os hidrolisados apresentaram um rendimento variando entre 63,4 e

94,2%, dependendo do sistema enzimático utilizado. Os hidrolisados

liofilizados continham teores protéicos semelhantes entre si, em média

73,6% e um teor lipídico muito reduzido, da ordem de 1,4%.

~ Todos os hidrolisados apresentaram uma composição em aminoácidos

semelhante entre si, atendendo às recomendações da FAO 1991, para

crianças entre 3 e 8 anos e para adultos.

~ Os hidrolisados 1 e 4 são indicados para o tratamento de pacientes com

encefalopatia hepática, pois apresentaram uma relação de Fischer elevada,

de 3: 1, e uma elevada concentração de peptídeos pequenos.

~ O processo de ultrafiltração, com membranas de exclusão molecular,

mostrou ser um método de baixo custo e eficiente para separar as frações

peptídicas com diferentes pesos moleculares e pouco interferiu na

distribuição dos aminoácidos.

~ No hidrolisado 5, a fração com peso molecular menor que 3 KDa,

apresentou uma porcentagem elevada (57%) de peptídeos com baixo peso

molecular, podendo ser utilizada no tratamento de pacientes com alergias

alimentares.

~ P\lém de apresentar uma porcentagem alta de peptídeos com baixo peso

molecular, a fração < 3KDa (H5), apresentou uma elevada concentração de

fenilalanina, podendo ser submetida a um processo de remoção da


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fenilalanina, para posterior formulação de dietas para pacientes

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hidrolisados protéicos de peixe: caracterização e proposta de uso

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