preparo de hidrolisados protéicos e análise de aminoácidos por

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

PREPARO DE HIDROLISADOS PROTÉICOS E

ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS POR DUAS

METODOLOGIAS

CARLOS ROBERTO BERNARDI

FLORIANÓPOLIS

2000

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

PREPARO DE HIDROLISADOS PROTÉICOS E

ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS POR DUAS

METODOLOGIAS

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos doCentro de Ciências Agrárias daUniversidade Federal de Santa Catarinacomo requisito final para obtenção do títulode Mestre em Ciência dos Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Marilde Terezinha Bordignon Luiz

CARLOS ROBERTO BERNARDI

FLORIANÓPOLIS

2000

III

À minha esposa Jenecir e aos meus

filhos Julian Roberto e Caroline.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os que colaboraram direta ou indiretamente para a

realização deste curso, e em especial para:

1. À Profa. Dra. Marilde Terezinha Bordignon Luiz, pela orientação, apoio e estímulo

durante a realização do curso.

2. Ao pesquisador MS Dirceu Luiz Zanotto, conselheiro acadêmico, pelo apoio durante

a realização do curso.

3. Ao pesquisador Dr. Antônio Lourenço Guidoni pelos conselhos e análise estatística.

4. Aos professores do CCA pelo apoio e atenção.

5. Aos pesquisadores Dr. Cláudio Bellaver, Dr. Élsio A. P. de Figueiredo, Dr. Gustavo

M. M. Lima e Dr. Paulo A. R de Brum pela ajuda para dirimir dúvidas.

6. Aos pesquisadores Dr. Flávio Bello Fialho, Dr. Gustavo M. M. Lima e Dr. Laurimar

Fiorentin, pela ajuda para escrever o Abstract.

7. Aos colegas do Laboratório de Análises Físico-Químicas da Embrapa Suínos e

Aves, Claudete H. Klein, Iraí P. de Mello, Lindamar A. Gonçalves, Lucimara

Suzin, Maria C. V. Carlotto, Nilse A. Vanzo, Rosemari Martini, Rosilei S. Klein e

Terezinha B. Cestonaro,, pelo apoio e ajuda na realização das análises laboratoriais.

8. Aos colegas dos laboratórios de Química de Proteínas e Bioquímica do CCA-UFSC

pelo apoio e amizade.

V

9. Aos colegas de curso pela amizade e companheirismo.

10. Ao pesquisador Dr. Paulo Roberto S. da Silveira, pelo apoio oferecido.

11. À Irene Câmera, bibliotecária da Embrapa Suínos e Aves, e Ivana Vicente pela

ajuda na obtenção de referências bibliográficas.

12. À equipe de nutrição da Embrapa Suínos e Aves pelo apoio oferecido.

13. À Embrapa Suínos e Aves em nome da Chefia e equipe técnica pela oportunidade de

realização deste treinamento.

14. Aos membros da banca examinadora, Profa. Dra. Marilde T. B. Luiz, Profa. Dra.

Úrsula M. Lanfer Marquez, Prof. Dr. Moacir G. Pizzolati, Profa. Dra. Roseane Fett

e Profa. Dra. Edna R. Amante.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS IX

LISTA DE QUADROS XV

LISTA DE FIGURAS XIX

RESUMO XXIV

ABSTRACT XXV

1 INTRODUÇÃO 01

2 REVISÃO DE LITERATURA 04

2.1 Proteínas 04

2.2 Aminoácidos 07

2.3 A análise de aminoácidos 08

2.3.1 Importância 08

2.3.2 O método cromatográfico 09

2.3.3 A hidrólise de proteínas 13

2.3.4 A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas 17

2.4 O preparo dos hidrolisados protéicos 20

3 MATERIAL E MÉTODOS 23

3.1 Amostras 23

3.2 Equipamentos 24

VII

3.3 Soluções e reagentes 24

3.3.1 Reagentes 24

3.3.2 Soluções 25

3.4 Métodos 27

3.4.1 Preparo das amostras 27

3.4.2 Hidrólise e preparo dos hidrolisados 28

3.4.2.1 Método 1 – evaporação em evaporador rotativo 28

3.4.2.2 Método 2 – evaporação em dessecador a vácuo 29

3.4.2.3 Método 3 – Evaporação em fluxo de argônio 29

3.4.2.4 Método 4 – Neutralização 29

3.4.2.5 Método 5 - Microondas 30

3.4.3 Experimento 1 30




3.4.7 Condições cromatográficas 32

3.4.7.1 Analisador de aminoácidos Beckman System 6300 32

3.4.7.2 CLAE 33

3.5 Determinação do teor de aminoácidos 35

3.6 Análise estatística 36

3.6.1 Experimentos 1 e 2 36

3.6.2 Experimentos 3 e 4 39

VIII

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40

4.1 Análise de composição química 40

4.2 Experimentos 1 e 2 44

4.3 Experimento 3 67

4.4 Experimento 4 73

5 CONCLUSÕES 75

6 RECOMENDAÇÕES 76

7 ANEXOS 77

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 123

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo

(EE) e matéria mineral (Cinzas), nas amostras de milho, farelo de

soja e hidrolisado ácido de caseína, em g/100g da amostra com base

na matéria natural.

40

Tabela 02 - Nível mínimo de significância, envolvendo os métodos, amostras e

a interação métodos x amostras, analisados independentemente de

amostra, no analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.

47

Tabela 03 - Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses

multivariadas sobre os métodos, para a amostra milho, no analisador

de aminoácidos Beckman e CLAE.

48


multivariadas sobre os métodos, para a amostra farelo de soja, no

analisador de aminoácidos Beckman.

52


multivariadas sobre os métodos, para a amostra hidrolisado ácido de

caseína, no analisador de aminoácidos Beckman.

54

X


multivariadas sobre os métodos, independente de amostra, para o

analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.

92

Tabela 07 - Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao

aminoácido ácido aspártico (Asp), no analisador de aminoácidos

Beckman, para os dados censurados.

93

Tabela 08 - Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e

comparação entre os métodos para o aminoácido ácido aspártico

(Asp) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.

94


aminoácido treonina (Tre), no analisador de aminoácidos Beckman,

para os dados censurados.

95


comparação entre os métodos para o aminoácido treonina (Tre)

obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados

censurados.

96


aminoácido serina (Ser), no analisador de aminoácidos Beckman,


97


comparação entre os métodos para o aminoácido serina (Ser)


censurados.

98

XI


aminoácido ácido glutâmico (Glu), no analisador de aminoácidos


99


comparação entre os métodos para o aminoácido ácido glutâmico

(Glu) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados

censurados.

100


aminoácido prolina (Pro), no analisador de aminoácidos Beckman,


101


comparação entre os métodos para o aminoácido prolina (Pro)


censurados.

102


aminoácido glicina (Gli), no analisador de aminoácidos Beckman,


103


comparação entre os métodos para o aminoácido glicina (Gli)


censurados.

104


aminoácido alanina (Ala), no analisador de aminoácidos Beckman,


105

XII


comparação entre os métodos para o aminoácido alanina (Ala)


censurados.

106


aminoácido valina (Val), no analisador de aminoácidos Beckman,


107


comparação entre os métodos para o aminoácido valina (Val)


censurados.

108


aminoácido isoleucina (Ile), no analisador de aminoácidos


109


comparação entre os métodos para o aminoácido isoleucina (Ile)


censurados.

110


aminoácido leucina (Leu), no analisador de aminoácidos Beckman,


111

XIII


comparação entre os métodos para o aminoácido leucina (Leu)


censurados.

112


aminoácido tirosina (Tir), no analisador de aminoácidos Beckman,


113


comparação entre os métodos para o aminoácido tirosina (Tir)


censurados.

114


aminoácido fenilalanina (Fen), no analisador de aminoácidos


115


comparação entre os métodos para o aminoácido fenilalanina (Fen)


censurados.

116


aminoácido histidina (His), no analisador de aminoácidos Beckman,


117

XIV


comparação entre os métodos para o aminoácido histidina (His)


censurados.

118


aminoácido lisina (Lis), no analisador de aminoácidos Beckman,


119


comparação entre os métodos para o aminoácido Lisina (Lis)


censurados.

120


aminoácido arginina (Arg), no analisador de aminoácidos Beckman,


121


comparação entre os métodos para o aminoácido arginina (Arg)


censurados.

122

LISTA DE QUADROS

Quadro 01 - Composição em aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e

hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico

Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da

amostra com base na matéria natural.

41

Quadro 02 - Perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e

hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico

Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g de

proteína com base na matéria natural.

42

Quadro 03 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido,

independente de método, nos dados não censurados, para as

amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína, em

g/100g da amostra com base na matéria natural, para o analisador

de aminoácidos Beckman System 6300.

43

Quadro 04 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada amostra,

independente de método, nos dados não censurados, em g/100g da

amostra com base na matéria natural, para CLAE.

44

XVI

Quadro 05 - Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na

amostra milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra

com base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos

Beckman System 6300.

78


amostra milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra

com base na matéria natural, para CLAE.

79


amostra farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da

amostra com base na matéria natural, para o analisador de

aminoácidos Beckman System 6300.

80


amostra farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da


81


amostra hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em

g/100g da amostra com base na matéria natural, para o analisador

de aminoácidos Beckman System 6300.

82


amostra hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em

g/100g da amostra com base na matéria natural, para CLAE.

83

XVII

Quadro 11 - Composição em aminoácidos para cada método, independentemente

de amostra, através do analisador específico Beckman, e

comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas

em conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra

com base na matéria natural.

84

Quadro 12 – Composição em aminoácidos para cada método, independentemente

de amostra, através de CLAE, e comparação do vetor de médias

envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não

censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.

85

Quadro 13 – Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra

milho, através de analisador específico Beckman, e comparação do

vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto,

para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural.

86


milho, através de CLAE, e comparação do vetor de médias



87


farelo de soja, através de analisador específico Beckman, e

comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas

em conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra

com base na matéria natural.

88

XVIII


farelo de soja, através de CLAE, e comparação do vetor de médias



89


hidrolisado ácido de caseína, através de analisador específico

Beckman, e comparação do vetor de médias envolvendo as

variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em

g/100g da amostra com base na matéria natural.

90


hidrolisado ácido de caseína, através de CLAE, e comparação do

vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto,

para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural.

91

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em analisador


48

Figura 02 - Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas

Can1 e Can2, da amostra milho, para o analisador de aminoácidos

Beckman.

49


Can1 e Can2, da amostra milho, para CLAE.

49


Can1 e Can2, da amostra farelo de soja, para o analisador de

aminoácidos Beckman.

50


Can1 e Can2, da amostra farelo de soja, para CLAE.

50

Figura 06 - Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em CLAE 51


Can1 e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para o


53


Can1 e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para CLAE.

53

XX

Figura 09 - Aminograma da amostra milho, obtido em analisador Beckman

System 6300.

55


Can1 e Can2, independente de amostra, para o analisador de

aminoácidos Beckman.

56


Can1 e Can2, independente de amostra, para CLAE.

56

Figura 12 - Aminograma da amostra milho, obtido em CLAE. 57

Figura 13 - Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em analisador


57

Figura 14 - Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em CLAE. 58

Figura 15 - Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em

analisador Beckman System 6300.

58

Figura 16 - Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em

CLAE.

59

Figura 17 - Visualização gráfica da comparação entre os métodos para o

aminoácido treonina, na amostra farelo de soja, utilizando o


60


aminoácido serina, na amostra farelo de soja, utilizando o analisador

de aminoácidos Beckman.

61


aminoácido treonina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,

utilizando o analisador de aminoácidos Beckman.

61

XXI


aminoácido serina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,


62


aminoácido tirosina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,


62


aminoácido fenilalanina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,


63


aminoácido lisina, na amostra hidrolisado ácido de caseína,


63

Figura 24 - Visualização gráfica da comparação através de valores relativos à

média entre os métodos para a amostra hidrolisado ácido de caseína,

no analisador de aminoácidos Beckman.

65

Figura 25 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise

em microondas na potência 2, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32

minutos, em valores percentuais relativos à recuperação obtida pela

hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.

69



minutos (média de duas repetições), em valores percentuais relativos

à recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4,

para a amostra milho.

69

XXII





70






70





71


em microondas na potência 6, nos tempos de 2, 4, 5, 6, 7 e 8 minutos

(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à

recuperação obtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para

a amostra milho.

71





72

XXIII





72


em microondas na potência 12, nos tempos de 05, 10, 15, 25 e 60




73

Figura 34 - Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos obtidos por

analisador específico Beckman e CLAE, em valores relativizados,

independentemente de amostra.

74

RESUMO

Amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram submetidas à

hidrólise ácida em estufa (110 ± 5 °C, durante 22 horas) com ácido clorídrico 6 N, em

ampolas de vidro seladas sob vácuo e microondas. Os hidrolisados foram preparados

por quatro métodos: 1) evaporação em evaporador rotativo sob vácuo, 2) evaporação em

câmaras a vácuo em presença de pastilhas de NaOH, 3) evaporação em bloco de

aquecimento sob fluxo de argônio e 4) neutralização com solução padrão de

citrato/NaOH. Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador

específico Beckman System 6300 e CLAE Shimadzu LC-10AD, com derivatização pós-

coluna por ninidrina e OPA, respectivamente. O método de neutralização dos reagentes

da hidrólise apresentou o maior teor para a maioria dos aminoácidos. Permite boa

produtividade, atendendo às necessidades de trabalhar com grandes quantidades de

amostras. A evaporação em evaporador rotativo apresentou perdas significativas apenas

para treonina e serina na amostra farelo de soja, sob fluxo de argônio observou-se

baixos teores para treonina, fenilalanina e lisina e em câmaras sob vácuo apresentou

perdas significativas para treonina, serina e tirosina. A utilização da solução de

redissolução de amostras recomendada para o analisador Beckman apresentou

resultados superestimados, quando utilizada em CLAE com detecção por fluorescência.

O uso do microondas Pressurized Microwave Decomposition System PAAR não

apresentou resultados equivalentes aos obtidos pela hidrólise em estufa.

Palavras chave: aminoácidos, análise de aminoácidos, hidrólise de proteínas, preparo de

amostras, hidrólise por microondas.

ABSTRACT

Comparative Study of Sample Preparation Methodologies for Amino Acid

Analysis. Samples of maize, soybean and casein (acid hydrolysate) were submitted to

acid hydrolysis in oven (110 ± 5 °C, for 22 hours) with 6 N HCl, in evacuated and

sealed ampoules under vacuum. Four methods of hydrolysate preparation were used:

1) evaporation to dryness in rotary evaporator under vacuum, 2) evacuated desiccator

under vacuum and NaOH, 3) flushing the open vial with argon and 4) neutralization

with standard citrate/NaOH solution. The amino acids were isolated and quantified in

specific amino acid analyser Beckman System 6300 and HPLC Shimadzu LC-10AD,

with post column derivatization with ninhidrin and OPA, respectively. Hydrolysates

were prepared, for both equipments, by a method for the Beckman analyser. The

neutralization method presented the best result considering all amino acids. Besides, it is

more practical for rapid processing of a large number of samples. In the case of

evaporation method, in the rotary evaporator, significant losses were verified only for

threonine and serine in the soybean sample. There was low recovery of threonine,

phenylalanine and lysine using heat and flushing with argon. The evacuated desiccator

method presented significative losses of threonine, serine and tyrosine. The sample

dillution buffer recommended for Beckman analyser presented superestimate results in

HPLC with fluorescence detector. Pressurized Microwave Decomposition System

PAAR did not present equivalent results with oven hydrolysis.

Key words: amino acid, amino acid analysis, protein hydrolysis, sample preparation,

microwave hydrolysis.

1 INTRODUÇÃO

A hidrólise de proteínas é uma atividade fundamental e indispensável nos

procedimentos de análise e determinação de aminoácidos. Nos últimos anos foram

obtidos avanços importantes, quanto a equipamentos e reagentes, entretanto, muitos

problemas ainda persistem, relacionados principalmente ao preparo dos hidrolisados e à

constituição da amostra.

O método tradicional de hidrólise, com o uso de ácido clorídrico 6 N a

110 ºC, ainda é reconhecido como padrão e o mais utilizado, apesar de promover a

destruição parcial ou total dos aminoácidos sulfurados (cistina e metionina) e do

triptofano.

A completa recuperação de todos os aminoácidos em um único

procedimento de hidrólise, bem como para a redução do tempo de preparo e sua

determinação analítica são objetivos de estudos. Reduções substanciais em tempo de

análise, com aumento da precisão, foram observados com a introdução da

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

Os métodos de hidrólise e preparo de amostras atualmente disponíveis não

possibilitam a completa recuperação de todos os aminoácidos em um único

procedimento, sendo necessário a utilização de métodos alternativos para a

2

determinação de alguns aminoácidos, mais especificamente, de cistina, metionina e

triptofano.

A redução do tempo de hidrólise de proteínas foi objeto de vários estudos,

direcionados principalmente para o aumento da temperatura de hidrólise, onde obteve-

se ganhos significativos de tempo, especialmente após a introdução de equipamentos de

microondas. Esses avanços, embora sinalizados em diversos estudos científicos, não

estão recomendados pelos órgãos oficiais de metodologia analítica, tais como a AOAC

(Association of Official Analitical Chemists). Apesar disso, a maioria dos laboratórios

vêm regularmente adotando métodos alternativos, embora não oficiais, em busca de

ganhos em qualidade, tempo e custos de processamento. Os laboratórios oficiais,

voltados para a produção científica, já não podem fazer o mesmo, pois necessitam de

parâmetros de comparação e de validação das novas técnicas.

Assim, uma proposta de trabalho colaborativo interlaboratorial teria muitas

dificuldades a superar. Se variações em torno do reagente de derivatização e as

condições de derivatização pré ou pós-coluna já dificultam a comparação dos

resultados, variações em torno da metodologia de preparo das amostras tornam quase

impossível a sua realização.

Além disso, os novos procedimentos de hidrólise e preparo das amostras

propostos recentemente, com o uso de equipamentos de microondas, precisam ser

consolidados e adotados, haja visto que, a utilização da metodologia oficialmente

reconhecida necessita de tempo significativo, o que já não pode mais ser aceito quando

a demanda de amostras é elevada.

Com o propósito de colaborar para a superação dessas dificuldades, o

presente trabalho objetivou estudar metodologias de preparo dos hidrolisados protéicos

3

para a análise de aminoácidos, pelo uso do método tradicional de hidrólise em estufa a

110 ºC durante 22 horas, comparando métodos de evaporação e neutralização dos

reagentes da hidrólise, através da determinação dos aminoácidos por analisador

específico e cromatografia líquida de alta eficiência e estudo da viabilidade de utilização

de equipamento de microondas pressurizado PMD System da Anton Paar (Anton Paar

KG, Áustria) como alternativa ao método tradicional.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Proteínas

As proteínas (do grego proteos = primeiro) são compostos orgânicos

extremamente complexos, de natureza coloidal, formados fundamentalmente por

carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio. O termo proteína foi criado por Mulder, em

1840, citado por Andriguetto et al. (1983), para designar a substância fundamental da

albumina da clara de ovo.

Todas as proteínas são polímeros formados de um grande número de

unidades fundamentais chamadas de aminoácidos (Sienko & Plane, 1976). Mas,

somente L-α-aminoácidos estão presentes nas proteínas (Rodwell , 1996).

Representam uma classe variada e heterogênea de macromoléculas,

formadas por polipeptídeos de alto peso molecular. Quimicamente, dividem-se em

proteínas simples, constituídas apenas de polipeptídeos, e complexas, que contém

grupamentos adicionais, como carboidratos, lipídeos e ácidos nucléicos. Com relação à

sua forma, dividem-se em duas grandes classes: proteínas globulares, caracterizadas

pela presença de cadeias polipeptídicas dobradas ou envolvidas de maneira muito

compacta, e a das proteínas fibrosas, altamente assimétricas e consistem de longas

cadeias ou grupos de cadeias peptídicas (Harper et al., 1982).

5

Segundo Rodwell (1996), as estruturas protéicas são estabilizadas por várias

forças, que incluem: pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações

eletrostáticas e forças de van der Waals. Para Harper et al. (1982), as estruturas

protéicas são estabilizadas por duas categorias de ligações fortes (peptídica e dissulfeto)

e duas de ligações fracas (pontes de hidrogênio e hidrofóbicas).

A estrutura primária das proteínas é derivada de ligações α-peptídicas entre

L-α-aminoácidos. As ligações de dissulfeto podem interconectar duas cadeias paralelas

por intermédio de resíduos de cisteína. Essas ligações são relativamente estáveis, sendo

difícil seu rompimento em condições usuais de desnaturação. As pontes de hidrogênio

resultam de ligações de átomos de hidrogênio com o nitrogênio e o oxigênio carbonílico

de ligações peptídicas diversas. Podem ser originárias de resíduos de aminoácidos da

mesma cadeia polipeptídica ou de outras cadeias. Sua importância na cadeia peptídica

resulta da grande quantidade de pontes de hidrogênio que podem formar-se. As

interações hidrofóbicas envolvem as cadeias laterais não polares, desempenhando um

importante papel na manutenção da estrutura protéica. As ligações eletrostáticas são

ligações salinas formadas entre grupos com cargas opostas, presentes nas cadeias

laterais dos aminoácidos constituintes da proteína (Harper et al., 1982; Rodwell, 1996).

Quanto à ordem de organização da estrutura protéica, divide-se em primária,

secundária, terciária e quaternária. A estrutura primária refere-se à ordem das

seqüências de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas que formam as proteínas. As

estruturas secundárias e terciárias estão relacionadas com a conformação das cadeias, ou

seja, com as posições relativas, no espaço, em que cada um dos átomos constituintes da

molécula se encontram. A estrutura quaternária refere-se a um quarto nível de

organização, através do qual várias unidades monoméricas, cada uma com suas

6

estruturas primárias, secundárias e terciárias apropriadas, podem se combinar, através

de ligações e interações iguais às da estrutura terciária, originados principalmente

naqueles resíduos que ficaram orientados em direção à sua superfície (Harper et al.,

1982; Farfán, 1994).

Segundo Means & Feeney (1971), a estrutura tridimensional da proteína é

governada pela estrutura primária. Modificações na estrutura tridimensional podem

produzir efeitos importantes nas propriedades da proteína. Modificações nos resíduos de

aminoácidos necessariamente modificam a estrutura primária.

As estruturas secundárias, terciárias e quaternárias são mantidas por forças

relativamente fracas e são facilmente rompidas por diversas manipulações, com perda

da atividade biológica. Essa perda da atividade é chamada de desnaturação

(Harper et al., 1982).

Para Farfán (1994), usa-se a palavra desnaturação para denotar qualquer

alteração nas estruturas quaternária, terciária e secundária das proteínas, considerando

que essas estruturas são resultado de um número relativamente grande de interações

fisico-químicas e até, ligações peptídicas, e que, por isso, não é possível definir com

brevidade e precisão qualquer mudança de estado da estrutura superior.

Means & Feeney (1971), citam que durante muitos anos o fator de

motivação para o estudo de modificações químicas de proteínas foi para sua

determinação quantitativa ou da sua composição em aminoácidos, sendo que, os

métodos utilizados não preservam a sua integridade.

Fallon et al. (1987), citam que os interesses recentes em cromatografia de

proteínas estão voltados para o desenvolvimento de tecnologia de recombinação de

DNA, que pode facilitar o estudo detalhado da estrutura de proteínas (com alto potencial

7

terapêutico), com a possibilidade de redesenhar a estrutura para alterar a atividade

biológica.

Dependendo dos objetivos pretendidos, a desnaturação pode ser empregada

em vários graus. Enquanto na bioquímica e na biofísica a proteína é desnaturada apenas

para estudar a sua forma nativa e o seu funcionamento, na ciência e tecnologia de

alimentos a estrutura nativa tem importância relativa, conforme a necessidade do

tecnólogo ou consumidor. Graus diferenciados de desnaturação podem ser alcançados

utilizando-se de meios mecânicos, físicos ou químicos, sendo que, a combinação desses

agentes produz sempre efeitos mais drásticos e violentos do que quando usados

individualmente (Farfán, 1994).

Para a determinação da composição em aminoácidos, o método mais

utilizado é a hidrólise completa de proteínas (ruptura da ligação covalente com adição

dos elementos da água) por ação de ácidos, bases ou catalisadas por enzimas

(Harper et al., 1982).

2.2 Aminoácidos

O estudo dos aminoácidos é fundamental na nutrição humana e animal pois

estes não podem, como os vegetais, sintetizar proteínas a partir de elementos mais

simples, necessitando assim da ingestão de aminoácidos para formar suas próprias

proteínas (Andriguetto et al., 1983).

Nas proteínas são encontrados, normalmente, 20 α-aminoácidos, que

formam sua espinha dorsal. São eles: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico,

cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina,

8

metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina

(Rodwell, 1996).

Os aminoácidos são definidos como compostos orgânicos que contém grupo

ácido (carboxílico) e amínico. Constituem as unidades fundamentais das moléculas

protéicas, unindo-se pelos grupos amino e carboxílico ou a outros grupos reagentes que

contenham, e são obtidos através da hidrólise dessas moléculas. Como possuem

grupamentos COOH e NH2, apresentam propriedades ácidas e básicas ao mesmo tempo

(Andriguetto et al., 1983).

O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos é muito

importante na compreensão e análise das propriedades das proteínas. Além disso,

grande parte da arte de separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, e a

determinação da sua seqüência nas proteínas, é baseada em seu comportamento ácido-

básico (Lehninger et al., 1995).

As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de seus

grupamentos funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os α-aminogrupos, e os grupos

funcionais presentes nas diversas cadeias laterais. Entre outros aspectos importantes da

química de proteínas, o conhecimento dessas reações é muito útil para a identificação e

análise dos aminoácidos nos hidrolisados protéicos (Lehninger et al., 1995).

2.3 A análise de aminoácidos

2.3.1 Importância

A completa recuperação dos aminoácidos hidrolisados é essencial para

validar estudos de seqüência de aminoácidos, confirmar a identidade de proteínas

9

biossintéticas e oferecer dados sobre a pureza das proteínas (Lanfer Marquez, 1996;

Sales, 1994), importante na investigação de distúrbios ocasionados pela alteração dos

aminoácidos em fluídos fisiológicos (Padovan, 1994), e fundamental na nutrição

animal, onde o conhecimento exato da composição dos nutrientes contidos nas matérias

primas usadas para a fabricação das rações é de importância vital para utilizar todo o

potencial genético dos animais (Nery, 1994).

Na nutrição humana apresenta importância nas dietas especializadas, em

suporte nutricional (Petrucci, 1994), e em protocolos para rotulagem dos produtos

alimentícios destinados a crianças maiores de 1 ano e adultos (Sales, 1994).

Segundo Benson et al. (1981), a determinação acurada dos aminoácidos

presentes nas amostras é um dos tipos de análise mais importantes no catálogo

metodológico da pesquisa biológica. Para Ambler (1981), a análise de aminoácidos é

importante em diversas atividades, tais como: na nutrição, na composição e

metabolismo de alimentos; na medicina, na detecção e controle de desordens

metabólicas e investigação de fisiologia celular; na química de proteínas, na

determinação da estrutura de proteínas, no mecanismo de ação de enzimas e na

investigação da evolução celular e, ainda, em outras atividades, tais como datar sítios

arqueológicos e geológicos.

2.3.2 O método cromatográfico

A análise quantitativa e a determinação de cada aminoácido em uma mistura

complexa como o hidrolisado de uma proteína era um problema complexo, que poderia

tomar até seis meses de trabalho. Com o desenvolvimento do método cromatográfico e

sua aplicação às análises de misturas de aminoácidos foi obtido um progresso

10

significativo. Desde então, métodos analíticos baseados nesses princípios foram sendo

refinados e automatizados, permitindo, atualmente, grande velocidade, precisão e

sensibilidade (Fallon et al, 1987; Rodwell, 1996).

O método cromatográfico consiste em um sistema dinâmico de separação,

composto por dois meios: uma fase estacionária, formada por partículas sólidas ou

líquidas e uma fase móvel, que pode ser gasosa ou líquida, com a função de transportar

as moléculas componentes da amostra através do sistema cromatográfico

(Braithwaite & Smith, 1985). O suporte sólido da fase estacionária é, normalmente,

empacotado em uma coluna de vidro ou aço inoxidável, denominada de coluna

cromatográfica (Fallon et al., 1987). Durante a passagem pela coluna cromatográfica, a

mistura de componentes dissolvidos na fase móvel entra em contato com as partículas

da fase estacionária. Nesse momento ocorre uma competição entre as duas fases pelos

componentes da amostra que, dependendo das suas propriedades físicas e afinidade pela

fase estacionária, produz uma distribuição, sendo cada componente da mistura

distribuído através da fase estacionária e da fase móvel, passando assim pelo sistema

(Braithwaite & Smith, 1985).

As forças físicas e químicas que atuam sobre a mistura de componentes da

amostra e as duas fases são responsáveis pela retenção desses componentes na coluna

cromatográfica. As diferenças e a magnitude dessas forças determinam a resolução e a

separação de cada componente individual (Fallon et al., 1987).

Para Fallon et al. (1987), as forças elementares que atuam nas moléculas são

de cinco tipos: (1) Forças de dispersão ou de van der Waals atuam sobre as moléculas

causando uma distorção momentânea na sua configuração eletrostática; (2) Interações

dipolares surgem nas moléculas temporariamente distorcidas e resultam numa atração

11

eletrostática entre essas moléculas; (3) Pontes de hidrogênio ocorrem entre doadores de

prótons e receptores de prótons; (4) As interações dielétricas resultantes da atração

eletrostática entre as moléculas do soluto e solvente são constantes; (5) As interações

são eletrostáticas ou de coulomb.

O método cromatográfico foi aperfeiçoado na cromatografia de troca iônica,

que, segundo Fallon et al. (1987), foi a primeira forma de cromatografia desenvolvida

sob o novo termo de cromatografia liquida de alta eficiência.

A cromatografia de troca iônica depende da interação entre moléculas

eletricamente carregadas na fase estacionária e solutos também carregados e íons

presentes na fase móvel. Assim, as moléculas do soluto são diferenciadas em função da

diversidade de seu comportamento ácido-básico. Para esse processo, a coluna é

recheada com uma fase estacionária constituída por uma resina sintética contendo

grupos carregados positiva ou negativamente, ou seja, grupos aniônicos ou catiônicos,

respectivamente. Os aminoácidos são geralmente separados em colunas de troca de

cátions, usando como fase estacionária uma resina poliestirênica sulfonada, previamente

equilibrada com solução de hidróxido de sódio (Fallon et al., 1987; Rodwell, 1996).

Segundo Fallon et al. (1987), os principais avanços no método cromatográfico na

década de 50 foram devido às necessidades de aperfeiçoamentos nas técnicas de análise

de aminoácidos.

A automação do processo de determinação dos aminoácidos deve-se aos

trabalhos de Spackmann et al., em 1958, que desenvolveram o primeiro equipamento

com o qual era possível separar e quantificar por reação com ninidrina todos os

aminoácidos (Bazílio, 1994; Sales, 1994). Desde então, grandes avanços foram

alcançados com relação à sensibilidade, resolução, versatilidade e segurança para a

12

determinação de aminoácidos em amostras biológicas (Gehrke et al., 1985 e Zumwalt

et al., 1987).

Os principais métodos automatizados para a análise de aminoácidos da

atualidade utilizam a cromatografia de troca iônica, onde a completa separação,

identificação e quantificação requer menos de três horas (Rodwell, 1996). Os métodos

automatizados utilizam preferencialmente a reação com a ninidrina, que produz forte

coloração azul e permite a sua detecção e quantificação por colorimetria a 570 nm.

Também podem ser utilizadas reações de fluorescência, como por exemplo, a reação

com a fluorescamina (Fallon et al., 1987; Rodwell, 1996).

Um grande esforço foi feito para o desenvolvimento de metodologias para a

análise de aminoácidos por cromatografia gasosa, com a promessa de maior

sensibilidade, tempos de análise menores e a utilização de equipamentos mais versáteis,

compactos e baratos, além da possibilidade de usar a cromatografia gasosa combinada

com a espectrometria de massa, favorecendo a identificação dos compostos. A principal

desvantagem dessa metodologia, é a necessidade de transformar os aminoácidos em

derivados voláteis, através de derivatização química, o que é difícil e trabalhoso (Blau,

1981). Jennings (1980), cita que a determinação quantitativa de aminoácidos é uma das

análises mais difíceis da cromatografia gasosa, e que, um dos principais problemas são

as severas perdas que os derivados de aminoácidos termicamente lábeis sofrem durante

a etapa de volatilização.

Devido ao alto custo de manutenção dos sistemas específicos para a análise

de aminoácidos, os métodos foram modificados e adaptados para a cromatografia

líquida (CLAE) com derivatização pós-coluna com ortoftaldeído (OPA) e detecção por

fluorescência que, segundo Ashworth (1987), apresenta uma série de vantagens sobre

13

os equipamentos específicos, tais como: (1) Condições de injeção de amostras mais

simples e confiáveis; (2) o equipamento não é dedicado exclusivamente para a análise

de aminoácidos; (3) o gradiente para a separação por troca iônica requer apenas duas

soluções, que podem ser preparadas no próprio laboratório; (4) reagentes de

derivatização pós-coluna são mais baratos e mais fáceis de preparar; (5) sensibilidade de

detecção muito maior.

Apesar das vantagens atribuídas à CLAE, os analistas ainda preferem o uso

do analisador específico, pelo fato de que as amostras contendo aminoácidos livres

podem ser aplicadas direta e imediatamente, enquanto que os equipamentos de

cromatografia gasosa e CLAE freqüentemente estão ocupados com outras análises

(Blau, 1981). Kellner et al. (1994) e Fountoulakis & Lahm (1998), aprofundam a

discussão sobre as metodologias de hidrólise, técnicas de separação e outras aplicações

sobre a análise de aminoácidos, bem como sobre as suas vantagens e desvantagens.

2.3.3 A hidrólise de proteínas

Antes de separar e quantificar os aminoácidos pelos métodos

cromatográficos, necessita-se extraí-los da estrutura protéica de forma rápida e eficiente.

Para romper as pontes de peptídios das proteínas e preparar os hidrolisados para a

análise de aminoácidos são indicados três métodos principais: a hidrólise enzimática, a

hidrólise alcalina e a hidrólise ácida. Cada um deles apresenta vantagens e

desvantagens, dependendo a sua utilização dos objetivos a serem alcançados.

A utilização de enzimas para hidrolisar peptídios e proteínas apresenta

várias vantagens: 1) a atuação das enzimas é específica e quebra ligações que são

resistentes a catalisadores não específicos; 2) o método é não destrutivo, não apenas

14

para os aminoácidos comuns, mas também para os grupos lábeis; 3) Agem rapidamente

e, teoricamente, completam a hidrólise em apenas alguns minutos. Na prática, essas

vantagens são neutralizadas pelo fato de que a hidrólise catalisada por enzimas não ser,

essencialmente, tão rápida quanto outros catalisadores e, mais importante,

freqüentemente não hidrolisar completamente a proteína (Benson et al., 1981).

Em vista disso, esse método tem a sua utilização reduzida para fins

específicos, como a identificação de derivados de aminoácidos lábeis, ou outros casos

especiais (Benson et al., 1981; Kellner et al., 1994; Fountoulakis & Lahm, 1998).

A principal utilização da hidrólise alcalina para a análise de aminoácidos é

para a determinação de triptofano, sendo também empregada para o estudo de

fosfoproteínas (Kellner et al., 1994; Fountoulakis & Lahm, 1998). Esse método

apresenta como desvantagem a destruição da maioria dos aminoácidos, além de requerer

um manuseio extremamente cuidadoso pela utilização de reagentes perigosos

(Benson et al., 1981; Kellner et al., 1994).

A utilização da hidrólise ácida para a análise de aminoácidos é bastante

antiga, proveniente dos trabalhos de Braconnot em 1820, com a utilização de ácido

sulfúrico (Roach & Gehrke, 1970; Davies & Thomas, 1973; Benson et al., 1981;

Gehrke et al., 1985). Roach & Gehrke (1970) e Gehrke et al. (1985), citam que o uso do

ácido clorídrico foi introduzido por Bopp, em 1849, sendo que, a partir de então este

passou a ser o agente hidrolítico mais utilizado para a determinação da maioria dos

aminoácidos.

Ácidos minerais fortes e soluções alcalinas atacam e/ou desestabilizam as

ligações peptídicas produzindo a hidrólise da proteína, e consequentemente a liberação

dos aminoácidos (Farfán, 1994).

15

Glicina e leucina foram os primeiros aminoácidos puros obtidos através da

hidrólise ácida de proteínas, em 1820, com a utilização de ácido sulfúrico (Tristram &

Rattenbury, 1981; Benson et al., 1981). A partir de então, muitos outros agentes

hidrolíticos foram estudados, sendo que, o método de hidrólise ácida mais comumente

utilizado e reconhecido como padrão ou “método tradicional” para a análise de

aminoácidos é o método de Moore et al., de 1958, citados por Savoy et al. (1975),

Zumwalt et al. (1987), Nakazawa & Manabe (1992), Kellner et al. (1994) e

Marconi et al. (1995). Também são citadas como padrão ou clássico as modificações

acrescentadas por Moore & Stein, em 1963, citados por Phillips (1983), o trabalho de

Schram et al., de 1953, citados por Van Der Meer (1990) e Llames & Fontaine (1994),

e o método de Hirs et al., de 1954, citados por Chen et al. (1987) e Chiou &

Wang (1989), sendo que todos propõem a utilização de ácido clorídrico 6 N a 110-

120 °C durante 24 a 72 horas. A partir desses trabalhos, muitos artigos de revisão sobre

a hidrólise de proteínas foram publicados discutindo fatores tais como: a concentração e

a pureza do ácido, o tempo e a temperatura de hidrólise, a presença de carboidratos na

matriz, a presença de aldeídos e impurezas de metais, a cinética da hidrólise da proteína

e a destruição de aminoácidos (Gehrke et al., 1985; Zumwalt et al., 1987; Fountoulakis

& Lahm, 1998).

Com o intuito de acelerar o processo de hidrólise das ligações peptídicas e

liberar rapidamente os aminoácidos, estudos foram realizados utilizando enzimas

(Davies & Thomas, 1973; Benson et al., 1981), aumentando o poder do agente

hidrolítico (Tsugita & Scheiffler, 1982), utilizando aditivos e protetores (Csapó, 1983;

Phillips, 1983; Inglis, 1983; Spindler et al., 1984; Wong et al., 1984; Csapó et al., 1986;

Nakazawa & Manabe, 1992; Kellner et al., 1994; Csapó et al., 1994) e aumentando a

16

temperatura (Roach & Gehrke, 1970; Phillips, 1983; Gehrke et al., 1985; Csapó et al.,

1986; Zumwalt et al., 1987).

Dentre esses métodos, sobressaíram-se a hidrólise ácida com o uso de

aditivos e protetores, como o ácido mercaptoetanossulfônico, fenol e mercaptoetanol,

entre outros, e o aumento da temperatura de hidrólise, sendo que, apesar de obterem

relativo sucesso, inicialmente o aumento da temperatura acentuou as perdas na

recuperação de alguns aminoácidos. (Benson et al., 1981; Zumwalt et al., 1987;

Nakazawa & Manabe, 1992; Lanfer Marquez, 1996; Kellner et al., 1994; Csapó et al.,

1994).

O uso de ácido mercaptoetanossulfônico é recomendado para a

determinação de triptofano. Para a determinação dos demais aminoácidos, entretanto,

Csapó et al. (1994) citam que esse método apresenta como grande inconveniente a

redução de cistina para cisteína, que se sobrepõe à prolina no cromatograma,

produzindo resultados falsos de cistina e prolina. Fenol e/ou mercaptoetanol são

utilizados como agentes protetores para os aminoácidos lábeis, como a fenilalanina,

histidina e arginina, reduzindo, também, significativamente as perdas de tirosina

durante a hidrólise ácida (Gehrke et al., 1985; Zumwalt et al., 1987). Para a

determinação de cistina e metionina, Llames & Fontaine (1994) recomendam o uso de

pré-oxidação com ácido perfórmico e hidrólise ácida.

O aumento da temperatura de hidrólise para 145 ° C durante 4 horas

apresentou resultados comparáveis ao método de hidrólise clássica para a maioria das

amostras (Zumwalt et al., 1987). Deve-se observar que o efeito da variação do

tempo x temperatura manifesta-se nos aminoácidos mais susceptíveis à destruição

(treonina e serina), que apresentam redução em condições de 145 ° C por 6 horas,

17

enquanto que, naqueles envolvidos em ligações peptídicas mais resistentes à hidrólise,

como a valina e a isoleucina, a recuperação tem sido maior em temperaturas mais

elevadas (Lanfer Marquez, 1996).

Uma revisão atualizada sobre os agentes hidrolíticos, condições de hidrólise

e aditivos utilizados na hidrólise ácida é apresentada por Fountoulakis & Lahm em

artigo de revisão sobre a hidrólise e a análise de composição de proteínas (Fountoulakis

& Lahm, 1998).

Mas o fator decisivo na redução do tempo de hidrólise de proteínas foi a

introdução de equipamentos à base de microondas, a partir dos trabalhos de Chen et al.

(1987), possibilitando a realização em um tempo que varia desde 3 a 30 minutos (Chen

et al., 1987; Chiou & Wang, 1989; Pecavar et al., 1990; Péter et al., 1993; Gerhardt &

Maucher, 1993; Marconi et al., 1995), até 2 a 4 horas (Margolis et al., 1991). Apesar

dessa nova tecnologia apresentar, inicialmente, algumas dificuldades técnicas, como o

controle da potência e da temperatura, estudos posteriores sugeriram os ajustes

adequados e a comprovaram (Chiou & Wang, 1989; Engelhart, 1990; Margolis et al.,

1991; Péter et al., 1993; Kellner et al., 1994; Marconi et al., 1995).

2.3.4 A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas

Microondas é a faixa de radiação eletromagnética que varia entre as

frequências de 300 MHz a 300 GHz. Os equipamentos de microondas domésticos,

industriais e de laboratório usualmente operam a uma freqüência de 2.450 MHz, que é

produzida pelo gerador de microondas, também chamado de “Magnetron” (Engelhart,

1990; Margolis et al., 1991; Anton Paar, 1992).

18

Os materiais que são expostos à radiação de microondas apresentam

diferentes efeitos, dependendo do seu coeficiente dielétrico. As microondas podem ser

refletidas, como nos metais, ou transpassar, como no vidro ou nos plásticos, sem

aquecer o material. Outras substância, como a água, absorvem a energia das

microondas: moléculas polares são excitadas, causando rotação e vibração molecular,

enquanto que os íons livres se movem através do campo eletromagnético. Esses

movimentos resultam em colisões, que causam o aquecimento da substância. Os dois

mecanismos (a rotação dipolar e a condução iônica) ocorrem simultaneamente e

contribuem para o aquecimento da solução. Esse efeito pode ser usado favoravelmente

para o aquecimento rápido de meios aquosos (Engelhart, 1990; Anton Paar, 1992).

A hidrólise ácida utilizando equipamentos de microondas para a análise de

aminoácidos foi proposta por Chen et al. (1987), que utilizando aquecimento por 3 a 5

minutos em microondas, obtiveram resultado similar ao procedimento convencional de

110 °C por 24 horas. Chiou & Wang (1989), evidenciaram que a irradiação por

microondas durante 2 a 8 minutos em presença de ácido clorídrico 6 M não causa

destruição da maioria dos aminoácidos, exceto alguma degradação menor de

aminoácidos lábeis, como a serina, treonina, metionina, tirosina e histidina. Pecavar et

al. (1990), confirmam que a destruição de aminoácidos no aquecimento por microondas

num período inferior a 15 minutos é comparável ao obtido pelo aquecimento clássico.

Margolis et al. (1991), relatam estudo comparativo de hidrólise por

microondas com potência controlada para obter uma temperatura de 125 °C, de forma a

completar a hidrólise em 4 horas, afim de poder comparar o uso de microondas nessas

condições com a hidrólise em estufa a 145 °C por 2 e 4 horas. Eles concluem que a

19

hidrólise por microondas é tão ou mais rápida que o método clássico, e produz menor

destruição dos aminoácidos lábeis.

Péter et al. (1993), citam que, a uma potência de 450 W, o rendimento de

cada aminoácido após 30 minutos de aquecimento por microondas é comparável ao

obtido após 24 horas pelo aquecimento convencional.

Marconi et al. (1995), confirmam que a hidrólise de proteínas por

microondas é uma ferramenta útil e importante na pesquisa de alimentos por ser fácil de

operar, minimiza erros do operador e reduz a possibilidade de contaminação das

amostras, permite o uso de protetores, tais como o fenol e o mercaptoetanol, os

resultados obtidos são consistentes e reprodutíveis, e os cromatogramas de aminoácidos

são limpos e livres de picos ambíguos.

Entretanto, para a utilização de equipamentos de microondas na hidrólise

de proteínas foi preciso superar alguns problemas técnicos, como o ajuste de

temperatura (Kellner et al., 1994), pois os equipamentos inicialmente disponíveis eram

exclusivamente para o preparo de amostras para a análise de minerais (Marconi et al.,

1995). Pickering & Newton (1990), relatam o uso de temperaturas a 178-180 °C.

Marconi et al. (1995), utilizaram em seu estudo um equipamento de microondas

especialmente desenhado para a hidrólise de proteínas, com controle para pressão e

temperatura, e mecanismos para a produção de vácuo e atmosfera de nitrogênio no

recipiente de amostra.

20

2.4 O preparo dos hidrolisados protéicos

Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de

aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método

cromatográfico (Gehrke et al., 1985 e Zumwalt et al., 1987).

A evaporação ou não dos agentes hidrolíticos, quando da hidrólise ácida

com HCl 6N, é importante fator de discussão. Bech-Andersen et al. (1990), não

recomendam a evaporação até a secagem, pois ela provoca erros e perdas nos

aminoácidos individuais, enquanto que Van Der Meer (1990), ressalta que o alto teor de

sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, provoca

alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas.

Llames & Fontaine (1994), em trabalho colaborativo adotado como método

oficial pela AOAC INTERNATIONAL (Association of Official Analitical Chemists

International) na sua 16ª edição de 1995, para a oxidação com ácido perfórmico e

hidrólise ácida pelo método de metabissulfito de sódio, recomendam a evaporação

apenas quando a saturação de cloreto de sódio na amostra pode comprometer a coluna

de troca iônica e, consequentemente, a separação dos aminoácidos, sugerindo para esse

método a neutralização dos reagentes, enquanto que, para o método de oxidação com

ácido perfórmico – ácido hidrobromídrico e hidrólise ácida, utilizam a evaporação em

evaporador rotativo como padrão.

O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da

hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. (Roach & Gehrke,

1970; Savoy et al., 1975; Benson et al., 1981; Chen et al., 1987; Van Der Meer, 1990;

Péter et al., 1993; Lebet et al., 1994; Marconi et al., 1995) . Quando da necessidade de

21

trabalhar com grandes quantidades de amostras, passa a ser um ponto crítico pela

morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, tornando-se um ponto de

estrangulamento e demora na análise. Para aumentar a produção na evaporação de

amostras foram propostos procedimentos tais como o sistema de evaporação para 12

amostras simultâneas reportado por Phillips (1983) e Alegria Toran et al. (1996), ou

então, um multi-evaporador de amostras utilizando um bloco de aquecimento

semelhante ao utilizado para a digestão de nitrogênio/proteína para o método de

Kjeldahl, com um sistema sob fluxo de nitrogênio e aspiração a vácuo, como proposto

por Gehrke et al. (1985). Péter et al. (1993), propõe o uso de fluxo de argônio para

acelerar a evaporação do ácido clorídrico ao invés de nitrogênio.

Savoy et al. (1975), Ambler (1981) e Lanfer Marquez (1996), citam como

tratamento alternativo utilizado em muitos laboratórios, a remoção dos reagentes em

dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou

pentóxido de fósforo.

Benson et al. (1981), recomendam que deve-se evitar a evaporação em

câmaras a vácuo preferindo o uso de evaporador rotativo para evitar a formação de

compostos como reportados por Ikawa & Snell (citados por Benson et al. (1981) e

Ambler (1981)), que verificaram a transformação de ácido glutâmico e serina em O-γ-

glutamilserina. Ambler (1981), relata o uso do procedimento de evaporação em

dessecador a vácuo, à temperatura ambiente, não encontrando baixas recuperações

relacionadas à formação desses compostos. Lanfer Marquez (1996), cita ainda, que a

formação desses compostos não foi verificada posteriormente, sendo o uso de câmaras a

vácuo empregado rotineiramente em muitos laboratórios.

22

Devido a essa diversidade de procedimentos, os laboratórios geralmente

adotam métodos que melhor se adaptam à sua realidade, realizando, inclusive,

modificações para atender às suas particularidades. Assim, trabalhos colaborativos

interlaboratoriais têm encontrado dificuldade para comparar os resultados obtidos, que

normalmente apresentam grande variação, sendo uma das principais causas citadas

como fonte de erro o manuseio de amostras e preparo de hidrolisados (Lanfer Marquez,

1996).

Rodriguez-Amaya (1998), relata que autoridades internacionais sempre

recomendam o uso de métodos oficiais. O fato destes terem passado por rigorosos

estudos colaborativos interlaboratoriais é considerado atestado da sua exatidão e

precisão, portanto, da confiabilidade dos resultados. No entanto, esses métodos,

desenvolvidos e avaliados em estudos colaborativos nos países desenvolvidos, não são

facilmente adotados, e nem sempre atendem às necessidades dos países em

desenvolvimento. Cita ainda que, inevitavelmente, os métodos sofrem modificações ou

métodos alternativos são adotados. E também que, como os métodos oficiais devem ser

obrigatoriamente aprovados por estudos colaborativos trabalhosos e demorados, estes

estão sempre mais atrasados que o desenvolvimento das novas metodologias analíticas.

3 MATERIAL E MÉTODOS

Os trabalhos experimentais de laboratório envolvendo os testes de

metodologias quanto a preparo das amostras, hidrólise de proteínas e separação e

quantificação dos aminoácidos foram realizados no Laboratório de Análises Físico

Químicas, do Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves da Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária (Embrapa Suínos e Aves), em Concórdia-SC.

3.1 Amostras

Foram utilizadas amostras de milho e farelo de soja, obtidas na fábrica de

rações da Embrapa Suínos e Aves, e de um hidrolisado ácido de caseína bovina, Sigma

referência A-2427, (SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO, USA).

As amostras de milho e farelo de soja são a base da produção de rações para

alimentação animal e, além disso, representam amostras com baixo e médio teor de

proteína, respectivamente. O hidrolisado ácido de caseína bovina foi utilizado para

representar amostras com alto teor de proteína.

24

3.2 Equipamentos

A hidrólise dos aminoácidos foi realizada em estufa tipo incubadora marca

FANEM Retilínea, (FANEM Ltda, São Paulo, SP, Brasil), e equipamento de

microondas PMD Pressurized Microwave Decomposition System PAAR (ANTON

PAAR KG, Áustria).

Para a evaporação dos reagentes foi utilizado dessecador de vidro sob

vácuo, evaporador rotativo Büchi (Büchi, Switzerland) e bloco digestor de

nitrogênio/proteína marca Tecnal (TECNAL Equipamentos para Laboratórios Ltda,

Piracicaba, SP, Brasil), com capacidade para 40 tubos de 100 mililitros (mL), sob fluxo

de argônio.

Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador de

aminoácidos Beckman System 6300 (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA),

equipado com integrador HP 3390A (Hewlett-Packard Avondale Division, Avondale,

PA, USA), e em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Shimadzu modelo LC-

10AD (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan), equipado com coluna de troca iônica e

detetor de fluorescência.

3.3 Soluções e reagentes

3.3.1 Reagentes

Para a hidrólise e preparação dos hidrolisados foram utilizados os reagentes

ácido clorídrico – HCl - (Reagentes Analíticos Dinâmica, Brasil) e hidróxido de sódio –

NaOH - (Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, Brasil), ambos grau analítico. Para a

25

evaporação dos hidrolisados em bloco digestor foi utilizado argônio 4.8, grau especial

(White Martins, Osasco-SP, Brasil).

Para a separação no analisador de aminoácidos Beckman System 6300,

foram utilizadas as soluções tamponadas comerciais Na-A, Na-B, Na-D, Na-R, Na-S e

Nin-RX (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA), conforme descrito por

Slocum et al. (1987).

Para a separação por CLAE, foram utilizadas as soluções tamponadas AA-

MA, AA-MB, AA-MC, AA-RA e AA-RB (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan),

conforme o manual de instruções para a análise de aminoácidos da Shimadzu

(Shimadzu Corporation, 1993).

Foram preparadas soluções padrão contendo os seguintes aminoácidos:

ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, prolina, glicina, alanina, valina, leucina,

tirosina, fenilalanina, lisina, arginina (E. Merck, Darmstadt, Germany), serina,

norleucina (INLAB, São Paulo, Brasil), isoleucina (SIGMA Chemical Company, St.

Louis, MO, USA) e histidina (Reagentes Analíticos ECIBRA, São Paulo, Brasil), a 2,5

micromol por mililitro (µMol/mL) em HCl a 0,1 %.

3.3.2 Soluções

Solução tampão Na-A Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):

água 95 %, citrato de sódio 2 %, 2-metoxietanol 2% e ácido clorídrico 1 %.

Solução tampão Na-B Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):

água 97,8 %, citrato de sódio 1,7 % e ácido clorídrico 0,5 %.

Solução tampão Na-D Beckman (High Performance Amino Acid Analysis Buffer):

água 93 %, cloreto de sódio 5 %, citrato de sódio 1,9 % e fenol 0,1%.

26

Solução tampão Na-R Beckman (High Performance Regeneration Reagent): hidróxido

de sódio e outros reagentes não especificados.

Solução tampão de diluição Na-S pH 2,0 Beckman (High Performance Amino Acid

Sample Dilution Buffer): água 96,4 %, citrato de sódio 2 %, ácido clorídrico

1 %, tiodiglicol 0,5 % e ácido benzóico 0,1 %.

Solução tampão Nin-RX Beckman (High Performance Ninhydrin Reagent):

dimetilsulfóxido 76,7 %, água 22,5 %, acetato de lítio 0,7%, ácido acético

0,1 %, ninidrina 18 g e hidrantina 0,7 g.

Solução padrão AA-MA Shimadzu: citrato de sódio 0,20 N (ajustado para pH 3,2 com

ácido perclórico) e 7 % de etanol.

Solução padrão AA-MB Shimadzu: citrato de sódio 0,60 N e ácido bórico 0,20 M

(ajustado para pH 10,0 com hidróxido de sódio 4 M).

Solução padrão AA-MC Shimadzu: hidróxido de sódio 0,20 M.

Solução tampão AA-RA Shimadzu: solução de ácido bórico – ácido carbônico

(pH 10,0).

Solução padrão AA-RB Shimadzu (Solução reagente de orto-ftaldeído - OPA): solução

de ácido bórico – ácido carbônico (pH 10,0), 0,08 % de OPA, 1,40 % de

etanol, 0,04 % de brij-35, 0,10 % de n-acetil-l-cisteína e 0,04% de hipoclorito

de sódio.

Solução de ácido bórico – ácido carbônico: 4,07 % de carbonato de sódio, 1,36 % de

ácido bórico e 1,88 % de sulfato de potássio em água destilada.

Solução padrão de neutralização: Em balão volumétrico de 100 mL foi dissolvido

10,5 gramas de hidróxido de sódio p.a. com 90 mL de solução tampão Na-S.

27

Após resfriar até a temperatura ambiente, o volume foi completado para

100 mL com a solução tampão Na-S.

Solução padrão de norleucina 2,5 µMol/mL: Em balão volumétrico de 100 mL foi

dissolvido 32,80 mg de norleucina (SIGMA Chemical Company, St. Louis,

MO, USA), com HCl 0,1 N.

Solução padrão de norleucina 1:25: Foi evaporado 1 mL da solução padrão de

norleucina 2,5 µMol/mL, filtrada em sistema de microfiltragem Millipore

(Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) de 13 mm, com membrana de

celulose regenerada a 0,2 mícrons, marca S & S (cortado e embalado por F.

Maia S/A, Brasil). Foi recuperado com 25 mL da solução tampão de Na-S.

3.4 Métodos

3.4.1 Preparo das amostras

Todas as amostras foram finamente moídas em moinho Tecator Cyclotec

(TECATOR AB, atualmente disponível pela Perstorp Analytical Inc., Silver Spring,

USA), utilizando peneira de 0,5 mm. Foram determinados os teores de Matéria Seca

(MS) pelo método de secagem em estufa a 105 °C durante 24 horas (Brasil, 1992),

Proteína Bruta (PB) segundo o método 4.2.06 da AOAC INTERNATIONAL (AOAC

International, 1995), utilizando digestor 2020 e unidade de destilação 1026 da Tecator,

Extrato Etéreo (EE) pelo método de Soxhlet utilizando unidade de extração Soxtec

System 1040 da Tecator, e aminoácidos, exceto metionina, cistina e triptofano para

todas as amostras.

28

3.4.2 Hidrólise e preparo dos hidrolisados

Para os métodos de evaporação dos reagentes da hidrólise, descrito nos itens

3.4.2.1, 3.4.2.2 e 3.4.2.3, quantidades das amostras de milho, farelo de soja e

hidrolisado ácido de caseína, contendo aproximadamente 4 mg de proteína, foram

hidrolisados, com 1 mL de HCl 6 N durante 22 horas em estufa a 110 ± 5 °C, em

ampolas de vidro de 10 mL.

Para o método de neutralização dos reagentes da hidrólise, descrito no item

3.4.2.4., foram utilizadas quantidades das amostras de milho, farelo de soja e

hidrolisado ácido de caseína, contendo aproximadamente 40 mg de proteína, e

hidrolisadas com 10 mL de HCl 6 N durante 22 horas em estufa a 110 ± 5 °C, em

ampolas de vidro de 10 mL.

O oxigênio foi retirado através de aspiração a vácuo e fluxo de nitrogênio

(três vezes), e as ampolas com a amostra e ácido foram seladas sob vácuo e submetidas

à hidrólise.

A proporção de amostra - HCl foi de 3 a 5 mg de proteína por mL de ácido

para todos os métodos (Spitz, 1973), sendo que, para o método de neutralização foi

utilizado uma quantidade dez vezes maior de ácido e amostra para evitar perdas de

diluição.

Os métodos de preparo dos hidrolisados protéicos foram desenvolvidos da

seguinte forma:

3.4.2.1 Método 1 - Evaporação em evaporador rotativo

O ácido utilizado na hidrólise foi evaporado em evaporador rotativo sob

29

vácuo a uma temperatura de 50 °C, conforme citado por Roach & Gehrke (1970),

Savoy et al. (1975), Benson et al. (1981), Chen et al. (1987), Van Der Meer (1990),

Péter et al. (1993), Lebet et al. (1994) e Marconi et al. (1995). O evaporado foi

recuperado em 5 mL da solução de diluição Na-S Beckman e filtrado, primeiro em

papel filtro de filtragem média JP 40 marca Quanty (J. Prolab, Curitiba, Brasil) e depois

com sistema de microfiltragem Millipore em membrana de celulose regenerada de

13mm a 0,2 mícron marca S&S. O filtrado foi diluído 1:1 com a solução padrão de

norleucina redissolvida 1:25.

3.4.2.2 Método 2 - Evaporação em dessecador a vácuo

O ácido foi evaporado em dessecador a vácuo em presença de 15 g de

NaOH em pastilhas, até a completa evaporação dos reagentes da hidrólise, como citado

por Savoy et al. (1975), Ambler (1981) e Lanfer Marquez (1994). O evaporado foi

recuperado e filtrado da mesma forma do método 1, e diluído 1:1 com a solução padrão

de norleucina redissolvida 1:25.

3.4.2.3 Método 3 - Evaporação em fluxo de argônio

O ácido foi evaporado com fluxo de argônio em bloco de aquecimento a

65 °C, segundo os métodos propostos por Gehrke et al. (1985) e Péter et al. (1993). O

evaporado foi recuperado e filtrado da mesma forma do método 1, e diluído 1:1 com a

solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.

3.4.2.4 Método 4 – Neutralização

Os hidrolisados foram filtrados, primeiro em papel filtro de filtragem média

30

JP 40 marca Quanty e, depois, em sistema de microfiltragem Millipore com membrana

de celulose regenerada a 0,2 mícron e neutralizados com a solução padrão de

neutralização (na proporção de 1:2 de hidrolisado:solução padrão de neutralização). As

amostras neutralizadas foram diluídas com solução tampão de diluição Na-S Beckman

na proporção de 1:1, conforme Spitz (1973) e depois, diluídas novamente 1:1 com a

solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.

3.4.2.5 Método 5 – Microondas

Neste método, os hidrolisados foram filtrados, primeiro em papel de filtro

de filtragem média JP 40 marca Quanty e, depois, em sistema de microfiltragem

Millipore com membrana de celulose regenerada a 0,2 mícrons e neutralizados com a

solução padrão de neutralização (na proporção de 1:2 de hidrolisado:solução

neutralizante). As amostras neutralizadas foram diluídas com solução tampão de

diluição Na-S Beckman na proporção de 1:1, conforme Spitz (1973) e depois, diluídas

novamente 1:1 com a solução padrão de norleucina redissolvida 1:25.

3.4.3 Experimento 1

O experimento 1 consistiu da separação e quantificação dos aminoácidos

para todas as amostras através dos métodos 1 a 4, no analisador específico para

aminoácidos Beckman System 6300.

Foram realizadas cinco repetições para cada método e amostra, divididas em

cinco blocos, onde os blocos foram compostos por uma repetição de cada método e

amostra. Os blocos amostrais foram hidrolisados, preparados e submetidos à análise de

forma independente e em datas diferentes.

31

Os aminoácidos foram quantificados e os resultados comparados

estatisticamente, conforme descrito no item 3.6.

3.4.4 Experimento 2

O experimento 2 consistiu da separação e quantificação dos aminoácidos

para todas as amostras através dos métodos 1 a 4, por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE).

Para este teste, foram utilizadas as mesmas amostras na forma como

preparadas para o experimento 1.

3.4.5 Experimento 3

O experimento 3 consistiu em um teste experimental para verificar a

viabilidade da utilização do equipamento de microondas PMD Pressurized Microwave

Decomposition System PAAR para a hidrólise de proteínas para a análise de

aminoácidos.

Para este teste, foi utilizado apenas a amostra milho, por possuir menor teor

protéico e, teoricamente, apresentar maior dificuldade de hidrólise pela presença de

possíveis interferentes.

Desse modo, para cada análise, foram utilizadas quantidades de 30 a 50 mg

da amostra milho, que foram submetidos à hidrólise em 8 mL de ácido clorídrico (HCl)

6 N, conforme proposto por Marconi et al. (1995).

Este experimento foi desenvolvido em duas fases; a primeira consistiu de

um teste para determinar os tempos e potências em que a hidrólise foi completa,

utilizando-se as potências 2, 4, 6, 8 e 10 (de uma escala de 2 a 12), e tempos de 1, 2, 4,

32

8, 16 e 32 minutos para cada fator de potência. Na segunda fase, para os fatores de

potência que apresentaram maior eficiência, foram repetidas as análises em unidades de

tempo onde o teor total dos aminoácidos recuperados foi mais elevado, com o objetivo

de identificar o melhor tempo de hidrólise.

Os hidrolisados assim obtidos, foram filtrados em sistema de microfiltragem

Millipore, com membrana de celulose regenerada a 0,2 mícrons e diluídos em solução

padrão de neutralização, conforme Spitz (1973), e os aminoácidos separados e

quantificados em analisador de aminoácidos Beckman System 6300.

3.4.6 Experimento 4

O experimento 4 consistiu da comparação entre os resultados obtidos nos

experimentos 1 e 2.

3.4.7 Condições cromatográficas

Para todos os experimentos, as condições cromatográficas para a separação

e detecção dos aminoácidos foram as seguintes:

3.4.7.1 Analisador de aminoácidos Beckman System 6300

O analisador de aminoácidos Beckman System 6300 foi utilizado segundo o

método padrão Na-A, -B, -D, para coluna de troca iônica de sódio Beckman de 25 cm,

como descrito por Slocum et al. (1987), parcialmente modificado, como segue:

Parâmetros de análise:

Soluções:

B1 (Na-A) aos 52 minutos.

33

B2 (Na-B) aos 16,2 minutos.

B3 (Na-D) aos 27,4 minutos.

B6 (Na-R) aos 51 minutos.

Solvente (H2O) aos 50 minutos.

Reagente (Nin-RX) aos 53 minutos.

Temperatura da coluna:

T1 - 50 °C aos 36 minutos.



Outros parâmetros:

Leitura de dados (Rd) aos 52 minutos.

Final de análise (Rc) aos 57 minutos.

Gradiente de aquecimento da coluna = 1 °C/min.

Fluxo das soluções tamponadas = 20 mL/h.

Fluxo do reagente = 10 mL/h.

Volume de injeção = 50 µL.

3.4.7.2 CLAE

O cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Shimadzu LC-10AD foi

utilizado segundo o manual para a análise de aminoácidos do equipamento

(SHIMADZU CORPORATION, 1993), para coluna de troca iônica de sódio Shimadzu

Shim-pack Amino-Na de 4,6 x 100 mm, como segue:

34

Parâmetros de análise:

Soluções:

A (AA-MA) pH 3,0.

B (AA-MB) pH 10,0.

C (AA-MC) NaOH 10M.

Reagente A - OPA - (AA-RA).

Reagente B (AA-RB).

Temperatura da coluna: 60 °C.

Fluxo: 0,6 mL/min.

Gradiente de pH:

100 % da solução A até 09 minutos.

7 % da solução B aos 13 minutos.

8 % da solução B aos 17,2 minutos.







100 % da solução C aos 29,01 minutos.

100 % da solução A aos 35 minutos.

Fim da análise aos 59 minutos.

Volume de injeção = 50 µL.

35

3.5 Determinação do teor de aminoácidos

O teor de cada aminoácido presente nas amostras foi calculado utilizando-se

a equação (1).

PM . Sa . a . V2 . V4 . 100

Aminoácido (%) = -------------------------------------------- . fc (1)

Sp . V1 . V3 . pa . 1000

Onde:

PM - Peso molecular do aminoácido.

Sa - Área do pico do aminoácido na amostra.

Sp - Área do pico do aminoácido no padrão.

a - Número de micromoles do aminoácido no padrão.

V1 - Volume injetado da amostra (0,05 mL).

V2 - Volume redissolvido da amostra em mL.

V3 - Volume evaporado da amostra em mL.

V4 - Volume hidrolizado da amostra em mL.

pa - peso da amostra em mg.

fc - fator de correção do padrão interno norleucina, calculado pela

equação (2).

Sp (Norleucina)

fc = ------------------------ (2)

Sa (Norleucina)

36

3.6 Análise estatística

Nas análises estatísticas foi utilizado o sistema estatístico SAS (Statistical

Analysis System), versão 6.12 para Microsoft Windows 95 (SAS Institute Inc., 1996).

3.6.1 Experimentos 1 e 2

O modelo utilizado para esses experimentos foi para a análise de um

experimento fatorial de 4 x 3, onde 4 são os níveis do fator métodos e 3 são os níveis do

fator amostras, de acordo com Steel & Torie (1981).

Esse modelo está caracterizado conforme a equação (3):

Yijk = µ + mi + aj + maij + eijk (3)

Onde:

i = 1, 2, 3 e 4 métodos;

j = 1, 2 e 3 amostras;

k = 1, ..., 5 repetições de cada combinação;

yijk = valor da resposta analisada na k-ésima repetição pertencente ao método

“i” e amostra “j”;

µ = média da resposta no experimento;

mi = efeito do método “i”;

aj = efeito da amostra “j”;

maij = efeito da interação método x amostra;

37

eijk = erro laboratorial não observável, suposto seguir a distribuição de

probabilidade normal, com média 0 (zero) e variância constante; isto

é: eijk ∼ N (0, σ2).

O modelo fatorial foi adotado com a finalidade de melhorar a precisão das

estimativas e dos testes das hipóteses, pois proporciona maior número de repetições,

nos casos em que não ocorre interação entre métodos e amostras.

Este modelo foi aplicado, inicialmente, a um vetor de respostas envolvendo

15 aminoácidos: ácido aspártico (Asp), treonina (Tre), serina (Ser), ácido glutâmico

(Glu), prolina (Pro), glicina (Gli), alanina (Ala), valina (Val), isoleucina (Ile), leucina

(Leu), tirosina (Tir), fenilalanina (Fen), histidina (His), lisina (Lis) e arginina (Arg),

para o qual foi realizado uma análise multivariada. Posteriormente, o mesmo modelo foi

aplicado para cada aminoácido individualmente, em uma análise univariada, cuja

finalidade é conhecer individualmente os resultados de cada aminoácido.

Na análise multivariada foi determinado, complementarmente, as duas

primeiras funções discriminantes canônicas de Fisher, formadas por:

Can1 = a1 x Asp + a2 x Tre + ... + a15 x Arg

Can2 = b1 x Asp + b2 x Tre + ... + b15 x Arg

Essas funções têm como finalidade permitir a transformação do vetor de

respostas da dimensão 15 para a dimensão 2, possibilitando uma visualização gráfica

para a comparação entre métodos e amostras envolvendo simultaneamente a análise de

todos os aminoácidos.

38

A determinação dessas funções é obtida de modo que a perda de informação

em relação ao total dos 15 aminoácidos seja mínima.

Nas análises estatísticas foram testadas as seguintes hipóteses:

1 – Comparação entre métodos, independente de amostras;

2 – Comparação de amostras, independente de métodos;

3 – Interação métodos x amostras;

4 – Comparação entre métodos de evaporação, independente de amostras;

5 – Teste de contraste entre métodos de evaporação versus método de neutralização,

independente de amostras;

6 – Comparações múltiplas entre métodos, independente de amostras;

7 – Em casos de interação métodos x amostras, foram testadas as hipóteses 1, 4, 5 e 6

dentro de cada amostra.

A análise multivariada das hipóteses foi realizada por 4 (quatro) testes

simultâneos, sobre os resultados analíticos sem qualquer censura:

1 – Teste de Wilks ou da máxima verossimilhança;

2 – Teste de Pillai;

3 – Teste de Hotteling-Lawley;

4 – Teste de Roy.

Guidoni (1997), descreve a conceituação elementar dos métodos, o

significado dos parâmetros estatísticos e as respectivas fórmulas de cálculo.

A hipótese foi considerada como rejeitada quando pelo menos um dos testes

mostrou significância (P < 0,05).

Nas análises univariadas, essas mesmas hipóteses foram submetidas ao teste

F. No caso de comparações múltiplas, foram submetidas ao teste T, protegido pela

39

significância do teste F global. Para essas análises os dados foram censurados, através

de dupla eliminação, adotando-se como regra um coeficiente de variação (CV) máximo

de 10 % para cada variável.

Embora o modelo leve em consideração o efeito de amostras, elas não foram

comparadas pelo fato de que são sabidamente diferentes. Mesmo assim, este modelo foi

adotado com o objetivo de maximizar a precisão experimental, sendo que, as

comparações das hipóteses 1, 4, 5 e 6 para cada amostra são desdobramentos do modelo

global (Cochram & Cox, 1979).

3.6.2 Experimentos 3 e 4

Para esse experimento foi realizada uma análise exploratória dos dados, que

foram relativizados, dividindo-se o teor recuperado de cada aminoácido com o valor

médio obtido pelo método 4 do experimento 1 para a amostra milho, o qual foi

considerado como 100 %.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análise de composição química

Nas amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram

determinados os teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo

(EE) e matéria mineral (Cinzas), cujos resultados são apresentados na Tabela 01, em

g/100g da amostra com base na matéria natural. A composição em aminoácidos para

todas as amostras e métodos estudados, em valores médios, independentemente de

metodologia, são apresentados no Quadro 01, em g/100g da amostra com base na

matéria natural.

Tabela 01. Teores de matéria seca total (MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE) e

matéria mineral (Cinzas)(1) nas amostras utilizadas nos experimentos, em


Amostras

MS

(g/100g)

PB(2)

(g/100g)

EE

(g/100g)

Cinzas

(g/100g)

Milho 91,56 7,13 3,92 0,97

Farelo de Soja 91,03 42,11 1,33 6,00

Caseína 96,62 81,34 0,31 2,12

(1) Média de 3 repetições.(2) Valores calculados pelo fator de conversão de nitrogênio para proteína de 5,72 para o

milho, 5,70 para o farelo de soja e 6,38 para o hidrolisado ácido de caseína (Dintzis et

al., 1988; Sosulski & Imafidon, 1990; Yamaguchi, 1992).

41

Quadro 01. Composição em aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e

hidrolisado ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e

CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural.

Milho Farelo de Soja Caseína

Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Asp 0,45±0,01 0,48±0,01 4,85±0,04 6,22±0,10 3,47±0,06 3,77±0,11

Tre 0,24±0,00 0,26±0,01 1,64±0,01 1,75±0,03 2,36±0,04 2,51±0,07

Ser 0,31±0,00 0,35±0,01 2,07±0,02 2,41±0,04 1,58±0,03 1,74±0,05

Glu 1,23±0,01 1,59±0,04 7,60±0,06 10,01±0,19 16,07±0,26 23,48±1,01

Pro 0,49±0,01 0,66±0,02 1,84±0,05 2,29±0,04 9,32±0,21 11,21±0,29

Gli 0,26±0,00 0,30±0,01 1,80±0,01 2,14±0,04 1,70±0,03 1,80±0,05

Ala 0,48±0,01 0,53±0,02 1,75±0,02 1,79±0,07 5,15±0,08 6,20±0,26

Val 0,31±0,01 0,33±0,01 1,87±0,04 1,84±0,08 5,82±0,09 6,19±0,23

Ile 0,32±0,01 0,35±0,01 2,72±0,06 3,00±0,05 6,14±0,10 7,13±0,16

Leu 0,79±0,01 0,93±0,02 3,13±0,03 3,50±0,05 7,00±0,10 8,31±0,24

Tir 0,18±0,00 0,17±0,01 1,43±0,01 1,59±0,04 2,69±0,05 2,64±0,16

Fen 0,32±0,00 0,33±0,01 2,14±0,02 2,29±0,03 3,40±0,05 3,59±0,18

His 0,20±0,00 0,22±0,00 1,06±0,01 1,22±0,02 2,00±0,03 2,43±0,07

Lis 0,21±0,00 0,22±0,00 2,52±0,02 2,68±0,04 7,11±0,11 7,33±0,28

Arg 0,29±0,00 0,30±0,01 2,99±0,03 3,18±0,05 2,63±0,04 2,65±0,15

Total 6,08±0,01 7,02±0,01 39,41±0,03 45,89±0,06 76,44±0,09 90,98±0,22

O perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado

ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e CLAE, nos dados não

censurados, em g/100g de proteína com base na matéria natural é apresentado no

Quadro 02.

42

Quadro 02. Perfil de aminoácidos das amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado

ácido de caseína, obtidas em analisador específico Beckman e CLAE, nos

dados não censurados, em g/100g de proteína com base na matéria natural.


Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Beckman

(g/100g)

CLAE

(g/100g)

Asp 6,31 6,73 11,52 14,77 4,27 4,63

Tre 3,37 3,65 3,89 4,16 2,90 3,09

Ser 4,35 4,91 4,92 5,72 1,94 2,14

Glu 17,25 22,30 18,05 23,77 19,76 28,87

Pro 6,87 9,26 4,37 5,44 11,46 13,78

Gli 3,65 4,21 4,27 5,08 2,09 2,21

Ala 6,73 7,43 1,16 4,25 6,33 7,62

Val 4,35 4,63 4,44 4,37 7,16 7,61

Ile 4,49 4,91 6,46 7.12 7,55 8,77

Leu 11,08 13,04 7,43 8,31 8,61 10,22

Tir 2,52 2,38 3,40 3,78 3,31 3,25

Fen 4,49 4,63 5,08 5,44 4,18 4,41

His 2,81 3,09 2,52 2,90 2,46 2,99

Lis 2,95 3,09 5,98 6,36 8,74 9,01

Arg 4,07 4,21 7,10 7,55 3,23 3,26

Total 85,29 98,47 90,59 120,90 93,99 111,86

Os valores mínimos e máximos para cada aminoácido, independente de

método, obtidos nas amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína,

em analisador específico Beckman e CLAE, nos dados não censurados, em g/100g da

amostra com base na matéria natural são apresentados nos Quadros 03 e 04,

43

respectivamente. Os valores mínimos e máximos obtidos em cada método nas mesmas

amostras e equipamentos são apresentados nos Anexos 01 a 06.

Quadro 03. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, independente

de método, nos dados não censurados, para as amostras de milho, farelo de

soja e hidrolisado ácido de caseína, em g/100g da amostra com base na

matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman System 6300.


Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Asp 0,39 0,48 4,47 5,24 2,51 3,80

Tre 0,23 0,27 1,56 1,76 1,72 2,51

Ser 0,28 0,34 1,97 2,19 1,09 1,72

Glu 1,11 1,37 7,08 8,22 11,55 17,64

Pro 0,42 0,59 1,46 2,32 6,70 11,04

Gli 0,24 0,30 1,69 1,95 1,23 1,83

Ala 0,44 0,53 1,55 1,88 3,94 5,61

Val 0,26 0,35 1,50 2,16 4,66 6,68

Ile 0,26 0,37 2,07 3,10 4,87 7,09

Leu 0,71 0,86 2,86 3,39 5,28 7,51

Tir 0,15 0,21 1,37 1,57 1,89 2,92

Fen 0,29 0,34 1,95 2,29 2,52 3,66

His 0,18 0,23 1,01 1,13 1,43 2,13

Lis 0,19 0,25 2,36 2,69 5,26 7,73

Arg 0,25 0,33 2,84 3,30 1,93 2,89

44

Quadro 04. Valores máximos e mínimos obtidos para cada amostra, independente de

método, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural, para CLAE.


Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Mínimo

(g/100g)

Máximo

(g/100g)

Asp 0,40 0,56 5,38 7,12 2,93 4,68

Tre 0,22 0,31 1,50 1,92 1,81 2,86

Ser 0,29 0,41 1,97 2,64 1,22 2,08

Glu 1,30 1,95 8,46 11,35 16,85 35,73

Pro 0,56 0,83 2,03 2,59 8,53 12,76

Gli 0,25 0,38 1,79 2,46 1,40 2,26

Ala 0,37 0,72 1,13 2,19 4,45 8,05

Val 0,26 0,40 1,23 2,37 4,68 7,99

Ile 0,26 0,42 2,56 3,43 5,68 7,94

Leu 0,78 1,09 2,98 3,81 6,25 10,07

Tir 0,13 0,21 1,26 1,83 0,00 3,28

Fen 0,30 0,39 2,09 2,49 0,81 4,21

His 0,19 0,25 1,06 1,34 1,72 2,82

Lis 0,19 0,25 2,41 3,06 3,39 8,52

Arg 0,25 0,36 2,81 3,67 0,34 3,16

4.2 Experimentos 1 e 2

Os resultados obtidos para o experimento 1 (separação e quantificação dos

aminoácidos para todos os métodos e amostras através de analisador de aminoácidos

Beckman) e para o experimento 2 (separação e quantificação através de CLAE), foram

45

analisados estatisticamente em duas etapas, na primeira através de uma análise

multivariada utilizando-se as informações sem qualquer censura e na segunda, por meio

de uma análise univariada, com os dados censurados através de dupla eliminação,

utilizando-se como regra a eliminação do valor discrepante quando o coeficiente de

variação entre as repetições de cada variável foi maior que 10 %.

Os resultados médios para os aminoácidos: ácido aspártico (Asp), treonina

(Tre), serina (Ser), ácido glutâmico (Glu), prolina (Pro), glicina (Gli), alanina (Ala),

valina (Val), isoleucina (Ile), leucina (Leu), tirosina (Tir), fenilalanina (Fen), histidina

(His), lisina (Lis) e arginina (Arg), encontrados para cada método, independentemente

de amostra, determinados em cada experimento são apresentados nos Anexos 07 e 08

para o analisador específico Beckman e CLAE, respectivamente.

Para a ilustração gráfica do vetor de médias, resultante da análise

multivariada, foram determinadas as duas primeiras funções discriminantes canônicas

de Fisher, formadas pelas equações (4) e (5), para o experimento 1, contendo 99,67 %

da quantidade total de informação:

Can1 = -8,186237 x Asp + 8,8200454 x Tre - 23,70557 x Ser + 4,6620632 x Glu (4)

+ 0,3757758 x Pro - 12,63843 x Gli - 0,127842 x Ala + 1,1759527 x Val

- 0,527894 x Ile + 7,6863718 x Leu - 6,375552 x Tir + 7,4549017 x Fen

- 1,005684 x His - 7,630186 x Lis - 3,222784 x Arg

Can2 = +7.3820202 x Asp + 15.562379 x Tre + 1.0268628 x Ser + 0.1226787 x Glu (5)

+ 1.4469548 x Pro - 35.27413 x Gli - 2.633601 x Ala + 9.8396676 x Val

- 7.311142 x Ile - 4.715367 x Leu - 6.643439 x Tir + 7.0742442 x Fen

- 10.14193 x His + 4.5161321 x Lis + 9.6178412 x Arg

46

e das equações (6) e (7), para o experimento 2, contendo 99,13 % da quantidade total de

informação:

Can1 = -3.668083 x Asp - 17.24707 x Tre + 4.7682632 x Ser + 0.5602176 x Glu (6)

- 0.466001 x Pro - 3.227726 x Gli - 1.525742 x Ala + 3.4895624 x Val

- 1.243465 x Ile + 2.8794588 x Leu + 3.7474366 x Tir - 6.621929 x Fen

+ 12.32277 x His + 3.7371878 x Lis - 5.016319 x Arg

Can2 = +1.8674307 x Asp - 18.98067 x Tre + 13.766842 x Ser + 0.3610235 x Glu (7)

- 2.110563 x Pro - 5.838949 x Gli - 0.919838 x Ala + 1.5003894 x Val

+ 13.892248 x Ile - 3.940527 x Leu - 0.112246 x Tir -2.099717 x Fen +

3.2800832 x His + 0.8069744 x Lis - 2.943403 x Arg

Independentemente de amostra, para os 15 aminoácidos citados, analisados

em conjunto, através do vetor de médias, os métodos mostraram-se diferentes para

ambos os experimentos, apresentando interação entre métodos e amostras (P < 0,05). Os

resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância envolvendo os

métodos, amostras e a interação métodos x amostras são apresentados na Tabela 02,

para o analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.

Devido à presença de interação entre métodos e amostras, todas as hipóteses

foram testadas quanto ao seu comportamento para cada amostra, individualmente.

Para a amostra milho não foi evidenciada a presença de diferenças entre os

métodos, tanto para o analisador específico quanto para CLAE. Os resultados médios

para cada método são apresentados nos Anexos 09 e 10, para cada equipamento. As

Figuras 02 e 03 mostram a visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis

canônicas Can1 e Can2, e os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de

47

significância envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, para a

amostra milho são apresentados na Tabela 03, para ambos os equipamentos.

Tabela 02. Nível mínimo de significância, envolvendo os métodos, amostras e a

interação métodos x amostras (P < 0,05), através dos testes de Wilks,

Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, independente de amostra, no analisador de

aminoácidos Beckman e CLAE.

Fonte de variação GL Wilks Pillai Hotteling-

Lawley

Roy

Analisador Beckman

Métodos 3 0,0072 0,0368 0,0009 0,0001

Amostras 2 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Interação Métodos x Amostras 6 0,5378 0,5915 0,4998 0,0032

CLAE

Métodos 3 0,0001 0,0008 0,0001 0,0001

Amostras 2 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Interação Métodos x Amostras 6 0,0804 0,2584 0,0156 0,0001

Para a amostra farelo de soja verificou-se a existência de diferenças entre os

métodos (P < 0,05), para ambos os equipamentos. Os métodos de evaporação não

diferiram entre si, enquanto que, pela análise de contraste diferiram do método de

neutralização dos reagentes da hidrólise, com exceção do método 3, que não apresentou

diferenças. Os resultados médios para cada método são apresentados no Anexo 11 para

o analisador Beckman e Anexo 12 para CLAE. As Figuras 04 e 05 mostram a

visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis canônicas Can1 e Can2

para esta amostra.

48

12

3

4

5

6

79

11

12

1314

15

16

17

19

8

10

18

1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Cis 9 – Val

10 – Met 11 – Ile 12 – Leu 13 – Nor 14 – Tir 15 – Fen 16 – His 17 – Lis 18 – Amn 19 - Arg

Figura 01. Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em analisador BeckmanSystem 6300. 1 – Ácido aspártico (Asp), 2 – Treonina (Tre), 3 – Serina(Ser), 4 – Ácido glutâmico (Glu), 5 – Prolina (Pro), 6 – Glicina (Gli), 7 -Alanina (Ala), 8 – Cistina (Cis), 9 – Valina (Val), 10 – Metionina (Met),11 – Isoleucina (Ile), 12 - Leucina (Leu), 13 – Norleucina (Nor), 14 –Tirosina (Tir), 15 – Fenilalanina (Fen), 16 – Histidina (His), 17 Lisina(Lis), 18 – Amônia (Amn) e 19 - Arginina (Arg).

Tabela 03. Nível mínimo de significância, envolvendo diferentes hipóteses

multivariadas sobre os métodos (P > 0,05), através dos testes de Wilks,

Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra milho, no analisador de



Lawley

Roy

Métodos Beckman 3 1,0000 1,0000 1,0000 0,9994

Métodos CLAE 3 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000

49

-2,0

-1,5

-1,0

-3,0 -2,5 -2,0

Can2

Can

1

Método 1 Método 2 Método 3 Método 4

Figura 02. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra milho, para o analisador de aminoácidos Beckman(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3:fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

-2,5

-2,0

-1,5

-2,0 -1,5 -1,0

Can2

Can

1


Figura 03. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra milho, para CLAE (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).

50

-60,5

-60,0

-59,5

-59,0

16,8 17,3 17,8 18,3 18,8 19,3

Can2

Can

1


Figura 04. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra farelo de soja, para o analisador de aminoácidosBeckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo;Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

-37

-36

-35

-34

-33

-32

-31

16,5 17,5 18,5 19,5 20,5

Can2

Can

1


Figura 05. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra farelo de soja, para CLAE (Método 1: evaporadorrotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio;Método 4: neutralização).

51

Figura 06. Aminograma do padrão de aminoácidos, obtido em CLAE.

Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância

envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, para a amostra

farelo de soja são apresentados na Tabela 04.

Para a amostra hidrolisado ácido de caseína os métodos mostraram-se

diferentes, em ambos os equipamentos, com exceção dos métodos 3 e 4, para o

analisador Beckman, que não diferiram entre si. Os resultados médios para cada método

são apresentados nos Anexos 13 e 14, para o analisador Beckman e CLAE,

respectivamente.

As Figuras 07 e 08 mostram a visualização gráfica dos vetores de médias

entre as variáveis canônicas Can1 e Can2 e os resultados estatísticos indicando o nível

mínimo de significância envolvendo as diferentes hipóteses multivariadas sobre os

52

métodos são apresentados na Tabela 05, para os resultados obtidos em ambos os

equipamentos.


multivariadas sobre os métodos (P < 0,05), através dos testes de Wilks,

Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra farelo de soja, no analisador

de aminoácidos Beckman e CLAE.


Lawley

Roy

Analisador Beckman

Métodos 3 0,1501 0,3989 0,0342 0,0001

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,7187 0,7676 0,6709 0,1394

Métodos 1,2 e 3 x Método 4 1 0,0030 0,0030 0,0030 0,0030

Método 1 x 4 1 0,0094 0,0094 0,0094 0,0094

Método 2 x 4 1 0,0016 0,0016 0,0016 0,0016

Método 3 x 4 1 0,4095 0,4095 0,4095 0,4095

CLAE

Métodos 3 0,0869 0,2882 0,0140 0,0001

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,5276 0,5609 0,4984 0,1109


Método 1 x 4 1 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003

Método 2 x 4 1 0,0217 0,0217 0,0217 0,0217

Método 3 x 4 1 0,4085 0,4085 0,4085 0,4085

53

11,4

11,9

12,4

12,9

26 27 28 29 30

Can2

Can

1


Figura 07. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para o analisador deaminoácidos Beckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmarassob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

9,8

10,3

10,8

11,3

11,8

12,3

22 23 24 25 26 27 28

Can2

Can

1


Figura 08. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, da amostra hidrolisado ácido de caseína, para CLAE (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização).

54


multivariadas sobre os métodos (P < 0,05), através dos testes de Wilks,

Pillai, Hotteling-Lawley e Roy, para a amostra hidrolisado ácido de caseína,

no analisador de aminoácidos Beckman e CLAE.


Lawley

Roy

Analisador Beckman

Métodos 3 0,0001 0,0002 0,0001 0,0002

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0002 0,0002 0,0003 0,0005


Método 1 x 2 1 0,0017 0,0017 0,0017 0,0017

Método 1 x 3 1 0,0470 0,0470 0,0470 0,0470

Método 1 x 4 1 0,0310 0,0310 0,0310 0,0310

Método 2 x 3 1 0,0022 0,0022 0,0022 0,0022

Método 2 x 4 1 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004

Método 3 x 4 1 0,4493 0,4493 0,4493 0,4493

CLAE

Métodos 3 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0005 0,0026 0,0001 0,0001


Método 1 x 2 1 0,0851 0,0851 0,0851 0,0851

Método 1 x 3 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 1 x 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 2 x 3 1 0,0220 0,0220 0,0220 0,0220

Método 2 x 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 3 x 4 1 0,0021 0,0021 0,0021 0,0021

55

9 – Ile 10 – Leu 11 – Nor 12 – Tir 13 – Fen 14 – His 15 – Lis 16 - Arg

1 – Asp 2 – Tre 3 – Ser 4 – Glu 5 – Pro 6 – Gli 7 – Ala 8 – Val

1

2

34

5

6 7

8 9

10

1112

13

14

15

16

Figura 09. Aminograma da amostra milho, obtido em analisador Beckman System

6300.

Embora exista interação entre métodos e amostras, quando analisados

independentemente de amostras os métodos 1 e 2 diferiram do método 4, para ambos os

equipamentos. O método 3 diferiu apenas do método 2 para o analisador Beckman. Para

CLAE, o método 3 não apresentou diferenças em relação ao método 2, diferindo dos

demais. Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância envolvendo

as diferentes hipóteses multivariadas sobre os métodos, independentemente de amostra

e da interação métodos x amostras são apresentados no Anexo 15. As Figuras 10 e 11

mostram a visualização gráfica dos vetores de médias entre as variáveis canônicas Can1

e Can2.

56

-16,7

-16,2

-15,7

13 14 15 16

Can2

Can

1


Figura 10. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, independente de amostra, para o analisador de aminoácidosBeckman (Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo;Método 3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

-10

-9

-8

-7

12 13 14 15 16

Can2

Can

1


Figura 11. Visualização gráfica do vetor de médias entre as variáveis canônicas Can1e Can2, independente de amostra, para CLAE (Método 1: evaporadorrotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio;Método 4: neutralização).

57

Figura 12. Aminograma da amostra milho, obtido em CLAE.



101

2

3 4

5

6

7

8

9

1112

13

14

15

16

Figura 13. Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em analisador Beckman

System 6300.

58

Figura 14. Aminograma da amostra farelo de soja, obtido em CLAE.



16

1

2

3

4

5

6

7

89

10

1112

13

14

15

Figura 15. Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em

analisador Beckman System 6300.

59

Figura 16. Aminograma da amostra hidrolisado ácido de caseína, obtido em CLAE.

Para identificar os aminoácidos responsáveis por essas variações, foi

realizado uma análise univariada para cada variável, cujos resultados são discutidos a

seguir.

Devido à alta variabilidade encontrada nos resultados obtidos utilizando

CLAE, após a dupla eliminação, os dados remanescentes não foram suficientes para

realizar a análise univariada para o experimento 2. Assim, para essas informações foi

realizada apenas a análise estatística multivariada. As possíveis causas dessa

variabilidade são discutidas no item 4.4.

Para o analisador de aminoácidos Beckman, a análise univariada mostrou a presença de

interação métodos x amostras (P < 0,05) para a treonina, serina, tirosina, fenilalanina e

lisina, esta a um nível de 5,20 %, sendo que, para a treonina e a serina os métodos

também resultaram diferentes. Para todos os demais aminoácidos não foi evidenciado

diferenças.

60

Para a treonina e serina foi observado diferença entre os métodos para as amostras de

farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína, enquanto que, para a tirosina, fenilalanina

e lisina os métodos resultaram diferentes apenas para a amostra hidrolisado ácido de

caseína. Para a amostra milho não foram encontradas diferenças entre os métodos.

Os resultados estatísticos indicando o nível mínimo de significância

envolvendo as diferentes hipóteses sobre os métodos, e os teores médios para cada

aminoácido, nos dados censurados, são apresentados nos Anexos 16 à 45.

O teor dos aminoácidos treonina, serina, tirosina, fenilalanina e lisina, nas

amostras farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína em g/100g da amostra na matéria

natural, determinados para cada método, são apresentados graficamente nas Figuras 17

a 23, através de seus valores médios.

1,50

1,55

1,60

1,65

1,70

1,75

Metodo 1 Método 2 Método 3 Método 4

Métodos

Tre

onin

a (g

/100

g)

Figura 17: Visualização gráfica do teor de treonina, determinado para cada métodona amostra farelo de soja, utilizando o analisador de aminoácidosBeckman, em g/100g da amostra na matéria natural (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização).

61

1,90

1,95

2,00

2,05

2,10

2,15

2,20


Métodos

Seri

na (g

/100

g)

Figura 18. Visualização gráfica do teor de serina, determinado para cada método naamostra farelo de soja, utilizando o analisador de aminoácidos Beckman,em g/100g da amostra na matéria natural (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).

2,20

2,25

2,30

2,35

2,40

2,45

2,50


Métodos

Tre

onin

a (g

/100

g)

Figura 19. Visualização gráfica do teor de treonina, determinado para cada métodona amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

62

1,45

1,50

1,55

1,60

1,65

1,70


Métodos

Seri

na (g

/100

g)

Figura 20. Visualização gráfica do teor de serina, determinado para cada método naamostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

2,55

2,60

2,65

2,70

2,75

2,80

2,85


Métodos

Tir

osin

a (g

/100

g)

Figura 21. Visualização gráfica do teor de tirosina, determinado para cada métodona amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

63

3,25

3,30

3,35

3,40

3,45

3,50

3,55


Métodos

Feni

lala

nina

(g/1

00g)

Figura 22. Visualização gráfica do teor de fenilalanina, determinado para cadamétodo na amostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisadorde aminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

6,80

6,90

7,00

7,10

7,20

7,30

7,40


Métodos

Lis

ina

(g/1

00g)

Figura 23. Visualização gráfica do teor de lisina, determinado para cada método naamostra hidrolisado ácido de caseína, utilizando o analisador deaminoácidos Beckman, em g/100g da amostra na matéria natural(Método 1: evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método3: fluxo de argônio; Método 4: neutralização).

64

Para essas variáveis, o método de neutralização dos reagentes da hidrólise

(método 4) mostrou-se mais eficiente, apresentando a maior recuperação, com exceção

da lisina para a amostra hidrolisado ácido de caseína, onde foi mais eficiente o método

de evaporação em evaporador rotativo (método 1). Para a fenilalanina o método 1

também apresentou maior valor de recuperação, porém, estatisticamente não foi

diferente do método 4. O método de evaporação em câmaras a vácuo (método 2)

apresentou menor recuperação para os aminoácidos treonina, serina e tirosina, enquanto

que o método de evaporação por aquecimento sob fluxo de argônio (método 3)

apresentou menor recuperação para fenilalanina e lisina. Na Figura 24 essas diferenças

são visualizadas através dos valores relativos para a treonina, serina, tirosina,

fenilalanina e lisina, calculados a partir da média de cada método pela média geral para

a amostra hidrolisado ácido de caseína.

Baixas recuperações para esses aminoácidos também foi relatado por Lanfer

Marquez (1996), citando ainda, que os aminoácidos treonina e serina são os mais

susceptíveis à destruição por calor, e que a tirosina, fenilalanina, lisina e arginina

também apresentam problemas de recuperação. Essas perdas geralmente são associadas

ao tempo e temperatura da hidrólise, também citadas por Phillips (1983), Gehrke et al.

(1985), Bech-Andersen et al. (1990), Lanfer Marquez (1996) e Marconi et al. (1995).

Para este teste, as condições de tempo e temperatura de hidrólise

permaneceram constantes para todos os métodos e amostras, sugerindo outras

possibilidades de perdas, após a hidrólise ácida, quando os aminoácidos livres ainda

podem reagir, durante o preparo dos hidrolisados protéicos ou no armazenamento, como

observado por Ambler (1981).

65

0,95

0,97

0,99

1,01

1,03

1,05

Tre Ser Tir Fen Lis

Aminoácidos

Val

or re

lativ

o


Figura 24. Visualização gráfica da comparação através de valores relativos à médiaentre os métodos para a amostra hidrolisado ácido de caseína, noanalisador de aminoácidos Beckman (Método 1: evaporador rotativo;Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo de argônio; Método 4:neutralização).

Para o método 1, foram observadas perdas significativas apenas para

treonina e serina na amostra farelo de soja, perdas essas que podem ter ocorrido por

aderência ao frasco quando da evaporação em evaporador rotativo, como relatado por

Bech-Andersen et al. (1990) e Lanfer Marquez (1996). Para evitar esse tipo de perdas,

Lanfer Marquez (1996) relata sugestão de adição de pequena quantidade de glicerol ao

frasco de hidrólise antes da evaporação.

No método 2, as perdas verificadas para os aminoácidos treonina, serina e

tirosina podem estar relacionadas à formação de compostos, como a transformação de

ácido glutâmico e serina em O-γ-glutamilserina, quando da evaporação em câmaras de

vácuo, como relatado por Ambler (1981), Benson et al. (1981), Bech-Andersen et al.

(1990) e Lanfer Marquez (1996), a formação de O-sulfatos de serina e treonina com

ácido cisteico, observado por Bech-Andersen et al. (1990), a formação de 3-

66

clorotirosina ou 3-bromotirosina, citado por Gehrke et al. (1985) ou, também, por

aderência ao frasco de hidrólise.

As baixas recuperações de treonina, fenilalanina e lisina verificadas para o

método 3, também podem estar relacionadas à aderência ao frasco, como no método 1,

agravado pelo fato do fluxo de argônio pressionar a solução contra a parede do frasco.

Com exceção de treonina e serina para a amostra hidrolisado ácido de caseína, o método

3 foi semelhante ao método 4, como também foi observado por Csapó et al. (1986),

utilizando evaporação sob fluxo de nitrogênio.

Para os demais aminoácidos, menores recuperações observadas nos métodos

de evaporação (1, 2 e 3), em comparação com o método de neutralização (4), também

podem estar relacionadas à aderência ao frasco de hidrólise, porém, essas diferenças não

foram estatisticamente significativas.

Apesar de o método 4 estar em oposição ao método 1 quando comparados

pelo fator de respostas da análise multivariada, neste caso diferiram apenas para a

treonina na amostra farelo de soja e lisina na amostra hidrolisado ácido de caseína.

Entretanto, no conjunto, o método 4 apresentou maior recuperação para a maioria dos

aminoácidos (Anexo 01).

Nas condições deste experimento, o método de neutralização dos reagentes

da hidrólise (método 4), como proposto por Spitz (1973), Csapó et al. (1986), Bech-

Andersen et al. (1990), Pecavar et al (1990) e Csapó et al. (1994), não ocasionou

problemas de separação dos aminoácidos tanto para o analisador Beckman quanto para

CLAE. Além disso, o método de neutralização mostrou-se mais prático e rápido para o

processamento de grandes quantidades de amostras, como também observaram Csapó et

al (1986).

67

4.3 Experimento 3

Este experimento foi realizado em duas etapas. Uma, preliminar, para

verificar a eficiência da hidrólise nas potências 2, 4, 6, 8 e 10, em tempos de 1, 2, 4, 8,

16 e 32 minutos para cada fator de potência, sem repetições de análise, e outra, para

confirmar os resultados, em tempos próximos à maior recuperação obtida na primeira

etapa, com duas repetições para cada análise.

Foi utilizada apenas a amostra milho supondo-se que, por possuir maior teor

de material não protéico, estaria mais propensa a sofrer interferências e, portanto, o

método otimizado para essas condições poderia ser aplicado para qualquer amostra.

Para a potência 2, os resultados mais eficientes de hidrólise na primeira

etapa foram obtidos para os tempos de 16 e 32 minutos (Figura 25). Na Segunda etapa,

a hidrólise foi testada nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos (Figura 26), não

confirmando os valores obtidos anteriormente, e bem abaixo daqueles obtidos pela

hidrólise em estufa (valor 100 % para todas as variáveis).

A hidrólise na potência 4 apresentou resultados semelhantes aos obtidos

para a potência 2 (Figuras 27 e 28).

Nas potências 6, 8 e 10, os teores encontrados para os aminoácidos treonina,

serina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina e arginina apresentaram valores

significativamente baixos em relação aos demais aminoácidos (Figuras 29 a 32). Como

complemento, foi testada a hidrólise na potência máxima (12), em tempos de 5, 10, 15,

25 e 60 minutos (Figura 33), repetindo valores insatisfatórios para os mesmos

aminoácidos.

Os baixos teores obtidos para esses aminoácidos nas potências 6, 8, 10 e 12,

que também são observados para as potências 2 e 4, embora em menor grau, mostram

68

uma situação contraditória, apresentando condições de perdas semelhantes para os

aminoácidos mais sensíveis ao calor, como a treonina e serina, ao mesmo tempo em que

para aqueles mais difíceis de separar, como a valina e a isoleucina. Teoricamente,

baixos valores de recuperação de valina e isoleucina estão relacionados à hidrólise

incompleta, causada por condições de tempo e/ou temperatura insuficientes, enquanto

que, para a treonina e a serina as perdas estão relacionadas à destruição parcial por

tempo e/ou temperatura excessivos (Lookhart et al., 1982; Gehrke et al., 1985; Zumwalt

et al., 1987; Carisano, 1992; Lanfer Marquez, 1996).

O equipamento de microondas PMD Pressurized Microwave Decomposition

System PAAR foi utilizado nas condições de pressão média, de até 34 bar e temperatura

em meio ácido de até 250 °C, como recomendado para a digestão de amostras para

absorção atômica (ANTON PAAR KG, 1992). Nessas condições, o aparelho não

oferece possibilidades de ajuste de pressão ou temperatura, sendo que, as diferentes

potências apenas influenciam no tempo para atingir a pressão e temperatura máximos.

O controle da temperatura da hidrólise por microondas é fator decisivo para

a obtenção de resultados satisfatórios, como mostram os trabalhos de Pickering &

Newton (1990), Margolis et al. (1991), Carisano (1992), Kellner et al. (1994) e Marconi

et al. (1995).

A temperatura recomendada para a hidrólise de proteínas por microondas

varia de 150 °C (Fountoulakis & Lahm, 1998) até 178-180 °C (Pickering & Newton,

1990), sendo que, a obtenção de maiores teores para todos os aminoácidos na menor

potência representa um indicativo de temperatura excessiva utilizada nestes testes,

sugerindo a utilização de equipamentos mais apropriados, tal como utilizado por

Marconi et al. (1995).

69

0

20

40

60

80

100

120

Asp Tre Ser Glu Pro Gli Ala Val Ile Leu Tir Fen His Lis Arg

Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)

1 min 2 min 4 min 8 min 16 min 32 min

Figura 25. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 2, nos tempos de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 minutos, emvalores percentuais relativos à recuperação obtida pela hidrólise em estufaatravés do método 4, para a amostra milho.

0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)


Figura 26: Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 2, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.

70

0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)



0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)


Figura 28. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 4, nos tempos de 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.

71

0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)



0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)


Figura 30. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 6, nos tempos de 2, 4, 5, 6, 7 e 8 minutos (médiade duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperação obtidapela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.

72

0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)



0

20

40

60

80

100

120


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)



73

0

20

40

60

80

100

120

140


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)

5 min 10 min 15 min 25 min 60 min

Figura 33. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos para a hidrólise emmicroondas na potência 12, nos tempos de 05, 10, 15, 25 e 60 minutos(média de duas repetições), em valores percentuais relativos à recuperaçãoobtida pela hidrólise em estufa através do método 4, para a amostra milho.

4.4 Experimento 4

O objetivo deste experimento foi verificar a viabilidade de separação e

quantificação dos aminoácidos nos hidrolisados protéicos redissolvidos ou neutralizados

sob as mesmas condições em analisador específico Beckman e CLAE.

Observou-se nos resultados obtidos por CLAE valores superestimados em

relação ao analisador Beckman para a maioria dos aminoácidos (Figura 34). Admite-se

como possível causa para esses resultados a utilização da solução de diluição de

amostras Na-S Beckman para a redissolução dos hidrolisados e preparo da solução de

neutralização para o método 4, que possui em sua fórmula os reagentes tiodiglicol e

ácido benzóico, não relacionados na fórmula recomendada pelo manual de instruções da

Shimadzu para a análise de aminoácidos (SHIMADZU CORPORATION, 1993), que

74

podem produzir emissão de fluorescência indesejada. Um indicador dessa possibilidade

pode ser observado nos resultados obtidos para o método 4b para CLAE (linha

vermelha na Figura 34), onde a solução Na-S foi diluída e os valores obtidos são

significativamente inferiores aos obtidos para os métodos 1b, 2b e 3b (linhas amarelas e

laranja na Figura 34).

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30


Aminoácidos

Val

or re

lativ

o (%

)

Método 1a Método 2a Método 3a Método 4aMétodo 1b Método 2b Método 3b Método 4b

Figura 34. Visualização gráfica da recuperação dos aminoácidos obtidos poranalisador específico Beckman e CLAE, em valores relativizados a partirdas respectivas médias, independentemente de amostra (Método 1:evaporador rotativo; Método 2: câmaras sob vácuo; Método 3: fluxo deargônio; Método 4: neutralização; Métodos 1-4a: analisador específicoBeckman; Métodos 1-4b: CLAE)

5 CONCLUSÕES

Nas condições propostas para este estudo, conclui-se que:

1. O método de neutralização dos reagentes da hidrólise apresentou maior teor para a

maioria dos aminoácidos.

2. Permite boa produtividade, atendendo às necessidades de trabalhar com grandes

quantidades de amostras.

3. Os métodos de evaporação em evaporador rotativo e por aquecimento sob fluxo de

argônio necessitam de testes em condições de proteção dos aminoácidos contra a

aderência à parede do frasco de hidrólise.

4. O método de evaporação em câmaras sob vácuo em presença de NaOH apresentou

perdas significativas para treonina, serina e tirosina.

5. A hidrólise de proteínas pelo equipamento de microondas PMD Pressurized

Microwave Decomposition System PAAR não apresentou resultados equivalentes à

hidrólise em estufa.

6. A utilização da solução de redissolução de amostras recomendada para o analisador

Beckman apresentou resultados superestimados, quando utilizada em CLAE com

detecção por fluorescência.

6 RECOMENDAÇÕES

Tendo em vista os resultados obtidos neste trabalho, recomenda-se:

1. A utilização do método de neutralização dos reagentes da hidrólise como método

padrão para a análise de aminoácidos.

2. Desaconselhar a utilização do método de evaporação em câmaras sob vácuo em

presença de NaOH, quando da hidrólise ácida.

3. Repetir o experimento 4, utilizando as soluções para a redissolução dos hidrolisados

recomendadas pelos fabricantes dos equipamentos.

7 ANEXOS

78

12.1 Anexo 01

Quadro 05. Valores máximos e mínimos obtidos para cada aminoácido, na amostra

milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman System

6300.


Min. Max. Min. Max. Min. Max. Min. Max.

Asp 0,44 0,48 0,45 0,48 0,44 0,48 0,39 0,48

Tre 0,24 0,26 0,23 0,25 0,23 0,25 0,23 0,27

Ser 0,30 0,32 0,28 0,31 0,31 0,34 0,30 0,34

Glu 1,19 1,28 1,17 1,26 1,18 1,29 1,11 1,37

Pro 0,43 0,53 0,45 0,59 0,46 0,53 0,42 0,59

Gli 0,26 0,30 0,25 0,27 0,25 0,27 0,24 0,29

Ala 0,47 0,51 0,45 0,50 0,45 0,53 0,44 0,52

Val 0,30 0,33 0,28 0,35 0,26 0,34 0,26 0,34

Ile 0,31 0,36 0,30 0,37 0,26 0,36 0,27 0,34

Leu 0,77 0,83 0,75 0,83 0,76 0,86 0,71 0,86

Tir 0,17 0,21 0,15 0,21 0,15 0,21 0,15 0,19

Fen 0,31 0,33 0,30 0,33 0,31 0,34 0,29 0,34

His 0,19 0,23 0,18 0,20 0,19 0,21 0,18 0,22

Lis 0,19 0,22 0,19 0,21 0,19 0,21 0,19 0,25

Arg 0,28 0,33 0,25 0,30 0,26 0,32 0,25 0,29

79

12.2 Anexo 02


milho, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com base na

matéria natural, para CLAE.



Asp 0,44 0,56 0,44 0,51 0,43 0,52 0,40 0,48

Tre 0,23 0,31 0,23 0,29 0,23 0,29 0,22 0,27

Ser 0,30 0,41 0,29 0,37 0,30 0,40 0,29 0,37

Glu 1,45 1,95 1,49 1,70 1,37 1,74 1,30 1,77

Pro 0,56 0,83 0,58 0,72 0,57 0,73 0,57 0,76

Gli 0,28 0,38 0,29 0,35 0,27 0,33 0,25 0,32

Ala 0,41 0,69 0,43 0,72 0,38 0,65 0,37 0,68

Val 0,29 0,40 0,30 0,35 0,29 0,36 0,26 0,33

Ile 0,30 0,42 0,30 0,40 0,28 0,39 0,26 0,36

Leu 0,88 1,09 0,86 1,02 0,80 1,02 0,78 0,99

Tir 0,13 0,21 0,13 0,20 0,14 0,20 0,13 0,19

Fen 0,31 0,39 0,32 0,37 0,31 0,37 0,30 0,33

His 0,19 0,25 0,20 0,24 0,20 0,24 0,19 0,21

Lis 0,19 0,25 0,20 0,24 0,20 0,24 0,19 0,22

Arg 0,26 0,36 0,27 0,35 0,27 0,35 0,25 0,32

80

12.3 Anexo 03


farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com

base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos Beckman

System 6300.



Asp 4,70 5,24 4,59 5,07 4,69 4,93 4,47 5,12

Tre 1,56 1,76 1,56 1,67 1,59 1,68 1,56 1,73

Ser 1,97 2,19 1,97 2,09 2,03 2,16 2,02 2,17

Glu 7,41 8,22 7,27 7,90 7,40 7,71 7,08 7,92

Pro 1,66 1,98 1,70 2,17 1,65 2,04 1,46 2,32

Gli 1,73 1,95 1,74 1,91 1,78 1,81 1,69 1,83

Ala 1,65 1,88 1,70 1,86 1,71 1,83 1,55 1,79

Val 1,68 2,16 1,70 2,16 1,66 2,02 1,50 2,06

Ile 2,42 3,10 2,51 3,02 2,32 2,83 2,07 2,97

Leu 2,88 3,39 3,06 3,27 3,07 3,23 2,86 3,27

Tir 1,39 1,57 1,42 1,50 1,37 1,46 1,39 1,44

Fen 1,98 2,29 2,10 2,22 2,10 2,22 1,95 2,23

His 1,01 1,13 1,03 1,13 1,01 1,10 1,01 1,09

Lis 2,36 2,68 2,36 2,69 2,43 2,61 2,38 2,66

Arg 2,84 3,30 2,84 3,21 2,86 3,04 2,89 3,06

81

12.4 Anexo 04


farelo de soja, nos dados não censurados, em g/100g da amostra com

base na matéria natural, para CLAE.



Asp 6,30 6,80 5,96 7,12 5,74 6,45 5,38 6,25

Tre 1,63 1,92 1,71 1,86 1,51 1,81 1,50 1,76

Ser 2,18 2,64 2,34 2,62 1,98 2,60 1,97 2,55

Glu 10,07 10,96 9,51 11,35 8,81 10,58 8,46 10,85

Pro 2,13 2,56 2,10 2,59 2,07 2,52 2,03 2,52

Gli 2,09 2,46 2,07 2,29 1,95 2,27 1,79 2,15

Ala 1,60 2,19 1,57 2,04 1,13 2,03 1,38 1,98

Val 1,46 2,37 1,43 2,18 1,40 2,15 1,23 2,00

Ile 2,99 3,43 2,89 3,26 2,76 3,10 2,56 2,99

Leu 3,52 3,81 3,57 3,66 3,02 3,59 2,98 3,53

Tir 1,32 1,77 1,48 1,83 1,30 1,76 1,26 1,79

Fen 2,09 2,49 2,35 2,44 2,12 2,39 2,09 2,25

His 1,15 1,34 1,16 1,29 1,07 1,31 1,06 1,23

Lis 2,53 3,06 2,65 2,89 2,41 2,78 2,42 2,76

Arg 2,93 3,67 3,15 3,43 2,83 3,39 2,81 3,34

82

12.5 Anexo 05


hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em g/100g da

amostra com base na matéria natural, para o analisador de aminoácidos




Asp 3,43 3,63 2,51 3,52 3,32 3,69 3,53 3,80

Tre 2,31 2,51 1,72 2,39 2,24 2,50 2,44 2,50

Ser 1,54 1,63 1,09 1,58 1,54 1,72 1,58 1,69

Glu 15,95 16,74 11,55 16,40 15,46 17,22 16,01 17,64

Pro 8,37 10,67 6,70 9,99 8,81 10,04 8,99 11,04

Gli 1,70 1,82 1,23 1,73 1,63 1,79 1,70 1,83

Ala 4,95 5,35 3,94 5,37 4,90 5,43 5,24 5,61

Val 5,69 6,10 4,66 6,01 5,31 6,25 5,70 6,68

Ile 5,88 6,39 4,87 6,50 5,50 6,62 5,98 7,09

Leu 6,96 7,24 5,28 7,16 6,63 7,41 7,03 7,51

Tir 2,52 2,88 1,89 2,71 2,55 2,92 2,73 2,85

Fen 3,32 3,54 2,52 3,53 3,20 3,66 3,40 3,55

His 2,01 2,11 1,43 2,07 1,88 2,13 1,99 2,12

Lis 7,05 7,49 5,26 7,44 6,64 7,69 6,83 7,73

Arg 2,59 2,77 1,93 2,72 2,47 2,89 2,62 2,77

83

12.6 Anexo 06


hidrolisado ácido de caseína, nos dados não censurados, em g/100g da




Asp 2,93 4,23 2,94 4,28 3,29 4,68 3,46 3,77

Tre 1,99 2,82 1,81 2,78 2,07 2,86 2,51 2,73

Ser 1,37 2,00 1,22 1,89 1,40 2,08 1,72 1,90

Glu 16,87 28,24 16,85 27,17 20,98 35,73 19,55 27,12

Pro 8,92 12,46 8,53 12,16 9,35 12,21 10,86 12,76

Gli 1,40 1,98 1,53 2,14 1,53 2,26 1,51 1,79

Ala 4,79 6,55 5,28 8,05 4,45 7,93 4,48 7,38

Val 5,42 7,06 5,16 7,93 4,70 7,99 4,68 7,13

Ile 5,77 7,94 5,68 7,87 6,37 7,93 6,82 7,38

Leu 6,43 9,21 6,25 9,14 7,03 10,07 8,00 8,76

Tir 0,00 3,02 2,17 3,02 2,37 3,28 2,75 2,88

Fen 0,81 4,13 2,82 4,06 3,23 4,21 3,73 3,97

His 1,72 2,82 1,76 2,67 2,04 2,76 2,42 2,69

Lis 3,39 8,52 5,49 8,23 6,43 8,08 7,50 8,38

Arg 0,34 3,00 2,07 2,96 2,40 3,09 2,74 3,16

84

12.7 Anexo 07

Quadro 11. Composição em aminoácidos para cada método, independentemente de

amostra, através do analisador específico Beckman, e comparação do

vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para

os dados não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria

natural.


Asp 2,96±0,50 2,86±0,49 2,91±0,49 2,96±0,50

Tre 1,43±0,24 1,35±0,22 1,42±0,24 1,46±0,25

Ser 1,31±0,20 1,27±0,20 1,35±0,20 1,36±0,20

Glu 8,40±1,65 7,99±1,55 8,36±1,65 8,45±1,69

Pro 3,91±1,06 3,71±0,97 3,91±1,06 4,02±1,09

Gli 1,28±0,19 1,22±0,19 1,25±0,19 1,26±0,19

Ala 2,46±0,53 2,40±0,51 2,47±0,53 2,51±0,55

Val 2,70±0,63 2,60±0,59 2,65±0,62 2,71±0,65

Ile 3,10±0,64 3,01±0,61 3,05±0,65 3,10±0,67

Leu 3,68±0,70 3,56±0,66 3,65±0,69 3,68±0,70

Tir 1,45±0,28 1,38±0,26 1,44±0,28 1,46±0,29

Fen 1,97±0,34 1,91±0,33 1,96±0,34 1,97±0,35

His 1,11±0,20 1,06±0,19 1,09±0,20 1,09±0,20

Lis 3,33±0,79 3,18±0,74 3,28±0,77 3,32±0,78

Arg 1,99±0,32 1,93±0,32 1,97±0,32 1,98±0,32

Comparação do

vetor de médias(1)

ab a bc c

(1) – Vetor de médias ligado por letras distintas, diferem (P < 0,05) quanto às variáveis

conjuntas analisadas.

85

12.8 Anexo 08

Quadro 12. Composição em aminoácidos para cada método, independentemente de

amostra, através de CLAE, e comparação do vetor de médias




Asp 3,57±±±±0,66 3,39±±±±0,67 3,52±±±±0,63 3,26±±±±0,63

Tre 1,50±±±±0,25 1,49±±±±0,27 1,52±±±±0,26 1,43±±±±0,27

Ser 1,51±±±±0,24 1,43±±±±0,24 1,51±±±±0,23 1,47±±±±0,24

Glu 11,41±±±±2,32 11,81±±±±2,61 12,38±±±±2,80 10,41±±±±2,40

Pro 4,61±±±±1,21 4,83±±±±1,31 4,71±±±±1,26 4,45±±±±1,33

Gli 1,47±±±±0,23 1,39±±±±0,23 1,43±±±±0,22 1,28±±±±0,21

Ala 2,75±±±±0,60 2,96±±±±0,73 2,97±±±±0,75 2,52±±±±0,64

Val 2,72±±±±0,63 2,89±±±±0,74 2,84±±±±0,72 2,52±±±±0,69

Ile 3,52±±±±0,74 3,58±±±±0,82 3,52±±±±0,77 3,13±±±±0,75

Leu 4,20±±±±0,80 4,34±±±±0,89 4,31±±±±0,87 3,89±±±±0,84

Tir 1,30±±±±0,28 1,52±±±±0,31 1,55±±±±0,30 1,40±±±±0,30

Fen 1,94±±±±0,37 2,12±±±±0,40 2,13±±±±0,38 1,98±±±±0,39

His 1,27±±±±0,24 1,29±±±±0,26 1,30±±±±0,25 1,22±±±±0,26

Lis 3,24±±±±0,77 3,49±±±±0,86 3,42±±±±0,81 3,27±±±±0,86

Arg 1,95±±±±0,36 2,00±±±±0,36 2,07±±±±0,34 2,04±±±±0,37

Comparação do

vetor de médias(1)

c bc b a



86

12.9 Anexo 09

Quadro 13. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra milho,

através de analisador específico Beckman, e comparação do vetor de

médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados

não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.


Asp 0,46±±±±0,01 0,46±±±±0,01 0,45±±±±0,01 0,43±±±±0,02

Tre 0,25±±±±0,00 0,24±±±±0,00 0,24±±±±0,01 0,24±±±±0,01

Ser 0,31±±±±0,00 0,30±±±±0,01 0,32±±±±0,01 0,31±±±±0,01

Glu 1,23±±±±0,02 1,22±±±±0,02 1,24±±±±0,02 1,22±±±±0,04

Pro 0,48±±±±0,02 0,51±±±±0,03 0,49±±±±0,01 0,50±±±±0,03

Gli 0,27±±±±0,01 0,26±±±±0,00 0,26±±±±0,00 0,26±±±±0,01

Ala 0,49±±±±0,01 0,48±±±±0,01 0,49±±±±0,01 0,47±±±±0,01

Val 0,31±±±±0,01 0,31±±±±0,01 0,31±±±±0,02 0,30±±±±0,01

Ile 0,33±±±±0,01 0,33±±±±0,01 0,32±±±±0,02 0,31±±±±0,02

Leu 0,80±±±±0,01 0,80±±±±0,01 0,80±±±±0,02 0,78±±±±0,02

Tir 0,18±±±±0,01 0,18±±±±0,01 0,18±±±±0,01 0,17±±±±0,01

Fen 0,32±±±±0,00 0,32±±±±0,00 0,32±±±±0,01 0,31±±±±0,01

His 0,20±±±±0,01 0,19±±±±0,00 0,20±±±±0,00 0,19±±±±0,01

Lis 0,21±±±±0,01 0,20±±±±0,00 0,20±±±±0,00 0,22±±±±0,01

Arg 0,30±±±±0,01 0,28±±±±0,01 0,29±±±±0,01 0,28±±±±0,01

Comparação do

vetor de médias(1)

a a a a



87

12.10 Anexo 10

Quadro 14. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra milho,

através de CLAE, e comparação do vetor de médias envolvendo as

variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em



Asp 0,50±±±±0,02 0,49±±±±0,01 0,48±±±±0,02 0,44±±±±0,01

Tre 0,27±±±±0,01 0,26±±±±0,01 0,26±±±±0,01 0,25±±±±0,01

Ser 0,36±±±±0,02 0,34±±±±0,02 0,35±±±±0,02 0,34±±±±0,01

Glu 1,66±±±±0,09 1,63±±±±0,04 1,58±±±±0,06 1,48±±±±0,08

Pro 0,68±±±±0,05 0,66±±±±0,03 0,64±±±±0,03 0,66±±±±0,04

Gli 0,31±±±±0,02 0,30±±±±0,01 0,30±±±±0,01 0,28±±±±0,01

Ala 0,55±±±±0,05 0,53±±±±0,05 0,52±±±±0,06 0,54±±±±0,05

Val 0,34±±±±0,02 0,34±±±±0,01 0,32±±±±0,01 0,30±±±±0,01

Ile 0,36±±±±0,02 0,36±±±±0,02 0,34±±±±0,02 0,32±±±±0,02

Leu 0,97±±±±0,05 0,95±±±±0,03 0,92±±±±0,04 0,88±±±±0,03

Tir 0,17±±±±0,01 0,16±±±±0,01 0,17±±±±0,01 0,16±±±±0,01

Fen 0,35±±±±0,02 0,34±±±±0,01 0,34±±±±0,01 0,31±±±±0,00

His 0,23±±±±0,01 0,22±±±±0,01 0,21±±±±0,01 0,21±±±±0,00

Lis 0,23±±±±0,01 0,22±±±±0,01 0,21±±±±0,01 0,21±±±±0,01

Arg 0,32±±±±0,02 0,32±±±±0,02 0,30±±±±0,02 0,28±±±±0,01

Comparação do

vetor de médias(1)

a a a a



88

12.11 Anexo 11

Quadro 15. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra farelo

de soja, através de analisador específico Beckman, e comparação do

vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os

dados não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria

natural.


Asp 4,93±±±±0,09 4,86±±±±0,08 4,79±±±±0,04 4,81±±±±0,12

Tre 1,62±±±±0,04 1,62±±±±0,02 1,64±±±±0,02 1,67±±±±0,03

Ser 2,03±±±±0,04 2,04±±±±0,02 2,11±±±±0,02 2,12±±±±0,03

Glu 7,71±±±±0,15 7,60±±±±0,13 7,54±±±±0,05 7,55±±±±0,14

Pro 1,82±±±±0,06 1,92±±±±0,07 1,78±±±±0,07 1,85±±±±0,15

Gli 1,82±±±±0,05 1,81±±±±0,03 1,79±±±±0,01 1,78±±±±0,02

Ala 1,73±±±±0,04 1,77±±±±0,03 1,77±±±±0,02 1,73±±±±0,05

Val 1,91±±±±0,09 1,93±±±±0,08 1,84±±±±0,06 1,81±±±±0,10

Ile 2,80±±±±0,12 2,81±±±±0,09 2,66±±±±0,09 2,62±±±±0,15

Leu 3,12±±±±0,09 3,16±±±±0,04 3,14±±±±0,04 3,10±±±±0,07

Tir 1,44±±±±0,03 1,46±±±±0,02 1,42±±±±0,02 1,42±±±±0,01

Fen 2,13±±±±0,06 2,15±±±±0,02 2,15±±±±0,02 2,12±±±±0,05

His 1,06±±±±0,02 1,07±±±±0,02 1,06±±±±0,02 1,05±±±±0,01

Lis 2,50±±±±0,07 2,52±±±±0,06 2,51±±±±0,03 2,53±±±±0,05

Arg 3,02±±±±0,09 3,02±±±±0,06 2,97±±±±0,03 2,97±±±±0,03

Comparação do

vetor de médias(1)

a a ab b



89

12.12 Anexo 12

Quadro 16. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra farelo

de soja, através de CLAE, e comparação do vetor de médias envolvendo

as variáveis analisadas em conjunto, para os dados não censurados, em



Asp 6,54±±±±0,09 6,45±±±±0,25 6,16±±±±0,15 5,77±±±±0,18

Tre 1,81±±±±0,05 1,81±±±±0,03 1,73±±±±0,05 1,68±±±±0,05

Ser 2,47±±±±0,08 2,47±±±±0,06 2,40±±±±0,11 2,33±±±±0,10

Glu 10,46±±±±0,16 10,29±±±±0,40 9,87±±±±0,31 9,48±±±±0,49

Pro 2,31±±±±0,07 2,33±±±±0,12 2,24±±±±0,07 2,28±±±±0,09

Gli 2,33±±±±0,07 2,20±±±±0,05 2,10±±±±0,06 1,96±±±±0,06

Ala 1,94±±±±0,14 1,81±±±±0,11 1,68±±±±0,17 1,73±±±±0,11

Val 1,97±±±±0,20 1,85±±±±0,18 1,80±±±±0,16 1,75±±±±0,14

Ile 3,19±±±±0,08 3,10±±±±0,08 2,94±±±±0,07 2,80±±±±0,08

Leu 3,64±±±±0,06 3,62±±±±0,02 3,43±±±±0,10 3,32±±±±0,09

Tir 1,56±±±±0,09 1,69±±±±0,07 1,60±±±±0,10 1,53±±±±0,10

Fen 2,35±±±±0,08 2,39±±±±0,02 2,26±±±±0,05 2,16±±±±0,03

His 1,25±±±±0,03 1,25±±±±0,03 1,20±±±±0,04 1,17±±±±0,03

Lis 2,76±±±±0,09 2,74±±±±0,06 2,61±±±±0,06 2,61±±±±0,07

Arg 3,27±±±±0,12 3,26±±±±0,06 3,10±±±±0,10 3,12±±±±0,09

Comparação do

vetor de médias(1)

b b ab a



90

12.13 Anexo 13

Quadro 17. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra

hidrolisado ácido de caseína, através de analisador específico Beckman, e

comparação do vetor de médias envolvendo as variáveis analisadas em

conjunto, para os dados não censurados, em g/100g da amostra com base

na matéria natural.


Asp 3,49±±±±0,04 3,25±±±±0,19 3,49±±±±0,06 3,63±±±±0,04

Tre 2,42±±±±0,03 2,19±±±±0,12 2,37±±±±0,05 2,47±±±±0,01

Ser 1,59±±±±0,02 1,46±±±±0,09 1,62±±±±0,04 1,65±±±±0,02

Glu 16,25±±±±0,17 15,15±±±±0,91 16,31±±±±0,31 16,59±±±±0,28

Pro 9,42±±±±0,40 8,69±±±±0,55 9,45±±±±0,26 9,71±±±±0,39

Gli 1,75±±±±0,02 1,60±±±±0,09 1,71±±±±0,03 1,75±±±±0,02

Ala 5,16±±±±0,08 4,94±±±±0,26 5,15±±±±0,12 5,33±±±±0,07

Val 5,88±±±±0,08 5,57±±±±0,23 5,80±±±±0,17 6,02±±±±0,17

Ile 6,17±±±±0,09 5,87±±±±0,28 6,16±±±±0,20 6,38±±±±0,20

Leu 7,12±±±±0,06 6,73±±±±0,36 7,01±±±±0,15 7,15±±±±0,09

Tir 2,73±±±±0,07 2,51±±±±0,16 2,74±±±±0,07 2,79±±±±0,02

Fen 3,46±±±±0,04 3,26±±±±0,19 3,40±±±±0,08 3,46±±±±0,03

His 2,06±±±±0,02 1,91±±±±0,12 2,01±±±±0,05 2,04±±±±0,03

Lis 7,28±±±±0,08 6,80±±±±0,39 7,13±±±±0,18 7,20±±±±0,15

Arg 2,65±±±±0,03 2,49±±±±0,14 2,67±±±±0,08 2,70±±±±0,02

Comparação do

vetor de médias(1)

b a c c



91

12.14 Anexo 14

Quadro 18. Composição em aminoácidos para cada método, para a amostra

hidrolisado ácido de caseína, através de CLAE, e comparação do vetor de

médias envolvendo as variáveis analisadas em conjunto, para os dados

não censurados, em g/100g da amostra com base na matéria natural.


Asp 3,66±±±±0,25 3,84±±±±0,24 3,91±±±±0,27 3,63±±±±0,07

Tre 2,43±±±±0,18 2,47±±±±0,17 2,56±±±±0,14 2,60±±±±0,05

Ser 1,70±±±±0,14 1,69±±±±0,12 1,79±±±±0,12 1,81±±±±0,04

Glu 22,11±±±±1,96 23,21±±±±1,73 25,71±±±±2,67 22,74±±±±1,62

Pro 10,84±±±±0,69 11,00±±±±0,64 11,25±±±±0,55 11,89±±±±0,50

Gli 1,76±±±±0,10 1,84±±±±0,10 1,90±±±±0,15 1,67±±±±0,07

Ala 5,75±±±±0,29 6,32±±±±0,51 6,72±±±±0,65 5,98±±±±0,61

Val 5,86±±±±0,30 6,26±±±±0,51 6,39±±±±0,60 6,27±±±±0,56

Ile 7,00±±±±0,42 7,19±±±±0,39 7,27±±±±0,30 7,06±±±±0,14

Leu 8,00±±±±0,59 8,30±±±±0,53 8,59±±±±0,53 8,35±±±±0,16

Tir 2,17±±±±0,56 2,74±±±±0,15 2,89±±±±0,15 2,81±±±±0,03

Fen 3,12±±±±0,61 3,67±±±±0,22 3,78±±±±0,19 3,86±±±±0,05

His 2,32±±±±0,21 2,39±±±±0,17 2,47±±±±0,12 2,55±±±±0,06

Lis 6,73±±±±0,92 7,37±±±±0,50 7,43±±±±0,28 7,91±±±±0,20

Arg 2,26±±±±0,50 2,68±±±±0,17 2,82±±±±0,14 2,89±±±±0,09

Comparação do

vetor de médias(1)

c c b A



92

12.15 Anexo 15


multivariadas sobre os métodos, através dos testes de Wilks, Pillai,

Hotteling-Lawley e Roy, independente de amostra, para o analisador de



Lawley

Roy

Analisador Beckman

Métodos 3 0,0072 0,0368 0,0009 0,0001

Interação Método x Amostras 6 0,5378 0,5915 0,4998 0,0032

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0355 0,0365 0,0350 0,0116

Métodos 1,2 e 3 vs Método 4 1 0,0026 0,0026 0,0026 0,0026

Método 1 vs 2 1 0,1370 0,1370 0,1370 0,1370

Método 1 vs 3 1 0,2617 0,2617 0,2617 0,2617

Método 1 vs 4 1 0,0231 0,0231 0,0231 0,0231

Método 2 vs 3 1 0,0152 0,0152 0,0152 0,0152

Método 2 vs 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 3 vs 4 1 0,5427 0,5427 0,5427 0,5427

CLAE

Métodos 3 0,0001 0,0008 0,0001 0,0001


Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0184 0,0315 0,0109 0,0016

Métodos 1,2 e 3 vs Método 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 1 vs 2 1 0,1783 0,1783 0,1783 0,1783

Método 1 vs 3 1 0,0022 0,0022 0,0022 0,0022

Método 1 vs 4 1 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Método 2 vs 3 1 0,2275 0,2275 0,2275 0,2275

Método 2 vs 4 1 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003

Método 3 vs 4 1 0,0206 0,0206 0,0206 0,0206

93

12.16 Anexo 16

Tabela 07. Análise de variância para comparar métodos e amostras referente ao

aminoácido ácido aspártico (Asp), no analisador de aminoácidos


Fonte de variação GL Soma de

quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,048319 0,016106 2,05 0,1248

Amostras 2 163,304234 81,652117 10368,33 0,0001


Métodos – Milho 3 0,005239 0,001746 0,22 0,8806

Métodos - Farelo de Soja 3 0,070345 0,023448 2,98 0,0443

Métodos – Caseína 3 0,058411 0,019470 2,47 0,0773

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,024216 0,012108 1,54 0,2287


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,001058 0,000529 0,07 0,9351

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,004181 0,004181 0,53 0,4709

Métodos 1, 2 e 3 - Farelo de Soja 2 0,061570 0,030785 3,91 0,0291

Métodos 1 a 3 x 4 - Farelo de Soja 1 0,008775 0,008775 1,11 0,2982

Métodos 1, 2 e 3 – Caseína 2 0,000865 0,000432 0,05 0,9467

Métodos 1 a 3 x 4 – Caseína 1 0,057547 0,057547 7,31 0,0104

Resíduo 36 0,283505 0,007875 - -

Total 47 163,721735 - - -

R2 = 99,83 % CV = 3,03 % Desvio Padrão residual = 0,09 Média Geral = 2,93 %

94

12.17 Anexo 17

Tabela 08. Teores médios em g/100g da amostra com base na matéria natural e

comparação entre os métodos para o aminoácido ácido aspártico

(Asp) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.

Método Milho Farelo de

Soja

Caseína Média(1)

1 0,45 ± 0,04 4,86 ± 0,04 3,46 ± 0,04 2,92 ± 0,03a

2 0,47 ± 0,04 4,93 ± 0,04 3,44 ± 0,04 2,94 ± 0,03a

3 0,45 ± 0,04 4,75 ± 0,04 3,44 ± 0,04 2,88 ± 0,03a

4 0,42 ± 0,04 4,90 ± 0,04 3,58 ± 0,04 2,97 ± 0,03a

Média 0,44 ± 0,02 4,86 ± 0,02 3,48 ± 0,02

(1) – Médias ligadas por letras distintas diferem (P < 0,05).

95

12.18 Anexo 18


aminoácido treonina (Tre), no analisador de aminoácidos Beckman, para

os dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0488233 0,0162744 8,49 0,0002

Amostras 2 37,9416732 18,9708366 9893,31 0,0001


Métodos - Milho 3 0,0002563 0,0000854 0,04 0,9873


Métodos - Caseína 3 0,0846333 0,0282111 14,71 0,0001

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0117029 0,0058514 3,05 0,0597


Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0000875 0,0000438 0,02 0,9775

Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0001687 0,0001687 0,09 0,7684



Métodos 1, 2 e 3 - Caseína 2 0,0427432 0,0213716 11,15 0,0002

Métodos 1 a 3 x 4 - Caseína 1 0,0418901 0,0418901 21,85 0,0001

Resíduo 36 0,0690315 0,0019175 - -

Total 47 38,1251127 - - -

R2 = 99.82 % CV = 3,08 % Desvio Padrão residual = 0,04 Média Geral = 1,42 %

96

12.19 Anexo 19


comparação entre os métodos para o aminoácido treonina (Tre)


censurados.

Método Milho(1) Farelo de

Soja(1)

Caseína(1) Média

1 0,24±0,02a 1,59±0,02c 2,44±0,02a 1,43±0,01

2 0,24±0,02a 1,60±0,02bc 2,30±0,02b 1,38±0,01

3 0,25±0,02a 1,65±0,02ab 2,33±0,02b 1,41±0,01

4 0,24±0,02a 1,70±0,02a 2,48±0,02a 1,47±0,01

Média 0,24±0,01 1,64±0,01 2,39±0,01


97

12.20 Anexo 20


aminoácido serina (Ser), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0404427 0,0134809 13,33 0,0001

Amostras 2 26,8768693 13,4384346 13288,30 0,0001


Métodos - Milho 3 0,0003755 0,0001252 0,12 0,9455


Métodos - Caseína 3 0,0278933 0,0092978 9,19 0,0001

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0124144 0,0062072 6,14 0,0051


Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0003702 0,0001851 0,18 0,8335

Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0000053 0,0000053 0,01 0,9425





Resíduo 36 0,0364067 0,0010113 - -

Total 47 26,9946330 - - -


98

12.21 Anexo 21


comparação entre os métodos para o aminoácido serina (Ser) obtidos

no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados censurados.


Soja(1)

Caseína(1) Média

1 0,31±0,02a 2,00±0,02c 1,60±0,02b 1,30±0,01

2 0,30±0,02a 2,06±0,02b 1,55±0,02c 1,30±0,01

3 0,31±0,02a 2,13±0,02a 1,59±0,02bc 1,34±0,01

4 0,31±0,02a 2,14±0,02a 1,67±0,02a 1,37±0,01

Média 0,31±0,01 2,08±0,01 1,60±0,01


99

12.22 Anexo 22


aminoácido ácido glutâmico (Glu), no analisador de aminoácidos



quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,08355 0,02785 0,46 0,7094

Amostras 2 1793,93470 896,96735 14935,84 0,0001


Métodos - Milho 3 0,01001 0,00334 0,06 0,9825


Métodos - Caseína 3 0,18114 0,06038 1,01 0,4016

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,01332 0,00666 0,11 0,8953


Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,00182 0,00091 0,02 0,9850

Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,00819 0,00819 0,14 0,7141





Resíduo 36 2,16197 0,06005 - -

Total 47 1796,37118 - - -


100

12.23 Anexo 23


comparação entre os métodos para o aminoácido ácido glutâmico

(Glu) obtidos no analisador de aminoácidos Beckman, para os dados

censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 1,22±0,12 7,59±0,12 16,13±0,12 8,31±0,07a

2 1,23±0,12 7,68±0,12 16,05±0,12 8,32±0,07a

3 1,25±0,12 7,50±0,12 16,08±0,12 8,28±0,07a

4 1,18±0,12 7,67±0,12 16,32±0,12 8,39±0,07a

Média 1,22±0,06 7,61±0,06 16,14±0,06


101

12.24 Anexo 24


aminoácido prolina (Pro), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados não censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,139465 0,046488 0,41 0,7494

Amostras 2 711,075060 355,537530 3107,76 0,0001


Métodos – Milho 3 0,003406 0,001135 0,01 0,9986


Métodos – Caseína 3 0,618785 0,206262 1,80 0,1652

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,113569 0,056784 0,50 0,6131


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,003096 0,001548 0,01 0,9866

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000310 0,000310 0,00 0,9588

Métodos 1, 2 e 3 – Farelo de Soja 2 0,060403 0,030201 0,26 0,7695

Métodos 1 a 3 x 4 – Farelo de Soja 1 0,021664 0,021664 0,19 0,6662



Resíduo 34 3,889704 0,114403 - -

Total 45 721,974030 - - -


102

12.25 Anexo 25


comparação entre os métodos para o aminoácido prolina (Pro)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,46±0,17 1,86±0,17 9,11±0,17 3,81±0,10a

2 0,49±0,17 1,86±0,17 9,18±0,17 3,84±0,10a

3 0,50±0,17 1,71±0,17 9,62±0,17 3,94±0,10a

4 0,47±0,17 1,93±0,24 9,38±0,17 3,93±0,11a

Média 0,48±0,08 1,84±0,09 9,32±0,08


103

12.26 Anexo 26


aminoácido glicina (Gli), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0012329 0,0004110 0,28 0,8379

Amostras 2 23,5179332 11,7589666 8072,74 0,0001


Métodos - Milho 3 0,0003305 0,0001102 0,08 0,9727


Métodos - Caseína 3 0,0039872 0,0013291 0,91 0,4449

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0007590 0,0003795 0,26 0,7721


Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,0000502 0,0000251 0,02 0,9829

Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,0002803 0,0002803 0,19 0,6636





Resíduo 35 0,0509819 0,0014566 - -

Total 46 23,6517319 - - -


104

12.27 Anexo 27


comparação entre os métodos para o aminoácido glicina (Gli)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,26±0,02 1,78±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a

2 0,26±0,02 1,79±0,02 1,69±0,02 1,25±0,01a

3 0,26±0,02 1,78±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a

4 0,25±0,02 1,80±0,02 1,73±0,02 1,26±0,01a

Média 0,26±0,01 1,79±0,01 1,72±0,01


105

12.28 Anexo 28


aminoácido alanina (Ala), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,020905 0,006968 0,77 0,5166

Amostras 2 189,487810 94,743905 10513,35 0,0001


Métodos – Milho 3 0,003956 0,001319 0,15 0,9314


Métodos – Caseína 3 0,075967 0,025322 2,81 0,0532

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,006685 0,003342 0,37 0,6927


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000640 0,000320 0,04 0,9652

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,003317 0,003317 0,37 0,5479





Resíduo 36 0,324424 0,009012 - -

Total 47 189,908699 - - -


106

12.29 Anexo 29


comparação entre os métodos para o aminoácido alanina (Ala)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,49±0,05 1,69±0,05 5,21±0,05 2,46±0,03a

2 0,49±0,05 1,75±0,05 5,19±0,05 2,48±0,03a

3 0,50±0,05 1,75±0,05 5,08±0,05 2,44±0,03a

4 0,46±0,05 1,78±0,05 5,26±0,05 2,50±0,03a

Média 0,49±0,02 1,74±0,02 5,19±0,02


107

12.30 Anexo 30


aminoácido valina (Val), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,004197 0,001399 0,07 0,9770

Amostras 2 259,442568 129,721284 6230,42 0,0001


Métodos - Milho 3 0,000459 0,000153 0,01 0,9991


Métodos - Caseína 3 0,036707 0,012236 0,59 0,6270

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,001190 0,000595 0,03 0,9718


Métodos 1, 2 e 3 - Milho 2 0,000407 0,000204 0,01 0,9903

Métodos 1 a 3 x 4 - Milho 1 0,000052 0,000052 0,00 0,9604





Resíduo 36 0,749543 0,020821 - -

Total 47 260,263659 - - -


108

12.31 Anexo 31


comparação entre os métodos para o aminoácido valina (Val) obtidos



Soja

Caseína Média(1)

1 0,31±0,07 1,97±0,07 5,83±0,07 2,70±0,04a

2 0,30±0,07 1,99±0,07 5,80±0,07 2,70±0,04a

3 0,32±0,07 1,89±0,07 5,93±0,07 2,71±0,04a

4 0,31±0,07 1,89±0,07 5,85±0,07 2,68±0,04a

Média 0,31±0,04 1,93±0,04 5,85±0,04


109

12.32 Anexo 32


aminoácido isoleucina (Ile), no analisador de aminoácidos Beckman, para



quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,027039 0,009013 0,28 0,8381

Amostras 2 280,443981 140,221990 4385,70 0,0001


Métodos – Milho 3 0,000335 0,000112 0,00 0,9997


Métodos – Caseína 3 0,084200 0,028067 0,88 0,4617

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,010009 0,005004 0,16 0,8557


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000020 0,000010 0,00 0,9997

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000315 0,000315 0,01 0,9215





Resíduo 36 1,151011 0,031973 - -

Total 47 281,758434 - - -


110

12.33 Anexo 33


comparação entre os métodos para o aminoácido isoleucina (Ile)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,33±0,09 2,89±0,09 6,24±0,09 3,15±0,05a

2 0,33±0,09 2,89±0,09 6,12±0,09 3,11±0,05a

3 0,33±0,09 2,75±0,09 6,32±0,09 3,13±0,05a

4 0,32±0,09 2,75±0,09 6,20±0,09 3,09±0,05a

Média 0,32±0,04 2,82±0,04 6,22±0,04


111

12.34 Anexo 34


aminoácido leucina (Leu), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,038811 0,012937 1,03 0,3907

Amostras 2 321,154730 160,577365 12790,64 0,0001


Métodos – Milho 3 0,005008 0,001669 0,13 0,9398


Métodos – Caseína 3 0,133913 0,044638 3,56 0,0237

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,037926 0,018963 1,51 0,2345


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,001245 0,000623 0,05 0,9517

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,003763 0,003763 0,30 0,5874





Resíduo 36 0,451954 0,012554 - -

Total 47 321,766841 - - -


112

12.35 Anexo 35


comparação entre os métodos para o aminoácido leucina (Leu)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,79±0,06 3,06±0,06 7,16±0,06 3,67±0,03a

2 0,81±0,06 3,14±0,06 7,09±0,06 3,68±0,03a

3 0,79±0,06 3,12±0,06 6,91±0,06 3,60±0,03a

4 0,76±0,06 3,15±0,06 7,07±0,06 3,66±0,03a

Média 0,79±0,03 3,12±0,03 7,05±0,03


113

12.36 Anexo 36


aminoácido tirosina (Tir), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0062769 0,0020923 0,66 0,5846

Amostras 2 43,9147514 21,9573757 6894,01 0,0001


Métodos – Milho 3 0,0006114 0,0002038 0,06 0,9785


Métodos – Caseína 3 0,0518082 0,0172694 5,42 0,0039

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0048506 0,0024253 0,76 0,4753


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0004854 0,0002427 0,08 0,9268

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0000483 0,0000483 0,02 0,9028





Resíduo 32 0,1019198 0,0031850 - -

Total 43 46,7421765 - - -


114

12.37 Anexo 37


comparação entre os métodos para o aminoácido tirosina (Tir)


censurados.


Soja(1)

Caseína(1) Média

1 0,18±0,03a 1,41±0,03a 2,79±0,03a 1,46±0,02

2 0,16±0,04a 1,47±0,03a 2,66±0,03b 1,43±0,02

3 0,17±0,04a 1,43±0,03a 2,79±0,03a 1,46±0,02

4 0,16±0,03a 1,42±0,03a 2,80±0,03a 1,46±0,02

Média 0,17±0,02 1,43±0,01 2,76±0,01


115

12.38 Anexo 38


aminoácido fenilalanina (Fen), no analisador de aminoácidos Beckman,



quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0161345 0,0053782 1,44 0,2480

Amostras 2 78,3575843 39,1787921 10469,74 0,0001


Métodos – Milho 3 0,0005885 0,0001962 0,05 0,9839


Métodos – Caseína 3 0,0571227 0,0190409 5,09 0,0049

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0135335 0,0067668 1,81 0,1785


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0001322 0,0000661 0,02 0,9825

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0004563 0,0004563 0,12 0,7290





Resíduo 36 0,1347155 0,0037421 - -

Total 47 78,5628157 - - -


116

12.39 Anexo 39


comparação entre os métodos para o aminoácido fenilalanina (Fen)


censurados.


Soja(1)

Caseína(1) Média

1 0,32±0,03a 2,09±0,03a 3,50±0,03a 1,97±0,02

2 0,32±0,03a 2,14±0,03a 3,45±0,03a 1,97±0,02

3 0,31±0,03a 2,13±0,03a 3,34±0,03b 1,93±0,02

4 0,31±0,03a 2,16±0,03a 3,44±0,03a 1,97±0,02

Média 0,32±0,02 2,13±0,02 3,43±0,02


117

12.40 Anexo 40


aminoácido histidina (His), no analisador de aminoácidos Beckman, para



quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0027517 0,0009172 0,54 0,6595

Amostras 2 27,1431382 13,5715691 7955,62 0,0001


Métodos – Milho 3 0,0004012 0,0001337 0,08 0,9713


Métodos – Caseína 3 0,0009612 0,0003204 0,19 0,9040

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0002434 0,0001217 0,07 0,9313


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0000215 0,0000107 0,01 0,9937

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0003797 0,0003797 0,22 0,6399





Resíduo 36 0,0614128 0,0017059 - -

Total 47 27,2082830 - - -


118

12.41 Anexo 41


comparação entre os métodos para o aminoácido histidina (His)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,20±0,02 1,05±0,02 2,04±0,02 1,10±0,01a

2 0,20±0,02 1,06±0,02 2,03±0,02 1,09±0,01a

3 0,19±0,02 1,07±0,02 2,04±0,02 1,10±0,01a

4 0,18±0,02 1,03±0,02 2,02±0,02 1,08±0,01a

Média 0,19±0,01 1,05±0,01 2,03±0,01


119

12.42 Anexo 42


aminoácido lisina (Lis), no analisador de aminoácidos Beckman, para os

dados censurados.


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,075446 0,025149 1,51 0,2286

Amostras 2 400,362732 200,181366 12014,14 0,0001


Métodos – Milho 3 0,000159 0,000053 0,00 0,9997


Métodos – Caseína 3 0,279818 0,093273 5,60 0,0030

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,075428 0,037714 2,26 0,1186


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,000152 0,000076 0,00 0,9954

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,000007 0,000007 0,00 0,9841





Resíduo 36 0,599837 0,016662 - -

Total 47 401,271940 - - -


120

12.43 Anexo 43


comparação entre os métodos para o aminoácido lisina (Lis) obtidos



Soja(1)

Caseína(1) Média

1 0,21±0,06a 2,46±0,06a 7,34±0,06a 3,34±0,04

2 0,20±0,06a 2,48±0,06a 7,19±0,06ab 3,29±0,04

3 0,20±0,06a 2,48±0,06a 6,99±0,06c 3,23±0,04

4 0,21±0,06a 2,57±0,06a 7,07±0,06bc 3,28±0,04

Média 0,21±0,03 2,50±0,03 7,15±0,03


121

12.44 Anexo 44


aminoácido arginina (Arg), no analisador de aminoácidos Beckman, para

os dados censurados..


quadrados

Quadrado

Médio

Teste F Prob >

F

Métodos 3 0,0042087 0,0014029 0,27 0,8463

Amostras 2 68,2630362 34,1315181 6578,79 0,0001


Métodos – Milho 3 0,0023812 0,0007937 0,15 0,9271


Métodos – Caseína 3 0,0297802 0,0099267 1,91 0,1449

Entre Métodos 1,2 e 3 2 0,0001447 0,0000723 0,01 0,9862


Métodos 1, 2 e 3 – Milho 2 0,0018935 0,0009467 0,18 0,8340

Métodos 1 a 3 x 4 – Milho 1 0,0004877 0,0004877 0,09 0,7609





Resíduo 36 0,1867723 0,0051881 - -

Total 47 68,4881655 - - -


122

12.45 Anexo 45


comparação entre os métodos para o aminoácido arginina (Arg)


censurados.


Soja

Caseína Média(1)

1 0,31±0,04 2,95±0,04 2,62±0,04 1,96±0,02a

2 0,29±0,04 2,97±0,04 2,63±0,04 1,96±0,02a

3 0,28±0,04 2,99±0,04 2,61±0,04 1,96±0,02a

4 0,28±0,04 2,95±0,04 2,72±0,04 1,98±0,02a

Média 0,29±0,02 2,96±0,02 2,65±0,02


8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALEGRÍA TORAN, A.; BARBERÁ, R.; FARRÉ, R.; LAGARDA, M. J. & LÓPEZ, J.

C.. HPLC method for cyst(e)ine and methionine in infant formulas. Journal of

Food Science. Vol. 61, no. 6, pg. 1132-1135, 1170, 1996.

AMBLER, R. P.. Standards and accuracy in amino acid analysis. In: RATTENBURY,

J. M.. Amino Acid Analysis. Chichester: Ellis Horwood, 1981. 380p.

ANDRIGUETTO, J. M.; PERLY, L.; MINARDI, I.; GEMAEL, A.; FLEMMING, J. S.;

SOUZA, G. A. de & BONA FILHO, A.. Nutrição Animal. 4 ed. Vol. 1. São

Paulo: Nobel, 1983. 395 p.

ANTON PAAR KG. PMD Pressurized Microwave Decomposition System:

Instruction Manual. Edition 930420. Graz: Anton Paar, 1992.

ASHWORTH, R. B.. Amino acid analysis for meat protein evaluation. Journal of

AOAC. Vol. 70, no. 1, pg. 80-85, 1987.

AOAC INTERNATIONAL. Official Methods of Analysis of AOAC, 16 ed. Arlington

(USA): 1995.

BAZILIO, J.. Chromatographic amino acid analysis. In: Seminário sobre a análise de

aminoácidos em alimentos e outros materiais biológicos. Campinas: Instituto de

Tecnologia de Alimentos, pg. 1-4, 1994.

124

BECH-ANDERSEN, S., MASON & V. C. DHANOA, M. S.. Hydrolysate preparation

for amino acid determinations in feed constituents. Journal of Animal Physiology

and Animal Nutritions. Vol. 63, no. 4, pg. 188-197. Apr, 1990.

BENSON, J.; LOUIE, P. C. & BRADSHAW, R. A.. Amino acid analysis of peptides.

In: The Peptides. Vol. 4, Academic Press, 1981.

BLAU, K.. Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. In: RATTENBURY, J. M..

Amino Acid Analysis. Chichester: Ellis Horwood, 1981. 380p.

BRAITHWAITE, A. & SMITH, F. J.. Chromatographic methods. 4 ed. London:

Chapman and Hall, 1985. 414 p.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Departamento Nacional de Defesa Animal. Divisão

de Laboratório Animal. Métodos Analíticos de Controle de Alimentos para Uso

Animal. São Paulo: Anfar, 1992. 208p.

CARISANO, A.. Digestione rapida delle proteine in matrici alimentari, com forno a

microonde – determinazione degli aminoacidi com esclusione di triptofano, cistina

e metionina. Industrie Alimentari. XXXI, pg. 891-895, 1992.

CHEN, S. T.; CHIOU, S. H.; CHU, Y. H. & WANG, K. T.. Rapid hydrolysis of

proteins and peptides by means of microwave technology and its application to

amino acid analysis. Int. J. Peptide Protein Res. Vol. 30, pg. 572-576, 1987.

CHIOU, S. H. & WANG, K. T.. Peptide and protein hydrolysis by microwave

irradiation. Journal of Chromatography. Vol. 491, pg. 424-431, 1989.

COCHRAM, W. G. & COX, G. M.. Diseños Experimentales. Quinta reimpressão.

México: Editorial Trillas, 1978. 661p.

125

CSAPÓ, J.. Determination of amino acid composition of foods and feeds using different

methods of protein hydrolysis. Elelmiszer - Vizsgalati Kozl. Vol. 29, no. 3-4, pg.

159 – 169, 1983.

CSAPÓ, J.; TOTH-POSFAI, I. & CSAPO-KISS, Z.. Optimization of hydrolysis in the

determination of amino acid contents in food and feed products. Acta Aliment. Vol

15, no. 1, pg. 3-21, 1986.

CSAPÓ, J.; CSAPÓ-KISS, Z.; FOLESTAD, S. & TIVESTEN, A..

Mercaptoethanesulphonic acid as a protecting and hydrolysing agent for the

determination of the amino acid composition of proteins using na elevated

temperature for protein hydrolysis. Analytica Chimica Acta. Vol. 289, no. 1, pg.

105-111, 1994.

DAVIES, M. G. & THOMAS, A. J.. An investigation of hydrolytic techniques for the

amino acid analysis of foodstuffs. J. Sci. Fd. Agric. Vol. 24, pg. 1525-1540, 1973.

DINTZIS, F. R.; CAVINS, J. F.; GRAF, E. & STAHLY, T.. Nitrogen-to-protein

conversion factors in animal feed and fecal samples. J. Anim. Sci.. Vol. 66, pg. 5-

11, 1988.

ENGELHART, W. G.. Microwave hydrolysis of peptides and proteins for amino acid

analysis. Am. Biotechnol. Lab. Vol. 8, no. 15, pg. 30, 32, 34, 1990.

FALLON, A.; BOOTH, R. F. G. & BELL, L. D.. Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular Biology: Applications of HPLC in Biochemistry.

Vol. 17. Amsterdam: Elsevier, 1987. 338 p. (3a. impressão,1993).

FARFÁN, J. A.. Química de Proteínas Aplicada à Ciência e Tecnologia dos

Alimentos. 2 ed.. Campinas: Unicamp, 1994. 134 p.

126

FOUNTOULAKIS, M. & LAHM, H. W.. Hydrolysis and amino acid composition

analysis of proteins. J. of Chromatography A. Vol. 826 (1998), pg. 109-134, 1998.

GEHRKE, C. W.; WALL, L. L.; ABSHEER, J. S.; KAISER, F. E & ZUMWALT, R.

W.. Sample preparation for chromatography of amino acids: acid hydrolysis of

proteins. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Vol. 68, no. 5, pg. 811-821, 1985.

GERHARDT, J. & MAUCHER, J.. Comparison of the method of hydrolysis with

respect to racemization and quantitative amino acid analysis of peptides. In:

SCHNEIDER, C. H.; EBERLE, A. N., eds. Peptides 1992. [s.n.]: ESCOM Science

Publishers, pg. 457-458, 1993.

GUIDONI, A. L.. Enfoque Multivariado e Bioeconômico na Análise de Experimentos

com Alimentação e Nutrição Animal. In: Coletânea de Seminários Internos

Apresentados na Embrapa Suínos e Aves. Concórdia: Embrapa Suínos e Aves,

1997.

HARPER, H. A.; RODWELL, V. W. & MAYES, P. A.. Manual de química

fisiológica. 5 ed.. Tradução de J. Reinaldo Magalhães. São Paulo: Ateneu, 1982.

736 p.

INGLIS, A. S.. Single hydrolysis method for all amino acids, including cysteine and

tryptophan. Methods Enzymol. Vol 91 (Enzyme struct., Pt I), pg. 26-36, 1983.

JENNINGS, W.. Gas Chromatography with Glass Capillary Columns. 2 ed. New

York: Academic Press, 1980. 320p.

KELLNER, R.; MEYER, H. E. & LOTTSPEICH, F.. Amino acid analysis. In:

KELLNER, R.; LOTTSPEICH, F. & MEYER, H. E.. Microcharacteristics

Proteins [s. n.]: VCH Weinheim, cap. 3.1, pg. 93-113, 1994.

127

LANFER MARQUEZ, U. M.. Preparo de amostras para a análise de aminoácidos em

proteínas alimentares. Bol. SBCTA. Vol 30, no. 1, pg. 19-27, 1996.

LEBET, V.; SCHNEIDER, E. A. & AMADÓ, R.. A critical appreciation of the protein

determination by Kjeldahl’s method based on the amino acid analysis. Mitt. Gebiete

Lebensm. Hyg. Vol. 85, no. 1, pg. 46-58, 1994.

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L. & COX, M. M.. Princípios de Bioquímica. 2

ed. Tradução: Arnaldo Antônio Simões e Wilson Roberto Navega Lodi. São Paulo:

Sarvier, 1995. 839 p.

LLAMES, C. R. & FONTAINE, J.. Determination of amino acids in feeds:

collaborative study. Journal of AOAC International. Vol. 77. No. 6, pg. 1362-

1402, 1994.

LOOKHART, G. L.; JONES, B. L.; COOPER, D. B. & HALL, S. B.. A method for

hydrolyzing and determining the amino acid compositions of picomole quantities of

proteins in less than 3 hours. Journal of Biochemical and Biophysical Methods.

Vol. 7. No. 1, pg. 15-23, 1982.

MARCONI, E.; PANFILI, G.; BRUSCHI, L.; VIVANTI, V. & PIZZOFERRATO, L..

Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in

food. Amino Acids. Vol. 8, no. 2, pg. 201-208, 1995.

MARGOLIS, S. A.; JASSIE, & KINGSTON, H. M.. The hydrolysis of proteins by

microwave energy. Journal of Automatic Chemistry. Vol 13, no. 3, pg. 93-95,

May-June 1991.

MEANS, G. E. & FEENEY, R. E.. Chemical modification of proteins. San Francisco:

Holden-Day, 1971. 254 p.

128

NAKAZAWA, M. & MANABE, K.. The direct hydrolysis of proteins containing

tryptophan on polyvinylidene difluoride membranes by mercaptoethanesulfonic acid

in the vapor phase. Analytical Biochemistry. Vol. 206, no. 1, pg. 105-108 1992.

NERY, H. D.. . Análise de aminoácidos na indústria de ração e na nutrição animal. In:

Seminário sobre a análise de aminoácidos em alimentos e outros materiais

biológicos. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos, 1994.

PADOVAN, G.. . Determinação de aminoácidos em fluidos fisiológicos e outros

materiais biológicos. In: Seminário sobre a análise de aminoácidos em alimentos

e outros materiais biológicos. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos,

1994.

PECAVAR, A.; PROSEC, M.; FERCEJ-TEMELJOTOV, D. & MARSEL, J..

Quantitative evaluation of amino acids using microwave accelerated hydrolysis.

Chromatographia. Vol. 30, no. 3-4, pg. 159-162, 1990.

PÉTER, A.; LAUS, G.; TOURWÉ, D.; GERLO, E. & VAN BINST, Gan evaluation of

microwave heating for the rapid hydrolysis of peptide samples for chiral amino acid

analysis. Peptide Research. Vol. 6, no. 1, pg. 48-52, 1993.

PETRUCCI, P. H. G.. Aminoácidos em suporte nutricional. In: Seminário sobre a

análise de aminoácidos em alimentos e outros materiais biológicos. Campinas:

Instituto de Tecnologia de Alimentos, 1994.

PHILLIPS, D. D.. A scheme for the rapid preparation of protein hydrolysates for amino

acid analysis. Journal of Food Science. Vol. 48, pg. 284-285, 1983.

PICKERING, M. V. & NEWTON, P.. Amino Acid Hydrolysis: Old Problems, New

Solutions. LC-GC. Vol. 8, pg. 778, 780-781, 1990.

129

ROACH, D. & GEHRKE, C. W.. The hydrolysis of proteins. Journal of

Chromatography. Vol. 52, pg. 393-404, 1970.

RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.. O uso de métodos oficiais em países em

desenvolvimento. In: IX Encontro Nacional de Micotoxinas: Livro de Resumos.

Florianópolis: Univ. Fed. Santa Catarina, pg. 15, 1998.

RODWELL, V. W.. Amino acids. In: MURRAY, R. K.; GRANNER, D. K.; MAYES,

P. A. & RODWELL, V. W.. Harper’s biochemistry. 24 ed.. Stamford: Appleton &

Lange, 1996. 868 p.

SALES, A. M.. Análise de aminoácidos na determinação da qualidade protéica dos

alimentos. In: Seminário sobre a análise de aminoácidos em alimentos e outros

materiais biológicos. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos, 1994.

SAS Institute Inc.. System for Microsoft Windows, release 6.12, Cary, NC, USA, 1996.

SAVOY, C. F., HEINIS, J. L. & SEALS, R. G.. Improved Methodology for Rapid and

Reproducible Acid Hydrolysis of Food and Purified Proteins. Analytical

Biochemistry. Vol. 68, pg. 562-571, 1975.

SHIMADZU CORPORATION. Shimadzu High-Performance Liquid Chromatograph

LC-10A/C-R7A Amino Acid Analysis System Instruction Manual. Kyoto, Japan,

1993.

SIENKO, M. J. & PLANE, R. A.. Química. 7 ed. Tradução de Ernesto Giesbrecht,

Lélia Mennucci, Viktória K. L. Osório e Minaco K. Kuya. São Paulo: Companhia

Editora Nacional, 1976. 605 p.

SLOCUM, R.; LEE, P. & ARRIZON-LOPEZ, V.. Standard protein hydrolyzate

analysis, alternate third buffer (Na-D). System 6300/7300 Application Notes.

Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, 1987.

130

SOSULSKI, F. W. & IMAFIDON, G. I.. Amino acid composition and nitrogen-to-

protein conversion factors for animal and plant foods. Journal of Agricultural and

Food Chemistry. Vol. 38, pg. 1351-1356. 1990.

SPINDLER, M.; STADLER, R. & TANNER, H.. Amino acid analysis of feedstuffs:

determination of methionine and cystine after oxidation with performic acid and

hydrolysis. J. Agric. Food Chem. Vol. 32, pg. 1366-1371, 1984.

SPITZ, H. D.. Amino acid determination – hydrolysis procedure. Anal. Biochem.. Vol.

56, pg. 66-73, 1973.

STEEL, R. G. D. & TORRIE, J. H.. Principles and Procedures of Statistics – A

Biomedical Approach. 2 ed. Auckland: McGraw-Hill International Book

Company, 1981. 633 p.

TRISTRAM, G. R. & RATTENBURY, J. M.. The Development of Amino Acid

Analysis. In: RATTENBURY, J. M.. Amino Acid Analysis. Chichester: Ellis

Horwood, 1981. 380p.

TSUGITA, A. & SCHEIFFLER, J. J.. A rapid method for acid hydrolysis of protein

with a mixture of trifluoroacetic acid and hydrochloric acid. Eur. J. Biochem. Vol.

124, no. 3, pg. 585-588, 1982.

VAN DER MEER, J. M. Amino Acid Analysis in the Netherlands: Four-Year

Proficiency Study. J. Off. Anal. Chem. Vol. 73. No. 3, pg. 394 –398, 1990.

YAMAGUCHI, M.. Determination of the nitrogen-to-protein conversion factor in

cereals. Moderne Methoden der Pflanzenalyse. Vol. 14 (Seed anal.), pg. 95-107,

1992.

131

WONG, W. S. D.; OSUGA, D. T.; BURCHAM, T. S. & FEENEY, R. E..

Determination of tryptophan as the reduced derivative by acid hydrolysis and

chromatography. Analytical Biochemistry. Vol. 143, pg. 62-70, 1984.

ZUMWALT, R. W.; ABSHEER, J. S.; KAISER, F. E. & GEHRKE, C. W.. Acid

hydrolysis of proteins for chromatographic analysis of amino acids. J. Assoc. Off.

Anal. Chem. Vol. 70, no.1, pg. 147-151, 1987.

preparo de hidrolisados protéicos e análise de aminoácidos por

Documents