uji in vitro penghambatan aktivitas α-amilase …

UJI IN VITRO PENGHAMBATAN AKTIVITAS α-AMILASE

KOMBINASI EKSTRAK AIR DAUN Andrographis Paniculata (Burm.f.)

Nees dan BATANG Tinospora Crispa (L.) Hook.f. & Thomson 1:3

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Carolina Loy Nau

NIM: 168114066

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

Persetujuan Pembimbing

UJI IN VITRO PENGHAMBATAN AKTIVITAS α-AMILASE

KOMBINASI EKSTRAK AIR DAUN Andrographis Paniculata (Burm.f.)

Nees dan BATANG Tinospora Crispa (L.) Hook.f. & Thomson 1:3

Skripsi yang diajukan oleh:


NIM: 168114066

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Dr. Yustina Sri Hartini, Apt tanggal 27 April 2020


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Dengan penuh syukur kepada Allah Bapa, Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria,

Saya persembahkan karya ini untuk:

Orangtua dan adik tercinta yang selalu memberikan doa dan dukungan yang tak

terhitung jumlahnya kepada saya.

Keluarga yang selalu memberikan semangat melalui doa dan peneguhan

Sahabat-sahabat yang senantiasa memotivasi, menghibur dan mendukung saya.

Dosen pembimbing dan teman-teman skripsi yang selalu membantu saya mulai

dari awal tahap penyusunan proposal, penelitian hingga saatnya saya dapat

menyelesaikan ujian skripsi saya.

Dan almamater tercinta, Universitas Sanata Dharma.


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan Syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena

atas segala rahmat dan belas kasih-Nya yang melimpah sehingga penelitian skripsi

yang berjudul ‘’UJI IN VITRO PENGHAMBATAN AKTIVITAS α-

AMILASE KOMBINASI EKSTRAK AIR DAUN Andrographis paniculata

(Burm.f) Nees dan BATANG Tinospora Crispa (L.) Hook.f. & Thomson 1:3’’

dapat terselesaikan dengan baik.

Penulis menyadari penulisan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan,

bimbingan, bantuan dan doa banyak pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini

tanpa mengurangi rasa hormat, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Dr.Yustina Sri Hartini, Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sekaligus dosen pembimbing

skripsi atas segala bimbingan, kritik, masukan, saran dan kesabarannya

dalam mendampingi penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.

2. Ibu Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Univeristas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji atas segala kritik

dan saran selama penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.

4. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt. selaku wakil dekan sekaligus

dosen penguji skripsi atas segala kritik dan saran selama penelitian dan

penyusunan naskah skripsi ini.

5. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Kepala

Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang

memberikan ijin penggunaan Laboratorium sehingga skripsi ini dapat

terselesaikan.

6. Mas Antonius Dwi Priyana dan Mas Sarwanto selaku Sekretariat S1

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan

informasi mengenai perkuliahan dan proses pengerjaan skripsi.

7. Pak Wagiran dan Pak Kayat yang telah banyak membantu selama proses

pengerjaan skripsi ini di laboratorium.


viii

8. Mama Ermalinda Lodja dan Adik Yohana Fransiska Gracia Nau yang

tidak pernah jemu memberikan dukungan, doa dan kekuatan selama

penyusunan skripsi ini.

9. Yasinta Rosario Oktobrin Lendo, Winarti Rambu Tagu Dima dan

Beatrix Woa Raga, yang selalu mendukung, menghibur, memberikan

semangat dan motivasi selama proses pengerjaan skripsi ini.

10. Rekan seperjuangan penelitian skripsi saya yaitu: Agustinus Nara

Tukan, Rani Langkeru, Agatha Maia, Vinsensius Rubin, Fila Delfia,

Fetiana Chrismaurin, Ayu Priscilia, Yohana, Maria Josephine dan Maria

Cyrilla, terimakasih atas semangat dan kerja samanya selama ini.

11. Teman-teman FSM B 2016, terima kasih atas kebersamaannya selama

ini.

12. Semua pihak yang memberikan dukungan, doa dan semangat yang tidak

dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa naskah skripsi ini masih jauh dari

sempurna dan terdapat kekurangan. Oleh karena itu penulis

mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar naskah ini

menjadi lebih baik. Akhir kata, penulis berharap agar skripsi ini

bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 27 April 2020

Penulis



ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI................................. vi

PRAKATA ............................................................................................................ vii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

ABSTRAK ........................................................................................................... xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

METODE PENELITIAN ........................................................................................ 2

Alat dan Bahan .................................................................................................... 2

Penyiapan Bahan Uji dan Determinasi tanaman ................................................. 3

Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto dan Batang Brotowali ............ 3

Pembuatan Ekstrak Air Daun Sambiloto ............................................................ 4

Pembuatan Esktrak Air Batang Brotowali .......................................................... 4

Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Daun Sambiloto dengan Kromatografi

Lapis Tipis ............................................................................................................ 5

Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Batang Brotowali dengan Kromatografi

Lapis Tipis ........................................................................................................... 5

Identifikasi Kualitatif Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan

Batang Brotowali 1:3 dengan Kromatografi Lapis Tipis ..................................... 6

Uji Penghambatan Enzim α-Amilase .................................................................. 6

Teknik Analisis Data Penelitian ........................................................................ 10

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 11

Determinasi Simplisia Daun Sambiloto dan Simplisia Batang Brotowali ........ 11

Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto .............................................. 11

Penetapan Kadar Air Simplisia Batang Brotowali ............................................. 11

Ekstraksi Daun Sambiloto dengan Pelarut air ................................................... 12

Ekstraksi Batang Brotowali dengan Pelarut Air ............................................... 13

Identifikasi Kualitatif Ekstrak Tunggal dan Kombinasi Ekstrak

Air Daun Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3 dengan

Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................... 13

Uji Pendahuluan Penghambatan Aktivitas Enzim α-Amilase........................... 16

Uji Penghambatan Aktivitas α-Amilase Oleh Kombinasi Ekstrak

Air Daun Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3 ................................................. 16

KESIMPULAN ..................................................................................................... 26

SARAN ................................................................................................................. 26

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 27

LAMPIRAN .......................................................................................................... 30

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 51


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Prosedur Uji Penghambatan Aktitas α-amilase ......................... 10

Tabel II. Nilai Rf dan Warna Hasil Uji KLT ........................................... 15

Tabel III. Nilai IC50 Standar Akarbose ...................................................... 20

Tabel IV. Nilai IC50 Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto

&Batang Brotowali 1:3 .............................................................. 22

Tabel V. Perbandingan Nilai IC50 Ekstrak Tunggal dan Kombinasi

Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Batang

Brotowali 1:3 .............................................................................. 24


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Profil KLT Ekstrak Air Daun Sambiloto .......................................... 13

Gambar 2. Profil KLT Ekstrak Air Batang Brotowali........................................ 14

Gambar 3. Profil KLT Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto

& Batang Brotowali 1:3 .................................................................... 14

Gambar 4. Hubungan Konsentrasi Akarbose dengan Persen (%)

Inhibisi Enzim α-Amilase Replikasi 1,

Replikasi 2 dan Replikasi 3 ............................................................... 19

Gambar 5. Hubungan Konsentrasi Kombinasi Ekstrak Air

Daun Sambiloto& Batang Brotowali 1:3 dengan Persen (%)

Inhibisi Enzim α-Amilase Replikasi 1,

Replikasi 2 dan Replikasi 3 ............................................................... 22

Gambar 6. Perbandingan Persen (%) Inhibisi Enzim α-Amilase Kombinasi

Ekstrak Air Daun Sambiloto &

Batang Brotowali 1:3 dan Akarbose ................................................. 24


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Identifikasi Serbuk Simplisia

Daun Sambiloto & Batang Brotowali ........................................... 31

Lampiran 2. Sertifikat Analisis Enzim α-Amilase ............................................ 32

Lampiran 3. Penetapan Kadar Air & Ekstraksi ................................................. 33

Lampiran 4. Data Penimbangan & Perolehan Rendemen

Ekstrak Air Daun Sambiloto ......................................................... 34

Lampiran 5. Data Penimbangan & Perolehan Rendemen

Ekstrak Air Batang Brotowali ....................................................... 37

Lampiran 6. Data Pengenceran Konsentrasi Kombinasi Ekstrak

Air Daun Sambiloto & Batang Brotowali 1:3

serta Standar Akarbose. ................................................................. 40

Lampiran 7. Gambar Optimasi Panjang Gelombang ........................................ 42

Lampiran 8. Perlakuan Optimasi Waktu Inkubasi ............................................ 43

Lampiran 9. Pengujian Blanko dan Kontrol Blanko ......................................... 44

Lampiran 10. Uji Penghambatan Aktivitas α-Amilase ....................................... 45

Lampiran 11. Data Hasil Perhitungan Persen (%) Inhibisi

dan IC50 Standar Akarbose dan Kombinasi Ekstrak

Air Daun Sambiloto & Batang Brotowali 1:3 ............................... 46

Lampiran 12. Sertifikat Pengujian dengan SPSS ................................................ 48

Lampiran 13. Hasil Uji Statistik IC50 Kombinasi Ekstrak Air

Daun Sambiloto & Batang Brotowali 1:3 dan Akarbose ............. 49


xiii

ABSTRAK

Latar Belakang: Diabetes melitus merupakan kelompok penyakit metabolik

dengan karakteristik hiperglikemia yang terjadi karena kelainan sekresi insulin,

kerja insulin atau kedua-duanya. Salah satu pendekatan terapetik untuk

mengatasinya adalah menghambat enzim α-amilase yang terlibat dalam digesti

karbohidrat, sehingga kadar glukosa darah menurun. Akarbose adalah salah satu

inhibitor α-amilase, namun menimbulkan efek samping yang mengganggu.

Sambiloto (Andrographis paniculata) dan brotowali (Tinospora crispa) telah

diketahui memiliki beberapa khasiat dalam pengobatan, salah satunya berpotensi

sebagai agen antidiabetes. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji

efektivitas antidiabetes dari kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang

brotowali 1:3 melalui penghambatan aktivitas α-amilase secara in vitro.

Metode: Ekstrak air daun sambiloto dibuat menggunakan teknik maserasi dengan

pelarut air dan ekstrak air batang brotowali dengan teknik dekok dengan pelarut air.

Aktivitas antidibates diukur melalui penghambatan aktivitas α-amilase yang

diinterpretasikan dalam nilai IC50.

Hasil: Kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 mampu

menghambat aktivitas α-amilase pada konsentrasi tertinggi dengan perolehan

persentase inhibisi 35,80 % dan dibandingkan akarbose 56,78 %. Nilai IC50 oleh

kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 adalah 30,34 mg/ml

dan akarbose 6,72 mg/mL. secara statitstik, kedua kelompok tersebut menunjukkan

perbedaan yang signifikan dengan P<0,05.

Kesimpulan: Kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3

menghambat aktivitas α-amilase.

Kata Kunci: Sambiloto, Brotowali, Akarbose, α-Amilase, Antidiabetes.


xiv

ABSTRACT

Background: Diabetes mellitus is a group of metabolic diseases with characteristic

hyperglycemia that occurs due to abnormalities of insulin secretion, insulin work

or both. One therapeutic approach to overcome it is to inhibit the enzyme α-amylase

involved in the concentration of carbohydrates, so that blood glucose levels are

decreased. Acarbose is one of the inhibitors of α-amylase, but it poses a disturbing

side effect. Sambiloto (Andrographis paniculata) and brotowali (Tinospora crispa)

have been known to have some medicinal properties, one of which is potentially an

antidiabetic agent. The purpose of this research is to test the effectiveness of

antidiabetic from the combination of sambiloto leaf water extract and brotowali

stem water extract 1:3 through inhibition of in vitro α-amylase activity.

Method: Sambiloto leaf water extract was made using maceration with water

solvent & brotowali stem water extract using decoction techniques with water

solvent. Antidiabetic activity is measured through inhibition of the interpreted α-

amylase activity in the value of IC50.

Result: Combination of sambiloto leaf water extract & brotowali stem water extract

1:3 is able to inhibit the activity of α-amylase at the highest concentrations with a

percentage of inhibition of 35,80% and compared to a 56,78% acarbose. The value

of IC50 by the combination of a sambiloto leaf water extract & brotowali stem water

extract 1:3 is 30,34 mg/ml and acarbose 6,72 mg/ml. Statisfically, the two groups

indicate a significant difference with P < 0.05.

Conclusion: Combination of sambiloto leaf water extract & brotowali stem water

extract 1:3 inhibits the activity of α-amylase.

Keyword: Sambiloto, Brotowali, Acarbose, α-Amylase, Antidiabetic.


1

PENDAHULUAN

Diabetes melitus merupakan suatu kelompok penyakit metabolik dengan

karakteristik hiperglikemia yang terjadi karena kelainan sekresi insulin, kerja

insulin atau kedua-duanya (Soelistijo et al., 2015). Diabetes melitus tipe 2 adalah

keadaan umum dan menjadi masalah kesehatan global yang serius. Prevalensi

diabetes melitus di Indonesia mengalami peningkatan yang signifikan dari tahun ke

tahun, yakni 6,9% di tahun 2013 menjadi 8,5% di tahun 2018. Sehingga estimasinya

dapat mencapai lebih dari 16 juta jiwa (Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia, 2018).

Postprandial hyperglicemia atau peningkatan kadar gula darah pasca makan

merupakan salah satu gangguan awal sebelum berkembangnya penyakit diabetes

melitus II lebih jauh di dalam tubuh. Hal ini sangat tergantung pada absorbsi

monosakarida, yang mana pemecahannya dikatalisis oleh salah satu enzim

penghidrolisis karbohidrat, yaitu α-amilase.

Salah satu pendekatan terapetik untuk mengobati diabetes melitus tipe II ini

adalah dengan jalan menghambat enzim α-amilase yang terlibat dalam digesti

karbohidrat, sehingga mengurangi pemecahan polisakarida menjadi oligosakarida

dan disakarida yang mengakibatkan penyerapan gula terhambat dan kadar glukosa

darah menurun. Akarbose merupakan salah satu agen antidiabetes oral yang

mekanisme aksinya menghambat aktivitas enzim α-amilase. Namun,

penghambatan ɑ-amilase pankreatik yang berlebihan dapat menyebabkan distensi

abdominal, flatulens dan diare.

Saat ini, inhibitor alami dari beberapa spesies tanaman obat telah

dikembangkan dan dipercaya dapat mengontrol kadar gula darah dengan sedikit

efek sekunder yang tidak diinginkan, lebih ekonomis dan terjangkau. Selain itu

pengobatan tradisional berbahan dasar produk alam semakin diminati masyarakat

karena dipercaya aman untuk dikonsumsi. Sathiavelu et al. (2013) menemukan

bahwa ekstrak air daun sambiloto dapat menginhibisi enzim α-amilase karena

mengandung senyawa andrografolid. Selain itu, ekstrak air batang brotowali juga

dapat mengatasi diabetes melitus dengan memodulasi konsentrasi Ca2+ sel ß


2

(Ahmad et al., 2016). Tetapi, belum diketahui secara pasti komponen-komponen

senyawa kimia yang bertanggung jawab terhadap aktivitas ekstrak air batang

brotowali sebagai antidiabetes. Di sisi lain, Hamid et al (2015) menunjukkan bahwa

hasil isolasi ekstrak metanol-kloroform batang brotowali yakni borapetosida c

merupakan senyawa aktif yang memiliki aktivitas inhibisi α-amilase paling poten.

Kombinasi ekstrak dari kedua tanaman tersebut diduga mampu memberikan

efek penghambatan aktivitas α-amilase yang sinergis. Penelitian sebelumnya yang

dilakukan secara in vivo, mengungkapkan bahwa kombinasi ekstrak air daun

sambiloto dan batang brotowali 1:3 merupakan formula yang memiliki aktivitas

antidiabetes paling baik dengan menghasilkan penurunan glukosa darah 36%

(Ismoyo & Tanjung, 2010). Namun, penelitian tersebut belum mengkaji adanya

mekanisme penghambatan enzim α-amilase yang terlibat.

Potensi kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali sebagai

antidiabetes dengan menghambat aktivitas α-amilase akan menjadi fokus dalam

penelitian ini. Disamping itu, pengujian mengenai inhibisi α-amilase kombinasi

kedua ekstrak tersebut belum banyak diteliti. Oleh karena itu penelitian ini perlu

dilakukan untuk mengetahui efektivitas kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan

batang brotowali 1:3 yang dapat digunakan oleh masyarakat luas untuk mengatasi

diabetes melitus. Uji penghambatan dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis

untuk mengukur serapan pada panjang gelombang maksimum.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, tabung reaksi,

corong, labu ukur, pipet tetes, glassfirn, pipet volume, batang pengaduk, cawan

porselen, gelas ukur, sendok, glass beaker, platform shaker (Innova 2100), rotary

evaporator (Buchi), inkubator, mikropipet, kertas saring, lempeng KLT, timbangan

analitik, vortex, inkubator dan spektrofotometer UV-Vis (UVmini-1240

Shimadzu).


3

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah, simplisia daun

sambiloto dan simplisia batang brotowali yang diperoleh dari PT.HRL

Internasional Jawa Timur, enzim ɑ-amilase sigma Aldrich®, DMSO 1%, aquadest

steril (aquabides), reagen iodin, pati, HCl 1N, NaOH 1M, natrium fosfat, standar

andrografolid sigma Aldrich®, standar kuersetin, metanol pro analisis, kloroform

pro analisis, etanol pro analisis dan tablet akarbose @50 mg.

Penyiapan Bahan Uji dan Determinasi tanaman

Bahan uji daun sambiloto dan batang brotowali yang diperoleh dari PT.HRL

Internasional Jawa Timur berupa serbuk simplisia. Determinasi atau identifikasi

serbuk simplisia daun sambiloto dan simplisia batang brotowali dilakukan di

Departemen Biologi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto dan Batang Brotowali

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluena. Prosedur

kerjanya adalah pereaksi toluena jenuh air dibuat terlebih dahulu dengan cara

mengocok toluene P dengan sedikit air (20 mL) kemudian dibiarkan terpisah dan

lapisan air dibuang. Setelah itu, masing-masing 10 g simplisia kering daun

sambiloto dan batang brotowali serta 200 mL toluen jenuh air dimasukkan ke dalam

labu. Toluen jenuh air dimasukkan ke dalam tabung penerima melalui pendingin

sampai leher alat penampung dan labu dipanaskan dengan hati-hati selama 15

menit. Setelah toluen mulai mendidih penyulingan diatur dengan kecepatan lebih

kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan

penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Penyulingan dilanjutkan selama 5

menit. Setelah selesai, tabung penerima didinginkan hingga suhu ruang dan

kemudian volume air dibaca setelah air dan toluen terpisah. Kadar air dihitung

menggunakan rumus:

Kadar air = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑖𝑟 (𝑚𝐿)

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 (𝑚𝑔) 𝑥 100%

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2013)


4

Pembuatan Ekstrak Air Daun Sambiloto

Ekstrak air daun sambiloto dibuat dengan metode ekstraksi maserasi.

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditimbang dan dilarutkan ke dalam 100 ml

aquadest, ditutup, kemudian dibiarkan selama 24 jam, terlindung dari cahaya

matahari, dan sambil diaduk dengan menggunakan alat shaker. Hasil maserat

kemudian disaring dengan menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas

saring Whatman No. 1 sambil di vakum. Serbuk hasil penyarian dimaserasi kembali

dengan pelarut baru sebanyak 100 ml selama 24 jam, proses maserasi ini dilakukan

sebanyak 2 kali (Sathiavelu et al., 2013).

Hasil maserat pertama, kedua dan ketiga kemudian dimasukkan ke dalam

rotary evaporator pada suhu 50oC untuk menguapkan pelarut yang terdapat pada

ekstrak. Kemudian, ekstrak diletakkan pada cawan porselen dan diuapkan kembali

menggunakan waterbath pada suhu 600-75oC untuk menghilangkan pelarut yang

masih terdapat dalam ekstrak. Ekstrak yang didapatkan merupakan ekstrak kental

dengan bobot tetap sesuai dengan syarat yang ada. Selanjutnya, rendemen dihitung

menggunakan rumus:

% rendemen = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 (𝑔)

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 (𝑔) 𝑥 100%

(Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2011)

Pembuatan Esktrak Air Batang Brotowali

Ekstrak air batang brotowali dibuat dengan metode ekstraksi dekok.

Simplisia batang brotowali ditimbang sebanyak 10 g lalu dicampur dan dilarutkan

dalam aquadest sejumlah 100 mL, kemudian dipanaskan di atas penangas air

menggunakan panci selama 30 menit terhitung mulai suhu 900C sambil sekali-

sekali diaduk. Serkai selagi masih panas dengan kain flannel, lalu ditambahkan air

panas secukupnya melalui ampas. Kemudian ekstrak diuapkan lagi di atas

waterbath bersuhu 600C untuk menghilangkan pelarut yang terdapat di dalam

ekstrak (Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2011). Selanjutnya rendemen

dihitung menggunakan rumus:

% rendemen = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 (𝑔)

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 (𝑔) 𝑥 100%


5

Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Daun Sambiloto dengan Kromatografi

Lapis Tipis.

Kandungan fitokimia andrografolid dalam ekstrak air daun sambiloto

ditetapkan dengan metode kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan

adalah silika gel F254. Campuran pelarut kloroform dan metanol (9:1) digunakan

sebagai fase gerak. Senyawa standar andrografolid (sigma) digunakan sebagai

pembanding yang dibuat dalam larutan 0,1% (b/v) dalam pelarut etanol p.a. Larutan

uji (sampel) 5% b/v dibuat dengan melarutkan ekstrak air daun sambiloto dalam

etanol. Sebanyak 20 µL sampel uji ekstrak air daun sambiloto dan 2 µL larutan

standar andrografolid ditotolkan pada lempeng silika gel F254 dan dikering

anginkan. Plat KLT dimasukkan ke dalam chamber KLT yang telah dijenuhi oleh

fase gerak. Totolan dielusi sepanjang 10 cm dan selanjutnya dikering anginkan.

Bercak dibaca di bawah sinar UV 254 nm dan selanjutnya dilakukan perhitungan

nilai retardation factor (Rf) menggunakan rumus:

Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑧𝑎𝑡

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡


Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Batang Brotowali dengan Kromatografi

Lapis Tipis.

Kandungan fitokimia ekstrak air batang brotowali diidentifikasi

menggunakan kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah silika gel

F254. Campuran pelarut kloroform dan metanol (9:1) digunakan sebagai fase gerak.

Senyawa standar kuersetin 0,1% (b/v) dalam pelarut metanol digunakan sebagai

pembanding. Larutan uji (sampel) 1% b/v dibuat dengan melarutkan ekstrak air

batang brotowali dalam metanol. Sebanyak 10 µL sampel uji ekstrak air daun

sambiloto dan 5 µL larutan standar kuersetin ditotolkan pada lempeng silika gel

F254 dan dikering anginkan. Plat KLT dimasukkan ke dalam chamber KLT yang

telah dijenuhi oleh fase gerak. Totolan dielusi sepanjang 10 cm dan selanjutnya

dikering anginkan. Bercak dibaca dengan menyemprotkan sitroborat LP lalu

lempeng dipanaskan pada suhu 1000C selama 5-10 menit serta di bawah UV 254


6

nm dan 366 nm. Kemudian dihitung nilai retardation factor (Rf) dengan

menggunakan rumus:




Identifikasi Kualitatif Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Batang

Brotowali 1:3 dengan Kromatografi Lapis Tipis.

Kandungan fitokimia kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang

brotowali diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis. Fase diam yang

digunakan adalah silika gel F254. Campuran pelarut kloroform dan metanol (9:1)

digunakan sebagai fase gerak. Senyawa standar andrografolid (sigma) 0,1% (b/v)

dalam pelarut etanol dan kuersetin 0,1% (b/v) dalam pelarut metanol digunakan

sebagai pembanding. Larutan uji nya adalah kombinasi ekstrak air daun sambiloto

dan batang brotowali 1:3 dalam pelarut DMSO 1%. Sebanyak 30 µl sampel uji dan

larutan standar andrografolid 2 µL serta 5 µL kuersetin ditotolkan pada lempeng

silika gel F254, kemudian dikering anginkan. Plat KLT dimasukkan ke dalam

chamber KLT yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Totolan dielusi sepanjang 8 cm

dan selanjutnya dikering anginkan. Bercak dibaca di bawah UV 254 nm dan 366

nm. Kemudian dihitung nilai retardation factor (Rf) dengan menggunakan rumus:



Uji Penghambatan Enzim α-Amilase

Penyiapan Larutan Uji

Penyiapan larutan uji meliputi pembuatan larutan dapar fosfat pH 6,9;

larutan HCl 1N; NaOH 1M; larutan enzim α-amilase pengenceran 100x; larutan

substrat amilum 1% b/v; pembuatan larutan uji kombinasi ekstrak air daun

sambiloto dan batang brotowali; dan pembuatan larutan pembanding akarbose.

Optimasi Panjang Gelombang Maksimum

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan ekstrak konsentrasi 1,25

mg/ml (dibuat dengan melakukan pengenceran seri konsentrasi 10; 7,5; 5; 2,5 dan


7

1,25 mg/mL) sejumlah 1 mL dan larutan enzim α-amilase dalam dapar fosfat PH

6,9 (0,02 M natrium fosfat dengan 0,006 M natrium klorida) sejumlah 1 mL

dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu

370c. Kemudian larutan ditambahkan 1 mL larutan pati 1% b/v dan diinkubasi

Kembali selama 15 menit pada suhu 370C. Selanjutnya, larutan campuran tersebut

ditambahkan 1 mL HCl 1 N untuk mengakhiri reaksi enzimatik yang diikuti dengan

penambahan 0,1 mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur

menggunakan spektrofotometer pada kisaran panjang gelombang 400-800 nm.

Dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Optimasi Waktu Inkubasi

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan ekstrak konsentrasi 1,25

mg/ml sejumlah 1 mL dan larutan enzim α-amilase dalam dapar fosfat PH 6,9 (0,02

M natrium fosfat dengan 0,006 M natrium klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke

dalam tabung reaksi. Larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 370c.

Kemudian larutan ditambahkan 1 mL larutan pati 1% b/v dan diinkubasi kembali

selama 5; 10; 15; 15; 20; 25; 30; 40; 50; dan 60 menit pada suhu 370c. Selanjutnya,

larutan campuran tersebut ditambahkan 1 mL HCl 1 N untuk mengakhiri reaksi

enzimatik yang diikuti dengan penambahan 0,1 mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm

KI). Serapan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum. Dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Pengujian Larutan Blanko

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan DMSO 1% sejumlah 1

mL, larutan enzim α-amilase dalam dapar fosfat PH 6,9 (0,02 M natrium fosfat

dengan 0,006 M natrium klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke dalam tabung

reaksi. Larutan diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit, kemudian ditambahkan

1 ml larutan substrat amilum 1% b/v sejumlah 1 mL. Kemudian larutan campuran

diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15 menit. Selanjutnya, larutan campuran

tersebut ditambahkan HCl 1 N sebanyak 1 mL untuk menghentikan reaksi

enzimatik, diikuti dengan penambahan 0,1 mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI).


8

Serapan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum. Dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Pengujian Larutan Kontrol Blanko

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 3 mL, larutan DMSO 1% sejumlah 1

mL, dimasukkan ke dalam tabung reaksi (tanpa penambahan larutan enzim).

Larutan diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit, lalu ditambahkan larutan

substrat amilum 1% b/v sejumlah 1 mL. Kemudian, larutan diinkubasi pada suhu

370C selama 15 menit. Selanjutnya, larutan campuran tersebut ditambahkan 1 mL

HCl 1N untuk menghentikan reaksi enzimatik yang diikuti dengan penambahan 0,1

mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan sebanyak 3 kali

replikasi.

Pengujian Larutan Uji Sampel

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan uji ekstrak dengan

variasi konsentrasi 10; 7,5; 5; 2,5 dan 1,25 mg/ml sejumlah 1 ml dan larutan enzim

α-amilase dalam dapar fosfat PH 6,9 (0,02 M natrium fosfat dengan 0,006 M

natrium klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Larutan

diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit. Lalu, ditambahkan larutan substrat

amilum 1% b/v sejumlah 1 mL dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15

menit. Selanjutnya, ke dalam larutan campuran tersebut di tambahkan 1 mL HCl

1N untuk menghentikan reaksi enzimatik, yang diikuti dengan penambahan 0,1 mL

reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan sebanyak 3 kali

replikasi.

Pengujian Larutan Kontrol Sampel

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan uji ekstrak dengan

variasi konsentrasi 10; 7,5; 5; 2,5 dan 1,25 mg/mL sejumlah 1 mL dan larutan dapar

fosfat PH 6,9 tanpa larutan enzim (0,02 M natrium fosfat dengan 0,006 M natrium

klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Larutan diinkubasi


9

pada suhu 370C selama 10 menit. Lalu, ditambahkan larutan substrat amilum 1%

b/v sejumlah 1 mL dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15 menit.

Selanjutnya, ke dalam larutan campuran tersebut di tambahkan 1 mL HCl 1N untuk

menghentikan reaksi enzimatik, yang diikuti dengan penambahan 0,1 mL reagen

iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang maksimum. Dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Pengujian Larutan Pembanding Akarbose

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan pembanding akarbose

dengan variasi konsentrasi 10; 7,5; 5; 2,5 dan 1,25 mg/mL sejumlah 1 mL dan

larutan enzim α-amilase dalam dapar fosfat PH 6,9 (0,02 M natrium fosfat dengan

0,006 M natrium klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

Larutan diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit. Lalu, ditambahkan larutan

substrat amilum 1% b/v sejumlah 1 mL dan diinkubasi kembali pada suhu 370C

selama 15 menit. Selanjutnya, ke dalam larutan campuran tersebut di tambahkan 1

mL HCl 1N untuk menghentikan reaksi enzimatik, yang diikuti dengan

penambahan 0,1 mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan

sebanyak 3 kali replikasi.

Pengujian Larutan Kontrol Akarbose

Larutan dapar fosfat pH 6,9 sebanyak 2 mL, larutan pembanding akarbose

dengan variasi konsentrasi 10; 7,5; 5; 2,5 dan 1,25 mg/mL sejumlah 1 mL dan

larutan dapar fosfat PH 6,9 tanpa penambahan larutan enzim (0,02 M natrium fosfat

dengan 0,006 M natrium klorida) sejumlah 1 mL dimasukkan ke dalam tabung

reaksi. Larutan diinkubasi pada suhu 370C selama 10 menit. Lalu, ditambahkan

larutan substrat amilum 1% b/v sejumlah 1 mL dan diinkubasi kembali pada suhu

370C selama 15 menit. Selanjutnya, ke dalam larutan campuran tersebut di

tambahkan 1 mL HCl 1N untuk menghentikan reaksi enzimatik, yang diikuti

dengan penambahan 0,1 mL reagen iodin (5Mm I2 dan 5Mm KI). Serapan diukur

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan

sebanyak 3 kali replikasi.


10

Tabel I. Prosedur Uji Penghambatan Aktitas α-amilase

Reagen Volume (ml)

Blanko

(B)

Kontrol

Blanko

(KB)

Sampel (S) Kontrol

Sampel

(KS)

Sampel (Akarbose/ekstrak

dengan konsentrasi 1,25;

2,5; 5; 7,5 dan 10 mg/mL)

- - 1 1

DMSO 1 1 - -

Dapar fosfat PH 6,9 2 3 2 3

Enzim Pengenceran 100 x 1 - 1 -

Inkubasi pada 370C, 10 menit

Substrat amilum 1% b/v 1 1 1 1

Inkubasi pada 370C, 15 menit

HCl 1 N 1 1 1 1

Reagen iodin 0,1 0,1 0,1 0,1

Volume Total 6,1 6,1 6,1 6,1

Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimal

Teknik Analisis Data Penelitian

Data dianalisis secara statistik diawali dengan menguji distribusi normalitas

dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila diperoleh data terdistribusi normal (P>0,05),

dilanjutkan dengan uji sampel tidak berpasangan (idendependent sample t-test)

dengan taraf kepercayaan 95% dan jika P<0,05 dipertimbangkan signifikan secara

statistik.

Perhitungan aktivitas inhibisi enzim α-amilase dapat dihitung dengan

rumus:

% Inhibisi = 1 − 𝐴1−𝐴2

𝐴0 𝑥 100%

Keterangan:

A1 = absorbansi Sampel Uji (ekstrak/pembanding)

A2 = absorbansi kontrol (sampel uji tanpa enzim)

A0 = Absorbansi kontrol negatif (blanko)


11

Konsentrasi larutan uji yang menghambat 50% enzim α-amilase dihitung

setelah mendapatkan regresi y= bx+a. Dimana sumbu x adalah konsentrasi sampel

dan sumbu y adalah % inhibisi.

IC50 = 50−𝑎

𝑏

(Yesmin et al., 2019)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi Simplisia Daun Sambiloto dan Simplisia Batang Brotowali

Tujuan determinasi adalah untuk mendapatkan kebenaran identitas dengan

jelas dari tanaman yang diteliti dan untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam

pengumpulan bahan utama penelitian. Determinasi dilakukan dengan identifikasi

serbuk simplisia daun sambiloto dan simplisia batang brotowali di Departemen

Biologi, Fakultas Farmasi, UGM. Berdasarkan hasil identifikasi, sampel tersebut

adalah benar tanaman brotowali atau Tinospora crispa (L.) Hook.f.& Thomson dan

tanaman sambiloto atau Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees, masing-masing

dari suku Menispermaceae dan Acanthaceae (Lampiran 1).

Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto

Penetapan kadar air simplisia daun sambiloto mengacu pada Farmakope

Herbal Indonesia (2011) yaitu menggunakan metode destilasi toluena. Serbuk

simplisia daun sambiloto yang ditimbang 10,0067 gram. Sedangkan volume air

yang didapatkan adalah 0,5 mL. Maka kadar air serbuk simplisia daun sambiloto

adalah 4,99%. Hal ini menunjukkan bahwa simplisia yang digunakan sudah

memenuhi syarat kadar air yang sudah ditetapkan yaitu ≤ 10%.

Penetapan Kadar Air Simplisia Batang Brotowali

Penetapan kadar air simplisia batang brotowali mengacu pada Farmakope

Herbal Indonesia (2011) yaitu menggunakan metode destilasi toluena. Serbuk

simplisia batang brotowali yang ditimbang berturut-turut adalah dan 10,0067 gram.

Volume air yang didapatkan adalah 0,9 mL. Maka kadar air serbuk simplisia batang


12

brotowali adalah 8,966%. Hal ini menunjukkan bahwa simplisia yang digunakan

sudah memenuhi syarat kadar air yang sudah ditetapkan yaitu ≤ 10%.

Ekstraksi Daun Sambiloto dengan Pelarut air

Penelitian ini menggunakan metode remaserasi sebagai metode

pengesktraksi simplisia daun sambiloto, dimana remaserasi merupakan salah satu

metode modifikasi dari maserasi. Maserasi adalah proses penyarian simplisia

menggunakan pelarut dengan perendaman dan beberapa kali pengadukan pada

temperatur ruangan. Sedangkan remaserasi merupakan metode ekstraksi yang mana

terjadi pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyarian maserat

pertama, kedua dan ketiga. Pelarut kedua ditambahkan sebanyak penambahan

pelarut pertama, dan seterusnya (Departemen Kesehatan RI, 2000).

Beberapa metode ekstraksi dengan cara panas dapat berdampak negatif

terhadap perolehan andrografolid seperti mengakibatkan terjadinya degradasi

termal, karena senyawa andrografolid merupakan senyawa yang resisten terhadap

panas dan maserasi menghasilkan rendemen terbanyak (33,3%) dibandingkan

menggunakan pemanasan dan gelombang ultrasonik (30,4%), perolehan ini

dikondisikan dengan pelarut etanol (Rafi,2014). Rentang terjadinya degradasi

andrografolid tergantung dari temperatur dan komposisi pelarut yang digunakan.

Menggunakan suhu 600c atau dibawahnya cukup untuk meminimalisir terjadinya

degradasi komponen. Sedangkan menggunakan pelarut metanol dan air (air dalam

jumlah berlebih) dapat menyebabkan terjadinya degradasi andrografolid menjadi

deoxandrografolid karena dapat meingkatkan titik didih metanol sehingga kuantitas

andrografolid berkurang (Kumoro et al., 2009). Pelarut yang digunakan sebagai

cairan penyari dalam penelitian ini adalah air. Air dipertimbangkan sebagai cairan

penyari karena murah, mudah diperoleh, stabil, tidak beracun, tidak mudah

menguap dan terbakar. Namun, hanya menghasilkan andrografolid yang sedikit

karena kelarutannya yang rendah di dalam air. Rendemen ekstrak air daun

sambiloto yang diperoleh pada tiga kali replikasi, masing-masing adalah 16,98%;

12,97% dan 17,96%.


13

Ekstraksi Batang Brotowali dengan Pelarut Air

Batang brotowali mengandung borapetosida c yang merupakan golongan

diterpen glikosida dan bersifat polar. Sehingga pada penelitian ini proses ekstraksi

batang brotowali dilakukan dengan metode dekok. Dekok adalah ekstraksi dengan

pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air

mendidih, temperatur terukur 900C) dengan waktu 30 menit dan temperatur sampai

titik didih air yaitu 1000c. Kemudian, untuk menghilangkan sedikit pelarut

diuapkan lagi menggunakan waterbath pada suhu 600c untuk memperoleh ekstrak

kental dan dihitung persen rendemen. Adapun rendemen ekstrak air batang

brotowali yang diperoleh pada tiga kali pengulangan, masing-masing adalah

26,78%; 20,81%; dan 24,45%.

Identifikasi Kualitatif Ekstrak Tunggal dan Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3 dengan Kromatografi Lapis Tipis

Identifikasi golongan senyawa kimia bertujuan untuk mengetahui

kandungan golongan senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak. Identifikasi

dilakukan pada kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3.

Kuersetin dan andrografolid digunakan sebagai senyawa marker untuk melihat ada

atau tidaknya golongan senyawa yang diuji. Hasil identifikasi golongan senyawa

kimia dapat dilihat pada Tabel II.

Gambar 1. Profil KLT Ekstrak Air Daun Sambiloto

S

a

2 b

2


14

Keterangan gambar: Pemeriksaan di bawah sinar UV 254 nm. P:

Pembanding atau marker andrografolid. S: Sampel ekstrak air daun sambiloto; a.

Senyawa dengan Rf 0,85; b. Senyawa dengan Rf 0,91.

Gambar 2. Profil KLT Ekstrak Air Batang Brotowali

Keterangan gambar: Pemeriksaan di bawah sinar UV 366 nm. P:

Pembanding atau Marker Kuersetin. S: Sampel Ekstrak Air Batang Brotowali; a.

Senyawa dengan Rf 0,21; b. Senyawa dengan Rf 0,71.

Gambar 3. Profil KLT Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto& Batang

Brotowali 1:3

Keterangan gambar: Pemeriksaan di bawah sinar UV 366 nm (kiri) dan 254 nm

(kanan). P1: Pembanding Andrografolid; P2: pembanding kuersetin dan S:

Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3

S

S S

a

2

b


15

Tabel II. Nilai Rf dan Warna Hasil Uji KLT

Deteksi Bercak yang diperoleh Nilai Rf Senyawa Warna

UV 254 nm

(Ekstrak air

daun

sambiloto)

Marker andrografolid

(P)

0,61 Hitam

Bercak a (S) 0,85 Hitam

Bercak b (S) 0,91 Hitam

UV 366 nm

(Ekstrak air

batang

brotowali)

Marker kuersetin (P) 0,55 Hijau

Bercak a (S) 0,21 Hijau

Bercak b (S) 0,71 Hijau

UV 254 nm

(Kombinasi

ekstrak air

daun

sambiloto

dan batang

brotowali

1:3

Marker andrografolid

(P1)

Marker kuersetin (P2)

Sampel kombinasi

ekstrak air daun

sambiloto dan batang

brotowali 1:3 tidak

menunjukkan bercak

seperti pembanding

0,95

0,89

-

Hitam

Hitam

-

UV 366 nm

(Kombinasi

ekstrak air

daun

sambiloto

dan batang

brotowali

1:3)

Marker kuersetin (P2)

Sampel kombinasi

ekstrak air daun


brotowali 1:3 tidak

menunjukkan bercak

seperti pembanding

0,89

-

Hijau

Fase diam yang digunakan adalah plat silika gel GF254, yang artinya terdiri

dari silika gel dengan pengikat dan indikator fluorosensi. Huruf ‘F’ menunjukkan

adanya indikator UV gelombang pendek (short wave) yang berpendar pada 254 nm.

Biasanya berfluorosensi kehijauan jika dilihat pada sinar UV 254 nm dan akan

tampak gelap saat disinari UV 366 nm. Berdasarkan Farmakope Herbal Indonesia

(2008), pembanding yang digunakan untuk ekstrak daun sambiloto adalah

andrografolid, dan ekstrak batang brotowali menggunakan kuersetin (Farmakope

Herbal Indonesia, 2013). Pada pengujian ini, dapat dilihat bahwa ekstrak air daun

sambiloto menghasilkan nilai Rf yang berbeda dengan marker andrografolid, tetapi


16

warna bercak yang dihasilkan sama dengan senyawa marker. Oleh karena itu,

belum dapat dipastikan dengan jelas bahwa ekstrak air daun sambiloto mengandung

andrografolid. Hal ini dapat diakibatkan karena polaritas pelarut air di dalam

andrografolid yang rendah, sehingga memungkinkan kuantitasnya rendah di dalam

ekstrak air dan menghasilkan Rf yang berbeda dengan senyawa marker. Di sisi lain,

ekstrak air batang brotowali juga menunjukkan hal yang sama, dimana nilai Rf

senyawa marker berbeda dengan sampel yang diuji, tetapi menghasilkan warna

bercak yang sama. Hasil kromatogram pada ekstrak air batang brotowali

kemungkinan menunjukkan golongan flavonoid lain selain kuersetin, seperti

katekin, luteolin, morin dan rutin (Amom et al., 2009). Selain itu, bercak juga

menampilkan warna biru yang menandakan bahwa batang brotowali mengandung

senyawa golongan terpenoid (Warsinah et al., 2015) dan harus dipastikan lagi

dengan menyemprotkan pereaksi kimia yang dapat mendeteksi keberadaan

golongan senyawa tersebut. Sedangkan kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan

batang brotowali 1:3 tidak menunjukkan bercak flavonoid dan andrografolid yang

jelas, sehingga Rf keduanya tidak dapat ditentukan. Sehingga, perlu adanya

pengujian lanjutan untuk mempertegas keberadaan kandungan andrografolid dan

kuersetin di dalam ekstrak air tunggal daun sambiloto dan batang brotowali serta

kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3.

Uji Pendahuluan Penghambatan Aktivitas Enzim α-Amilase

Sebelum menguji adanya efek penghambatan pada kombinasi ekstrak air

daun sambiloto dan batang brotowali 1:3, pertama-tama dilakukan uji pendahuluan

berupa optimasi panjang gelombang maksimum dan waktu inkubasi agar saat

pengujian menghasilkan aktivitas inhibisi yang optimal.

Optimasi panjang gelombang bertujuan untuk melihat panjang gelombang

yang menghasilkan serapan maksimum. Selain itu, agar dapat memberikan

kepekaan sampel yang maksimal dan memberikan hasil yang cukup konstan jika

dilakukan pengukuran berulang. Pengukuran dilakukan menggunakan konsentrasi

kombinasi ekstrak terkecil yaitu 1,25 mg/mL sebagai pengganti senyawa standar

murni (andrografolid dan borapetosida c) dengan spektrofotometer UV-Vis pada


17

rentang panjang gelombang 400-800 nm. Hasil bacaan serapan maksimum yang

diperoleh adalah 635,5 nm. Beberapa penelitian menggunakan panjang gelombang

yang berbeda seperti Akoro et al. (2017) dan Yesmin et al. (2019) panjang

gelombang yang digunakan adalah 620 nm serta Subba et al. (2019) menggunakan

panjang gelombang 630 nm. Hasil panjang gelombang yang bervariasi ini dapat

diakibatkan dari subjek yang diteliti berbeda-beda, Akoro et al. (2017) menguji

penghambatan aktivitas α-amilase pada daun Petiveria alliacea (singalawang) dan

Yesmin et al. (2019) menguji pada kulit Michelia campaca (cempaka wangi) serta

Subba et al. (2019) menguji pada Persea americana mill (avokad), Rhododendron

arboretum sm. Rubus ellipticus sm (Raspberry Himalaya emas), yang mana semua

penelitian ini juga menggunakan metode pengujian iodin-pati pada penghambatan

aktivitas α-amilase.

Penentuan waktu inkubasi dilakukan sama seperti pada pengujian panjang

gelombang maksimum, dengan variasi waktu inkubasi adalah menit ke-

5,10,15,20,25,30,40,50,60 secara triplo. Pengukuran dilakukan menggunakan

panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh yaitu 635,5 nm. Tujuan

penetapan waktu inkubasi adalah untuk mendapatkan waktu pengukuran pada saat

reaksi telah berjalan optimal yang ditandai dari absorbansi yang stabil, sehingga

dapat memaksimalkan pengukuran. Dari pengukuran diperoleh waktu inkubasi

adalah 15 menit.

Uji Penghambatan Aktivitas α-Amilase Oleh Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3

Uji penghambatan aktivitas α-amilase dilakukan menggunakan metode

pengujian iodin pati. Metode ini mengukur serapan sisa pati sebagai substrat yang

terbentuk setelah diberi perlakuan dengan enzim α-amilase (Abdullah & Kasim,

2017) dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum yaitu 635,5 nm.

Prosedur pengujian penghambatan aktivitas α-amilase oleh standar

akarbose dan kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 tersaji

secara ringkas pada tabel I. Pada pengujian ini, terdapat beberapa perbedaan seperti


18

pengujian blanko tidak menggunakan sampel ekstrak dan hanya berisikan larutan

dapar fosfaf PH 6,9, DMSO, larutan enzim pengenceran 100x, substrat pati, HCl

1N dan reagen iodin. Sedangkan kontrol blanko tidak mengandung ekstrak dan

enzim dan hanya berisikan larutan dapar fosfat PH 6,9, DMSO, substrat pati, HCl

1N dan reagen iodin. Sedangkan pada pengujian sampel (standar akarbose dan

kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3) menggunakan

larutan sampel dan enzim. Namun, pada kontrol sampel larutan enzim tidak

diikutsertakan dalam pengujian.

α-Amilase adalah suatu enzim pencernaan yang bertugas untuk

mempercepat laju reaksi dalam langkah awal hidrolisis glukosa, tetapi tidak

berubah secara kimiawi pada akhir reaksi. Jangkauan hidrolisis tersebut tergantung

dari berapa lama enzim bereaksi. Jika pati terhidrolisis sempurna, maka akan

menghasilkan produk glukosa. Hadir tidaknya pati dalam larutan dapat dilihat

menggunakan reagen iodin (I2). Iodin membentuk kompleks biru kehitaman dengan

pati, tetapi tidak bereaksi dengan glukosa. Jika iodin ditambahkan ke dalam larutan

glukosa, warna yang terlihat hanya merah atau kuning dari iodin. Sementara itu,

semakin cepat warna biru pati menghilang, semakin cepat pula enzim bekerja. Jika

α-amilase diinaktivasi, maka tidak bisa lagi menghidrolisis pati, sehingga kompleks

warna biru pati-iodin akan bertahan (tetap berwarna biru).

Salah satu strategi pengobatan diabetes melitus tipe II adalah dengan jalan

menghambat enzim α-amilase. Penghambatan α-amilase intestinal nantinya akan

menunda degradasi monosakarida sekaligus absorbsi glukosa, sehingga

mengakibatkan kadar glukosa darah postprandial menurun (Gondokesumo et al.,

2017). Inhibitor-inhibitor α-amilase juga sering disebut starch blockers

sebagaimana mereka mencegah atau memperlambat hidrolisis ikatan glikosidik

glukosa (starch)-1,4 dan oligosakarida menjadi maltosa, maltriosa dan bentuk

sederhana gula lainnya (Wickramaratne et al., 2016).

Pada pengujian ini, akarbose digunakan sebagai pembanding karena

merupakan salah satu agen inhibitor α-amilase (selain sebagai inhibitor α-

glukosidase) yang umum digunakan untuk memanajemen kadar glukosa pada

pasien diabetes melitus tipe 2 dan banyak digunakan sebagai pembanding pada


19

berbagai literatur (Oboh et al., 2016; Mandal & Reddy, 2016; Yesmin et al., 2019).

Konsentrasi larutan induk akarbose yang dibuat adalah 100 mg/mL. Kemudian

diencerkan menjadi beberapa variasi konsentrasi seri yaitu 1,25; 2,5; 5; 7,5; dan 10

mg/mL.

Konsentrasi pada sampel ekstrak dan standar akarbose dibuat bervariasi

untuk memperoleh persen (%) penghambatan yang selanjutnya digunakan untuk

menghitung nilai IC50.

Gambar 4. Hubungan Konsentrasi Akarbose dengan Persen Inhibisi Enzim α-

Amilase Replikasi 1, Replikasi 2 dan Replikasi 3.

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%in

hib

isi

Konsentrasi (mg/ml)

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%In

hib

isi

Konsentrasi (mg/ml)2

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%In

hib

isi


1


20

Tabel III. Nilai IC50 Standar Akarbose

Sampel Persamaan

Regresi Linear

r IC50

(mg/mL)

Rata-rata IC50

(mg/mL)

Akarbose

Replikasi 1

Y = 2,18x+34,48 0,993 7,12

Akarbose

Replikasi 2

Y = 2,29x+35,09 0,992 6,51

Akarbose

Replikasi 3

Y = 2,35x+34,64 0,995 6,53

Rata-rata Y = 2,27x+ 34,74 0,993 6,72 6,72 ±0,35

Dari Gambar 4 dan yang secara ringkas tersaji pada Tabel III, persamaan

regresi linear penghambatan oleh standar akarbose replikasi 1 adalah y =

2,18x+34,48 dengan nilai koefisien korelasi (r) = 0,993 serta perolehan nilai IC50

nya adalah 7,12 mg/mL. Persamaan regresi linear yang didapatkan dari kurva

penghambatan standar akarbose replikasi 2 adalah y = 2,29x+35,09 dengan nilai

koefisien korelasi (r) = 0,992 serta perolehan nilai IC50 nya adalah 6,51 mg/ml.

Persamaan regresi linear yang didapatkan dari kurva penghambatan standar

akarbose replikasi 3 adalah y = 2,35x+34,64 dengan nilai koefisien korelasi (r) =

0,995 serta perolehan nilai IC50 nya adalah 6,53 mg/mL.

Perolehan rata-rata nilai IC50 standar akarbose adalah 6,72 ± 0,35 mg/mL.

Hasil yang diperoleh pada penelitian ini cukup berbeda dengan beberapa penelitian

sebelumnya seperti pada penelitian Akoro et al (2017) serta Mandal&Reddy (2016)

masing-masing IC50 yang diperoleh adalah 0,1149 mg/mL dan 0,083 mg/mL.

Namun, berbeda pada penelitian Subramanian et al (2008) yang menguji

penghambatan aktivitas α-amilase oleh ekstrak sambiloto yang dibandingkan

dengan andrografolid murni dan akarbose, diperoleh bahwa IC50 akarbose adalah

11,3 mg/mL. Hal ini dapat diakibatkan karena sumber akarbose yang digunakan

berbeda-beda. Penelitian ini menggunakan akarbose tablet @50 mg yang

diproduksi oleh PT. Dexa Medica, Indonesia, sedangkan Subramanian et al. (2008)

menggunakan akarbose yang diproduksi oleh Bayers Pharmaceuticals,

Leverkusen, Jerman. Akoro et al (2017) dan Mandal & Reddy (2016) tidak

menyebutkan secara spesifik sumber akarbose yang digunakan.


21

Larutan uji sampel yang digunakan adalah kombinasi ekstrak air daun

sambiloto dan batang brotowali 1:3. Uji inhibisi menggunakan beberapa variasi

konsentrasi seri seperti halnya pada standar akarbose yaitu 1,25;2,5;7,5 dan 10

mg/mL. Pengujian konsentrasi yang beragam ini bertujuan untuk melihat pengaruh

penambahan konsentrasi ekstrak terhadap peningkatan persen inhibisi dan untuk

menghitung nilai IC50. Nilai IC50 mengindikasikan konsentrasi inhibitor yang

dibutuhkan untuk menghambat fungsi biokimia setengahnya.

Pada uji ini, dilakukan pengukuran serapan sampel (S) dan serapan blanko

(B). Pada pengukuran serapan blanko, DMSO digunakan sebagai pengganti larutan

ekstrak. Sedangkan, pengukuran serapan sampel (S), menggunakan larutan ekstrak

dan larutan pembanding akarbose. Perlakuan untuk pengukuran serapan sampel (S)

(ekstrak dan pembanding) dan blanko (B) adalah sama yaitu menggunakan kontrol

sampel dan kontrol blanko untuk melihat apakah produk masih dapat terbentuk

setelah larutan di terminasi reaksinya menggunakan HCl 1N. Selain itu, sebagai

faktor koreksi terhadap nilai serapan sampel maupun blanko karena warna ekstrak

juga dapat memberikan nilai serapan tertentu pada panjang gelombang maksimum

yang digunakan.

Hasil serapan yang diperoleh dipengaruhi oleh warna yang terbentuk

sebagai akibat dari reaksi antara inhibitor, enzim dan substratnya yang ditetesi

reagen iodin. Pada pengujian blanko (B) yang terdiri dari enzim α-amilase tanpa

ekstrak, terbentuk warna kuning yang menandakan absennya pati karena tidak

terbentuk kompleks iodin-pati atau amilase berhasil mengkatalisis pati menjadi

glukosa sehingga tidak berubah warna saat ditetesi iodin. Sedangkan pada

pengujian sampel yaitu ekstrak dan pembanding, warna yang terbentuk adalah

kompleks biru gelap. Hal ini menandakan bahwa aktivitas enzim telah berhasil di

inhibisi oleh ekstrak dan pembanding sebagai inhibitor. Sedangkan pada kontrol

ekstrak dan pembanding, warna yang terbentuk juga biru yang menunjukkan

hadirnya pati atau amilum di dalam larutan campuran tersebut.


22

Gambar 5. Hubungan Konsentrasi Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto&

Batang Brotowali 1:3 dengan Persen Inhibisi Enzim α-Amilase Replikasi 1,

Replikasi 2 dan Replikasi 3.

Tabel IV. Nilai IC50 Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto& Batang Brotowali

1:3.

Sampel Persamaan

Regresi Linear

r IC50

(mg/mL)

Rata-rata IC50

(mg/mL)

Kombinasi

Ekstrak Replikasi

1

Y =0,70x+28,74 0,9876 30,37

Kombinasi

Ekstrak Replikasi

2

Y = 0,74x+29,09 0,9862 28,26

Kombinasi

Ekstrak Replikasi

3

Y = 0,64x+29,27 0,9872 32,39

Rata-rata Y = 0,693x+ 29,03 0,987 30,34 30,34 ±2,06

Berdasarkan Gambar 5 dan yang secara ringkas tersaji pada Tabel IV,

persamaan regresi linear yang didapatkan dari kurva penghambatan kombinasi

ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 replikasi 1 adalah Y =

0,70x+28,74 dengan koefisien korelasi (r) = 0,9876 serta nilai IC50 yang diperoleh

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%In

hib

isi

Konsentrasi (mg/ml)

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%In

hib

isi

Konsentrasi (mg/ml)

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

1,25 2,5 5 7,5 10

%In

hib

isi


1 2


23

adalah 30,37 mg/mL. Persamaan regresi linear yang didapatkan dari kurva

penghambatan kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3

replikasi 2 adalah Y = 0,74x+29,09 dengan koefisien korelasi (r) =0,9862 serta nilai

IC50 yang diperoleh adalah 28,26 mg/mL. Persamaan regresi linear yang didapatkan

dari kurva penghambatan kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang

brotowali 1:3 replikasi 2 adalah Y= 0,64x+29,27 dengan koefisien korelasi (r) =

0,9872 serta nilai IC50 yang diperoleh adalah 32,39 mg/mL.

Perolehan rata-rata nilai IC50 kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan

batang brotowali 1:3 adalah 30,34±2,06 mg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa

inhibisi aktivitas α-amilase oleh kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang

brotowali 1:3 kurang efektif dibandingkan akarbose, yang mana dapat dilihat dari

nilai IC50 akarbose yang lebih kecil yaitu 6,72±0,35 mg/mL. Nilai IC50 yang besar

menunjukkan interaksi inhibitor dengan enzim kurang efektif daripada inhibitor

yang memilki nilai IC50 kecil (Caldwell et al., 2012). Meskipun memiliki nilai IC50

yang relatif kecil, kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3

juga mampu menghambat aktivitas α-amilase yang ditunjukkan dengan rata-rata

persen inhibisi nya pada konsentrasi 10 mg/mL sebesar 35,80 mg/mL. Di sisi lain,

seperti yang tertera pada Gambar 6 penghambatan yang dilakukan oleh sampel uji

menunjukkan cara yang tergantung konsentrasi (concentration-dependent manner),

yang mana persen (%) penghambatan akan semakin meningkat seiring dengan

kenaikan konsentrasi (Yesmin et al., 2019).


24

Gambar 6. Perbandingan % Inhibisi Enzim α-Amilase Kombinasi Ekstrak Air

Daun Sambiloto& Batang Brotowali 1:3 dan Akarbose.

Tabel V. Perbandingan Nilai IC50 Ekstrak Tunggal dan Kombinasi Ekstrak

Ekstrak IC50

Ekstrak etanol daun

sambiloto (Subramanian et

al., 2008)

50,9 mg/mL

Ekstrak metanol-kloroform

batang brotowali (Hamid et

al., 2015)

0,775 mg/mL

Kombinasi ekstrak air daun


brotowali 1:3

30,34 mg/mL

Berdasarkan tabel V. mengenai perbandingan nilai IC50 ekstrak tunggal dan

kombinasi ekstrak, dapat dilihat bahwa kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan

batang brotowali 1:3 menghasilkan penghambatan yang sedikit lebih efektif

dibandingkan ekstrak tunggal etanol daun sambiloto, namun kurang efektif

dibandingkan ekstrak metanol-kloroform. Perbandingan nilai IC50 kombinasi

ekstrak daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 dengan ekstrak tunggal (daun

sambiloto dan batang brotowali) yang tidak menggunakan pelarut air, dikarenakan

data mengenai pengujian aktivitas penghambatan α-amilase nya masih jarang

dilakukan. Pada penelitian Sathiavelu et al (2013), pengujian ekstrak air daun

sambiloto nya tidak melibatkan nilai IC50. Sedangkan, pengujian penghambatan

aktivitas α-amilase pada batang brotowali baru dilakukan oleh Hamid et al (2015)

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

1 2 3 4 5 6

%P

en

gham

bat

an α

-Am

ilase

Konsentrasi (mg/ml)

Rerata % Inhibisi Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto & Batang Brotowali 1:3 dan Akarbose

Kombinasi Ekstrak air daun sambiloto dan batang Brotowali 1:3 Akarbose


25

dan belum ada penelitian lain yang menguji efektivitas penghambatan α-amilase

oleh ekstrak air tunggal daun sambiloto dan batang brotowali.

Penghambatan aktivitas α-amilase oleh kombinasi ekstrak air daun

sambiloto dan batang brotowali 1:3 diduga terjadi karena adanya kandungan

fitokimia yang terkandung di dalamnya, yakni masing-masing berupa andrografolid

dan borapetosida c. Namun, pada penelitian ini keberadaan kedua senyawa tersebut

masih belum dipastikan dengan jelas. Oleh karena itu, perlu adanya penelitian

lanjutan pada pengujian kualitatif ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali

serta kombinasi ekstraknya. Secara teori, andrografolid merupakan golongan

diterpen lakton yang terdapat paling banyak pada bagian daun sambiloto dan

pengujian in vitro sebelumnya menunjukkan bahwa kandungan inilah yang

berperan utama dalam menghambat aktivitas α-amilase (Subramanian et al., 2008)

dan penelitian lain oleh Sathiavelu et al (2013) membuktikan bahwa ekstrak air

daun sambiloto mampu menghambat α-amilase. Sedangkan borapetosida c yang

adalah golongan diterpen glikosida banyak terdapat pada batang brotowali.

Penelitian yang dilakukan oleh Ahmad et al (2016) menunjukkan bahwa ekstrak air

batang brotowali mampu menurunkan kadar glukosa darah pada tikus, namun tidak

diketahui secara pasti komponen fitokimia yang terlibat di dalamnya. Pengujian in

vitro mengenai efektifivas ekstrak air batang brotowali dalam menghambat

aktivitas α-amilase masih jarang dilakukan. Kemudian oleh Hamid et al (2015)

menemukan bahwa kandungan borapetosida c dalam batang brotowali adalah

komponen paling penting yang menghambat aktivitas α-amilase, namun pengujian

ini dilakukan pada ekstrak metanol-kloroform batang brotowali, bukan pada ekstrak

air batang brotowali.

Selanjutnya, dilakukan uji statistik antara IC50 kelompok standar akarbose

dan kelompok kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3, yang

didahului oleh uji Shapiro-Wilk dan didapatkan data terdistribusi normal (P>0,05).

Oleh karena data terdistribusi normal dilanjutkan dengan uji t tidak berpasangan

(independent-sampel t test). Dari hasil pengujian, diperoleh bahwa ada perbedaan

diantara dua kelompok dengan nilai signifikansi 0,000 (P<0,05). Sehingga, dapat

dikatakan bahwa terdapat perbedaan penghambatan aktivitas α-amilase bermakna


26

antara kelompok uji akarbose dan kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang

brotowali 1:3.

KESIMPULAN

Kesimpulan dari penelitian ini adalah kombinasi ekstrak air daun sambiloto

dan batang brotowali 1:3 memiliki efek penghambatan aktivitas α-amilase dengan

nilai IC50 30,34±2,06 mg/mL.

SARAN

Penulis menyarankan untuk dilakukan pengujian kembali untuk

mempertegas kandungan andrografolid dan borapetosida c yang ada pada ekstrak

air tunggal daun sambilto dan batang brotowali serta pada kombinasi ekstrak air

daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 dan menguji kinetika penghambatan

enzim agar dapat diketahui jenis atau tipe penghambatan enzim α-amilase yang

dilakukan oleh kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3.


27

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, N., & Kasim, K. F., 2017. In-Vitro Antidiabetic Activity of Clinacanthus

nutans Extracts. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical

Research, 9(6), 846–852.

Ahmad, W., Jantan, I., & Bukhari, S. N. A., 2016. Tinospora crispa (L.) Hook. f. &

Thomson: A Review Of Its Ethnobotanical, Phytochemical, and

Pharmacological Aspects. Frontiers in Pharmacology, 7(59), 1–19.

Akoro, S., Ogundare, C., & Oladipupo, O., 2017. Phytochemical Study and Alpha-

amylase Inhibitory Properties of Leaf Extracts of Croton zambesicus (Müll.

Arg.). Biotechnology Journal International, 18(1), 1–8.

Akoro, S., Omotayo, M., Ajibaye, S., & Dada, F., 2017. Comparative Alpa-

Amylase Inhibitory Properties of the Leaff Extracts of Petiveria alliacea L.

Chemical Science International Journal, 19(1), 1-9.

Amom, Z., Bahari, H., Isemaail, S., Ismail, N. A., Shah, Z. M., & Arsyad, M. S.,

2009. Nutritional composition, antioxidant ability and flavonoid content of

Tinospora crispa stem. Advances in Natural and Applied Sciences, 3(1), 88–

94.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia., 2011. Acuan Sediaan

Herbal. Volume 6, Edisi 1, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik

Indonesia, Jakarta, pp. 8.

Bharti, S. K., Krishnan, S., Kumar, A., & Kumar, A., 2018. Antidiabetic

phytoconstituents and their mode of action on metabolic pathways.

Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism, 9(3), 81–100.

Caldwell, G. W., Yan, Z., Lang, W., & Masucci, J. A., 2012. The IC50 Concept

Revisited. Curr. Top. Med. Chem., 12, 1282–1290.

Departemen Kesehetan Republik Indonesia., 2000. Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat, Edisi 1, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta, pp. 10-11

Departemen Kesehatan Republik Indonesia., 2008. Farmakope Herbal Indonesia,

Edisi 1, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 69; 124-125.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia., 2013. Suplemen III Farmakope

Herbal Indonesia, Edisi 1, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, pp. 14-15.

Etsassala, N. G. E. R., Badmus, J. A., Waryo, T. T., Marnewick, J. L., Cupido, C.

N., Hussein, A. A., & Iwuoha, E. I., 2019. Alpha-glucosidase and alpha-

amylase inhibitory activities of novel abietane diterpenes from Salvia

Africana-Lutea. Antioxidants, 8(10).

Kementrian Kesehatan Republik Indonesia., 2011. Suplemen II Farmakope Herbal

Indonesia, Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 92-93

Ganesan, K., & Xu, B. (2019). Anti-diabetic effects and mechanisms of dietary

polysaccharides. Molecules, 24(14).

Garg, C., Sharma, P., Satija, S., & Garg, M., 2016. Stability indicating studies of

Andrographis paniculata extract by validate HPTLC protocol. Journal of

Pharmacognosy and Phytochemistry, 5(6), 337–344.

Gondokesumo, M. E., Kusuma, H. S. W., & Widowati, W., 2017. α-/β-Glucosidase


28

and α-Amylase Inhibitory Activities of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.)

Ethanol Extract. Molecular and Cellular Biomedical Sciences, 1(1), 34.

Hossain, S., Urbi, Z., Sule, A., & Rahman, K. M. H., 2014. Andrographis

paniculata (Burm.f) Wall. Ex Nees: A Review of Ethnobotany

Phytochemistry, Pharmacology. The Scientific World Journal, 1-28

Ismoyo dan Tanjung, S. P., 2010. Uji Pra Klinis Ramuan Ekstrak Tanaman Obat

Sambiloto (Andrographis paniculata) dan Brotowali (Tinosora crispa)

sebagai Obat Anti Diabetes. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Tanaman Obat dan Tanaman Obat Tradisional Tawangmangu.

Jijith, U. S., & S, J., 2017. Recent Advances and Methods for in-Vitro Evaluation

of Antidiaetic Activity: a Review. International Journal of Research in

Ayurveda & Pharmacy, 8(1), 81–87.

Kementrian Kesehatan Republik Indonesia., 2018. Cegah Cegah, Cegah dan Cegah:

Suara Dunia Perangi Diabetes, http://www.depkes.go.idarticle/view/

18121200001/prevent-prevent-and-prevent-the-voice-of-the-world-fight-

diabetes.html, diakses tanggal 20 Juni 2019.

Kumar, P. N., Vijayan, S. K., Dharsana, J. N., Seena & Anjana., 2012. Comparing

The effect of Antidiabetic Activity of Andrographis paniculata, Salacia

reticulata, Ocimum sanctum By In Vitro Screening. Asiann Journal of

Pharmaceutical and Clinical Research. 5(4). 146-149.

Kumoro, A. C., Hasan, M., dan Singh, H., 2009. Effect of Solvent Properties on

The Soxhlet Extraction of Diterpenoid Lactones from Andrographis

paniculata Leaves. Science Asia.

Rafi, M., Devi, A. F., Syafitri, U. D., Heryanto, R., Suparto, I. H., Amran, M. B.,

Rohman, A., Prajogo, B., & Lim, L. W., 2020. Classification of Andrographis

paniculata extracts by solvent extraction using HPLC fingerprint and

chemometric analysis. BMC Research Notes, 13(1), 56.

Rais, I. R., 2014. Ekstraksi Andrografolid Dari (Burm.f.) Nees Menggunakan

Ekstraktor Soxhlet. Pharmaciana, 4(1).

Thomas, A., Rajesh, E. K., & Kumar, D. S., 2016. The Significance of Tinospora

crispa in Treatment of Diabetes Mellitus. Phytotherapy Research, 30(3), 357–

366.

Sathiavelu, A., Sangeetha, S., Archit, R., & Mythili, S., 2013. In vitro anti-diabetic

activity of aqueous extract of the medicinal plants Nigella sativa, Eugenia

jambolana, Andrographis paniculata and Gymnema sylvestre. International

Journal of Drug Development and Research, 5(2), 323–328.

Sharma, R., Amin, H., Galib., & Prajapati, P. K., 2015. Antidiabetic Claims of

Tinospora cardifolia (Wild.) Miers: Critical Appraisal and The Role in

Therapy. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5(1), 68-78.

Soelistijo, S., Novida, H., Rudijanto, A., Soewondo, P., Suastika, K., Manaf, A.,

Sanusi, H., Lindarto, D., Shahab, A., Pramono, B., Langi, Y., Purnamasari, D.,

& Soetedjo, N., 2015. Konsesus Pengelolaan Dan Pencegahan Diabetes

Melitus Tipe2 Di Indonesia 2015. In Perkeni.

Subba, B., Gaire, S., & Raj Sharma, K., 2019. Analysis of Phyto-Constituents,

Antioxidant, and Alpha Amylase Inhibitory Activities of Persea Americana

Mill., Rhododendron Arboretum Sm. Rubus Ellipticus Sm. From


29

Arghakhanchi District Nepal. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical

Research, 12(1), 301.

Subramanian, R., Asmawi, M. Z., & Sadikun, A. 2008. In vitro α-glucosidase and

α-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and

andrographolide. Acta Biochimica Polonica, 55(2), 391–398.

Swapna, G., Jyothirmai, T., Lavanya, V., Swapnakumari, S., & Sri, L. P. A., 2015.

Extraction and Characterization of Bioactive Compounds from Plant Extracts:

A Review. Europan Journal of Pharmaceutical Science and Research, 2(1),

1-6.

Talubmook, C., & Buddhakala, N., 2013. Bioactive of Extracts from Tinospora

crispa Stems, Annona squamosal Leaves, Musa spientum Flowers and Piper

sarmentosum Leaves in Diabetic Rats. International Journal of Advancements

in Research & Technology, 2(6), 144-149.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., & Kaur, H., 2011. Phytochemical

Screening and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Scienca,

1(1), 98-106.

Wang, N.S., 2009. Experiment No.5 Starch Hydrolisis By Amilase. University of

Maryland: Department of Chemical and Biomolecular Engineering.

Warsinah, Harwoko, & Nuryanti. 2015. Screening of volatile compounds of

Brotowali (Tinospora crispa) and antifungal activity against Candida

albicans. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical

Research, 7(1), 132–136.

Wickramaratne, M. N., Punchihewa, J. C., & Wickramaratne, D. B. M. 2016. In-

vitro alpha amylase inhibitory activity of the leaf extracts of Adenanthera

pavonina. BMC Complementary and Alternative Medicine, 16(1), 1–5.

Yesmin, R., Das, P. K., & Belal, H. 2019. In Vitro Antioxidant And Antidiabetic

Assessment Of Extracts From The Bark Of Michelia Champaca , A Medicinal

Plant In World Journal Of Pharmaceutical Research Extracts From The Bark

Of Michelia Champaca, World Journal of Pharmaceutical Research, 8(9), 1-

5


30

LAMPIRAN


31

Lampiran 1. Surat Keterangan Identifikasi Serbuk Simplisia Daun

Sambiloto & Batang Brotowali


32

Lampiran 2. Sertifikat Analisis Enzim α-Amilase


33

Lampiran 3. Penetapan Kadar Air & Ekstraksi

Penetapan Kadar Air

Ekstrak Air Daun Sambiloto

Ekstrak Air Batang Brotowali


34

Lampiran 4. Data Penimbangan & Perolehan Rendemen Ekstrak Air Daun

Sambiloto

Replikasi I

Penimbangan Bobot Tetap

Berat (g)

Cawan Porselen 53,7142

Cawan + Isi 55,4194

Perhitungan Rendemen Ekstrak

Bobot Cawan (g) Cawan + Isi (g) Bobot Ekstrak (g) Rendemen (%)

53,7142 55,4194 1,7052 16,98

% rendemen ekstrak air daun sambiloto = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠𝑎 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑥 100%

% rendemen ekstrak air daun sambiloto = 1,7052 𝑔

10,0378 𝑔 𝑥 100%

= 16,98%

Berat (g)

Cawan kosong 62,4856

Cawan + isi 72,5244

Cawan + sisa 62,4866

Bobot akhir 10,0378


35

Replikasi II


Berat (g)


Cawan + Isi 58,2720



56,9630 58,2720 1,309 12,97




10,0917 𝑔 𝑥 100%

= 12,97 %

Berat (g)


Cawan + isi 73,6789


Bobot akhir 10,0917


36

Replikasi III


Berat (g)


Cawan + Isi 22,5042



24,3840 22,5042 1,879




10,4601 𝑔 𝑥 100%

= 17,96%

Berat (g)


Cawan + isi 75,7819


Bobot akhir 10,4601


37

Lampiran 5. Data Penimbangan & Perolehan Rendemen Ekstrak Air Batang

Brotowali

Replikasi I


Berat (g)


Cawan + Isi 36,2978



33,6174 36,2978 2,6804 26,78%




10,0067 𝑔 𝑥 100%

=26,78%

Berat (g)


Cawan + isi 72,3908


Bobot akhir 10,0067


38

Replikasi II


Berat (g)


Cawan + Isi 59,7732



57,6276 59,7732 2,1456 21,78




10,3089 𝑔 𝑥 100%

=20,81 %

Berat (g)


Cawan + isi 76,5943


Bobot akhir 10,3089


39

Replikasi III


Berat (g)


Cawan + Isi 58,3685



55,8351 58,3685 2,5334 24,45



% rendemen ekstrak air daun sambiloto = 2,5334𝑔

10,3612𝑔 𝑥 100%

=24,45 %

Berat (g)


Cawan + isi 74,9865


Bobot akhir 10,3612


40

Lampiran 6. Data Pengenceran Konsentrasi Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto & Batang Brotowali 1:3 serta Standar Akarbose.

1. Penimbangan Ekstrak Air Daun Sambiloto & Ekstrak Air Batang Brotowali

• Bobot ekstrak air daun sambiloto = 250 mg

• Bobot ekstrak air batang brotowali = 750 mg

• Bobot kombinasi ekstrak air daun sambiloto dan batang brotowali 1:3 =

1000 mg.

• Konsentrasi larutan induk kombinasi esktrak air daun sambiloto dan batang

brotowali 1:3 (10 mL) = 1000 mg/ 10 m = 100 mg/mL

Volume yang diambil untuk memperoleh seri konsentrasi adalah:

a. 10 mg/mL

C1.V1 = C2.V2

100 mg/mL.x = 10 mg/ml.10 mL

= 1 mL

b. 7,5 mg/mL

C1. V1 = C2.V2

10 mg/mL.x = 7,5 mg/mL. 10 mL

= 7,5 mL

c. 5 mg/mL

C1. V1 = C2V2

7,5 mg/mL.x = 5 mg/mL. 10 mL

= 6,67 mL

d. 2,5 mg/mL

C1.V1 = C2.V2

5 mg/mL. x = 2,5 mg/mL. 10 mL

= 5 mL

e. 1,25 mg/mL

C1. V1 = C2.V2

2,5 mg/mL. x = 1,25 mg/ml. 10 mL


41

= 5 mL

2. Penimbangan Standar Akarbose @ 50 mg

• Bobot standar akarbose adalah = 1000 mg.

• Konsentrasi larutan induk standar akarbose adalah (10 mL) = 1000 mg/

10 mL= 100 mg/mL

Volume yang diambil untuk memperoleh seri konsentrasi adalah

a. 10 mg/mL

C1.V1 = C2.V2

100 mg/mL.x = 10 mg/ml.10 mL

= 1 mL

b. 7,5 mg/mL

C1. V1 = C2.V2

10 mg/mL.x = 7,5 mg/mL. 10 mL

= 7,5 mL

c. 5 mg/mL

C1. V1 = C2V2

7,5 mg/mL.x = 5 mg/mL. 10 mL

= 6,67 mL

d. 2,5 mg/mL

C1. V1 = C2.V2

5 mg/mL. x = 2,5 mg/mL. 10 mL

= 5 mL

e. 1,25 mg/mL

C1. V1 = C2.V2

2,5 mg/mL. x = 1,25 mg/ml. 10 mL

= 5 mL


42

Lampiran 7. Gambar Optimasi Panjang Gelombang


43

Lampiran 8. Perlakuan Optimasi Operating Time

Tabel Hasil Optimasi operating time untuk uji penghambatan aktivitas α-Amilase

Menit ke- Absorbansi pada panjang gelombang

635,5 nm

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

5 0,271 0,359 0,208

10 0,257 0,364 0,558

15 0,268 0,367 0,538

20 0,313 0,347 0,417

25 0,708 0,322 0,276

30 0,419 0,324 0,484

40 0,415 0,658 0,762

50 0,385 0,405 0,786

60 0,665 0,723 0,780

t= 5 t= 10 t= 15 t= 20 t= 25 t= 30

t= 40 t= 50 t= 60


44

Lampiran 9. Pengujian Blanko dan Kontrol Blanko

Perlakuan Blanko

Perlakuan Kontrol Blanko


45

Lampiran 10. Uji Penghambatan Aktivitas α-Amilase

Perlakuan Sampel Ekstrak

Perlakuan Kontrol Ekstrak

Perlakuan Standar Akarbose

Perlakuan Kontrol Akarbose

1,25 2,5 5 7,5 10

1,25 2,5

5 7,5 10

1,25 2,5

1,25

5

1,25

7,5

1,25

10

1,25

1,25

1,25

2,5

1,25

5

1,25

7,5

1,25

10

1,25


46

Lampiran 11. Data Hasil Perhitungan % Inhibisi dan IC50 Standar Akarbose

dan Kombinasi Ekstrak Air Daun Sambiloto & Batang Brotowali 1:3.

Tabel Data Absorbansi Kontrol Blanko dan Blanko

Blanko Kontrol Blanko (Rata-rata B)-

(Rata-rata KB)

Replikasi 1 0,633 0,059

0,660-0,053 =

0,0607 Replikasi 2 0,660 0,052

Replikasi 3 0,688 0,050

Rata-Rata 0,660 0,053

Tabel Penghambatan Aktivitas α-Amilase Pada Akarbose sebagai Pembanding

Replikasi Konsentrasi

(mg/ml)

Absorbansi

Sampel (S)

Absorbansi

Kontrol

Sampel (KS)

B-KB S-KS % Inhibisi

R1

1,25 0,683 0,295 0,607 0,388 36,08%

2,5 0,621 0,260 0,607 0,361 40,52%

5 0,520 0,194 0,607 0,326 46,29%

7,5 0,463 0,168 0,607 0,295 51,40%

10 0,450 0,140 0,607 0,270 55,52%

R2

1,25 0,676 0,291 0,607 0,385 36,57%

2,5 0,620 0,266 0,607 0,354 41,68%

5 0,515 0,197 0,607 0,318 47,61%

7,5 0,459 0,170 0,607 0,289 52,38%

10 0,432 0,173 0,607 0,259 57,33%

R3

1,25 0,671 0,286 0,607 0,385 36,57%

2,5 0,610 0,262 0,607 0,358 41,02%

5 0,511 0,199 0,607 0,320 47,28%

7,5 0,450 0,162 0,607 0,288 52,55%

10 0,427 0,169 0,607 0,258 57,50%


47

Tabel Penghambatan Aktivitas α-Amilase Pada Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto dan Batang Brotowali 1:3

Replikasi Konsentrasi

(mg/ml)

Absorbansi

Sampel (S)

Absorbansi

Kontrol

Sampel (KS)

B-KB S-KS % Inhibisi

R1

1,25 0,580 0,150 0,607 0,430 29,16%

2,5 0,566 0,148 0,607 0,418 31,14%

5 0,558 0,146 0,607 0,412 32,12%

7,5 0,541 0,141 0,607 0,400 34,10%

10 0,536 0,146 0,607 0,390 35,75%

R2

1,25 0,578 0,151 0,607 0,427 29,65%

2,5 0,565 0,149 0,607 0,416 31,46%

5 0,558 0,148 0,607 0,410 32,45%

7,5 0,537 0,143 0,607 0,394 35,09%

10 0,537 0,143 0,607 0,387 36,24%

R3

1,25 0,581 0,154 0,607 0,427 29,65%

2,5 0,568 0,151 0,607 0,417 31,30%

5 0,560 0,150 0,607 0,410 32,45%

7,5 0,545 0,147 0,607 0,398 34,43%

10 0,534 0,142 0,607 0,392 35,42%


48

Lampiran 12. Sertifikat Pengujian dengan SPSS


49

Lampiran 13. Hasil Uji Statistik IC50 Kombinasi Ekstrak Air Daun

Sambiloto & Batang Brotowali 1:3 dan Akarbose


50


51

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Maria Carolina Loy Nau lahir di

Soa, 10 Desember 1997. Penulis merupakan anak pertama

dari 2 bersaudara dari pasangan Almarhum Bapak Paulus

Bernardinus Nau dan Ibu Ermalinda Lodja. Penulis

menempuh Pendidikan di TK Santa Ana Waikabubak, SD

Katolik Waikabubak, SMP Katolik Stella Maris

Waikabubak, SMA Katolik Baleriwu Danga dan pada

tahun 2016 mengeyam Pendidikan di Program Studi

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis

aktif dalam beberapa kegiatan kepanitiaan antara lain

sebagai koordinator divisi acara kegiatan World No

Tobacco Day, anggota divisi dana dan usaha kegiatan

Desa Mitra 1, Koordinator divisi dana dan usaha kegiatan

Desa Mitra 2, anggota divisi liturgi kegiatan Perayaan Ekaristi Paskah 2017,

menjadi volunteer kegiatan Kampanye Informasi Obat, kegiatan Faction #2, bakti

sosial kegiatan Walubi di Candi Borobudur dan kegiatan bakti sosial yang

diseleranggarakan oleh Yayasan Persaudaraan Masyarakat Jogja. Penulis terlibat

sebagai anggota divisi pengabdian masyarakat dalam organisasi Jaringan

Mahasiswa Kesehatan Indonesia (2017). Penulis juga pernah menjadi asisten dosen

praktikum Biokimia (2019) dan Pharmaceutical Care 3 (2020).


uji in vitro penghambatan aktivitas α-amilase …

Documents