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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

ADAPTAÇÃO E RECICLAGEM DA LEVEDURA Canâida guilttermondii FTI 20037 NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA A OBTENÇÃO DE

XILITOL

. -· .,..._ ~- ..

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial.

, Luciane Sene

Lorena-SP-Brasil abril/1996

ADAPTAÇÃO E RECICLAGEM DA LEVEDURA Candida guilliermondii FTI 20037 NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE

CANA-DE-AÇÚCAR PARA A OBTENÇÃO DE XILITOL

APROVADA.

Lorena, 26 de abril de 1996.

Dr. Michele Vitolo

aças A. Felipe ( orientadora)

__ _,-

Ao meu querido filho,

Eduardo Eisele.

ü

AGRADECIMENTOS

À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES), pelo apoio financeiro.

À Drª Maria das Graças, pela grande capacidade e dedicação no papel de

orientadora.

Aos funcionários do Departamento de Engenharia Química, pelo auxílio

na obtenção do hidrolisado.

Às colegas de curso, Cleyde, Milva, Ivanéa e Patrícia, pela integração e

saudável convivência e à Lourdes, pela colaboração nos detalhes finais.

Ao João Dimas, "companheiro de bancada", pelos momentos felizes, pelo

apoio e agradável presença em momentos difícieis, revelando-se um grande

arrugo.

À Rita, técnica de laboratório, pela presteza e sempre boa vontade e ao

Paulinho, laboratorista, pelo preparo de vidrarias.

iii

À Ludmila, pelo auxílio na aquisição e tratamento das informações

bibliográficas.

Ao Humberto, pelo valioso auxílio e pelas "dicas" no computador.

Aos professores da Pós-Graduação do DEBIQ, bem como ao professor

convidado, Dr. Dayson Olzani Silva, pela oportunidade de usufruir de valiosos

conhecimentos.

Aos Drs. Sílvio, Ismael e ao Arnaldo Márcio, João Batista e Inês pelas

sugestões apresentadas.

Ao Dr. Michele Vitolo, pela valiosa contribuição.

Aos demais funcionários e colegas do DEBIQ que não foram citados, mas

que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

Aos meus familiares, pelo carinho e grande incentivo.

iv

BIOGRAFIA

Luciane Sene, filha de Domingos Alves Sene e Iza Longanezi Sene,

nasceu em Cachoeira Paulista, Estado de São Paulo, a 16 de janeiro de 1965.

Graduou-se em Farmácia-Bioquímica, Habilitação em Indústria, pela

Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Estado

de Minas Gerais, no ano de 1989 .

Trabalhou no ramo de Farmácia Magistral no período de 1990 a 1994, ano

em que ingressou no Curso de Mestrado em Biotecnologia Industrial, do

Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena.

V

CONTEÚDO

1. INTRODUÇAO 1

. , 2. REVISAO BIBLIOGRAFICA 3

2. 1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 3

2.2. XILITOL 5

2. 2.1. Propriedades 5

2.2.2. Produção de Xilitol 5

2.2.2.1. Processo Químico 5

2.2.2.2. Processo Microbiológico l O

2.2.2.3. Obtenção de Xilitol por Fermentação de Hidrolisados

Hemicelulósicos 15 ,

3. MATERIAL E METODOS 21

3.1. MICRORGANISMO 21

3.2. OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE

BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 2 l

3. 2. 1. Hidrólise Ácida do Bagaço 21

3.2.2. Concentração do Hidrolisado 23

3.2.3. Tratamento do Hidrolisado 23

vi

3.3. AVALIAÇÃO DA ADAPTAÇÃO DA LEVEDURA AO HIDROLISADO 23

3.3.J. Preparo do Inoculo 23

3.3.2. Meio e Condições de Fermentação 25

3.4. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE INÓCULO ADAPTADO 25

3.4.1. Preparo do Inôculo 25

3.4.2. Meio e Condições de Fermentação 26

3.5. AVALIAÇÃO DA RECICLAGEM DA LEVEDURA NO HIDROLISADO .. 26

3.5.J. Preparo do Inôculo 26

3.5.2. Meio e Condições de Fermentação 26

3.6. MÉTODOS AN"ALÍTICOS 27

3.6.1. Viabilidade e Pureza da Cultura 27

3. 6. 2. Concentração Celular 2 7

3.6.3. Concentração de Açúcares e Ácido Acético 28

3.6.4. Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural 28

3. 6. 5. Determinação do pH e Grau Brtx 29

3.7. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS 29 ' -- ,.... -_..,.., - 4. RESULTADOS E DISCUSSAO 30

4.1. CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO 30

4.2. AVALIAÇÃO DA ADAPTAÇÃO DA LEVEDURA AO HIDROLISADO 32

4.3. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE INÓCULO

ADAPTAD0 46

4.4. AVALIAÇÃO DA RECICLAGEM DA LEVEDURA NO HIDROLISADO .. 52

5. CONCLUSOES 58

A ,

6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 60

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et ai., 1973; HWÔNEN et ai., l 982) 6

Tabela 2 - Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar obtido por hidrólise ácida, na forma original e após submetido a diferentes níveis de concentração .30

Tabela 3- Concentração de glicose durante fermentação dos meios constituídos dos hidrolisados 2HC, 3HC e 4HC por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo .35

Tabela 4- Variação da concentração de arabinose na fermentação por C. guilliermondii dos meios constituídos dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar 2HC, 3HC e 4HC em função de diferentes nrveis de adaptação do inóculo 36

Tabela 5 - Variação da concentração de ácido acético durante as fermentações dos meios constituídos dos hidrolisados 2HC, 3HC e 4HC por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo 39

Tabela 6- Variação do pH na fermentação dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar 2HC, 3HC e 4HC por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo .40

Tabela 7- Fator de rendimento (Y p/s) da conversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação e diferentes concentrações de hidrolisado .40

viii

Tabela 8- Eficiência (%) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação e diferentes concentrações de hidrolisado 41

Tabela 9- Produtividade em xilitol (Qp) em fermentações por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação e diferentes concentrações de hidrolisado .41

Tabela l O-Variação da concentração de células de C. guilliermondii na fermentação de meios constituídos do hidrolisado hemicelulósico de bagaço 2HC, 3HC e 4HC em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo 45

Tabela I I-Concentração de glicose durante fermentação de meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 .46

Tabela I2-Variação da concentração de ácido acético na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 47

Tabela 13- Variação do pH na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 .47

Tabela 14-Variação da concentração de arabinose na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 ••.••........•.•...........•..••.••.••.••.•••••••••••.•••....••..•••••...•••.•••••.•••...••........•• 48

Tabela 15-Parâmetros fermentativos da conversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC em função de diferentes concentrações iniciais de inóculo de nível de adaptação N3 51

Tabela 16-Produção de células de C. guilliermondii na fermentação do hidrolisado 3HC em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 52

Tabela 17-Concentração de glicose em fermentações conduzidas em meio constituído do hidrolizado hemicelulósico de bagaço de cana-de- açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii 54

ix

Tabela 18- Variação da concentração de arabinose em fermentações conduzidas em meio constituído do hidrolizado hemicelulósico de bagaço de cana- de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii 55

Tabela 19-Parâmetros fermentativos da conversão de xilose em xilitol em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii 56

Tabela 20- Variação da concentração de ácido acético em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com reciclo de células de e. guilliermondii 56

Tabela 21- Variação do pH em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolizado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii .57

Tabela 22-Variação da concentração de células de C. guilliermondii em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células 57

X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Produção de xilose e xilitol (MELAJA, HÃMÃLÃINEN, 1977) 9

Figura 2- Representação esquemática da conversão de xilose em xilulose-5- fosfato via xilose induzida em leveduras (WEBB, LEE, 1990) 11

Figura 3- Principal via metabólica envolvida na fermentação de xilose (TAYLOR et ai., 1990) 12

Figura 4- Reator de hidrólise ácida 22

Figura 5- Variação da concentração de xilose durante fermentações de meios constiuídos pelos hidrolisado 2HC (A), 3HC (B) e 4HC (C) por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo: N1 <--); N2 <--); N3 (-.-); N4 <-·-) 33

Figura 6- Produção de xilitol durante fermentações de meios constituídos pelos hidrolisados 2HC (A), 3HC (B), 4HC (C) por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo: N1 (--+-); N2 <--); N3 (-.-); N4 <-•-) 37

Figura 7- Variação da concentração de xilose durante fermentação do hidrolisado 3HC por C. guiliiermondli em função de diferentes concentrações iniciais de inóculo:0, 1 g/L <----); 1,0 g/L <--); 6,0 g/L <-•-) .49

Figura 8- Produção de xilitol durante fermentação do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais de inóculo: 0,1 g/L <----); 1,0 g/L <--); 6,0 g/L (-.-) .49

xi

Figura 9- Variação da concentração de xilose durante fermentações do hidrolisado 3HC com reciclo de células de C. Williermondii: 1 º-ciclo (--+--); 2º ciclo r-s-j, 3º ciclo (-.t.-); 4º ciclo (-T-); 5- ciclo (--e--) ...•.•..••.•.. 53

Figura 1 O- Produção de xilitol durante fermentações do hidrolisado 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii: 1 º-ciclo (--+--); 2º ciclo (--.-); 3º ciclo t- ... -); 4º ciclo (-T-); sº ciclo (--e--) ....••..........••...•.....•.••••...•.•.....•... 53

- --,..,

xii

RESUMO

Visando a melhoria do processo de bioconversão de xilose em xilitol,

foram realizados ensaios para avaliar a adaptação da levedura C. guil/iermondii

FTI 20037 ao meio constituído de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-

de-açúcar e a técnica do reciclo de células. Com estes procedimentos buscou-se

contornar o efeito tóxico do hidrolisado sobre a atividade fermentativa da

levedura.

A adaptação do inóculo foi avaliada através de ensaios empregando-se

inóculos submetidos a diferentes níveis de adaptação (N1, N2, N3 e N4), ou seja,

células cultivadas em hidrolisados com concentrações crescentes de açúcares e

ácido acético. Como meio de fermentação empregaram-se hidrolisados

submetidos a diferentes níveis de concentração. Os resultados revelaram que a

· adaptação do inóculo favoreceu o consumo de xilose bem como a produção de

xilitol, independente do nível de concentração do hidrolisado empregado como

meio de fermentação. Os valores dos parâmetros fermentativos foram favorecidos

com o aumento do nível de adaptação do inóculo utilizado. A avaliação do

inóculo de maior nível de adaptação (N4) em hidrolisado contendo 72,35 g/L e

5,77 g/L de xilose e ácido acético, respectivamente, demonstrou uma elevação de

50% na produtividade (0,60 g/Lh), enquanto o rendimento em xilitol apresentou

um aumento de 46% (0,73 g/g) quando comparado aos demais níveis de

xiii

adaptação. O efeito da concentração inicial do inóculo ( 106 a 108 cels/ mL) foi

avaliado para o nível de adaptação N3, em fermentações conduzidas no meio

constituído do hidrolisado contendo 59,85 g/L de xilose e 4, 97 g/L de ácido

acético. Verificou-se que praticamente não houve influência dessa variável na

bioconversão de xilose em xilitol, uma vez que os parâmetros fermentativos

apresentaram valores semelhantes.

A reciclagem foi conduzida em meio constituído de hidrolisado contendo

59,85 g/L de xilose e 4,97 g/L de ácido acético, empregando-se, no 1º ciclo,

inóculo previamente adaptado (N3). A reciclagem de células adaptadas não

favoreceu o rendimento em xilitol, no entanto, a produtividade no 5º ciclo (0,60

g/Lh) apresentou um aumento de 15% em relação ao 1º ciclo (0,52 g!L.h).

xiv

ABSTRACT

With the aim of improving the xylose bioconversion to xylitol,

experiments were conducted to evaluate the yeast Candida guilliermondii FTI

2003 7 adaptation to the sugar cane hemicellulosic hydrolysate medium and the

cell recycle technique. With this procedure it was tried to reduce the toxic effect

of the hydrolysate on the yeast fermentative activity.

To evaluate the inoculum adaptation it was employed inocula submitted to

different adaptation leveis {N1, N2, N3 and N4), i. e., cells cultivated in

hydrolysate with increasing concentrations of sugars and acetic acid. As

fermentation medium it was employed hydrolysate concentrated at different

leveis. The results revealed that the inoculum adaptation affected both the xylose

consumption and the xylitol production, irrespective of the hydrolysate

concentrations employed as fermentation medium. Toe higher the inoculum

adaptation levei, the higher the fermentation performance.

Using the highest adaptation levei inoculum (N4) in hydrolysate containing

72.35 g/L xylose and 5.77 g/L acetic acid , the productivity of xylitol increased

50% (0.60 g/Lh), whereas the yield increased 46% (O. 73 glg) compared to the

others adaptation leveis. Toe effect of the inoculum initial concentration ( 106 -

108 cells/mL) was evaluated for N3 adaptation levei. Practically the inoculum

XV

concentration at this range did not influence the xylose bioconversion to xylitol,

since the fermentation parameters presented similar values.

Toe cell recycle technique was perfomed in hydrolysate containing 59 .85

glL xylose and 4.97 g/L acetic acidas fermentation medium. Inoculum previously

adapted (N3) employed in the first cycle. Toe adapted-cell recycle did not affect

the xylitol yield; however, in the fifth cycle the productivity (0.60 g!L.h)

increased 15% as compared to the first cycle (0.52 g/L.h).

xvi

1. INTRODUÇÃO

O xilitol é um açúcar de poder adoçante semelhante ao da sacarose, com

propriedade anticariogênica e próprio para uso por pessoas portadoras de

diabetes. Estas características o tomam um produto de alto valor econômico.

Além disso, sua capacidade inibidora de cáries representa um atrativo social em

países como o Brasil. Sua utilização em produtos destinados à merenda escolar,

por exemplo, poderia reduzir consideravelmente a incidência de cáries em

cnanças.

A produção microbiológica de xilitol tem sido objeto de estudos do Grupo

de Processos Fermentativos ( GPF) do Departamento de Biotecnologia da

Faculdade de Engenharia Química de Lorena, tendo sido alcançados resultados

satisfatórios tanto em fermentações de meios semi-sintéticos, quanto de

hidrolisados de materiais lignocelulósicos, dentre estes, o bagaço de cana de

açúcar. Entretanto, um melhor desempenho da fermentação de xilose a xilitol

tem sido obtido em meio semi-sintético devido principalmente à ausência neste

de compostos responsáveis pela inibição da atividade fermentativa da levedura.

Dentre estes compostos estão o furfural, o hidroximetilfurfural e especialmente o

ácido acético, presente em concentração elevada (-4,0 g!L) no hidrolisado

obtido da fração hemicelulósica do bagaço, resíduo encontrado em abundância

no setor sucroaJcooleiro.

Em vista da necessidade de se melhorar a conversão de xilose em xilitol

por Candida guilliermondii a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana-de-açúcar, foi avaliada a adaptação da levedura a hidrolisado concentrado

em diferentes níveis, ou seja, células cultivadas em concentrações crescentes de

açúcares, sobretudo a xilose, como também de ácido acético. Foi também

avaliado o efeito da concentração inicial de inóculo bem como a técnica de

reciclagem da levedura no hidrolisado.

Os resultados deste trabalho são importantes para a continuidade do

programa de pesquisa que consiste no desenvolvimento de processos

fermentativos para o aproveitamento da fração hemicelulósica da biomassa

vegetal visando à obtenção de produtos de interesse econômico e social"

conduzido no DEBIQ. Essa tecnologia poderá também contribuir para a redução

do impacto ambiental causado pelos resíduos agroindustriais e florestais.

2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O Brasil, maior produtor mundial de cana-de-açúcar, possuía em 1994,

4,2 milhões de hectares de área cultivada, o que correspondia à produção de 240

milhões de toneladas de cana (ORLANDO FILHO et ai., 1994 ). Após a extração

da sacarose são liberados anualmente em tomo de 5 a 12 milhões de toneladas de

bagaço (BURGI, 1988). Segundo MOLINA JUNIOR et ai., 1995, cada tonelada

de cana moída origina entre 250 a 280 Kg de bagaço, considerando 50% de

umidade.

Embora, dentre outros fins, o bagaço seja aplicado como suplemento em

rações (LACORTE et ai., 1986), na geração de energia em caldeiras (ARMAS,

BIANCHI, 1990; VENTURINI FILHO, ADDISON, 1992), e como material de

revestimento em aglomerados para construção de móveis (MOLINA JUNIOR et

ai., 1995), as unidades produtoras de álcool e os engenhos de açúcar têm ainda

um grande excedente desse resíduo, o que causa sérios problemas de estocagem,

além do impacto ao meio ambiente.

A necessidade do controle da poluição ambiental e a mudança dos valores

sociais e culturais no mundo tem levado muitos países ao uso de fontes

3

renováveis, como os materiais lignocelulósicos, os quais constituem 50% da

biomassa formada no mundo e correspondem aproximadamente a uma produção

de 1 O a 50 X 109 ton/ano (KUHAD, SINGH, 1993).

Os materiais lignocelulósicos são constituídos basicamente de três

frações, em proporções que variam com o tipo de material: celulose, um

polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações

glicosídicas ~-1~; hemicelulose, um heteropolímero composto

predominantemente por hexoses e pentoses com curtas ramificações tais como

D-xilose, D-glicose, L-arabinose e D-galactose; e lignina, uma macromolécula

polifenólica constituída por unidades básicas de 3-5-dimetoxi-4-hidroxi-

fenilpropano, 3-metoxi-4-hidroxi-fenilpropano e 4-hidroxi-fenilpropano (TSAO,

1986).

Um considerável interesse tem sido demonstrado na utilização dos

carboidratos presentes nos hidrolisados de materiais lignocelulósicos, sobretudo,

de resíduos agrícolas como o bagaço de cana-de-açúcar, o qual apresenta alto

teor de xilose (KUHAD, SINGH, 1993). Os hidrolisados são obtidos por

diferentes métodos de hidrólise como: hidrólise ácida (LEE et ai., 1978;

PESSOA JUNIOR, 1991 ), hidrólise enzimática (TSAO, 1986), "stearn-

explosion"( LEE, McCASKEY, 1983; MARCHAL et ai., 1986; PESSOA

JUNIOR, 1991) e extração através de soluções alcalinas (JOSELEAU, 1980; du

TOIT et ai., 1984).

As características do bagaço têm impulsionado diferentes grupos de

pesquisa a desenvolverem tecnologias alternativas que busquem seu

aproveitamento, principalmente aquelas que envolvam processos

biotecnológicos, já que a xilose, pentose que se encontra em até 80% na fração

hemicelulósica deste resíduo (LADISCH et ai., 1983), é um substrato para

muitos processos de bioconversão.

O emprego da xilose em processos biotecnológicos tomou-se possível

com a descoberta de diferentes espécies de leveduras fermentadoras desta

pentose (ONISH, SUZUKI, 1966), o que tem direcionado inúmeras pesquisas

visando ao aproveitamento biotecnológico de materiais lígnocelulósicos ricos em

4

xilose. A partir da xilose contida nos hidrolisados hemicelulósicos, diferentes

produtos de valor econômico e social podem ser obtidos, tais como: etanol

(CHUNG, LEE, 1985; van DUKEN, SCHEFFERS, 1987; WAYMAN et ai., 1987; van ZYL et ai. 1988; PEREGO et ai. 1990), ácido lático (SILVA et ai., 1990a), butanodiol (FRAZER, McCASKEY, 1989) e xilitol (CHEN, GONG,

1985; OJAMO, 1988; ROBERTO et ai., 1991; FELIPE et ai. 1993 a,b; FELIPE,

1994; ROBERTO et ai., 1994; FELIPE et ai., 1995 b ).

2.2. XILITOL

2.2.1. Propriedades

O xilitol (C5H1205), um álcool pentahidroxilado de massa molecular

152,15, é um produto intermediário do metabolismo de carboidratos no homem e

em animais; a concentração de xilitol no sangue humano encontra-se na faixa de

0,03-0,06 mg/100 mL (MANZ et al.,1913). É também encontrado em frutas e

vegetais (W ANG, van EYS, 1981; HYVÕNEN et ai., 1982), porém, a extração

de xilitol a partir dessas fontes não é economicamente viável, uma vez que este

ocorre em baixas concentrações (EMODI, 1978).

A importância econômica e social do xilitol deve-se principalmente a seu

potencial como substituto de açúcares convencionais devido a seu poder

adoçante (EMODI, 1978; HYVÕNEN et ai., 1982), comparável ao da sacarose e

superior ao do sorbitol e manitol (BAR, 1986). Suas propriedades fisico-

químicas estão listadas na Tabela 1.

O xilitol apresenta também propriedade anticariogênica devido ao fato de

não ser utilizado pelos microrganismos da flora bucal, em particular a bactéria

Streptococcus mutans, não ocorrendo a formação de ácidos que atacam o

esmalte dos dentes (MAKINEN, 1976; ASSEV et ai., 1983; ASSEV, ROLLA,

1984; WÃLER et ai., 1992; AGUIRRE-ZERO et ai., 1993). Além da redução de

5

cáries dentárias, o xilitol induz a remineralização do esmalte dos dentes,

revertendo lesões recém formadas, uma vez que a composição química da saliva

parece ser favoravelmente afetada pelo x.ilitol, apresentando um significativo

aumento de íons cálcio e fosfato (MAK.INEN, 1976). Isto deve-se ao fato do

xilitol, quando ingerido oralmente, promover a interação com certos cátions,

possibilitando a absorção de minerais (HÃMÃLÃINEN, MAKINEN, 1989). A

anticariogenicidade do xilitol é uma característica de grande importância

principalmente para os países do terceiro mundo onde a incidência de cáries é

extremamente alta.

Tabela 1- Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et al.,1913; HYVÕNEN et ai., 1982).

Fórmula química Massa molecular Aparência Odor Sabor Poder adoçante Valor calórico Solubilidade (20°C) Viscosidade da solução 60% Ponto de fusão Ponto de ebulição pH de uma solução a 5% Umidade (20°C/60% r.h.) Calor de solução Densidade

CsH120s 152,15 pó cristalino de cor branca inodoro doce igual ao da sacarose, superior ao do sorbitol 4,0 Kcal/g 64,2 g/100 g H20 20.63 cP 92:96 ºe 216 ºe 5-7 Aproximadamente 0,5% +34,8 cal/g 1,50

O xilitol apresenta ainda características que o tomam potencialmente

aplicável na indústria alimentícia devido à ausência em sua molécula de grupos

aldeídicos e cetônicos, não participando de reações de escurecimento do tipo

Maillard (MANZ et ai., 1973 ). Sendo assim, o xilitol toma-se apropriado para o

processamento, a temperaturas elevadas, de alimentos nos quais estas reações

não são desejáveis. No preparo de xaropes e refrescos, a vantagem de se utilizar

o xilitol deve-se ao fato do mesmo não ser fermentado por leveduras, não

requerendo pasteurização, nem a adição de conservantes quando o produto é

estocado por 4 a 5 meses em frascos fechados (MANZ et al., 1973).

6

Além disso, o xilitol é muito bem tolerado pelo orgamsmo humano

(MAKINEN, 1976), podendo inclusive ser empregado com segurança na dieta de

diabéticos por não requerer insulina para seu metabolismo (YLIKAHRI, 1979).

Na área clínica, o xilitol tem sido indicado como adoçante na dieta de

pacientes com doenças biliares e renais, como também na dieta de pessoas

obesas, uma vez que exerce pequena contribuição para a formação de tecidos

gordurosos quando comparado a outros açúcares. O xilitol pode ser empregado,

também, no tratamento de outras desordens metabólicas como a deficiência da

enzima glicose 6- fosfato desidrogenase (EMODI, 1978).

No Japão, Alemanha e outros países da Europa, o xilitol tem sido

amplamente aceito na nutrição parenteral (TOUSTER, 1974; MAKINEN, 1976)

e no preparo de soluções parenterais contendo açúcar e aminoácidos, já que não

reage com aminoácidos tal como ocorre com a glicose (FÔRSTER, 1974).

O conjunto dessas características promovem o xilitol como insumo de

grande importância na indústria alimentícia, odontológica e farmacêutica, Seu

uso como adoçante vem sendo largamente empregado em países da Europa como

Alemanha e Suíça; no Brasil, ele vem sendo utilizado na formulação de produtos

como gomas de mascar, pastilhas e creme dental.

Dentre outras aplicações do xilitol, destaca-se seu emprego como insumo

para indústria de papel e fumo, bem como poliol na manufatura de resinas

(APEL et ai., 1959).

2.2.2. Produção de Xilitol

2.2.2.1. Processo Químico

O xilitol foi primeiramente sintetizado em 1891 por Fischer e Bertrand,

sob a forma de xarope, através da redução da D-xilose empregando amálgama de

sódio. A obtenção de xilitol na forma cristalina se deu em 1942 por Wolfrom e

Kohn após a redução catalítica sob alta pressão de uma solução de xilose

altamente purificada (MANZ et ai., 1973). Somente a partir de 1964 o xilitol

7

passou a ser disponível em quantidades maiores, já sendo empregado na área

clínica em casos de diabetes sob a forma de solução intravenosa, principalmente

no Japão e Alemanha (MANZ et ai., 1973).

A produção de xilitol por via química, em escala comercial, iniciou-se na

Finlândia pela Finnish Sugar Co. Ltd., Helsink, com capacidade para produzir

acima de 3.000 ton/ano. Este processo (Figura 1) consiste na hidrogenação

catalítica da xilose pura obtida através da hidrólise de materiais lignocelulósicos

(JAFFE et ai., 1974; MELAJA, HÃMÃLÃINEN, 1977; HYVÔNEN, et ai., 1982). De modo geral, são necessárias quatro etapas básicas: 1. desintegração

(hidrólise ácida) de materiais naturais ricos em xilana; 2. separação da xilose do

hidrolisado por cromatografia, resultando em uma solução de xilose pura; 3.

hidrogenação catalítica da xilose pura a xilitol na presença de catalisador níquel;

4. cristalização do xilitol na forma orthorômbica (MELAJA, HÃMÃLÃINEN,

1977).

O rendimento deste processo, bem como a qualidade do xilitol estão

intimamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, já que a

presença de impurezas interfere no processo de catálise. Além disso, a produção

de xilitol por via química requer posteriormente várias etapas de purificação para

remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos originados durante

o processo de hidrogenação (MELAJA, HÃMÃLÃINEN, 1977), ocasionado

aumento do tempo de processo e encarecimento do produto.

8

lllf.LAÇO Dl

PlNTOSl

HIDRÓLISE DE MATÉRIASPRNAS CONTENDO PENTOSANAS

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I XILITOL

Figura 1- Produção de xilose e xilitol (MELA.TA. HÀJ\1ÀLÀINEN. 1977).

MEL~O D[ POLIOL

2.2.2.2. Processo Microbiológico

Apesar das características do xilitol, seu uso em escala comercial ainda

tem sido limitado devido a seu custo relativamente alto. Entretanto, sua produção

por via microbiológica tem recebido muita atenção como uma alternativa ao

processo convencional por não requerer uma solução inicial de xilose pura.

O processo microbiológico tomou-se possível a partir da descoberta por

ONISH, SUZUKI, 1966, de leveduras fermentadoras da xilose, as quais possuem

a enzima xilose redutase (E.C.1.1.1.21) que catalisa a redução de xilose a xilitol

na presença dos cofatores NAD(P)H e NADH em um primeiro passo do

metabolismo da xilose (BARNETT, 1976; JEFFRIES, 1983). Posteriormente,

ocorre a participação da enzima xilitol desidrogenase (E.C.1.1.1.9) que emprega

NAD+ ou NAD(P)+ como cofator, oxidando o xilitol a xilulose (SLININGER et

ai., 1987). A xilulose é convertida em piruvato, um intermediário que conecta a

via pentose fosfato com a via glicolítica (TAYLOR et ai. 1990; WEBB, LEE,

1990; ROSEIRO et al.1991 ).

Em trabalhos feitos com as leveduras do gênero Pichia e Candida, foram

constatadas diferenças na especificidade das enzimas xilose redutase e xilitol

desidrogenase pelos cofatores onde tanto NAD(P)H quanto NADH são

necessários para a atividade de xilose redutase (BRUINENBERG et ai., 1984).

Em trabalhos realizados com Pichia stipitis foi constatado a participação de

ambos cofatores sendo que a maior atividade da xilose redutase ocorreu com o

cofator NAD(P)H (VERDUYN et al., 1985), enquanto que em Candida utilis

apenas o NAD(P)H foi necessário para a atividade da xilose redutase.

A regeneração de NAD(P)H em leveduras é essencial para o acúmulo de

xilitol no meio a partir da xilose (KITPREECHA V ANICH et ai., 1984;

BRUINENBERG et al., 1984). Segundo BARBOSA et al., 1988, pela via

pentose fosfato ocorre a oxidação completa de 1 molde glicose-6-fosfato a C02

gerando 12 moles de NAD(P)H a partir de NAD(P)+. Assim, o metabolismo da

xilose em leveduras atua em um ciclo coordenado e fechado, assegurando a

regeneração do NAD(P)H necessário para a conversão de xilose em xilitol. A

10

JCILOII JCILITOL XII.~ ><ILOSE -TIWtS--PO-fl_T_l--1 XILOSE ,tlDUTAtl )CUTOl; OUIOftOOIMII XIUJLOSE KINASI XIWLOSE-

MAOC~,) + N~ ~P t5-1P

VIA f' tlTOSI ,os,ATO

FORA ,OA

CE LULA

levedura cataboliza apenas a quantidade de xilitol suficiente para a produção de

glicose-6-fosfato necessária para a regeneração do NAD(P)H e manutenção do

ciclo.

Segundo SILVA et ai., 1996, o acúmulo de xilitol no citoplasma de

C. guilliermondii e sua decorrente excreção no meio de cultivo pode também ser

explicado pelo fato do Km ( constante de Michaelis-Menten) da enzima xilose

redutase ser 4 vezes menor que o Km da enzima xilitol desidrogenase, o que

indica maior afinidade da xilose redutase pelo seu substrato.

WEBB, LEE, 1990, propuseram um esquema do passo inicial do

metabolismo de xilose em xilitol em leveduras (Figura 2). TAYLOR et ai., 1990,

apresentaram um esquema mais abrangente da principal via metabólica

envolvida no metabolismo da xilose (Figura 3).

DENTRO DA

CÉLULA

Figura 2- Representação esquemática da conversão de xilose em xilulose-5-

fosfato via xilose induzida em leveduras (WEBB, LEE, 1990).

11

PIADPH HAO

o-x1LoSE ~ XIUTOL ~D-XtLULOSE -D-XILULOSE '5-P

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1 • / 0-RIBOSE '5-P 0-ARABINITIX.. 0-RIBULOSE õ-P

SEOOHEPTULOSE 7-P 0-GUJCOOATO 6-P

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'--:::--P1 "TO a GLjÇÓUSE SE6-P ~LOEIOO ~co,. 1 •• I COI AClTl. CoA

2t·i ETANOL

0-GLICERALDEIOO 3-P

l t on OAOXIACE TONA - p

Figura 3- Principal via metabólica envolvida na fermentação de xilose

(TAYLOR et ai., l 990).

Diferentes microrganismos tem sido empregados visando a produção de

xilitol a partir da xilose, sendo reveladas algumas espécies de leveduras como

Pachysolen tannophilus (JEFFRIES, 1983), Candida sp (GONG et ai., 1981 );

12

Candida tropicalis (BARBOSA et ai., 1988), Candida guilliermondii

(BARBOSA et ai., 1988, FELIPE et ai., 1993 a,b; ROBERTO et ai., 1994;

SILVA et ai., 1996), Debaryomyces hansenii (ROSEIRO et ai., 1991), como

também de bactérias, dentre elas Enterobacter liquefaciens (YOSIIlT AKE et ai.,

1976) e de fungo filamentoso como Petromyces albertensis (DAIIlYA, 1991).

A bioconversão de xilose em xilitol é regulada por diversos fatores como:

concentração inicial de xilose (OJAMO et ai., 1988; MEYRIAL et ai., 1991;

NOLLEAU et ai., 1993), presença de glicose (du PREEZ et ai., 1986 a; BICHO

et ai., 1988; SILVA et ai., l 990b; FELIPE et ai., 1993 a), pH ( du PREEZ et ai.,

1986 b; SLININGER et ai., 1990), temperatura (BARBOSA et ai., 1988;

SOUZA et ai., 1993) e suprimento de 02 (SILVA et ai., 1990 b; FURLAN et ai.,

1991; NOLLEAU et ai., 1993, FELIPE et ai., 1995 b).

Vários trabalhos têm evidenciado a influência da concentração inicial de

xilose no meio na produção de xilitol. Segundo OJAMO et ai., 1988, durante a

fermentação de xilose por C. guilliermondt, a eficiência de conversão de xilose

em xilitol variou de 50 a 78% em função da concentração inicial de xilose

empregada. MEYRIAL et ai., 1991, verificaram maior produtividade (0,22

g!L.h) com 200 glL de xilose, sendo que em concentrações acima deste valor

ocorreu inibição da fermentação pelo substrato, resultando em maior tempo de

fermentação. Entretanto, concentração superior a esta foi considerada como

favorável à produção de xilitol por C. guitliermondii. obtendo-se rendimento

elevado (0,75 g/g) com a utilização de xilose na concentração de 300 glL

(NOLLEAU et ai., 1993). Estas diferenças quanto à concentração ótima de

xilose devem estar relacionadas com as diversas condições de fermentação

empregadas, principalmente com a disponibilidade de 02, conforme constatado

por NOLLEAU et ai., 1993.

Na fermentação em meio contendo uma mistura de xilose e glicose a

utilização preferencial de glicose é um efeito evidente (du PREEZ et ai., 1986a),

tendo sido este claramente evidenciado em fermentações conduzidas com P.

stipitis e P. tannophilus. Verificou-se que para ambas ocorre a repressão das

enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase pela glicose e a indução destas

13

enzimas pela xilose. Foi também verificada uma fase lag para o consumo de

xilose por P. tannophilus em meio contendo glicose, enquanto que P. stiptis

consumiu simultaneamente a xilose na presença de glicose (BICHO et. ai., 1988).

SILVA et ai., 1996, verificaram um aumento de 46% no rendimento em

xilitol por C. guilliermondii com a omissão de glicose do meio. Segundo FELIPE

et ai., I 993a, o efeito da glicose está relacionado com a proporção em que esta

se encontra em relação à xilose, ocorrendo maior inibição com o aumento desta

relação. Segundo estes autores, em experimentos com C. guilliermondii foi

verificada uma redução de 50% no rendimento em xilitol na fermentação em que

a concentração de glicose no meio correspondia à metade da concentração de

xilose, quando comparado ao valor obtido em meio ausente de glicose. Estes

autores também constataram que, quando a concentração de glicose foi inferior a

10% do total de xilose, a produção de xilitol não foi afetada.

O pH também é um fator capaz de afetar a bioconversão de xilose em

xilitol, embora este não deva ser avaliado como um fator isolado. Segundo

FELIPE, 1994, em fermentações de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana-de-açúcar conduzidas com C. guilliermondii, não foi constatado consumo

de xilose em pH abaixo de 4,6, e, em consequência, não se observou formação

de xilitol. Porém, a partir deste valor, a xilose foi consumida e convertida em

xilitol, obtendo-se o maior rendimento em pH 5,3. No entanto, em fermentações

em meio semi-sintético, foi observada a formação de xilitol em pH inferior a 4,6

(SILV ~ 1994).

Um dos mais importantes fatores ambientais que deve ser ajustado no

cultivo de microrganismos é a temperatura (BROCK et ai., 1994 ), embora as

leveduras sejam capazes de crescer em ampla faixa de temperatura. O

metabolismo de xilose em leveduras é fortemente afetado por este parâmetro,

sendo que para C. guilliermondii a produção de xilitol é favorecida na faixa de

30 a 35 ºe (BARBOSA et ai., 1988; SOUZA et ai., 1993).

A disponibilidade de oxigênio no meio é outro parâmetro de grande

influência na fermentação da xilose por leveduras, sendo o rendimento em xilitol

14

fortemente dependente da velocidade de transferência de 02 (DELGENES et ai., 1989; NOLLEAU et ai., 1993). Este fenômeno está diretamente relacionado com

a disponibilidade do cofator da enzima xilitol desidrogenase, o NAD+, o qual é

regenerado na cadeia respiratória (NOLLEAU et ai., 1993).

Segundo LAPLACE et ai., 1991, em fermentações conduzidas com P.

sttpitis e C. shehatae, o acúmulo de xilitol no meio foi favorecido em condições

de menor velocidade de transferência de 02, enquanto que o aumento da

velocidade de transferência de 02 resultou na redução da concentração de xilitol.

Isto, porque o acúmulo de xilitol é decorrente do desbalanço das concentrações

de NAD+ e NADH, pois, em condições anaeróbicas ou baixa velocidade de

transferência de 02, o sistema de transferência de elétrons em leveduras é

incapaz de oxidar o NADH completamente, aumentando assim a concentração

intracelular desta coenzima, favorecendo a formação de xilitol.

FELIPE et ai., l 995b, verificaram que na fermentação do hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por C. guilliermondii, a velocidade

de aeração exerceu uma forte influência na produção de xilitol, sendo constatado

um aumento de 179% na produtividade após 48 h quando elevou-se a velocidade

de aeração de 0,4 vvm para 0,8 vvm.

2.2.2.3. Obtenção de Xilitol por Fermentação de Hidrolisados

Hemicelulósicos

As pesquisas realizadas visando ao conhecimento dos parâmetros

reguladores da bioconversão de xilose em xilitol tem sido conduzidas, na maioria

dos casos, em meio sintético. Os resultados obtidos, portanto, nem sempre se

aplicam a fermentações conduzidas em hidrolisados, e em consequência,

observa-se uma baixa fermentabilidade dos hidrolisados quando comparada à

fermentação da xilose pura. Isto, deve-se ao fato de que nestes hidrolisados estão

presentes, além dos açúcares, compostos tóxicos tais como o furfural, o

hidroximetilfurfural e o ácido acético, oriundos do procedimento de hidrólise da

estrutura lignocelulósica (LEE, McCASKEY, 1983; JEFFRIES et ai, 1985), bem

15

como compostos fenólicos originados da lignina, extrativos da madeira e íons

metálicos oriundos da corrosão de equipamentos (CHUNG, LEE, 1985). A

desidratação parcial das pentoses presentes na hemicelulose leva ao 2-

furfuraldeído ( ou furfural); a desidratação das hexoses, tal como a glicose da

estrutura celulósica leva ao 5-hidroximetil-2-furfuraldeído ( ou

hidroximetilfurfural) (NJMZ, CASTEN, 1986), enquanto que o ácido acético é

oriundo dos grupos acetil das cadeias laterais da hemicelulose (LEE,

McCASKEY, 1983; FENGEL, WEGENER, 1989).

V árias pesquisas tem sido feitas visando ao entendimento dos mecanismos

de atuação do furfural e do hidroximetilfurfural sobre o metabolismo de xilose.

Segundo Nirupama et ai., 1981, citados por SANCHES, BAUTISTA, 1988, o

furfural exerceu um forte efeito inibidor na síntese de proteínas e RNA

em C. tropicalis. De acordo com estes autores, o efeito inibitório do furfural e do

hidroximetilfurfural sobre o crescimento e a fermentabilidade deve-se a sua ação

na glicólise, tendo sido mostrado, in vitro, que o furfural inibiu várias enzimas

desta via. O maior efeito observado foi sobre a enzima triose-fosfato-

desidrogenase (E.C.5.3.1.1) e em segundo lugar, sobre a enzima álcool-

desidrogenase (E.C.1.1.1.1 ). Por outro lado, WEIGERT et ai., 1988 atribuíram a

inibição pelo furfural a sua interferência direta no transporte de elétrons na

cadeia respiratória na mitocôndria. Soboleya, 1974, citado por WEIGERT et ai., 1988, constatou efeito inibitório do furfural sobre a síntese de citocromos.

Resultados de diversas pesquisas têm revelado um decréscimo na

concentração de furfural durante o processo fermentativo (MORIMOTO et al.,

1967; AZHAR et ai., 1981; CHUNG, LEE, 1985; TRAN, CHAfvffiERS, 1986;

WEIGERT et ai., 1988). WEIGERT et ai., 1988, constataram não somente este

decréscimo, como também obtiveram evidências de que a enzima álcool

desidrogenase foi a principal enzima responsável pela redução do furfural a

álcool furfurílico. MORIMOTO et ai., 1967, detectaram álcool furfurílico como

produto do metabolismo do furfural em várias espécies de leveduras. Foi também

constatado que a influência do furfural na via metabólica de utilização de

açúcares e crescimento microbiano é dependente da concentração de furfural no

16

meio de cultivo. Em fermentação alcoólica empregando Saccharomyces

cerevisiae, AZHAR et ai., 1981, verificaram uma fase lag de crescimento

celular, além da inibição da multiplicação da levedura, quando em presença de

furfural na concentração de 3,0 g/L.

Segundo SANCHEZ, BAUTIST A, 1988, em fermentação empregando

C. guilliermondii, o furfural mostrou-se um potente inibidor do metabolismo

oxidativo quando em concentrações acima de 1,0 g/L, enquanto que, na

concentração de 2,0 g/L, a inibição foi total. Estes autores detectaram ácido

furóico nos sobrenadantes do meio quando o furfural foi adicionado em

concentrações abaixo de 2,0 g/L. Em trabalhos realizados por OJAMO et ai., 1988, empregando esta mesma levedura, foi constatado que a presença de

furfural na concentração de 0,2 a 1,0 g/L favoreceu o rendimento em xilitol.

Outro potente inibidor do metabolismo de xilose pela célula é o ácido

acético (JEFFRIES, 1985; van ZYL et ai., 1988; FERRAR1 et ai., 1992), embora

este ácido se apresente como fonte de carbono para muitas leveduras e bactérias

(MEYER et ai., 1992 a e b; FERRARI et ai., 1992). Vários trabalhos têm

relatado que o efeito inibitório do ácido acético na atividade fermentativa está

relacionado à acidez do meio (NODA et ai., 1982; FERRARI et al., 1992), à

aeração do meio ( van ZYL et ai., 1988), à relação xilose/ácido acético ( du

PREEZ et al., 1991) e, principalmente, à concentração do ácido (FELIPE et ai.,

1995 a). Segundo HERRERO et ai., 1985, o efeito tóxico do ácido acético deve-

se à sua presença no meio sob a forma não dissociada, o que é dependente do

pH. No pH ótimo para a fermentação por leveduras (pH 4-5), o ácido acético

encontra-se, em sua maior parte, na forma não dissociada. Uma vez dentro da

célula, devido ao pH do citosol ser relativamente alto, o ácido acético dissocia-se

provocando um decréscimo do pH intracelular. Como resultado, ocorre

desacoplamento da produção de energia e do transporte de vários nutrientes. Este

processo pode, também, modificar o controle da glicólise por mecanismos de

acidificação interna e pela presença química deste ácido (P AMPULHA,

LOUREIRO-DIAS, 1990). LEE, McCASKEY, 1983, verificaram a inibição do

crescimento de P. tannophilus pelo ácido acético em função do pH do meio.

17

Estes autores observaram que na presença de 2,5 glL de ácido acético quando o

pH variou de 4,2 a 5,2, o crescimento da levedura foi estimulado, enquanto que

em pH 3,0 houve inibição do crescimento. van ZYL et al., 1991, na fermentação

de xilose por P. stipitis, verificaram um decréscimo do rendimento em etanol ,em

pH 5,1, em meio contendo ácido acético, porém, na ausência deste ácido, este

pH mostrou-se próximo do ótimo para a produção de etanol.

O poder de inibição do ácido acético é também dependente da sua

concentração no meio, podendo favorecer a fermentação da xilose quando em

baixas concentrações (LEE, McCASKEY, 1983; Van ZYL et ai., 1988; FELIPE

et ai., 1995 a). Na fermentação de xilose a xilitol por C. guilliermondii, foi

verificado que a presença de 1,0 glL de ácido acético aumentou em 14% o

rendimento em relação ao meio onde este ácido estava ausente (FELIPE et ai., l 995a). Segundo estes autores, uma possível explicação para este efeito é que

parte do ácido acético entraria diretamente no ciclo de Krebs via acetil-CoA,

enquanto que em concentrações acima de 1,0 g/L, parte do ácido seria dirigido

ao ciclo de Krebs e o restante utilizado por uma outra via metabólica que requer

energia, como o ciclo do Ácido Glioxílico. Isto resultaria em perda de energia

para a manutenção do metabolismo da célula, acarretando redução do

crescimento. Segundo HERRERO et ai., 1985, foi observado um baixo

crescimento na população de Clostridium thermocellum na presença de ácido

acético, o que foi atribuído ao fato de grandes quantidades de A TP serem

consumidas via A TPase, a fim de manter o gradiente de prótons. Em

consequência, menor quantidade de energia estaria disponível para biossíntese.

FELIPE et ai., l 995a, verificaram ,também, que na presença de ácido acético, na

concentração de 12 g/L, ocorreu redução de 50% na quantidade de xilitol em

relação à quantidade obtida em fermentação onde este ácido estava ausente. De

acordo com os resultados obtidos por van ZYL et ai., 1991, na fermentação da

xilose por P. stipitis, a utilização do ácido acético pela levedura foi dependente

da aeração, uma vez que, na ausência de oxigênio, este ácido não foi assimilado.

Devido ao ácido acético estar geralmente presente nos hidrolisados de

materiais lignocelulósicos (LEE, McCASKEY, 1983; FERRARI et ai., 1992 ),

18

várias técnicas têm sido empregadas visando a contornar o problema da

toxicidade deste ácido na utilização dos hidrolisados em processos de

bioconversão. FERRARI et ai., 1992, sugeriram como forma de minimizar os

efeitos inibitórios causados pela presença de concentrações elevadas de ácido

acético nos hidrolisados, a condução da fermentação em pH elevado. Segundo

estes autores, desta forma se trabalharia acima da constante de dissociação do

ácido acético. Porém, deve ser levado em conta o risco de contaminação

bacteriana, além de empregar-se pH superior ao considerado ótimo para a

fermentação.

Vários métodos de tratamento dos hidrolisados têm sido também

empregados antes de sua utilização como meio de cultura, tais como:

aquecimento (MARCHAI.., et ai., 1986); adição de carvão ativo e utilização de

resinas de troca iônica (MADDOX, MURRAY, 1983; van ZYL et al., 1991);

bem como alteração do pH com bases e ácidos (van ZYL et ai., 1988;

ROBERTO et ai., 1991; SILVA et ai., 1991). No entanto, algumas destas

técnicas são caras ou não são totalmente eficazes dependendo do tipo do

hidrolisado, surgindo a necessidade de alternativas que venham a reduzir a

toxicidade destes. No caso do tratamento com carvão ativo, tem sido constatada

uma perda significativa de açúcares, principalmente xilose (FRAZER,

McCASKEY, 1989), o que não é desejado, já que a concentração inicial desta

pentose é um fator importante para se alcançar elevados rendimentos no

processo de obtenção de xilitol (tvffiYRIAL et ai., 1991; NOLLEAU et

ai., 1993).

Segundo CHUNG, LEE, 1985, uma maneira para se contornar o problema

da toxicidade dos hidrolisados é o emprego de condições de fermentação com

alta densidade celular, pois desta forma, o furfural e o hidroximetilfurfural tem

seus efeitos anulados durante o estágio inicial da fermentação, o que foi

observado na fermentação de hidrolisado de madeira utilizando S. cerevisiae.

Estes autores verificaram que a utilização de 108 cels/mL como concentração

inicial resultou em uma sobrevivência de 50% das células durante o período

19

inicial de morte, período que correspondeu ao esgotamento do furfural e do

hidroximetilfurfural do meio.

Segundo FELIPE, 1994, na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de

bagaço de cana-de-açúcar por C. guilliermondii foi verificado um aumento do

consumo de xilose de 82% para 100% quando elevou-se o nível de inóculo de

O, 1 glL para 3,0 g/L. Este aumento da concentração inicial de inóculo também

resultou em aumento da produtividade em xilitol.

Segundo P AREKH et ai., 1986 e P AREKH et ai., 1987, o problema da

toxicidade dos hidrolisados pode também ser contornado através de técnicas de

adaptação da levedura ao hidrolisado. Em trabalhos conduzidos com as

leveduras C. shehatae e P. stipitis, o emprego de células adaptadas elevou o

rendimento em etanol em 15% para ambas as espécies estudadas (P AREKH et

ai., 1986). CHEN, GONG, 1985, também utilizaram esta técnica e constataram

que a adaptação da levedura Candida sp B 22, ao hidrolisado hernicelulósico de

bagaço de cana-de-açúcar, favoreceu a fermentação da xilose a xilitol. Segundo

estes autores, a levedura adquire habilidade para superar os efeitos inibitórios

causados pelos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados.

A reciclagem da levedura no hidrolisado tem sido também empregada e,

segundo P AREKH et ai., 1986, maior utilização do substrato por C. shehatae e

maior produção de etanol foram constatadas com esta técnica. Estes autores

acreditam que a reciclagem de células resulta na seleção de uma linhagem

melhor adaptada, ocorrendo maior eficiência na indução das enzimas requeridas

para fermentação da pentose. YU, et ai, 1987, verificaram que a reciclagem da

levedura C. shehatae na fermentação do liquor sulfitico favoreceu a fermentação

de pentoses e hexoses a etanol.

Embora os resultados obtidos na avaliação de métodos para contornar o

problema da toxicidade dos hidrolisados sejam satisfatórios, a literatura

apresenta pouca informação a respeito de técnicas de adaptação e reciclagem de

leveduras visando, especificamente, à fermentação de hidrolisado hemicelulósico

a xilitol.

20

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MICRORGANISMO

Os ensaios foram conduzidos com a levedura Candida guilliermondii FTI

20037, selecionada por BARBOSA et ai., 1988, mantida em ágar extrato de

malte a 4°C.

3.2. OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

3.2.1. Hidrólise Ácida do Bagaço

O bagaço de cana-de-açúcar proveniente da Usina Santa Bárbara, Santa

Bárbara do Oeste - SP, foi hidrolisado na planta de hidrólise ácida da

F AENQUIL, em reator de aço inox AISI 316, com volume total de 250L, com

aquecimento indireto por resistência elétrica por camisa de óleo térmico (Figura

4 ). A hidrólise foi realizada à temperatura de 121 ºe, por 1 O min., empregando

100 mg de H2SOJg de matéria seca para uma relação sólido-líquido de 1:10. O

21

teor de umidade do bagaço foi previamente determinado através da secagem de

amostras em estufa a 100 ºe, até peso constante.

O hidrolisado obtido foi filtrado sob vácuo em filtro de porcelana e

armazenado em câmara fria para posterior utilização.

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Figura 4- Reator de hidrólise ácida.

22

3.2.2. Concentração do Hidrolisado

Visando ao aumento do teor de xilose, o hidrolisado foi concentrado em

evaporador a vácuo, com capacidade de 4L, a 70 ± 3 ºe, aquecido indiretamente

com vapor gerado por autoclave a 121 ºe, de forma a aumentar o teor de xilose

para 2, 3 e 4 vezes a sua concentração original. O hidrolisado original, bem

como os hidrolisados obtidos após a etapa de concentração, foram

caracterizados, quanto ao pH, "Brix, à concentração dos açúcares xilose, glicose

e arabinose e à concentração de compostos tóxicos como furfural,

hidroximetilfurfural e ácido acético.

3.2.3. Tratamento do Hidrolisado

O hidrolisado concentrado, antes de ser utilizado como meio de

fermentação, foi tratado visando à redução da concentração dos compostos

tóxicos provenientes do processo de hidrólise. O tratamento consistiu do

aumento do pH do hidrolisado para 10,0 pela adição de óxido da cálcio

comercial, seguido da sua redução para 5,5 com H2S04 (P.A.). A cada alteração

de pí-l, o precipitado formado foi removido por filtração a vácuo em filtro de

porcelana.

3.3. AVALIAÇÃO DA ADAPTAÇÃO DA LEVEDURA AO

HIDROLISADO

3.3.1. Preparo do Inóculo

O inóculo foi preparado a partir de células de uma cultura estoque de

C. guilliermondii FTI 20037 recém repicada. Antes da utilização da cultura da

levedura para o preparo do inóculo, foram feitas observações, em microscópio

23

óptico LEITZ, de lâminas preparadas a fresco, coradas por azul de metileno vital

(0,01%) e também de lâminas fixadas e coradas por fucsina.

Para o cultivo do inóculo foram empregados meios preparados com os

seguintes hidrolisados: hidrolisado em sua forma original, isto é, não

concentrado (HC), cujas concentrações de xilose e ácido acético foram 18,6 glL

e 2,68 g!L, respectivamente; hidrolisado 2 vezes concentrado (2HC) contendo

38,32 g/L de xilose e 4,30 g/L de ácido acético; hidrolisado 3 vezes concentrado

(3HC) contendo 59,85 g/L de xilose e 4,97 g/L de ácido acético e hidrolisado 4

vezes concentrado (4HC) contendo 72,35 g/L de xilose e 5,77 glL de ácido

acético.

Os meios de cultivo do inóculo foram obtidos suplementando-se os

hidrolisados com os seguintes nutrientes: 2,0 glL de CNH4)2S04, O, 1 glL de

CaCh.2H20 e 20,0 g/L de farelo de arroz, in natura. As soluções de cálcio,

nitrogênio e de farelo de arroz, in natura, foram preparadas separadamente nas

concentrações de 1 O, 100 e 200 g/L respectivamente. Os hidrolisados foram

autoclavados a 115 ºe por 15 min e as demais soluções de nutrientes foram

esterilizadas a 121 ºe por 20 min. em autoclave SOC. F ABBE L TDA.

Foram avaliados 4 níveis de adaptação do inóculo (N1, N2, N3 e N4) com o

objetivo de se obter células adaptadas à concentrações crescentes de compostos

tóxicos, principalmente o ácido acético. Em N 1 o inóculo foi obtido cultivando-

se as células no meio composto pelo hidrolisado não concentrado (HC); em N2 o

inóculo foi obtido conforme N 1 seguido do cultivo em meio composto pelo

hidrolisado 2HC; em N3 o inóculo foi obtido conforme N2 seguido do cultivo em

meio composto pelo hidrolisado 3HC e em N4 conforme N3 seguido do cultivo

em meio constituído pelo hidrolisado 4HC.

Em todas as etapas do preparo do inóculo, os cultivos foram conduzidos

em frascos Erlenmeyer de 125 mL esterilizados a 121 ºe por 20 min., contendo

50 mL do meio de fermentação, incubados em shaker rotatório (ETICA) a 200

min", a 30 ºe, por um período de 24 h. Em seguida, as células foram

recuperadas por centrifugação a 800 x g durante 15 min., em centrífuga CU-5000

Damon/IEC Division, lavadas, e após nova centrifugação, ressuspensas em água

24

destilada estéril para então, serem utilizadas como inóculo no cultivo seguinte. A

concentração inicial de inóculo para todos os ensaios foi de 1,0 g/L de células.

3.3.2. Meio e Condições de Fermentação

Nos experimentos em que foi avaliada a adaptação do inóculo, as

fermentações foram conduzidas em meios constituídos pelos hidrolisados 2HC,

3HC e 4HC, ou seja, para cada nível de adaptação do inóculo (N1, N2, N3, N4)

foram feitas fermentações empregando-se os meios acima. Os meios foram

suplementados com os mesmos nutrientes empregados na obtenção do inóculo,

conforme mencionado no ítem 3 .3 .1.

Os experimentos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer em triplicata,

sob as mesmas condições empregadas para o preparo do inóculo (ítem 3.3.1).

O período de incubação foi calculado baseando-se no tempo necessário

para o consumo total de xilose e as amostras foram retiradas nos tempos O, 24,

34, 48 e 58 h para os meios compostos pelo hidrolisado 2HC e nestes mesmos

tempos e também após 72 h para os hidrolisados 3HC e 4HC. As amostras

corresponderam a alíquotas de 3 mL nos tempos O e à remoção de todo conteúdo

dos frascos nos demais tempos.

3.4. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE INÓCULO ADAPTADO

3.4.1. Preparo do Inóculo

As concentrações iniciais do inóculo adaptado avaliadas foram: 0,1, 1,0 e

6,0 g/L de células o que correspondeu a 2,5 x 106, 6,1 x 107 e 1,8 x 108

cels/mL, respectivamente. Empregou-se inóculo de nível de adaptação N3,

preparado conforme ítem 3 .3 .1.

25

3.4.2. Meio e Condições de Fermentação

Empregou-se corno meio de fermentação o hidrolisado 3HC (59,85 gil de

xilose, 4,97 gil de ácido acético) suplementado com nutrientes conforme ítern

3.3.1.

As fermentações e retiradas de amostras foram conduzidas conforme

descrito em 3.3.2.

3.5. AVALIAÇÃO DA RECICLAGEM DA LEVEDURA NO

HIDROLISADO

3.5.1. Preparo do Inóculo

Visando a estudar o desempenho da levedura em sistema com reciclagem

de células, empregou-se inóculo no nível de adaptação N3, para a condução da

primeira fermentação, preparado conforme ítern 3 .3 .1 .

As demais fermentações foram conduzidas com inóculo obtido de células

recuperadas da fermentação anterior por centrifugação a 800 x g por 15 min. em

centrífuga CU-5000 Darnon!IEC Division, lavadas e após nova centrifugação,

ressuspensas em água destilada estéril. Adotou-se para todas as fermentações a

concentração inicial de células de O, 1 gil, determinada

espectrofotornetricarnente.

3.5.2. Meio e Condições de Fermentação

Empregou-se o mesmo meio utilizado para a avaliação da concentração

do inóculo adaptado, conforme descrito em 3.4.2.

As fermentações foram conduzidas nas mesmas condições empregadas

nos ensaios anteriores, entretanto por um período de 48 h.

26

Foram efetuados 5 ciclos, sendo as amostras retiradas nos tempos O (3

mL) e nos intervalos de 24, 34 e 48 h (remoção do conteúdo dos frascos).

3.6. MÉTODOS ANALÍTICOS

O acompanhamento dos ensaios de fermentação foi realizado através de

observações da viabilidade e pureza da cultura, do consumo dos açúcares

glicose, xilose e arabinose, da produção de xilitol e de células, da concentração

de ácido acético e da variação do pH. Para isto, após separado de cada amostra,

o volume necessário para contagem de células e verificação da viabililade e

pureza da cultura, foram submetidos à centrifugação (CLAY-ADAMS) a 4000 x

g durante 15 min., 1 O mi para a determinação do pH do sobrenadante e posterior

armazenamento em freezer para análise de açúcares e ácido acético.

3.6.1. Viabilidade e Pureza da Cultura

A viabilidade e pureza da cultura foram verificadas a partir de

visualizações microscópicas de lâminas preparadas a fresco onde as células

foram coradas por solução de azul de metileno a 0,01 % e de lâminas fixadas e

coradas com fucsina, respectivamente. As observações foram feitas em

microscópio óptico LEITZ.

3.6.2. Concentração Celular

A concentração celular para o preparo do inóculo, nas concentrações de

O, 1, 1,0 ou 6,0 g/L, foi determinada por turbidimetria em espectrofotômetro

Micronal B34211 a 600 nm, onde a concentração de células em g/L foi calculada

por uma curva padrão que correlaciona a absorbância a 600 nm e o peso seco das

células obtidas do cultivo por 24 h em meio semi-sintético. O crescimento

27

celular foi determinado por contagem de células em Câmara de Neubauer (1/400

mm' x 1/10 mm).

3.6.3. Concentração de Açúcares e Ácido Acético

As concentrações dos açúcares glicose, xilose, arabinose e xilitol, bem

como de ácido acético foram determinadas em Cromatógrafo Líquido de Alta

Eficiência (Shimadzu-LC-1 O AD), empregando-se as seguintes condições:

coluna BIO RAD Aminex HPX-87H (300 X 7 ,8 mm); temperatura da coluna,

45°C; detector de índice de refração RID-6A; eluente, solução de H2S04 O,OIN;

fluxo de 0,6mL/min; volume da amostra injetada, 20 µL.

As amostras, devidamente diluídas, foram filtradas em filtro Sep Pak C 18

(MILLIPORE) e o eluente, antes do uso, foi filtrado a vácuo em membrana

HAWP 0,45µm (MILLIPORE) e em seguida degaseificado em banho de

ultrasom (Microsonic SX-50) por 15 min.

3.6.4. Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural nos hidrolisados

foram determinadas em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Shimadzu-

LC-1 OAD), empregando-se as seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP

18 (200 mm); temperatura da coluna 25°C; detector de ultra-violeta SPD-1 OA

UV-VIS; eluente, solução de acetronitrila/água (1: 8) com 1 % de ácido acético;

volume da amostra injetada, 20 µL. Os hidrolisados foram devidamente diluidos

e filtrados a vácuo em membrana HA WP 0,45 µm (MILLIPORE). O eluente foi

filtrado a vácuo empregando-se membrana GVWP 0,22 µm (MILLIPORE) e em

seguida degaseificado em banho de ultrasom (Microsonic SX-50) por 15 min.

28

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3.6.5. Determinação do pH e Grau Brix

O pH das amostras foi determinado em pHmetro MICRONAL 374. O

grau Brix dos hidrolisados foi medido em refratômetro Schmidt-Haensch.

3.7. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS

Os parâmetros fermentativos rendimento, produtividade e eficiência do

processo foram calculados conforme a seguir:

rendimento (Ypis)= quantidade de xilitol produzido (g)/quantidade de xilose

consumida (g)

produtividade (Qp)= concentração de xilitol produzido por unidade de tempo

(g!L.h)

eficiência (ri)= % calculada assumindo-se que o rendimento teórico (Ypis) é de

0,917 g/ g (BARBOSA et ai., 1988)

29

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO

A composição parcial do hidrolisado original bem como dos hidrolisados

concentrados está demonstrada na Tabela 2.

Tabela 2 - Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar obtido por hidrólise ácida, na forma original e após submetido a diferentes níveis de concentração.

HIDROLISADO CAR.A.CTERÍSTICAS ORIGINAL CONCENTRADO

2HC 3HC 4HC

r:rix 0,95 0,66 0,51 0,41 4,0 8,5 11,0 15,0

Glicose (g/L) 1,46 3,15 5,5 6,95 Xilose (g/L) 18,6 38,32 59,85 72,35 Arabinose (g/L) 1J3 2,86 6,56 7,67 Furfural (g/L) 0,24 0,11 0,0 0,0 Hidroximetilfurfural (g/L) 0,03 0,06 0,09 0,19 Acido acético (g/L) 2,68 4,30 4,97 5,77

Com relação à composição monossacarídica do hidrolisado de bagaço,

nota-se uma predominância da xilose em relação aos demais açúcares, conforme

já constatado por du TOIT et ai., 1984 (229 mglg de xilose, 44 mglg glicose, 2,8

mglg arabinose). No entanto, a concentração dos açúcares apresentaram

30

pequenas variações quando comparadas com aquelas verificadas por du TOIT et

ai., 1984, o que pode ser decorrente das diferentes condições de hidrólise

empregadas, bem como da variedade da cana-de-açúcar.

Verifica-se também a presença de compostos inibidores do metabolismo

microbiano como o furfural e o hidroximetilfurfural, originados da desidratação

de pentoses e hexoses, respectivamente (NIMZ, CASTEN, 1986) e de ácido

acético, oriundo dos grupos acetil das cadeias laterais da hemicelulose (LEE,

McCASKEY, 1983; FENGEL, WEGENER, 1989). Este ácido apresenta-se em

concentração abaixo da normalmente encontrada em hidrolisado de carvalho, 12

g/L (TRAN, CHAMBERS, 1985) e de bagaço de cana-de-açúcar, 10 g/L (van

ZYL et ai., 1988), em função das diferentes matérias primas e das condições de

hidrólise empregadas.

Nota-se ainda, na Tabela 2, a elevação da concentração dos açúcares bem

como do hidroximetilfurfural e do ácido acético com o aumento da concentração

do hidrolisado, enquanto o furfural, composto bastante volátil, teve a sua

concentração reduzida. Com relação ao ácido acético, verifica-se, no entanto, um

pequeno aumento em sua concentração em decorrência do processo de

concentração, o que indica que o ácido acético foi parcialmente removido.

ROBERTO, et ai., 1996, também verificaram uma pequena variação na

concentração do ácido acético (1,40 - 1,82 g/L) durante o processo de

evaporação do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz.

Verifica-se ainda na Tabela 2 que o aumento da concentração do

hidrolisado levou ao decréscimo do pH decorrente do aumento do teor de ácido

acético.

31

4.2. AVALIAÇÃO DA ADAPTAÇÃO DA LEVEDURA AO

HIDROLISADO

A avaliação de diferentes níveis de adaptação (N1, N2, N3 e N4) dos

inóculos de C. guilliermondii ao hidrolisado hemicelulósico de bagaço sobre a

conversão de xilose em xilitol foi realizada a partir de experimentos conduzidos

nos meios de fermentação constituídos dos hidrolisados concentrados (2HC,

3HC e 4HC), cujas concentrações iniciais de xilose e de ácido acético foram

38,32 e 4,30 g/L; 59,85 e 4,97 g/L e 72,35 e 5,77 g/L, respectivamente (Tabela

2).

Com relação ao consumo de xilose observa-se na Figura 5A que a

adaptação do inóculo afetou o consumo desta pentose nas primeiras 34 h,

quando as fermentações foram conduzidas em meio constituído do hidrolisado

2HC, observando-se maior consumo deste açúcar (87,70%) para o inóculo de

nível de adaptação N3, seguido dos níveis N4 (82,15%), N2 (75,22%) e N1

(69,44%). No entanto, no tempo correspondente a 58 h de fermentação, o

consumo de xilose foi de aproximadamente 100% para todos os níveis de

adaptação avaliados.

Com o aumento da concentração do hidrolisado para 3HC, nota-se na

Figura SB, que o consumo de xilose foi favorecido pelo inóculo de maior nível

de adaptação (N4) nas primeiras 34 h, o que resultou no consumo de 70, 13% da

xilose, seguido dos níveis N3 (58,86%), N1 (48,50%) e N2 (47,60%). Após 58 h

de fermentação, o consumo de xilose foi aproximadamente 100% para o maior

nível de adaptação estudado, sendo que, para os demais níveis, este açúcar foi

totalmente consumido após 72 h de fermentação.

Observa-se na Figura 5C, onde as fermentações foram conduzidas no

meio constituído pelo hidrolisado de maior concentração de xilose e de ácido

acético ( 4HC), maior velocidade no consumo de xilose após 24 h de fermentação

para o inóculo de nível de adaptação N3, observando-se um consumo de 93%

deste açúcar após 58 h de fermentação, enquanto que, para os demais níveis de

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adaptação, este consumo foi em tomo de 7 5%. Após 72 h, a utilização do

inóculo de nível de adaptação N3 resultou no consumo quase total de xilose

(97 ,22% ), enquanto para os demais níveis de adaptação o consumo foi de cerca

de 90%.

Verifica-se ainda na Figura 5 (A, B e C) que nas fermentações conduzidas

com meio constituído do hidrolisado de menor concentração (2HC), o consumo

total de xilose ocorreu em menor tempo, independente do nível de adaptação do

inóculo, enquanto que o aumento da concentração do hidrolisado resultou na

necessidade de maior nível de adaptação do inóculo. Este comportamento pode

ser explicado não apenas pelo menor teor de xilose no hidrolisado menos

concentrado (2HC), mas principalmente pela menor quantidade de ácido acético

(Tabela 2), não necessitando assim de inóculo adaptado em maior nível. Segundo

FELIPE et al., l 995a, em fermentações conduzidas em meio semi-sintético cujas

concentrações e proporções dos açúcares xilose e glicose foram próximas às do

hidrolisado 3HC, na presença de 1,0 g/L de ácido acético, a levedura

C. guilliermondii consumiu 94% de xilose, decrescendo para 77% quando a

concentração deste ácido foi elevada para 6,5 g/L.

O favorecimento do consumo de xilose pela adaptação do inóculo no

hidrolisado foi também verificado em experimentos conduzidos com a levedura

Candida sp B 22, adaptada ao hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar (CHEN, GONG, 1985). Segundo estes autores a adaptação da levedura

aumentou a tolerância das células ao hidrolisado. Tal comportamento foi também

verificado para a levedura C. guilliermondii durante a fermentação de

hidrolisado hemicelulósico de bagaço 3HC onde o inóculo foi previamente

cultivado por 24 h no próprio meio de fermentação (FELIPE, 1994 ).

Quanto à glicose, verificou-se um rápido consumo deste açúcar

independente do nível de adaptação do inóculo e da concentração inicial de

glicose no meio, uma vez que não foi detectada a presença deste açúcar no meio

após 24 h (Tabela 3). O rápido consumo de glicose foi também constatado na

fermentação dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar e de

34

eucalipto por esta levedura (FELIPE et al., l 993a, 1996) como também por

P. stipitis (BICHO et al., 1988) e P. tannophilus (du PREEZ et ai., 1986).

Tabela 3- Concentração de glicose durante fermentação dos meios constituídos dos hidrolisados 2HC, 3HC e 4HC por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo.

Hidrolisado Níveis

de Glicose (g/L)

Tempo(h)

3HC

Adaptação o 24 N1 3,04 o N2 3,36 o N3 2,85 o N4 2,93 o N1 5,18 o N2 3,17 o N3 4,85 o N4 6,31 o N1 7,94 o N2 5,99 o N, 6,26 o ·' N4 8,28 o

2HC

4HC

Quanto à arabinose, açúcar presente em baixa concentração no

hidrolisado (Tabela 2), verificou-se que este foi lentamente consumido

juntamente com a xilose ao longo da fermentação, independente do nível de

adaptação do inóculo e da concentração de xilose no hidrolisado, restando ainda

no final da fermentação cerca de 50% deste açúcar (Tabela 4). FELIPE, 1994,

também encontrou um decréscimo na concentração de arabinose durante

fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por

C. guilliermondii, O consumo de arabinose por esta levedura foi também

verificado em trabalhos conduzidos por MEYRIAL et ai., 1991, que atribuíram o

decréscimo da concentração deste açúcar à possível conversão em arabitol. Estes

autores também verificaram que o consumo de arabinose foi favorecido com o

esgotamento da xilose do meio, semelhante ao encontrado na fermentação de

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto a etanol por P. stipits (FERRARI et ai.,

1992) e de palha de arroz por C. guilliermondii (ROBERTO et ai., 1994).

35

Tabela 4- Variação da concentração de arabinose por C. guilliermondii na fermentação dos meios constituídos dos hidrolisados hernicelu1ósicos de bagaço de cana- de-açúcar 2HC, 3HC e 4HC em função de diferentes rúveis de adaptação do inóculo.

Nível Arabinose (g/L) Hidrolisado de Tempo (h)

Adaptação o 24 34 48 58 72 N1 2,76 3,36 3,34 2,02 1,81 0,0

2HC N2 3,25 2,80 2,51 2,40 1,48 0,0 N3 3,33 2,52 2,92 3,25 1,67 0,0 N4 3,30 3,26 3,20 2,75 2,00 0,0 N1 5,08 4,78 3,48 4,34 3,23 2,41

3HC N2 4,49 4,71 3,34 4,34 4,16 3,34 N3 3,65 4,64 4,55 4,09 4,18 2,50 N4 5,60 5,01 4,88 5,05 3,12 2,78 N1 7,85 4,55 6,59 4,17 3,59 3,49

4HC N2 6,27 3,16 5,24 4,45 4,85 5,43 N3 6,21 4,92 4,77 4,51 4,38 2,84 N4 7,38 6,69 6,69 6,23 6,22 5,04

Os resultados relativos à produção de :xilitol por C. guilliermondii em

função do nível de adaptação do inóculo e da concentração do hidrolisado

encontram-se demonstrados na Figura 6 (A, B e C). Observa-se que nas

fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado 2HC com os

inóculos mais adaptados (N3 e N4) obteve-se as maiores concentrações de :xilitol

nas primeiras 48 h de fermentação, sendo estes valores de 19,24 g/L e 19,73 g/L,

respectivamente. Observa-se, também, para todos os níveis de adaptação

estudados, que o aumento na produção de xilitol se deu nas primeiras 48 h,

permanecendo praticamente constante a partir deste tempo, exceto para a

condição de inóculo de nível de adaptação N3• onde se observou um ligeiro

decréscimo na concentração de xilitol, coincidindo com o esgotamento da xilose

do meio (Figura 5A). Este decréscimo na concentração de xilitol pode ser devido

a sua utilização como fonte de carbono pela levedura conforme já constatado em

trabalhos conduzidos por FELIPE, 1994 e por SCHNEIDER et ai., 1985 e

NEIRINK et ai., 1985 com P. tannophi/us. O consumo de :xilitol foi também

constatado durante o cultivo do fungo Aureobasidium pullulans e a assimilação

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deste açúcar foi associada à sua conversão em xilulose devido à presença de um

sistema redox balanceado (KOSSACZKÁ et al., 1991 ).

Os resultados relativos ao estudo do efeito da adaptação do inóculo na

produção de xilitol no meio constituído do hidrolisado 3HC (Figura 6B) revelam

que nas primeiras 34 h de fermentação a concentração de xilitol no meio foi

maior para os níveis N4 (23,78 g/L) e N3 (18,02 g/L), porém após 58 h, as

concentrações de xilitol encontradas foram próximas ( -28,0 g/L) para os níveis

de adaptação N2, N3 e N4, permanecendo estas praticamente constantes até o

período final de 72 h. Além disso, a concentração de xilitol verificada para o

nível N1 após 72 h (27,61 g/L) também foi semelhante às verificadas para os

demais níveis de adaptação.

Verifica-se também que nas fermentações conduzidas com o hidrolisado

mais concentrado (4HC), a produção de xilitol foi favorecida pela adaptação do

inóculo (Figura 6C). A utilização de inóculos adaptados nos níveis de adaptação

N3 e N4 resultou nas maiores concentrações de xilitol após 58 h, o que

correspondeu a 33,81 e 34, 73 g/L respectivamente, com pouca alteração a partir

deste período. Porém, no final do processo, a concentração de xilitol no meio foi

próxima para todos os níveis de adaptação estudados, semelhante ao encontrado

nos hidrolisados de menor concentração. Observa-se também um ligeiro

decréscimo na concentração de xilitol após 58 h para o nível N3, coincidindo

com o período em que a xilose residual no meio era inferior a 5,0 g/L (Figura

5C), semelhante ao observado na fermentação de hidrolisado menos concentrado

(Figura 6A), o que sugere a utilização do xilitol como fonte de carbono pela

levedura.

Os resultados referentes ao consumo de xilose e produção de xilitol

revelam a necessidade de adaptação do inóculo para as fermentações conduzidas

com hidrolisados de maior concentração. Esta necessidade pode estar

relacionada à adaptação das células frente aos compostos tóxicos presentes no

hidrolisado, uma vez que as maiores diferenças observadas quanto ao consumo

de xilose e produção de xilitol ocorreram no início da fermentação, ou seja, nas

primeiras 34 h. Esta proposição é suportada pelo fato de que o ácido acético,

38

composto tóxico ao metabolismo microbiano (van ZYL et ai., 1988; FERRARI

et al., 1992; FELIPE et ai., l 995a), foi lentamente consumido, juntamente com

os açúcares, no decorrer da fermentação, independente da condição de adaptação

do inóculo empregada e da concentração do hidrolisado (Tabela 5), observando-

se um ligeiro aumento do pH (Tabela 6). Verifica-se na Tabela 5, que o maior

consumo de ácido acético foi observado para o nível de adaptação N3 para os

meios preparados com os hidrolisados 2HC e 4HC, correspondendo à maior

elevação do pH (Tabela 6). A assimilação de ácido acético por C. guilliermondii

foi também constatada em meio semi-sintético (FELIPE et al., 1995a),

semelhante ao verificado para outros microrganismos como P. stipitis (van ZYL

et ai., 1991 ), C. blankii e C. utilis (MEYER et ai., 1992 a e b) Peacilomyces

variotii (ALMEIDA et ai, 1995). Ressalta-se que nas fermentações dos meios

compostos pelos hidrolisados 2HC e 4HC por inóculo de nível de adaptação N3,

além de maior assimilação de ácido acético foi também constatado um

decréscimo na concentração de xilitol após 58 h.

Tabela 5- Variação da concentração de ácido acético durante as fermentações dos meios constituídos dos hidrolisados 2HC, 3HC e 4HC por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo.

Níveis Acido acético (g/L 2 Variação Hidrolisado de Tempo (h) (%)

Adaetação o 58 N1 4,51 1, 17 74,00

2HC N2 4,05 1,01 77,77 N3 4,18 0,08 98,09 N4 4,41 0,82 77,10

o 72 N1 5,30 1,28 75,85

3HC N2 4,90 1,35 72,45 N3 4,55 0,57 86,84 N4 4,67 0,43 90,79

o 72 N1 4,17 1,77 57,55

4HC N2 5,54 1,65 68,51 N3 5,21 0,19 96,35 N4 4,70 1,75 62,77

39

Tabela 6- Variação do pH na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 2HC. 3HC e 4HC por C. guilliermondií em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo.

Nível H Hidro lisado de Tempo {h}

AdaEtaçâo o 24 34 48 58 72 N1 5,11 5,59 6,00 6,54 6,49

2HC N2 5,17 5,69 6,02 6,34 6,68 N3 5,28 5,72 6,21 6,67 7,58 N4 5,25 5,73 6,12 6,71 7,04 N1 5,08 5,42 5,67 6,30 6,39 6,44

3HC N2 5,14 5,50 5,79 6,27 6,40 6,44 N3 5,21 5,43 6,01 6,44 6,48 7,32 N4 5,18 5,64 6,18 6,39 6,58 7,29 N1 5,05 5,39 5,58 6,22 6,25 6,45

4HC N2 5,17 5,54 5,64 6,09 6,34 6,42 N3 5,26 5,39 5,97 6,30 6,44 7,08 N4 5,18 5,46 5,68 6,15 6,32 6,58

Os resultados relativos aos parâmetros cinéticos observados no presente

trabalho encontram-se apresentados nas Tabelas 7, 8 e 9.

Tabela 7- Fator de rendimento (Y p/s) da conversão de xilose em xilitol por C guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo e diferentes concentrações de hidrolisado.

Nível YE/S ~g/g} Hidrolisado de TemEo (h}

Adaetação 24 34 48 58 72 N1 0,49 0,54 0,50 0,51

2HC N2 0,46 0,50 0,52 0,52 N3 0,49 0,55 0,55 0,52 N4 0,63 0,64 0,60 0,57 N1 0,51 0,45 0,59 0,55 0,57

3HC N2 0,62 0,51 0,57 0,62 0,59 N3 0,60 0,62 0,62 0,62 0,59 N4 0,69 0,72 0,69 0,59 0,60 N1 0,31 0,47 0,46 0,50 0,62

4HC N2 0,23 0,44 0,56 0,57 0,58 N3 0,48 0,54 0,60 0,62 0,58 N4 0,64 0,68 0,65 0,73 0,62

40

Com relação ao rendimento em xilitol (Tabela 7), para o meio constituído

do hidrolisado 2HC, observa-se que os maiores valores foram encontrados para o

nível de adaptação N4, sendo o rendimento máximo (0,64 g/g), obtido após 34 h

de fermentação, correspondendo a uma eficiência de 70,27% de conversão de

xilose em xilitol (Tabela 8). Quando as fermentações foram conduzidas no meio

preparado com o hidrolisado 3HC, o maior rendimento em xilitol encontrado foi

de 0,72 g/g para o nível de adaptação N4 após 34 h, o que representa uma

eficiência de conversão de 77 ,99% (Tabela 8). Quando empregou-se o meio

composto pelo hidrolisado mais concentrado (4HC), onde o teor de ácido acético

era de 5,77 g/L, o maior valor de rendimento encontrado foi também para N4

(0,73 glg) após 58 h de fermentação, correspondendo a uma eficiência na

conversão de xilose em xilitol de 79,47% (Tabela 8).

De um modo geral, verifica-se um efeito positivo da adaptação sobre o

rendimento, independente da concentração do hidrolisado empregada.

Tabela 8- Eficiência (11) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo e diferentes concentrações de hidrolisado.

Nível 11 (% Hidro lisado de Tempo (h)

Adaptas:ão 24 34 48 58 72 N1 53,50 58,33 55,03 55,14

2HC N2 49,47 54,71 56,38 56,13 N3 53,82 60,02 60,33 56,14 N4 68,98 70,27 65,81 62,11 N1 55,90 49,19 64,29 60,02 62,02

3HC N2 55,71 55,09 62,42 67,06 64,68 N3 65,88 67,90 67,76 67,62 64,69 N4 75,27 77,99 74,95 64,44 65,42 N1 33,24 51,40 50,21 54,77 67,69

4HC N2 25,08 47,39 60,91 62,30 63,25 N3 52,73 59,06 65,84 67,04 63,08 N4 69,72 74,44 70,75 79,47 67,54

A adaptação do inóculo também exerceu grande influência sobre a

produtividade (Tabela 9), uma vez que para todas as concentrações de

hidrolisado empregadas, observa-se, na maioria dos tempos de amostragem, que

41

os valores deste parâmetro foram mais elevados quando se empregou inóculo de

maior nível de adaptação. Nota-se que a maior produtividade encontrada

corresponde ao nível de adaptação N4 para o meio constituído do hidrolisado

3HC, equivalendo a O, 72 g!L.h após 34 h de fermentação, seguido de O, 70 g!L.h

também para N4, porém, em meio composto do hidrolisado 4HC, após 58 h.

Tabela 9- Produtividade em xilitol (Qp) em fermentações por C. guilliermondii em função de diferentes níveis de adaptação do inóculo e diferentes concentrações de hidrolisado.

3HC

Nível Qp (g/L.h) de Tempo (h)

Adaptação 24 34 48 58 N1 0,34 0,38 0,36 0,30 N2 0,36 0,40 0,37 0,32 N3 0,48 0,51 0,40 0,31 N4 0,53 0,54 0,41 0,34 N1 0,31 0,31 0,44 0,43 N2 0,33 0,35 0,45 0,50 N3 0,42 0,53 0,58 0,50 N4 0,53 0,70 0,55 0,48 N1 0,19 0,29 0,37 0,40 N2 0,19 0,30 0,46 0,48 N3 0,40 0,53 0,58 0,58 N4 0,44 0,51 0,53 0,60

Hidro lisado 72

2HC

0,38 0,40 0,40 0,40

4HC 0,48 0,48 0,46 0,51

Os dados apresentados nas Tabelas 7, 8 e 9 evidenciam o favorecimento

da conversão de xilose em xilitol pela adaptação do inóculo. Verifica-se ainda

que os menores valores dos parâmetros fermentativos foram encontrados quando

utilizou-se inóculos menos adaptados (N 1 e N2) nas fermentações conduzidas no

meio constituído do hidrolisado mais concentrado ( 4HC). Tal fato foi observado

principalmente nas primeiras 48 h de fermentação, possivelmente em função de

elevada concentração de ácido acético no início da fermentação. Assim, a

utilização de inóculos de níveis de adaptação mais baixos resultaria em células

menos adaptadas para as concentrações elevadas de ácido acético ou outros

compostos inibidores não detectados pelo método cromatográfico empregado,

tais como compostos fenólicos como a vanilina e o seringaldeído, os quais foram

considerados como potentes inibidores do crescimento de P. tannophilus (LEE,

42

McCASKEY, 1983). No entanto, com o aumento do número de células no

decorrer da fermentação, estas poderiam atuar na detoxificação do hidrolisado já

que o ácido acético estaria sendo consumido, e em consequência, a bioconversão

de xilose em xilitol seria favorecida. Também não pode ser excluída a hipótese

das células já estarem adaptadas aos componentes tóxicos do meio após o

período de 48 h, uma vez que o consumo de xilose e a produção de xilitol, no

final das fermentações, não apresentaram diferenças marcantes em função do

nível de adaptação do inóculo.

Alguns autores tem relatado a atuação de leveduras na detoxificação de

meios compostos por hidrolisados de materiais lignocelulósicos (CHUNG, LEE,

1985; TRAN, CHAMBERS, 1986; WEIGERT et al., 1988), bem como de meio

semi-sintético (FELIPE et ai., 1995a). Segundo estes autores, a detoxificação

ocorre em função do decréscimo, durante a fermentação, da concentração de

compostos tóxicos como o furfural, o hidroximetilfurfural e ácido acético, que

muitas vezes são assimilados pela levedura. Segundo MORIMOTO et ai., 1968;

WEIGERT et ai., 1988, a redução na concentração de furfural no meio durante o

processo fermentativo foi atribuída à sua conversão em álcool furfurílico,

enquanto que para SANCHEZ, BAUTIST A, 1988, a degradação do furfural

resultou na formação de ácido furóico. FELIPE et ai., l 995a, atribuíram o

decréscimo da concentração de ácido acético ao fato deste ter sido assimilado

por C. guilliermondií via acetil-CoA no ciclo de Krebs.

Neste trabalho, portanto, é importante ressaltar que a adaptação do

inóculo tomou possível o emprego do hidrolisado mais concentrado (4HC), uma

vez que os valores dos parâmetros fermentativos foram maiores do que os

obtidos com hidrolisado de concentração semelhante, porém, com inóculo de C.

guilliermondii não adaptado (FELIPE, 1994 ). Os valores de rendimento (O, 73

g/g) e produtividade (0,60 g!L.h) verificados para o nível de adaptação N4 no

presente trabalho foram também superiores aos encontrados por FELIPE et ai.,

1995, em trabalhos conduzidos em meio semi-sintético com composição

semelhante de ácido acético (Yp/s = 0,66 g/g; Qp = 0,38 g!L.h), o que mostra

uma melhoria de 58% na produtividade em xilitol.

43

Os resultados referentes ao crescimento celular em função do nível de

adaptação do inóculo e da concentração do hidrolisado empregado no preparo do

meio de fermentação encontram-se apresentados na Tabela 1 O. Embora maior

concentração celular tenha sido verificada quando as fermentações foram

conduzidas em meio constituído pelo hidrolisado de menor concentração (2HC),.

este comportamento foi observado para todos os níveis de adaptação do inóculo

nesta concentração de hidrolisado. Possivelmente, o maior crescimento obtido no

meio composto pelo hidrolisado de menor concentração seria devido a que neste

hidrolisado a concentração de compostos inibidores é inferior à dos demais

hidrolisados empregados, principalmente quanto ao ácido acético (Tabela 2).

Segundo HERRERO et ai., 1985, durante a avaliação da inibição do crescimento

de Clostridium thermocellum por ácidos carboxílicos, foi verificado um baixo

crescimento celular na presença de ácido acético, o que, segundo estes autores, é

devido a um aumento no consumo de A TP via ATPase destinado à manutenção

do gradiente de prótons. A inibição do crescimento de C. guilliermondii pelo

ácido acético foi verificada por FELIPE et al., l 995a, em meio semi-sintético

contendo concentrações crescentes deste ácido.

O furfural seria outro composto que poderia exercer influência no

crescimento da levedura. Porém, a concentração de furfural nos hidrolisados foi

inferior à considerada inibitória para a atividade fermentativa de

C. guilliermondii (Tabela 2). Segundo SANCHEZ, BAUTIST A, 1988, a inibição

do crescimento de C. guilliermondii, pelo furfural, foi atribuída à presença deste

aldeído no meio em concentrações superiores a 1 g/L. Na fermentação alcoólica

por S. cerevisiae, o furfural, na concentração de 3,0 g/L, foi responsável pela

inibição da multiplicação da levedura, resultando numa extensa fase lag de

crescimento celular (AZHAR et al., 1981 ).

Quanto às características morfológicas das células, observou-se que para

todos os níveis de adaptação e concentração do hidrolisado estudado, as células

apresentaram as mesmas alterações ( células alongadas, formação de pseudo-

micélio ), apresentando no final das fermentações viabilidade celular próxima de

100%.

44

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Cd V}

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45

4.3. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE INÓCULO

ADAPTADO

A avaliação da concentração inicial do inóculo adaptado de

C. guilliermondii foi efetuada a partir de ensaios conduzidos no meio constituído

do hidrolisado 3HC, empregando-se inóculo adaptado no nível N3 nas

concentrações iniciais de células de 0,1 g/L (2,5x106 céls/mL), 1,0 g/L (6,7xl07

céls/mL) e 6,0 g/L (1,8x108 céls/mL).

De acordo com os resultados da Figura 7, nota-se que a concentração inicial

do inóculo influenciou no consumo de xilose. Verifica-se que para o maior nível de

inóculo avaliado (6,0 g/L) o consumo de xilose foi 88,24% após 34 h, enquanto

para os demais níveis foram consumidos 65, 78% e 58,86% de xilose para as

concentrações de inóculo de O, 1 g/L e 1,0 g/L respectivamente. Após 48 h, restavam

cerca de 10% deste açúcar para todas as concentrações iniciais de inóculo

avaliadas. Quanto a glicose, verificou-se que este açúcar foi rapidamente

consumido independente da concentração inicial de células, não tendo sido

detectado no meio após 24 h (Tabela 11 ).

' l'

i~

1

Tabela 11- Concentração de glicose durante fermentação de meio hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3.

constituído do de diferentes

Concentração Glicose (g/L) do Tempo(h)

inóculo (g/L) O 24 0,1 1,0 6,0

4,40 4,85 5,47

o o o

O emprego de alto nível de inóculo tem sido utilizado principalmente nas

fermentações de hidrolisado de materiais lignocelulósicos como forma de

minimizar o efeito inibitório dos compostos tóxicos sobre a atividade fermentativa.

Segundo CHUNG, LEE, 1985, a utilização de elevado nível de inóculo pode

beneficiar as fermentações destes hidrolisados, favorecendo o consumo de xilose

46

pela ação das células na detoxificação do meio. FELIPE et ai., 1996, constataram a

eliminação de uma extensa fase lag para o consumo de glicose e xilose durante a

fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guilliermondii em

decorrência do aumento da concentração inicial do inóculo de 1,0 para 3,0 g/L, A

detoxificação do hidrolisado pelas células de C. guilliermondii foi sugerida por

FELIPE et al., l 995a em função da assimilação do ácido acético presente no meio,

o que também foi observado no presente trabalho (Tabela 12). O decréscimo na

concentração de ácido acético foi relatado também em trabalhos realizados por van

ZYL et al., 1991; MEYER et ai., 1992 a, b, FERRARI et ai., 1992, FELIPE et

ai., 1995 a, ALMEIDA et ai., 1995.

O consumo do ácido acético foi acompanhado por ligeiro aumento do pH

durante as fermentações, independente da concentração de inóculo empregado

(Tabela 13). Segundo FELIPE, 1994, na fermentação do hidrolisado de bagaço por

C. guilliermondii foi verificado o decréscimo da concentração de ácido acético e

elevação do pH com a utilização de inóculo entre O, 1 a 3,0 g/L, enquanto que para

o nível de inóculo de 6,0 g/L, foi observado aumento da concentração deste ácido e

decréscimo do pH.

Tabela 12- Variação da concentração de ácido acenco na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 .

Concentração Acido acético {g/L) Variação do Tempo {h) (%)

inóculo (g/L) o 72 0,1 4,39 0,71 83,83 1,0 4,33 0,57 86,84 6,0 4,61 0,98 78,74

Tabela 13- Variação do pH na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3.

Concentração H do Tempo {h)

inóculo (g/L) o 24 34 48 58 72 0,1 5,40 5,85 6,45 6,75 7,13 7,48 1,0 5,21 5,43 6,01 6,44 6,48 7,32 6,0 5,40 5,95 6,36 6,68 7,38 7,48

47

Tabela 14- Variação da concentração de arabinose na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3 .

Concentração Arabinose (g/L) do Tempo (h)

inóculo (g/L) o 24 34 48 58 72 0,1 4,19 4,14 4,26 4,04 3,56 2,64 1,0 4,14 4,64 4,55 4,09 4,18 2,50 6,0 4,34 4,28 4,09 3,42 2,04 1,79

Quanto ao consumo de arabinose (Tabela 14 ), verificou-se que este açúcar

foi lentamente consumido juntamente com os demais no decorrer da fermentação,

independente da concentração do inóculo empregada, semelhante ao observado nos

experimentos relativos à avaliação da adaptação do inóculo. Nota-se ainda que o

consumo de arabinose foi favorecido com a utilização de inóculo mais alto

correspondendo ao consumo de 58, 76%. A assimilação de arabinose por

C. guil/iermondii foi também verificada em trabalhos conduzidos por FELIPE,

1994, bem como para outras espécies de leveduras (MEYRJ.AL, et ai., 1991;

FERRARJ et ai., 1992).

Os resultados referentes à produção de xilitol em função da concentração

inicial do inóculo, estão apresentados na Figura 8. Nota-se que esta foi favorecida

pelo aumento da concentração inicial do inóculo, encontrando-se após 34 h maior

concentração de xilitol (24,32 g/L) com o emprego de maior nível de inóculo (6,0

g/L). Nestas condições foi também verificada maior velocidade de consumo de

xilose (Figura 7). Porém, após 48 h, período que correspondeu ao esgotamento da

xilose, a concentração de xilitol foi semelhante para todos os níveis de inóculo

avaliados, permanecendo praticamente constante após este período. Segundo CAO

et al., 1994, a produção de xilitol em meio sintético aumentou com a elevação da

concentração inicial de inóculo de Candida sp B-22 de 3,8 glL para 26 g/L,

condição em que se obteve 21 O glL de xilitol a partir de 260 g/L de xilose após 96 h

de cultivo. No entanto, na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

48

• •

o 10 20 30 40 60 70 50

Tempo(h)

Figura 7- Variação da concentração de xilose durante fermentação do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações inicias de inóculo: 0,1 g/L (--); 1,0 g/L (-tt-); 6,0 g/L (-•-).

25

....... ~ -::9 20

Q = ·::; ~

15 -e Q ·= Cjo = .. ... = ~ lO ... = Q u

I'/

/ .. f

• •

Tempo(h)

Figura 8- Produção de xilitol durante fermentação do hidrolisado 3HC por C. guilliermondii em função de diferentes concentrações inicias de inóculo: O, 1 g/L <--); 1,0 g/L (-tt-); 6,0 g/L (-•-).

49

cana-de-açúcar por C. guilliermondii, a quantidade de xilitol obtida para o nível de

inóculo de 6,0 g/L foi duas vezes menor que a obtida com inóculo de O, 1 g/L

(FELIPE, 1994). Os diferentes resultados encontrados quanto à influência da

concentração inicial de inóculo na produção de xilitol, podem ser atribuídos às

diferentes composições dos meios empregados e a outros fatores, como

disponibilidade de oxigênio no meio. O efeito da concentração inicial do inóculo

sobre a bioconversão de xilose em xilitol pode não estar relacionado à concentração

celular por si só, mas também, ao fato de que a utilização de maior concentração

inicial de células no meio acarretaria em menor disponibilidade de oxigênio em

relação à fermentação conduzida com concentração inicial de inóculo mais baixa.

Embora a utilização de alto nível de inóculo possa contribuir para uma

detoxificação mais rápida do meio em função da assimilação de compostos tóxicos

(CHUNG, LEE, 1985; TRAN, CHAMBERS, 1986; WEIGERT et ai., 1988 e

FELIPE et ai., l 995a), isto resultaria em aumento da concentração celular,

reduzindo assim a disponibilidade de oxigênio. Este parâmentro é considerado de

extrema importância na bioconversão de xilose a xilitol (DELGENES et al., 1989;

SILVA et al., 1990b; FURLAN et al., 1991; LAPLACE et al., 1991; NOLLEAU et

al., 1993).

Os parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol em função

da densidade do inóculo estão listados na Tabela 15. Quanto ao rendimento em

xilitol, verifica-se que a concentração inicial do inóculo exerceu pouca influência

sobre os valores deste parâmetro, tendo sido o maior valor (0,67 g/g) obtido após

34 h com o inóculo de O, 1 g/L, o que representa uma eficiência de conversão de

xilose em xilitol de 73%. CAO et al., 1994, encontraram que o aumento da

densidade do inóculo de Candida sp B-22 de 3,8 g/L para 26,0 g/L reduziu

significantemente o tempo de fermentação, resultando em um aumento de 80% na

eficiência de conversão de xilose em xilitol. Para C. boidini foi constatado que o

rendimento em xilitol dobrou, passando de 0,12 g/g para 0,24 g/g com a elevação

da densidade celular de 1,3 g/L para 5, 1 g/L (V ANDESKA et ai., 1993). Segundo

CHUNG, LEE, 1985, a utilização de uma elevada concentração inicial de células

de 11 x 108 cels/mL foi uma forma de assegurar a fermentação alcoólica de

- ---

50

hidrolisado celulósico de madeira, não se observando morte celular significante

decorrente da presença de compostos inibidores no hidrolisado conforme verificado

quando se utilizou concentração inicial de inóculo mais baixo ( 1, 7 a 2,5 x 106

cels/mL).

No presente trabalho, a produtividade foi influenciada pela concentração

inicial do inóculo apenas no início da fermentação (Tabela 15), sendo o máximo

valor (O, 75 g/L.h) encontrado para o maior nível de inóculo (6,0 g/L) após 24 h de

fermentação. Segundo FELIPE, 1994, um aumento na produtividade em xilitol foi

verificado quando a concentração do inóculo de C. guilliermondii foi aumentada de

O, 1 g/L para 3,0 g/L, porém este aumento acarretou na redução em 10% na

eficiência de conversão de xilose em xilitol.

Os diferentes resultados encontrados nos trabalhos citados possivelmente

devem-se às diferenças na composição do meio e nas condições de fermentação, às

diferentes espécies de leveduras empregadas, e, principalmente, ao fato das células

estarem ou não adaptadas.

Tabela 15- Parâmetros fermentativos da conversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii na fermentação do meio constituído do hidrolisado 3HC em função de diferentes concentrações iniciais de inóculo de nível de adaptação N3_

Parâmetros Concentação Temeo (h2 fermentativos do inóculo {g/L 2 24 34 48 58 72

0,1 0,56 0,67 0,65 0,61 0,62 Yp/s 1,0 0,60 0,62 0,62 0,62 0,59 (glg) 6,0 0,63 0,62 0,64 0,60 0,62

o, 1 60,63 73,00 70,81 66,63 67,59 Tl 1,0 65,88 67,90 67,76 67,62 64,69

(%) 6,0 68,72 68,07 69,33 64,93 67,83 0,1 0,39 0,59 0,58 0,47 0,39

Qp 1,0 0,42 0,53 0,58 0,50 0,40 (g!L.h2 6,0 0,75 0,72 0,57 0,45 0,38

Quanto à influência da concentração inicial do inóculo adaptado sobre o

crescimento celular de C. guilliermondii (Tabela 16), verifica-se que a

concentração celular máxima foi da ordem de l,lxl09 cels/mL, quando empregou-

se a concentração inicial de inóculo de 6,lxl07 cels/mL (1,0 g/L).

51

A viabilidade celular foi verificada, tendo sido mantida próxima a 100%

para todas as condições de inóculo avaliadas. As alterações morfológicas

observadas ( células alongadas, formação de pseudo-micélio) foram semelhantes em

todos os casos.

Tabela 16- Produção de células de C. guilliermondii na fermentação do hidrolisado 3HC em função de diferentes concentrações iniciais do inóculo de nível de adaptação N3.

Concentração Concentração celular (n" céls/rnL} do Tempo (h}

inóculo {g/L} o 24 34 48 58 72 0,1 2,5x106 1, 7xl 08 2,0xl 08 3,6x108 4,4x108 6,6xl08 1,0 6,lxl07 2,7xl07 4,4xl08 6,0xl08 2,5x108 1,lxl09

6,0 1,8x108 1,8xl08 2,5xl08 3,7x108 4,5xl08 5,0xl08

4.4. AVALIAÇÃO DA RECICLAGEM DA LEVEDURA NO

HIDROLISADO

O efeito da reciclagem das células de C. guilliermondii na bioconversão de

xilose em xilitol foi avaliado no meio de fermentação constituído do hidrolisado

3HC, empregando-se como inóculo inicial, células de nível de adaptação N3 para o

primeiro ciclo e células recuperadas da fermentação anterior para os demais. Para

todas os ciclos a concentração inicial de inóculo foi O, 1 g/L de células.

Os resultados relativos ao consumo de xilose estão representados na Figura

9. Nota-se no 2º ciclo, uma menor assimilação (19,64%) nas primeiras 24 h, a qual

foi aumentada para 35,46% no 5º ciclo, enquanto nos demais (1º, 3º e 4º ciclos), o

consumo de xilose esteve em tomo de 26%. Este comportamento em relação ao

consumo de xilose foi mantido até o final da fermentação (48 h), encontrando-se no

5º ciclo um consumo de 93,08%. O consumo de xilose foi favorecido pela

reciclagem das células, encontrando-se entre o primeiro ciclo e o último, um

aumento de 10% no consumo desta pentose.

52

~ ... .s ·~ ~ 30 ~ ... .§ 'Si, -8 a 20 •• .... f = 8 e a 10

0+---.r-----r~--.-~~--.~-r-~-.----,~--.-~~ o 10 20 30 40 50

Tempo(h)

Figura 9- Variação da concentração de xilose durante fermentações do hidrolisado 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii: 12 ciclo(-+--); 22 ciclo(--); 32 ciclo (-•-); 42 ciclo t-v-), 52 cíclo r-e-).

30

• I / '/I

25 10í• . w· ~ /~1/ ~ 20

~/ Q ~/ = / ·~ J / ~ 15 'C //lí Q .. .... • ;Í/• / a. .. /j,i / e ~ 10

"' ~~· e Q e

o o 10 20 30 40 50

Tempo(h)

Figura 10- Produção de xilitol durante fermentações do hidrolisado 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii: 12 ciclo (-+--); 2º ciclo <-->; 32 ciclo (-•-); 42 ciclo r-e-): 52 ciclo r-e-).

53

PAREKH et al.. 1986. verificaram que o emprego de células recicladas de

C. shehatae e P. stipitis favoreceu a assimilação de xilose e a produção de etanol

não somente em fermentações em meio sintético (70:30 glicose-xilose) como

também em meio constituído de hidrolisado de madeira, quando comparadas às

fermentações conduzidas com culturas não adaptadas. Estes autores atribuíram este

comportamento ao fato da reciclagem permitir a seleção de uma linhagem melhor

adaptada. O favorecimento do consumo de xilose pela adaptação do inóculo

também foi constatada por outros autores (CHEN. GONG, 1985; FELIPE, 1994).

Quanto à glicose, esta foi consumida rapidamente em todos os ciclos

realizados (Tabela 17). semelhante ao observado nos experimentos relativos à

adaptação do inóculo (ítem 4.2.) e como já anteriormente verificado por diversos

autores (du PREEZ et ai .. 1986; BICHO et al., 1988; FELIPE et al.. 1993 a:

FELIPE 1994 ).

Tabela 17- Concentração de glicose em fermentações conduzidas em meio constituído do hldrolizado hernicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii.

Glicose (g/L) Ciclos Tempo(h)

o 24 ]- 4,86 o 2º 4.71 o 3º 4.60 o 4º 4,70 o sº 5.01 o

1 '·.

r-

De acordo com a Tabela 18, verifica-se que a concentração de arabinose no

meio manteve-se praticamente constante para todos os ciclos. Isto. provavelmente,

deve-se às fermentações terem sido interrompidas com 48 h, ou seja, antes da xilose

ter sido totalmente consumida já que o consumo de arabinose foi constatado neste

trabalho durante a avaliação da adaptação e concentração do inóculo. A assimilação

da arabinose em decorrência do esgotamento da xilose do meio foi verificada em

vários trabalhos (MEYRIAL et ai., 1991; FERRARI et al., 1992; FELIPE, 1994;

ROBERTO et ai., 1994).

54

Quanto à produção de xilitol, verifica-se na Figura 1 O. que o emprego de

inóculo obtido de células recicladas. exerceu pequena influência na produção deste

polioL de modo semelhante ao verificado para o consumo de xilose. A maior

concentração de xilitol foi verificada no sº ciclo (28,27 g/L), no tempo

correspondente a 48 h.

Tabela 18- Variação da concentração de arabinose em fermentações conduzidas em meio constituído do hidrolizado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii.

Arabinose (g/L) Ciclos Tempo (h)

o 24 34 48 1 i! 4.45 4,21 4.34 4,44 "º 4.47 4,27 3.72 4,27 ,,[, 4,21 4.62 3.81 3.66 ..,- 4\: 3.64 4,54 4,44 3,97 5º 4.16 3,94 4,35 3,90

Quanto aos parâmetros fermentativos da conversão de xilose em xilitol,

cujos valores estão apresentados na Tabela 19. nota-se que, com exceção do 2º

ciclo. os valores de rendimento verificados para os demais ciclos apresentaram-se

próximos. sendo o máximo valor observado para o 3il ciclo (0.64 glg) após 48 h. o

que corresponde a 69,46% em eficiência de conversão. No entanto. esta técnica

permitiu a reutilização da levedura por um período de 240 h se decréscimo no valor

de rendimento. P AREKH et ai .. 1986, verificaram um aumento do rendimento de

etanol de 0,41 g/g para 0,4 7 g/g e de 0.39 g/g para 0,45 g/g com a reciclagem das

leveduras P. stipitis e C. shehatae em meio constituído de hidrolisado de madeira.

De modo diferente ao verificado para o rendimento, excluindo-se 2º ciclo, houve

um aumento na produtividade em xilitol de 15.38%, comparando-se o 1 º com o sº ciclo após 48 h.

Foi também constatado um decréscimo da concentração do ácido acético no

decorrer das fermentações, reduzindo sua concentração em cerca de 50% em todos

os ciclos efetuados (Tabela 20). O consumo de ácido acético foi anteriormente

observado, neste trabalho, durante a avaliação da adaptação e da determinação da

concentração do inóculo de C. guilliermondii, bem como em outras espécies de

55

leveduras como P. stipitis (van ZYL et al., 1991 ). C. blankii e C. utilis (MEYER et

ai .. 1992 a e b) e no fungo P. variotii (ALMEIDA et al., 1995). O decréscimo da

concentração deste ácido foi acompanhado por um aumento do pH (Tabela 21 ).

Tabela 19- Parâmetros fermentativos da conversão de xilose em xilitol em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii.

ri (%,1

Ciclos Tempo (h) 24 34 48

1º- 0.50 059 0.63 2º 0,33 0,42 0.58 3º 0.50 0.63 0,64 4º 0.55 0.61 0,62 5º 0.45 0,55 0.62 }- 54.08 63.77 68.00 2º 35.98 45,74 63,26 3º 54.79 68.99 69.46 40 60.10 66.35 67.55 5º 49.02 59.92 67.42 1- 0,25 0,36 0,52 2º 0,13 0.27 0.49 3º 0,23 0.40 0.54 4D 0.30 0.43 0.55 5!! 0.33 0.45 0.60

Parâmetros fermentativos

Yp s (g/g l

Qp (g/L.h)

Tabela 20- Variação da concentração de ácido acético em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com reciclo de células de C. guilliermondii.

Acido acético (g/L) Ciclo Tempo (h) Variação

o 48 % 11 4,35 2.07 52,41 ..,º 4,34 1,76 59,45 3º 4,39 2,42 44.87 4º 4,72 2,14 54,66 sº 4,52 2.02 55,31

56

Tabela 21- Variação do pH em fermentações conduzidas nomeio constituído do hidrolizado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células de C. guilliermondii.

Ciclo o

1- 5,30

"º 5,30 3º 5,37 4º 5.32 5º 5,28

H Tempo (h)

24 34 48 5,84 5,99 6.70 5.58 6.07 6,67 5.78 6.07 6.72 5,67 6,44 6.78 5.56 5.91 6,62

Quanto ao crescimento de C. guilliermondii, verificou-se que a população

final de células foi semelhante em todos os ciclos. não tendo sido afetada pela

reciclagem das células (Tabela 22 ).

Tabela 22- Variação da concentração celular de C. guilliermondii em fermentações conduzidas no meio constituído do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 3HC com reciclo de células.

Concentração celular (n" cels/ml.) Ciclo Tempo (h)

o 24 34 48 1-' 2.6x10 4.5xl0 2.lx!O 4.8x!O 2L 2.4xl06 3: 1 xl 08 2:4x108 3:8xl08 "\ f: 2.9xl 06 1:3xl08 2.5xl 08 3:0x108 .,- 4L 2.2x106 1.5x108 2.lx108

. 8 2,7xl O 5( 1.6xl 06 L4xl08 1 :sxl 08 2,9x108 -

A viabilidade celular foi verificada. tendo sido mantida próxima a 100%

para todas as condições avaliadas. As alterações morfológicas observadas ( células

alongadas. formação de pseudo-micélio) foram semelhantes para todos os casos.

57

5. CONCLUSÕES

A utilização de técnicas de adaptação e reciclagem da levedura Candida

guilliermondií FTl 20037 no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar favoreceu a obtenção de xilitol em meios constituídos por este hidrolisado.

Quanto maior o nível de concentração do hidrolisado, maior a necessidade

de adaptar as células. ou seja, cultivá-Ias em meio constituído do hidrolisado mais

concentrado. A utilização do hidrolisado mais concentrado ( 4HC) e inóculo de

maior nível de adaptação (N4) resultou em aumento de 46 % no rendimento (O. 73

g/g) em relação ao obtido (0,50 glg) com o inóculo de menor nível (N1), enquanto a

produtividade variou de 0.40 para 0,60 g/Lh, o que corresponde a um aumento de

50%.

'-.

A utilização de diferentes concentrações iniciais de inóculo adaptado no

nível N3• em fermentações conduzidas com o hidrolisado 3HC, não influenciou nos

parâmetros fermentativos avaliados.

A reciclagem de células inicialmente adaptadas no nível N3 não resultou em

queda no rendimento em xilitol durante os 5 ciclos efetuados. Além disso,

verificou-se um aumento de 15% sobre a produtividade com o emprego de 4 ciclos

de reutilização das células.

58

Em síntese. a utilização da técnica de adaptação da levedura ao hidrolisado

de bagaço é um aspecto importante a ser considerado no sentido de se obter

melhoria no processo microbiológico de obtenção de xilitol a partir de resíduos

agroindustriais.

Os resultados referentes ao reciclo de células indicam a possibilidade de

execução de trabalhos em série sem queda de produtividade, seja pelo sistema de

cortes, "feed-batch" ou ainda. cultivo contínuo.

l -. -

1 ,,

59

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGR..\.FICAS

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