universidade positivo luciane mÜller martins
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UNIVERSIDADE POSITIVO
LUCIANE MÜLLER MARTINS
Desenvolvimento de um produto bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki HD-1
CURITIBA
2016
LUCIANE MÜLLER MARTINS
Desenvolvimento de um produto bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki HD-1
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Mestrado Profissional em Biotecnologia Industrial da
Universidade Positivo como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia
Industrial.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Susan Grace Karp
Co-orientador: Prof. M. Sc. Marcelo Calide Barga
CURITIBA
2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca da Universidade Positivo - Curitiba - PR
M386 Martins, Luciane Müller. Desenvolvimento de um produto bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 / Luciane Müller Martins. ― Curitiba: Universidade Positivo, 2016.
99 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Positivo, Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial, 2016. Orientador: Prof.ª Dr.ª Susan Grace Karp. Coorientador: Prof. M. Sc. Marcelo Calide Barga
1. Inseticida - biológico. 2. Endotoxinas. 3. Cinética de crescimento. I. Karp, Susan Grace. II. Barga, Marcelo Calide. III. Título.
CDU 504
A Deus dedico esse trabalho:
“Porque dEle, por Ele e
para Ele são todas as coisas”
(Romanos 11:36)
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu Deus, fonte de Inspiração e Capacitação, minha Força, meu
Refúgio...
À Universidade Positivo, Professores do Programa de Mestrado Profissional em
Biotecnologia Industrial e demais Funcionários da Instituição que muito colaboraram para a
realização desse trabalho;
À Prof.ª Dr.ª Leila Teresinha Maranho, Coordenadora do Mestrado, por sua incansável
dedicação e disposição em auxiliar os mestrandos em todos os aspectos;
À Prof.ª Dr.ª Susan Grace Karp pela orientação, paciência e carinho e por sempre me
transmitir além do conhecimento, a tranquilidade em todos os momentos que precisei. Minha
eterna admiração!
À Bio4 Soluções Biotecnológicas Ltda., especialmente ao Prof. M. Sc. Marcelo Calide
Barga pela disposição em colaborar com esse trabalho e à Rafaelly Maia pela ajuda sempre
que precisei;
À Prof.ª Dr.a Marie Bartz pelo auxílio com as análises estatísticas;
À Agrocete Indústria de Fertilizantes Ltda. por apoiar a realização deste Projeto, em
especial à Diretoria e aos gerentes Eduardo Faria, Fernanda Schena Figueiredo e Marcelo
Giroldo por acreditarem desde o início que essa conquista seria possível;
À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), principalmente à Dr.ª
Rose Monnerat e à Dr.ª Lilian Praça pelo envio da cepa para estudo e parceria na realização
dos bioensaios;
Aos meus pais Lilian e Oscar, incessantes fontes de incentivo, por investirem em
minha formação e por conduzirem minha educação em princípios éticos. Obrigada por
acreditarem em mim!
Às minhas irmãs Ligia e Lorena pelo apoio irrestrito, pela amizade e presenças
constantes em todos os momentos. Em especial à Ligia pela hospedagem todas as vezes que
estive em Curitiba para a concretização desse sonho. Você foi essencial!
Ao meu esposo Marcos pelo incentivo e compreensão nos momentos que estive
ausente;
A todos os amigos e colegas que de alguma forma colaboraram ou torceram para essa
conquista. Vocês tornaram mais agradável meu percurso! Muito Obrigada!
RESUMO
Visando minimizar o impacto ambiental importante consequente ao uso indiscriminado de
produtos químicos nas lavouras, cada vez mais bioinseticidas têm sido propostos para
controle e manejo integrado de pragas. Apesar da comprovada eficiência de Bacillus
thuringiensis nesses produtos, ainda existem limitações ao seu uso devido ao custo de
produção e pouco conhecimento referente à utilização correta das formulações. O presente
trabalho teve como objetivo desenvolver um produto bioinseticida à base de Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, que atenda aos critérios de qualidade e que seja viável
industrialmente. Foi avaliada inicialmente a influência da composição do meio de cultivo no
crescimento e esporulação. A modificação da fonte de nitrogênio, acrescentando-se peptona
ao extrato de levedura do meio original, não apresentou efeito significativo. Já a modificação
da fonte de carbono de glicose para sacarose resultou em esporulação significativamente
maior (4,83.108 UFC/mL) em frascos agitados. Para o cultivo em garrafões de 5 L
comparando glicose e sacarose, não houve diferença entre as concentrações máximas de
esporos obtidas nos dois meios, entre 2.107 e 3.107 UFC/mL após 34h, no entanto, verificou-
se que não houve consumo da sacarose pelo micro-organismo. Em biorreator de bancada (7,5
L) em batelada utilizando-se glicose como fonte de carbono, o pico de esporulação ocorreu
em 30 h (4,83.1010 UFC/mL). Já em batelada alimentada com glicose, utilizando-se o mesmo
meio, obteve-se valor máximo de esporulação após 72 h de cultivo (4,44.1012 UFC/mL). Foi
observada em gel de eletroforese a presença de proteínas com pesos moleculares estimados
em 70 kDa e 130 kDa, característicos das toxinas de interesse, visualmente em maior
concentração nas amostras da batelada alimentada. Uma formulação foi proposta para o caldo
concentrado de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 produzido em batelada e batelada
alimentada. As formulações foram testadas por meio de bioensaios com a lepidóptera
Spodoptera frugiperda para verificação da concentração letal (CL50). A CL50 da formulação
produzida em batelada foi 635.121 esporos/mL e da formulação de batelada alimentada foi
10.994 esporos/mL.
Palavras-chave: Bioinseticida, cinética de crescimento, batelada alimentada, endotoxinas,
bioensaio, formulações.
ABSTRACT
In order to minimize the significant environmental impact consequent to the indiscriminate
use of chemicals on crops, biopesticides have been proposed increasingly for pest control and
integrated management. Despite the proven Bacillus thuringiensis efficiency in these
products, there are still limitations to its use due to the cost of production and lack of
knowledge regarding the correct utilization of the formulations. This study aimed at
developing a biopesticide product based on Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1,
which attends the quality criteria and is viable industrially. Initially the influence of the
culture medium composition on the growth and sporulation was evaluated. The modification
in the nitrogen source, adding peptone to the yeast exteract present in the original medium,
did not present significant effect. However the modification in the carbon source, from
glucose to sucrose, resulted in significantly higher sporulation (4.83.108 UFC/mL) in agitated
flasks. For the cultivation in 5 L bottles comparing glucose and sucrose, there was no
difference between the maximum concentrations of spores obtained in both media, between
2.107 and 3.107 UFC/mL after 34 h, however, no consumption of sucrose by the
microorganism was verified. In a bench-scale bioreactor (7.5 L) in batch mode using glucose
as carbon source, the sporulation peak occured in 30 h (4.83.1010 UFC/mL). In fed-batch
mode with glucose, using the same medium, the maximum value of sporulation was obtained
after 72 h of cultivation (4.44.1012 UFC/mL). The presence of proteins with estimated
molecular weights of 70 kDa and 130 kDa, charactertistic of the toxins of interest, was
observed in electrophoresis gel, visually in higher concentration in the samples of the fed-
batch process. A formulation was proposed for the concentrated broth of Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 produced in batch and fed-batch modes. The formulations
were tested by bioassay with the lepidoptera Spodoptera frugiperda in order to verify the
lethal concentration (LC50). The LC50 of the batch formulation was 635.121 spores/mL and
the one of the fed-batch formulation was 10.994 spores/mL.
Keywords: Biopesticide, growth kinetics, fed-batch, endotoxins, bioassay, formulations.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1. Imagem de microscopia eletrônica de uma cepa de Bacillus thuringiensis........... 19
Figura 2. Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporos-cristais da estirpe de
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1.........................................................................
20
Figura 3. Modo de ação das toxinas de Bacillus thuringiensis............................................... 23
Figura 4. Fase vegetativa e de esporulação de uma cultura de Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki HD-73 em microscopia de contraste de fases...............................................
27
CAPÍTULO 2
Figura 1. Cinética de crescimento e esporulação em meio GYS em garrafão..................... 51
Figura 2. Cinética de crescimento e esporulação em meio com sacarose em garrafão........ 52
Figura 3. Cinética de crescimento e esporulação – Batelada em biorreator......................... 54
Figura 4. Cinética de crescimento e esporulação – Batelada alimentada em biorreator...... 57
Figura 5. Consumo de glicose x produção de biomassa seca – Batelada............................. 58
Figura 6. Consumo de glicose x produção de biomassa seca – Batelada alimentada.......... 58
Figura 7. Eletroforese em gel de poliacrilamida – Batelada................................................ 60
Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida – Batelada alimentada............................. 60
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Algumas patentes relacionadas à produção de bioinseticidas à base de
Bacillus thuringiensis.......................................................................................................
33
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Composição em g/L dos meios de cultura comparados................................... 43
Tabela 2. Resultados comparativos das modificações nos meios de cultura................... 50
Tabela 3. Parâmetros cinéticos e de rendimentos em batelada e batelada alimentada.... 59
Tabela 4. Estimativa da concentração letal (CL50) da formulação produzida em
batelada e batelada alimentada.........................................................................................
61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Btk Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
CaCl2.2H2O Cloreto de cálcio dihidratado
CMB Meio de cultivo à base de moagem de cereais
CMC Carboximetilcelulose
CENARGEN Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia
CL50 Concentração Letal Média
CRY Proteínas Cristal
CYT Proteínas Citolíticas
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
g Aceleração da gravidade
GYS Meio de cultura com glicose, extrato de leveduras e sais
H3PO4 Ácido Fosfórico
H2SO4 Ácido sulfúrico
ICP Insecticidal Crystal Proteins
kDa Quilodaltons
KLa Coeficiente de transferência de oxigênio
K2HPO4 Fosfato de potássio bibásico
KH2PO4 Fosfato de potássio monobásico
MnCl2 Cloreto de manganês
MgCl2 Cloreto de magnésio
MnSO4.H2O Sulfato de manganês monohidratado
MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio heptahidratado
MIP Manejo Integrado de Pragas
m/v Massa/volume
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NaH2PO4 Fosfato monobásico de sódio
(NH4)2SO4 Sulfato de amônio
NYSM Nutrient Yeast Extract Salt Medium
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
PO Fenoloxidase
SDS PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com sódio dodecil sulfato (desnaturante)
TEMED Tetrametil-etileno-diamina
UFC Unidade formadora de colônia
UV Ultravioleta
VIP Proteínas Inseticidas Vegetativas
v/v Volume/volume
vvm Volume de ar por volume de meio por minuto
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 12
OBJETIVOS ............................................................................................................................. 14
Objetivo geral ....................................................................................................................... 14
Objetivos específicos ............................................................................................................ 14
CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................... 15
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 16
Bacillus thuringiensis ............................................................................................................... 18
Histórico ................................................................................................................................ 18
Características Morfológicas e Bioquímicas de Bacillus thuringiensis ................................ 19
Atividade bioinseticida / mecanismo de ação das toxinas .................................................... 22
CULTIVO DE Bacillus thuringiensis ...................................................................................... 24
FORMULAÇÕES BIOINSETICIDAS .................................................................................... 28
Propriedade Intelectual ......................................................................................................... 33
CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 35
CAPÍTULO 2 ........................................................................................................................... 39
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 41
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 42
Micro-organismo .................................................................................................................. 42
Preparo da cultura estoque .................................................................................................... 42
Meios de cultura .................................................................................................................... 43
Preparo do inóculo ................................................................................................................ 44
Comparação dos meios de cultura modificados em frascos agitados ................................... 44
Cinética de crescimento em garrafões de fermentação ......................................................... 44
Batelada em biorreator de bancada ....................................................................................... 45
Batelada alimentada em biorreator de bancada .................................................................... 45
Acidificação e concentração da amostra ............................................................................... 46
Formulação ........................................................................................................................... 46
Observação microscópica ..................................................................................................... 46
Aferição do pH ...................................................................................................................... 46
Contagem de células viáveis ................................................................................................. 46
Contagem de esporos viáveis ................................................................................................ 47
Dosagem de açúcar redutor pelo método DNS ..................................................................... 47
Determinação da biomassa seca............................................................................................ 48
Caracterização e avaliação da expressão das endotoxinas .................................................... 48
Bioensaios ............................................................................................................................. 49
Análise de dados ................................................................................................................... 49
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 49
Comparação dos meios de cultura modificados em frascos agitados ................................... 49
Cinética de crescimento em garrafões de fermentação ......................................................... 50
Batelada em biorreator de bancada ....................................................................................... 53
Batelada alimentada em biorreator de bancada .................................................................... 56
Consumo de glicose e concentração de biomassa seca em batelada e batelada alimentada . 57
Caracterização e avaliação da expressão das endotoxinas .................................................... 59
Bioensaios ............................................................................................................................. 61
CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 63
CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 67
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 68
ANEXOS .................................................................................................................................. 77
Anexo 1 ................................................................................................................................. 77
Anexo 2 ................................................................................................................................. 85
12
INTRODUÇÃO
A crescente demanda por um abastecimento alimentar saudável exige um controle
eficiente das principais pragas e doenças na agricultura. As práticas de gestão atuais são
baseadas principalmente na aplicação de pesticidas sintéticos. No entanto, o uso excessivo de
agrotóxicos tem causado sérios problemas ambientais e de saúde em todo o mundo. Como
consequência, têm-se buscado alternativas através de métodos mais seguros para substituir ou
complementar as estratégias de controle existentes. O controle biológico, isto é, a utilização
de antagonistas naturais para combater pragas ou doenças de plantas surgiu como uma
alternativa promissora aos pesticidas químicos (PÉREZ-GARCÍA; ROMERO; VICENTE,
2011).
Devido à crescente ameaça à segurança alimentar global e pressão sobre os recursos
naturais, há uma necessidade urgente de identificar e criar produtos de base biológica no
mercado agrícola. Além de obtenção de recursos, os problemas e desafios inerentes à
identificação, avaliação de desempenho, e registo de agentes biológicos exigem uma
cooperação significativa de agências governamentais, dos setores acadêmicos e industriais
para apoiar o desenvolvimento da agricultura sustentável. A empresa Research BCC relatou
um valor de US $ 2,1 bilhões em 2011 para o mercado mundial de biocontrole e isso deverá
aumentar para US $ 3-4 bilhões em 2017, em parte influenciado pelo aumento da demanda
por produtos orgânicos (VELIVELLI et al., 2014).
Dentre os agentes de controle biológico de interesse em biotecnologia agrícola, pode-
se citar os bioinseticidas como sendo uma crescente promessa. A Agência de Proteção
Ambiental dos EUA (EPA) define bioinseticidas como “inseticidas derivados de materiais
naturais como animais, plantas, bactérias e certos minerais" (EPA, 2015).
Bacillus thuringiensis oferece uma série de vantagens para a sua aplicação em
biotecnologia agrícola e corresponde a 90% do mercado de bioinseticidas (MISHRA et al.,
2015). É notório que produtores, agricultores, bem como os consumidores estão sendo
beneficiados com os desenvolvimentos biotecnológicos baseados neste micro-organismo
(YILMAZ, 2012).
Pesquisas devem concentrar-se em melhorar técnicas de produção para baixar custos,
focar melhorias em termos de formulações, armazenamento e utilização, bem como sobre a
persistência em campo para reduzir a necessidade de aplicação frequente (LACEY et al.,
2015).
13
Didaticamente, esta dissertação está dividida em dois capítulos nos quais se buscou
elucidar os caminhos para o desenvolvimento de um novo produto bioinseticida. O primeiro
capítulo refere-se a um artigo de revisão que compila dados da literatura relevantes para
cumprir tal objetivo. Foi escrito com base nas normas do periódico Brazilian Archives of
Biology and Technology.
O segundo capítulo descreve em forma de artigo a parte experimental desde a escolha
do meio de cultivo, comparação de cultivo em diferentes fontes de carbono, cinética de
crescimento do micro-organismo em batelada e batelada alimentada e caracterização da
presença da toxina entomopatogênica. Além disso, foi proposta uma formulação ao produto
que foi avaliada quanto ao potencial bioinseticida por meio de ensaio biológico. Esse capítulo
foi redigido com base nas normas do periódico Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology.
14
OBJETIVOS
Objetivo geral
Desenvolver um produto líquido bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki HD-1 ativo contra Spodoptera frugiperda.
Objetivos específicos
Testar diferentes meios de cultivo para produção de células e esporos de Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1;
Avaliar a formação de biomassa, esporulação e síntese de endotoxinas de Bacillus
thuringiensis por cultivo em batelada e batelada alimentada em biorreator;
Desenvolver uma formulação para o produto;
Avaliar potencial de toxicidade da formulação por bioensaio contra Spodoptera
frugiperda.
15
CAPÍTULO 1
Bioinseticidas à Base de Bacillus thuringiensis: Uma
Revisão
Resumo
O uso indiscriminado de produtos químicos nas lavouras, além do impacto ambiental
importante, é questão de saúde pública em todo o mundo devido aos inúmeros casos de
intoxicações por agrotóxicos. Diante disso, cada vez mais bioinseticidas têm sido utilizados
para controle e manejo integrado de pragas em lavouras. Produtos à base de Bacillus
thuringiensis têm sido propostos devido à sua comprovada eficiência no combate a
lepidópteros, sendo inócuo para a saúde humana e de outros animais. No entanto, ainda
existem limitações ao seu uso, pois os produtos importados que ainda dominam o mercado
brasileiro possuem custo elevado, havendo a necessidade de desenvolvimento de produtos
nacionais competitivos. Esta revisão tem como objetivo compilar informações sobre Bacillus
thuringiensis necessárias para o desenvolvimento de formulações bioinseticidas.
Palavras chaves: Bacillus thuringiensis, bioinseticida, manejo integrado de pragas,
endotoxinas, formulações.
Abstract
The indiscriminate use of chemicals on crops, in addition to the environmental impact, is a
matter of public health throughout the world due to the numerous cases of pesticide
poisoning. Therefore, more and more bioinsecticides have been used for pest control and
integrated management in crops. Bacillus thuringiensis based products have been proposed
because of their proven effectiveness in combating lepidoptera and their harmlessness to
human health and other animals. However, there are still limitations to their use, because the
imported products that still dominate the Brazilian market are of high cost, and there is the
need for development of competitive domestic products. This review aims to compile
information on Bacillus thuringiensis that could contribute to the development of biopesticide
formulations.
Key words: Bacillus thuringiensis, biopesticide, integrated pest management, endotoxins,
formulations.
16
INTRODUÇÃO
O uso indiscriminado de produtos químicos nas lavouras constitui um grave problema
principalmente nos países em desenvolvimento. Além do impacto ambiental importante, a
exposição humana aos diferentes agrotóxicos é preocupação de saúde pública em todo o
mundo (Mishra et al. 2015). Por esta razão, os bioinseticidas estão ganhando cada vez mais
importância pois são alternativas aos inseticidas químicos e são importantes componentes de
programas de controle de muitas pragas (Senthil-Nathan 2015).
O cultivo extensivo de culturas como soja, milho, algodão e canola, entre outras,
requer elevado investimento em agrotóxicos, pois são acometidas por diversas pragas,
principalmente lepidópteros e coleópteros. Os danos provocados podem variar de acordo com
a região e o controle dessas pragas pode chegar a até 22% do custo da produção. Dados sobre
as medidas de controle utilizando produtos químicos sintéticos sugerem que
aproximadamente 5,6 bilhões de quilos de pesticidas são utilizados em todo o mundo e são
responsáveis por desequilíbrios no meio ambiente (Alavanja 2009).
Está previsto para 2050 que a população mundial exceda nove bilhões de pessoas.
Esforços precisam ser feitos para atender a demanda de 70-100% mais alimentos a partir da
mesma área e sem o uso excessivo de produtos químicos (Mishra et al. 2015).
Visando a redução da utilização dos agroquímicos, tem sido crescente a substituição,
mesmo que gradativa, pelo controle biológico de pragas em lavouras. O controle biológico
pode ser entendido como a regulação da população de insetos em níveis economicamente não
prejudiciais pelo uso de inimigos naturais, sendo uma estratégia utilizada tanto em sistemas
agroecológicos quanto na agricultura convencional que se vale do Manejo Integrado de
Pragas (MIP) (Tamez-Guerra et al. 2001).
Apesar de os bioinseticidas estarem lentamente substituindo os inseticidas químicos,
uma visão global indica que as indústrias de biocontrole estão numa posição insegura se
comparadas às indústrias de produtos químicos que dominam a agricultura. Até 2003, as
maiores quotas de mercado em bioinseticidas pertenciam à América do Norte com 44%,
seguida pela Europa com 20%, a Ásia 13%, Oceania 11%, América Latina 9% e África 3%.
Dentre os agentes biológicos utilizados, Bacillus thuringiensis é responsável por 90% do
faturamento com bioinseticidas (Mishra et al. 2015).
Diante disso, cada vez mais bioinseticidas à base de B. thuringiensis têm sido
propostos como substitutos aos pesticidas químicos, devido às inúmeras vantagens
apresentadas. Dentre elas, pode-se citar o fato de o B. thuringiensis produzir toxinas que agem
17
de forma sinérgica, sendo uma alternativa à seleção de populações de insetos resistentes aos
inseticidas químicos que tem sido frequentemente relatada. Outra importante vantagem é que
os bioinseticidas agem especificamente sobre o inseto-alvo, não havendo risco de intoxicação
para insetos benéficos, plantas e animais vertebrados, incluindo humanos. A alta
especificidade destes produtos em relação aos insetos-alvo leva à consequente redução do
impacto ambiental. Além disso, B. thuringiensis produz esporos, que são bastante resistentes
aos fatores adversos do ambiente, podendo ser mantidos na forma de pó ou líquido e sendo
facilmente aplicados nos mesmos equipamentos utilizados para aplicação de inseticidas
químicos (Bravo et al. 2011). Vale lembrar que bioinseticidas não deixam resíduos nocivos
em culturas, o que alivia a preocupação pública relativa à segurança alimentar (Behle e
Birthisel 2014). Outra importante vantagem é que bioinseticidas podem ser utilizados
juntamente com inseticidas químicos porque na maioria dos casos o produto microbiano não é
desativado ou danificado por resíduos de inseticidas convencionias (Chandler et al. 2011).
Além disso, com os avanços da biotecnologia, os genes que codificam as proteínas
insecticidas foram transferidos com sucesso em diferentes culturas de plantas, o que tem
levado a benefícios econômicos significativos para a agricultura (Pérez-Garcia et al. 2011).
Apesar das evidentes vantagens em sua utilização, no Brasil as principais limitações
ao uso de bioinseticidas à base de B. thuringiensis são o elevado custo, a concorrência com
produtos químicos e a falta de investimento dos setores público e privado no desenvolvimento
e formulação destes produtos (Angelo et al. 2010; Polanczyk e Alves 2003).
As diferenças em critérios de registo de produtos biológicos em três continentes
(América do Norte, América do Sul e Europa) ilustram as dificuldades práticas associadas
com os testes e comercialização para esta categoria. A aplicação tecnológica de um produto
de controle biológico não é uma tarefa fácil, porque prova substancial tem que ser fornecida
não só para os reguladores, mas também para os agricultores confiarem em sua capacidade
para fornecer igual ou melhor resultado que os produtos existentes no mercado, de uma forma
segura e com baixo custo (Velivelli et al. 2014).
Boyetchko et al. (1999) sugeriram que o sucesso comercial de bioinsecticidas é
limitado pelo inadequado estudo de scale-up da produção e tecnologias de formulação
deficientes.
Além disso, é absolutamente necessário criar a consciência entre os agricultores
quanto ao uso, eficácia, benefícios e importância de bioinseticidas. Os agricultores devem ser
treinados para os métodos de aplicação em campo bem como nas particularidades de cada
controle biológico, pois a aplicação correta de bioinseticidas é muito importante para alcançar
18
resultados ótimos. Além disso, os efeitos nocivos de inseticidas químicos devem ser
conhecidos e explicados (Mishra et al. 2015).
Pesquisas na área de bioinseticidas têm sido incentivadas, pois são necessários mais
estudos em alguns aspectos como bioformulações e comercialização. No aspecto comercial,
observa-se crescente interesse em bioinseticidas demonstrado pelo considerável número de
acordos entre empresas de inseticidas e de bioprodutos que permitem o desenvolvimento
efetivo de bioinseticidas no mercado (Senthil-Nathan 2015).
Bacillus thuringiensis
Histórico
A espécie B. thuringiensis foi isolada pela primeira vez em larvas de bicho da seda,
Bombix mori, infectadas. A descoberta ocorreu no Japão em 1902 quando Ishiwata observou
essa bactéria esporulada que causava mortalidade dessas larvas e a denominou Bacillus sotto.
Em 1911, Berliner redescreveu a mesma bactéria isolada a partir de lagartas da traça da
farinha Anagasta kuhniella e, em 1915, denominou-a de B. thuringiensis, em homenagem à
região de onde as lagartas foram coletadas, Thuringia na Alemanha (Whiteley e Schnepf
1986; Federici 1999).
O B. thuringiensis subsp. kurstaki, conhecido como Btk, foi primeiramente isolado na
década de 1960. Foi descoberta uma estirpe de B. thuringiensis subsp. kurstaki, chamada HD-
1 (Dulmage 1970) que apresentou toxicidade superior às estirpes conhecidas até então. O
produto à base de B. thuringiensis kurstaki HD-1 com maior alcance no mercado mundial é o
Dipel® (Abbott Laboratories, USA), altamente eficaz contra 170 lepidópteros praga (Glare e
O’Callagham 2000).
Produtos à base de B. thuringiensis são muito utilizados na América do Norte para
controle de pragas florestais como Lymantria dispar, Choristoneura fumiferana e C.
occidentalis. Nos Estados Unidos cerca de 2 milhões de hectares de florestas foram tratados
com B. thuringiensis kurstaki entre os anos de 1980 e 1995 para controle de L. dispar. Em
alguns casos isso resultou na erradicação dessa praga (Glare e O’Callagham 2000).
19
Características Morfológicas e Bioquímicas de Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis pertence à família Bacillaceae, que engloba grande parte das espécies
formadoras de esporos. Os esporos de B. thuringiensis podem ser isolados de diversos
ambientes como solo, raízes de plantas, água, partículas de poeira e insetos (Bizzarri e Bishop
2008).
Trata-se de um bacilo Gram-positivo cujo tamanho é de 1,0 a 1,2 μm de largura por
3,0 a 5,0 μm de comprimento, geralmente móvel (Glare e O’Callagham 2000; Angelo et al.
2010). O esporo localiza-se na região central ou paracentral da célula e possui formato
elipsoidal conforme pode ser observado na Figura 1.
Figura 1: Imagem de microscopia eletrônica de uma cepa de Bacillus
thuringiensis. C - cristal, E - esporo. Barra, 0,5 µm. Fonte: Sauka e Benintende
2008. Utilizada com permissão do autor.
A espécie é aeróbia não estrita com faixa de temperatura de crescimento entre 10ºC e
45°C. A produção de cristais proteicos intracelulares é uma característica típica de B.
thuringiensis, o que a distingue de outras espécies do mesmo gênero. Em geral, a formação
dos cristais ocorre durante a esporulação. Essa bactéria entra em processo de esporulação
durante a fase estacionária, acumulando cristais de proteínas tóxicas para insetos denominadas
proteínas Cry, também chamadas de δ-endotoxinas ou Insecticidal Crystal Proteins (ICPs).
Esses cristais apresentam atividade entomopatogênica para várias espécies de insetos,
destacando-se as ordens dos lepidópteros, dípteros e coleópteros (Glare e O’Calleghan 2000;
Brar et al. 2006a; Angelo et al. 2010).
Ao final da esporulação, o cristal proteico corresponde a cerca de 20% a 30% do peso
seco da célula, sendo liberado no momento da lise celular (Glare e O’Calleghan 2000; Angelo
et al. 2010). A morfologia destes cristais pode ser visualizada na Figura 2.
20
Em 1962, foi proposta por De Barjac e Bonnefoi uma classificação e nomenclatura
para B. thuringiensis baseada em propriedades bioquímicas e na sorotipagem através da
aglutinação de antígenos flagelares, denominados antígenos H das células vegetativas, o que
facilitou a diferenciação entre as várias estirpes, que passaram a ser agrupadas em
subespécies. Depois disso, em 1989 Hofte e Whiteley apresentaram uma nomenclatura
baseada nas sequências de aminoácidos e no espectro de ação das toxinas. Essa classificação
ainda não era adequada porque se percebeu que poderiam ser encontradas toxinas muito
semelhantes, no entanto com especificidades diferentes ou com atividade dupla para
coleópteros e lepidópteros, por exemplo, o que causou confusão na nomenclatura (Polanczyk
e Alves 2003). Diante disto, foi criado em 1994 um comitê internacional que propôs uma
nomenclatura baseada apenas na sequência de aminoácidos onde as proteínas Cry são
classificadas em diferentes grupos e subgrupos, além das toxinas Cyt (endotoxinas citolíticas)
devido à similaridade de seus aminoácidos (Crickmore et al. 2014).
Figura 2: Micrografia eletrônica de varredura da mistura
esporos-cristais da estirpe de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki HD-1. (a) ce - cristal esférico; (b) cb - cristal
bipiramidal, ep - esporo; (c) cc - cristal cubóide, ep - esporo
(aumento de 10.000x) Fonte: Praça et al. 2003. Utilizada com
permissão do autor.
Cada cepa de B. thuringiensis pode produzir um ou mais cristais que poderão conter,
por sua vez, uma ou mais toxinas com peso molecular variado. Por exemplo, o B.
thuringiensis kurstaki HD-1 contém três toxinas Cry1 com peso molecular de 130 kDa e duas
Cry2 de 70 kDa, enquanto outra subespécie B. thuringiensis tenebrionis produz uma única
toxina de 67 kDa (Glare e O’Callagham 2000; Polanczyck e Alves 2003).
21
Estudos detalhados destas toxinas (Crickmore et al. 1998) permitem identificar que
cada uma apresenta especificidade contra determinada ordem de insetos. A caracterização da
maioria das toxinas descritas foi feita através de bioensaios contra diferentes larvas de insetos.
O espectro de ação dos diversos isolados de B. thuringiensis depende da combinação das δ-
endotoxinas individuais presentes no cristal.
As proteínas tóxicas para lepidópteros normalmente pertencem ao grupo Cry 1, Cry 9
e Cry 2. As tóxicas para coleópteros são Cry 3, Cry 7 e Cry 8. As proteínas Cry 5, Cry 12, Cry
13 e Cry 14 têm atividade contra nematoides enquanto Cry 2, Cry 4, Cry 10, Cry 11, Cry 16,
Cry 17, Cry 19 e Cyt são tóxicas para dípteros (Crickmore et al. 2014).
Glare e O´Callagnam (2000) citam que mais de mil espécies de insetos de diversas
ordens são suscetíveis ao B. thuringiensis, embora os produtos comerciais disponíveis
restrinjam-se ao controle de lepidópteros, dípteros e coleópteros.
Estudos comprovam que existe um efeito sinérgico de diferentes combinações de
toxinas ou mesmo pela interação destas com os esporos (Bravo et al. 2007). Bioensaios
utilizando toxinas de B. thuringiensis demonstraram que Cry 1Aa exibiu alta toxicidade
contra Helicoverpa armigera com um valor de CL50 de 0,338 mg g-1, mas apresentou baixa
toxicidade contra Spodoptera exigua, com valor de CL50 de 3,936 mg g-1. Ao contrário, a
toxina Cry 1C exibiu maior toxicidade para Spodoptera exigua com CL50 de 1,466 mg g-1 e
apenas moderada toxicidade contra Helicoverpa armigera. Mas, quando Cry 1C e Cry 1Aa
foram misturadas, essa combinação apresentou maior toxicidade para S. exigua do que para
H. armigera, comparada ao efeito das toxinas de forma isolada (Xue et al. 2005).
Os genes cry que codificam a síntese dessas proteínas podem estar localizados tanto
em cromossomo, em grandes plasmídeos ou em ambos. Sua expressão pode ser regulada por
mecanismos distintos. Um deles, o qual ocorre com a maioria desses genes, é dependente de
fatores de transcrição específicos da fase de esporulação, e outro, independe da fase de
esporulação, como o gene vip3, cujos fatores são típicos da fase de crescimento vegetativo
(Polanczyk e Alves 2003).
As protoxinas “Vip” (vegetative insecticidal proteins) são proteínas produzidas e
secretadas por algumas estirpes de B. thuringiensis durante sua fase vegetativa e de
esporulação. As Vips foram excluídas da nomenclatura Cry por não formarem cristais
proteicos (Monnerat e Bravo 2000). Essas proteínas são produzidas em etapas iniciais do
processo de crescimento das bactérias em cultura, antecipando sua obtenção. Essa foi uma
descoberta importante, pois, além da mistura de esporos e cristais obtidos após o cultivo de B.
thuringiensis, pode-se utilizar o seu sobrenadante para produção de bioinseticidas. Essas
22
proteínas apresentam amplo espectro de ação principalmente contra larvas de lepidópteros. O
gene que codifica a toxina Vip 3 é encontrado em cerca de 30% dos isolados de B.
thuringiensis (Glare e O’Callagham 2000; Crickmore et al. 2014).
Além das toxinas do cristal e das Vips, alguns sorotipos de B. thuringiensis podem
produzir outras proteínas como as β-exotoxinas, também denominadas thuringiensinas, e
algumas α-exotoxinas. São produzidas na fase de crescimento, podendo ser encontradas no
sobrenadante das culturas. Também possuem atividade inseticida, no entanto, por serem
tóxicas para vertebrados, não devem ser utilizados sorotipos que as sintetizam para produção
de bioinseticidas (Glare e O’Callagham 2000).
Já foram descritos 85 sorotipos para B. thuringiensis (Jurat-Fuentes e Jackson 2012),
embora a maioria dos bioinseticidas comerciais seja baseada nos sorotipos (ou subespécies)
kurstaki (Btk), aizawai, israelensis (Bti), e tenebrionis (Btt).
Atividade bioinseticida / mecanismo de ação das toxinas
A atividade letal do B. thuringiensis na larva ocorre devido à ruptura de tecido
intestinal, seguida de infecção generalizada causada pelo próprio B. thuringiensis ou por
outras bactérias (Raymond et al. 2010).
Para que as proteínas Cry sejam efetivas, é necessária a ingestão de esporos e cristais
de B. thuringiensis pelas larvas susceptíveis. Logo em seguida, iniciam-se os sintomas como
perda do apetite e abandono do alimento, paralisia do intestino, vômito, diarreia, paralisia e
morte da larva. Após a ingestão dos cristais, ocorre a solubilização no intestino médio do
inseto pela ação de proteases intestinais, em pH de 9,5 aproximadamente, o que leva à
dissolução da maioria das protoxinas de B. thuringiensis, liberando os polipeptídios tóxicos
que provocarão lesões no epitélio intestinal das larvas (Bobrowski et al. 2003).
Após hidrólise pelas proteases, os fragmentos ativos ligam-se a receptores específicos
nas membranas das células colunares do intestino dos insetos, com subsequente abertura ou
formação de poros, ocorrendo assim um desequilíbrio osmótico entre o meio intra e
extracelular, ocasionando perda da integridade da membrana do intestino das larvas de insetos
suscetíveis. Uma vez que as células epiteliais são destruídas, os esporos de B. thuringiensis
têm acesso à hemolinfa, meio no qual se multiplicam. Tais eventos conduzem à morte dos
insetos por inanição e septicemia poucas horas após a ingestão dos cristais (Copping e Menn
2000). O modo de ação das toxinas está descrito na Figura 3.
23
Figura 3: Modo de ação das toxinas de Bacillus thuringiensis.
Fonte: www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc217.htm (WHO) adaptado
Entendendo o mecanismo de ação das toxinas, consegue-se explicar sua alta
especificidade se comparadas aos praguicidas sintéticos. A toxicidade depende de uma
ligação específica de fragmentos tóxicos aos receptores no epitélio intestinal dos insetos
susceptíveis. Não há relato de proteínas tóxicas que não se liguem a esses receptores
específicos, como também não foi observado esse tipo de ligação com proteínas não tóxicas.
Além disso, proteínas diferentes que são tóxicas para o mesmo inseto, podem interagir com
diferentes receptores no epitélio intestinal. Não há correlação quantitativa entre a afinidade da
toxina pelos seus receptores e alta toxicidade. A ligação específica é essencial para a
especificidade, mas não é suficiente para a toxicidade. A especificidade não é somente
determinada pela presença de receptores, mas também pela atividade proteolítica e pH no
intestino da larva (Lambert e Peferoen 1992).
Resistência dos insetos às toxinas tem sido explicada devido a mutações nos sítios de
ligação dos receptores. Além disso, a ativação de resposta imune inata contra agentes
patogênicos de insetos tem sido considerada fator importante que contribui para tolerância ao
B. thuringiensis. Essa reação imune no inseto compreende respostas que dependem da
ativação de hemócitos e de enzimas como fenoloxidases (PO) (Contreras et al. 2015).
Pesquisas afirmam que B. thuringiensis requer a cooperação de bactérias comensais no
interior do intestino do inseto para ser totalmente patogênico. Em clara oposição, estudos de
genômica e proteômica têm demonstrado dados de forma convincente que B. thuringiensis é
um agente patogênico primário, e não apenas um saprófita do solo (Pérez-Garcia et al. 2011).
24
CULTIVO DE Bacillus thuringiensis
Com relação às exigências nutricionais para cultivo, B. thuringiensis é relativamente
simples. Necessita de uma fonte proteica para o crescimento celular, um substrato energético
para produção de energia e alguns sais inorgânicos. Algumas vezes são adicionados ao meio
tampões e antiespumantes para facilitar o processo. Apesar de pouco exigente, esse micro-
organismo não cresce em meio mínimo contendo apenas sais e glicose, necessita também de
aspartato, citrato e glutamato (Mignone e Avignone-Rossa 1996).
A adição de fontes proteicas e sais pode interferir significativamente na contagem de
esporos. Vimala Devi et al. (2005) constataram que meios formulados com extrato de
levedura dobraram a produção de endotoxinas. O extrato de levedura é eficiente no
crescimento de B. thuringiensis porque possui todas as vitaminas e aminoácidos necessários
para seu desenvolvimento. Segundo Içgen et al. (2002), entre as fontes orgânicas de
nitrogênio, o extrato de levedura é bastante utilizado no cultivo de B. thuringiensis, porém o
uso de peptona e derivados de soja também apresenta resultados satisfatórios.
A glicose é um dos principais substratos energéticos utilizados no cultivo de B.
thuringiensis. No entanto, além da glicose, as variedades de B. thuringiensis são capazes de
metabolizar outros açúcares como a sacarose, lactose, maltose e até mesmo carboidratos mais
complexos, pois produzem amilases e proteases. Inclusive, o açúcar utilizado no meio de
cultivo pode influenciar na produção de endotoxinas (Özkan et al. 2003). Estudos de Içgen et
al. (2002) mostram efeito inibidor de altas concentrações de glicose durante a síntese de δ-
endotoxinas. De acordo com esses pesquisadores, as melhores fontes de carbono para
produção dos cristais tóxicos e esporulação são lactose, sacarose e inulina. Benoit et al. (1990)
constataram a importância da utilização de íons Ca2+ e Mn2+ nos meios de cultivo de B.
thuringiensis, por influenciarem positivamente na esporulação. Obeta e Okafor (1984) relatam
que o íon K+, além de ter papel na esporulação, também é essencial na formação do cristal
proteico.
As matérias primas correspondem a 30-40% do custo da produção. Por isso tem-se
buscado matérias primas alternativas, principalmente em países em desenvolvimento, como
estratégia para diminuir custos na produção. Alguns trabalhos têm demonstrado contagem
menor de células, porém com entomotoxicidade relevante utilizando esses recursos (Couch e
Jurat-Fuentes 2014). No entanto, existem algumas desvantagens em larga escala como o custo
com pré-tratamento dos resíduos, variabilidade na composição física e química devido ao tipo
de fonte primária, sazonalidade e disponibilidade local (Smitha et al. 2013).
25
Vários estudos têm utilizado resíduos industriais para substituir ingredientes de alto
custo em meios de cultivo. Farinha de soja, farinha de peixe, amido de mandioca, amido de
milho, palha de arroz, farelo de trigo, melaço de cana, soro de queijo, resíduos de coco, além
de lamas de efluentes, sobrenadante reutilizado de culturas e inclusive água do mar são
exemplos de matérias primas que já foram estudadas para produção de toxinas contra
lepidópteros e dípteros (Ozcan et al. 2010, Moreira et al. 2007, Ghibi et al. 2007).
Diversos meios semi-sintéticos são citados na literatura para cultivo ou preparo de
inóculo de B. thuringiensis. Rogoff e Yoursten (1969) propuseram um meio de cultivo que até
hoje tem sido muito utilizado como referência, denominado meio GYS, que apresenta a
seguinte composição (g/L): glicose 20,0; extrato de levedura 12,0; (NH4)2SO4 3,0;
CaCl2.2H2O 0,12; MgSO4.7H2O 1,5; MnSO4.H2O 0,09; K2HPO4 1,5; KH2PO4 1,5. Outros
meios comumente citados para preparo de inóculos são Luria Bertani composto de triptona,
extrato de levedura e NaCl (Ghribi et al. 2007, Mounsef et al. 2015), meio NYSM composto
de caldo nutriente, extrato de levedura, MnCl2, MgCl2, CaCl2 (Praça et al. 2009), meio semi-
sintético à base de farelo de soja (Vu et al. 2012), entre outros.
Para produção de bioinseticidas à base de B. thuringiensis, existem dois métodos
principais: submerso (líquido) e fermentação em estado sólido (Couch e Jurat-Fuentes 2014).
No entanto, a maneira mais utilizada é por fermentação submersa descontínua, também
conhecida como processo em batelada, onde as proteínas Cry são formadas na etapa final do
cultivo na fase estacionária de crescimento, quando as condições do meio vão se tornando
desfavoráveis (Angelo et al. 2010). A fermentação em batelada alimentada pode ser utilizada
como uma ferramenta para aumentar a produtividade e concomitantemente diminuir custos na
fabricação de produtos bioinseticidas (Yezza et al. 2005).
Alguns pesquisadores têm desenvolvido processos de fermentação em estado sólido
para B. thuringiensis em diferentes substratos como arroz embebido, esterco líquido de
suínos, sabugo de milho, extrato de pena de pássaros, lamas de águas residuais, farinha de
batata, entre outros. No entanto, protocolos de purificação de endotoxinas a partir da matéria
sólida são pouco documentados (Smitha et al. 2013).
O processo de cultivo industrial é iniciado laboratorialmente com a produção de um
pré-inóculo, geralmente em pequenos frascos Erlenmeyer, seguida de uma pré-fermentação
com um volume aproximado de 10% do volume do cultivo final e então a fermentação final.
Todas as etapas devem ser acompanhadas microscopicamente quanto à presença de
contaminação e características morfológicas do B. thuringiensis. O pré-inóculo, pré-
26
fermentador e o fermentador em volumes crescentes têm o objetivo de diminuir o período de
adaptação do micro-organismo ao meio, chamada fase lag de crescimento (Couch 2000).
Devido ao grande consumo de oxigênio durante o cultivo, o controle deste parâmetro é
muito importante e sua concentração dissolvida no meio não deve ser inferior a 20%. A
quantidade de oxigênio dissolvido exerce grande impacto na biossíntese das proteínas Cry, e
deve ser controlada através de eficiente taxa de aeração e agitação (Couch 2000). Estudos
indicam um incremento na produção de endotoxinas quando o oxigênio dissolvido está em
torno de 26% (Maldonado-Blanco et al. 2003).
A temperatura ideal de cultivo é em torno de 30 ± 2°C. Temperaturas superiores
poderão suprimir a formação de proteínas Cry, e inferiores diminuem o rendimento pois
desaceleram o ciclo de multiplicação bacteriana (Couch 2000).
O pH pode ser monitorado durante o processo por eletrodos sensíveis a variações, os
quais acionam reservatórios de ácidos ou bases a fim de mantê-lo constante. Segundo Couch
(2000), soluções tampões são comumente empregadas para evitar grandes oscilações.
Abdel-Hamed (2001) demonstrou o perfil de variação do pH no cultivo em um meio
inicialmente neutro, sem controle de pH. No início da fermentação ocorreu acidificação do
meio, e valores alcalinos foram registrados ao final do processo. Jing-Wen et al. (2007)
relatam que no metabolismo da glicose pelo B. thuringiensis ocorre acúmulo e consumo de
ácidos orgânicos tais como piruvato, acetato e citrato. O acúmulo de ácidos orgânicos e ácido
glutâmico (principal aminoácido encontrado no meio extracelular) pode provocar a queda do
pH, enquanto o consumo pode provocar aumento do mesmo. Ainda, o consumo de fontes de
nitrogênio como as proteínas pode ocasionar aumento do pH pela liberação de amônia
proveniente da desaminação de aminoácidos (Saksinchai et al. 2001).
Embora alguns autores acreditem que oscilações de pH possam ser benéficas ao
processo (Couch e Jurat-Fuentes 2014), Brar et al. (2009) afirmam que baixo nível de
entomotoxicidade da proteína foi atribuída a condições não controladas de pH durante o
cultivo.
Ao final da fermentação, a cultura apresenta cerca de 6 a 8% de sólidos, e metade
desse valor corresponde aos esporos e cristais. Alguns processos para concentrar esses cristais
e esporos são centrifugação, microfiltração e evaporação. Algumas outras técnicas têm sido
estudadas como liofilização e flotação (Couch 2000; Brar et al. 2006a). Segundo Couch e
Jurat-Fuente (2014), o processo de recuperação e concentração deve ser eficiente e, pelo
menos, 80% eficaz na remoção do ingrediente ativo a partir do caldo fermentado.
27
A centrifugação é o método mais prevalente para recuperação de ativos e também o
mais barato. É importante o cuidado durante o passo de recuperação para preservar a atividade
inseticida. Deve-se lembrar que alta temperatura e cisalhamento poderão destruir a atividade
rapidamente, e devem sempre ser evitados. O processo de recuperação também deve ser
estruturado de forma a evitar a contaminação microbiana exógena do concentrado recuperado
(Couch e Jurat-Fuentes 2014).
Prabakaran e Hoti (2008) fizeram um estudo comparativo entre os métodos de
separação de cristais e esporos do caldo fermentado de B. thuringiensis var. israelensis.
Foram comparados a ultra-filtração tangencial, centrifugação contínua e precipitação com
ácido, quanto à eficiência na separação de cristais e esporos a partir do caldo obtido em
fermentador piloto de 100 L de capacidade. Entre os três métodos de processamento, a ultra-
filtração de fluxo tangencial apresentou o valor máximo de biomassa, o número máximo de
esporos e o mais alto nível de atividade larvicida contra o Aedes aegypti, seguida por
centrifugação contínua e métodos de precipitação ácida.
Geralmente, o processo de fermentação dura aproximadamente 28-32 horas e termina
quando 80-90% das células foram lisadas, o que pode ser determinado por meio de exame
microscópico; neste ponto o processo de recuperação pode ser iniciado. Nas culturas de B.
thuringiensis, esporos e formação de cristais podem ser observados após 18 h. O ciclo
completo do tanque até o ponto da recuperação do ativo é tipicamente entre 62 e 92 h (Couch
2000). A Figura 4 demonstra as diferenças morfológicas observadas durante o cultivo.
Figura 4: Fase vegetativa e de esporulação de uma cultura de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-
73 em microscopia de contraste de fases. Células vegetativas são observadas nas fases iniciais (a) onde
aparecem escuras e baciliformes, formando cadeias. Quando os nutrientes já estão escassos, as células
sofrem esporulação (b). Durante esta fase, os esporos (setas brancas) e cristais de toxinas (setas pretas)
podem ser observados. Mais tardiamente, os esporos e cristais são liberados e podem ser observados no
meio (c) e (d). Fonte: Couch e Jurat-Fuentes 2014.
28
FORMULAÇÕES BIOINSETICIDAS
A formulação de um produto é um ponto crítico, pois exerce influência tanto na sua
produção, quanto em fatores econômicos como diminuição de custos de armazenamento, além
da efetividade em campo, prazo de validade e facilidade de manuseio e aplicação (Brar et al.
2006a). Contudo, existem poucos relatos na literatura científica sobre estudos de formulações
de micro-organismos entomopatógenos, principalmente porque as formulações já
desenvolvidas são mantidas em sigilo pelas empresas que as desenvolvem (Angelo et al.
2010, Finkler 2012).
Pode-se definir uma formulação como uma mistura de princípios ativos com
ingredientes inertes com a finalidade de promover o controle biológico de maneira
econômica. A formulação de agente de controle biológico tem como objetivo preservar as
características do micro-organismo, porém o custo do produto deve ser atrativo além de não
apresentar riscos ao aplicador, ao consumidor e ao meio ambiente (Spadaro e Gullino 2005).
Alguns desafios são encontrados no que se refere às formulações com bioinseticidas.
Por serem produtos com micro-organismos vivos, é necessário o máximo cuidado em todas as
etapas para manter a carga microbiana e viabilidade. Além disso, a tecnologia de produção
requer sofisticados equipamentos e métodos de controle para garantir produtos de qualidade
no mercado (Misha et al. 2015).
Muitas vezes, as formulações comerciais de sucesso para bioinseticidas são simples.
Devem se encaixar entre o sistema de produção microbiana e os requisitos para aplicação
final do produto. Facilidades de aplicação estão diretamente relacionadas com suas
características físicas, incluindo sua forma (líquida ou seca), a estabilidade de
armazenamento, capacidade de mistura com água para pulverização, além de compatibilidade
com outros agentes de misturas em tanques e método de aplicação (Behle e Birthisel 2014).
As formulações desenvolvidas devem ser compatíveis com as técnicas de aplicação e
com os equipamentos existentes. Em geral, a pulverização de inseticidas microbianos tem
sido realizada com equipamentos e tecnologia desenvolvidos para os inseticidas químicos.
Caso contrário, esses produtos encontrarão dificuldades para concorrer no mercado e terão sua
aceitação limitada (Couch e Jurat-Fuentes 2014).
Alguns fatores devem ser levados em consideração no processo de formulação com
agentes de biocontrole como as características químicas e físicas dos veículos utilizados, pois
o material deverá ser estéril. Além disso, a formulação deve promover, em condições de
campo, a liberação de quantidades homogêneas de células viáveis. Deve ser de fácil
29
aplicação, ecologicamente correta, não poluente e possibilitar um período de armazenamento
elevado (Bashan 1998).
Os componentes de uma formulação de bioinseticida são geralmente classificados em
três grupos: ingrediente ativo, transportador e adjuvante. O ativo é o micro-organismo em
questão. Os transportadores são componentes da formulação que servem como ingredientes
inertes utilizados para diluir o agente ativo com pouco ou nenhum benefício adicional.
Componentes adjuvantes compreendem uma ampla variedade de agentes que melhoram
características da formulação, tais como armazenamento (anti-aglomerante, umectantes),
homogeneidade (agentes dispersantes ou molhantes), aplicação (controle de viscosidade,
espalhamento), ou eficácia (proteção contra degradação por UV ou dessecação) do
bioinseticida. Esses componentes dos produtos biopesticidas são combinados para formar
formulações líquidas ou secas. No entanto, a escolha dos componentes é muitas vezes
limitada pelo alto custo de produção para muitos bioinseticidas em relação aos custos de
inseticidas químicos, o que pode limitar a margem financeira disponível para os custos de
formulação, levando a restrições para o desenvolvimento de bioinseticidas (Behle e Birthisel
2014).
Os tipos de formulações disponíveis comercialmente são suspensões concentradas,
emulsões concentradas, grânulos secos, grânulos e pós dispersíveis em água. As formulações
líquidas aquosas são as menos caras para produzir e formular (Couch e Jurat-Fuentes 2014).
Produtos comerciais à base de B. thuringiensis devem conter uma combinação de
esporos e cristais de toxinas que serão aplicados sobre as folhas ou outros ambientes onde as
larvas dos insetos se alimentam (Senthil-Nathan 2015).
A biomassa de B. thuringiensis, após separada do caldo fermentado, é composta por
um complexo de componentes orgânicos, mais especificamente as protoxinas e os respectivos
esporos. As protoxinas, por serem proteínas, são mais sensíveis a alterações em suas
estruturas químicas e podem ser inativadas ao longo do tempo. Essa inativação pode ser
causada por contaminação microbiana, radiação ultravioleta, ação de enzimas proteolíticas,
sensibilidade às condições de temperatura, presença de compostos tóxicos, secagem não
controlada, umidade, etc. (Finkler 2012).
Ao se pensar em formulações à base de B. thuringiensis deve-se considerar a
influência externa de fatores como a ação da radiação ultravioleta, chuva, temperatura e
folhagem (Behle e Birthisel 2014; Brar et al. 2006a). Além disso, os componentes utilizados
na formulação, além de serem inócuos às larvas, devem envolver os cristais de protoxinas sem
30
aumentar o tamanho da partícula, caso contrário podem não ser digeridos pelo inseto (Finkler
2012).
O tempo de meia vida da toxina em aplicação foliar é de 1-2 dias em locais expostos
ao sol e 20 a 30 dias para locais em sombra, sendo a radiação UV-A e UV-B os principais
responsáveis pela inativação da toxina patogênica. Por essa razão, as pulverizações nas
lavouras devem ser realizadas após as 16 horas, devido à menor incidência dos raios
ultravioleta. O produto deve ser armazenado em locais frescos e secos e com pouca incidência
de luz para melhor conservação (Valicente 2009).
Como estratégias para proteger os micro-organismos da radiação UV, pode-se
acrescentar às formulações um filtro solar químico para absorção de energia de comprimento
de onda curto, como branqueadores ópticos, corantes químicos, e absorventes (protetores
solares) ou protetores solares físicos que refletem a energia tais como argilas e dióxido de
titânio (Behle e Birthisel 2014).
A chuva pode provocar a lavagem das folhas antes da ação efetiva das toxinas (Brar et
al. 2006a). Para minimizar esse efeito, podem ser adicionados agentes aderentes como
adjuvantes, misturados em tanque de aplicação de bioinseticidas, ou pode-se incluir um
agente de adesão na própria formulação. Estes agentes podem ser de origem natural (hidratos
de carbono, proteínas, ou outros polímeros) ou sintética (álcoois etoxilados fenoxi, polímero
de látex), e destinam-se a fixar o micro-organismo à superfície tratada (Behle e Birthisel
2014).
Além disso, a atividade inseticida de entomopatógenos pode ser ainda mais
comprometida por competir com micro-organismos presentes no ambiente. É provável que as
formulações encapsuladas protejam melhor os agentes microbiológicos, separando-os de
substâncias químicas prejudiciais e micro-organismos concorrentes. A degradação ambiental
após a aplicação encurta a atividade inseticida residual, exigindo mais freqüentes aplicações
para manter o controle de pragas (Behle e Birthisel 2014).
Para melhorar a eficiência em campo, deve ser considerado um parâmetro importante
na aplicação: a primeira pulverização deve ser realizada assim que forem observados os
primeiros sinais de ataque das pragas, normalmente entre 5 a 15 dias após a germinação,
variando conforme a região. Essa medida é fundamental, pois quanto menor estiver a lagarta,
mais eficiente será o controle com bioinseticidas (Valicente 2009).
O pH da formulação também deve ser um ponto de atenção embora a toxina seja
estável entre pH 3 e 11 (Brar et al. 2006a). B. thuringiensis produz proteases alcalinas que
afetam a esporulação e entomotoxicidade. As proteases produzidas por B. thuringiensis
31
kurstaki têm sua atividade ótima em pH 6,5-7,5 (Brar et al. 2007) e podem degradar a toxina
de interesse em fragmentos menores de polipeptídeo que não possuem atividade inseticida
(Yezza et al. 2006).
Em uma pesquisa de Brar et al. (2007), formulações de diferentes meios com pH 7,0 ±
0,1, quando estocadas a -20°C durante 1 mês, não mostraram nenhuma alteração na
entomotoxicidade. No entanto, formulações de Bt com pH 7,0 ± 0,1 após 1 mês de
armazenamento a 20°C resultaram em declínio de 20-25% na atividade entomotóxica, que
pode ser devido à ação de proteases extracelulares ativas neste pH. Por outro lado, uma
formulação de Bt com pH 4,0 ± 0,1 foi armazenada a 20°C durante 1 ano, não havendo
alteração na entomotoxicidade.
Brar et al. (2005) fizeram o acompanhamento de uma formulação líquida à base de B.
thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, durante 1 ano através de diversos parâmetros físicos e
biológicos, entre eles pH e temperatura. Foram testadas diferentes faixas de pH (4,0, 4,5, 5,0,
6,0 e 6,5) e temperaturas (4ºC, 10ºC, 20ºC, 30ºC, 40ºC e 50°C) e verificou-se deterioração
maior em pH entre 6 e 6,5 e em temperatura de 40ºC e 50°C, onde também houve diminuição
da viscosidade da formulação.
O ponto isoelétrico das bactérias situa-se entre pH 2 e 4. Então, em valores alcalinos
de pH, as superfícies das partículas em suspensão ficam carregadas negativamente,
consequentemente causando repulsão entre elas. Ainda, o pH mais ácido em formulações,
além de inibir a atividade das proteases alcalinas, garante menos problemas com
contaminações (Brar et al. 2005).
Para centrifugação do caldo fermentado, Brar et al. (2005) primeiramente reduziram a
temperatura do caldo fermentado de 30°C para 20°C, e através de bomba peristáltica,
adicionaram assepticamente uma mistura esterilizada de H2SO4 4M e NaH2PO4 4M na
proporção de 1:1 para baixar o pH de 7,0 para 4,5 ± 0,1. Após centrifugação asséptica a 20°C,
obteve-se concentração de sólidos de aproximadamente 7 a 10% (m/v) que foram
posteriormente diluídos com sobrenadante e aditivos.
Em outro estudo de Brar et al. (2006b), a temperatura de 20°C e o pH 4 foram
encontrados como ideais para sedimentação a partir do caldo bacteriano. Os autores
justificaram tal fato devido à neutralização das cargas negativas na superfície da proteína
nesse pH, favorecendo a sedimentação.
Vu et al. (2012), para testar a entomotoxicidade de Btk em seis diferentes meios,
concentraram o caldo bacteriano dez vezes. No final da fermentação, após ajuste do pH para
32
4,5, as amostras foram centrifugadas e o sedimento ressuspenso nos respectivos sobrenadantes
para obter uma suspensão de um décimo do volume de cada cultura original.
Pesquisas de desenvolvimento de biopesticidas muitas vezes estão focadas em técnicas
de produção para maximizar o rendimento de produção. No entanto, reconhece-se que uma
formulação adequada é necessária para a estabilidade de armazenamento, facilidade de
aplicação e é um componente essencial para o desenvolvimento de produtos (Jackson et al.,
2010).
A manutenção da estabilidade de um bioinseticida, ou seja, a viabilidade do micro-
organismo e atividade de suas toxinas durante o armazenamento, é exigência principal para a
atividade subsequente após a aplicação, e certamente é mais difícil do que a manutenção da
estabilidade de um produto inseticida químico. A atividade inseticida da formulação deve ser
estável em condições normais de armazenamento encontrados em armazéns típicos.
Armazenamentos prolongados não devem ultrapassar 30°C, sendo que temperaturas entre
10ºC e 15°C são preferidas. Deverão ser evitadas temperaturas mais elevadas pois trarão
efeito adverso sobre a atividade da formulação e o seu desempenho no campo (Behle e
Birthisel 2014).
A formulação contribui favoravelmente para o consumo do produto quando se fornece
a conveniência esperada. Essa conveniência varia de acordo com mercado alvo. Normalmente
os agricultores operam sob os mais simples conceitos de aplicações de controles de pragas e
geralmente preferem produtos prontos para uso. O mercado requer produtos concentrados e
que misturem facilmente para aplicação através de equipamento de pulverização (Behle e
Birthisel 2014).
Recentemente, muitos estudos estão sendo realizados para aumentar a sobrevivência
dos micro-organismos, o tempo de prateleira dos produtos, além da eficiência e confiabilidade
em campo (Senthil-Nathan 2015).
Um fator importante envolvido na falta de sucesso de formulações tem sido o rápido
declínio na população de células ativas. Então, a manutenção da atividade das células por
período prolongado representa o principal obstáculo no sucesso da utilização de micro-
organismos como bioinseticidas (Arora et al. 2010).
Na formulação é essencial a preservação dos esporos no produto armazenado ou no
campo, pois levará ao prolongamento da persistência com multiplicação do patógeno nas
larvas infectadas. Embora não sejam obrigatoriamente necessários para a atividade larvicida,
os esporos participam secundariamente do ciclo entomopatógeno, pois quando há esporos,
esses germinam e se multiplicam nas larvas mortas. Desta forma os novos esporos e cristais
33
liberados infectam outros indivíduos, aumentando-se a atividade residual do produto (Alves et
al. 2001).
Propriedade Intelectual
Várias indústrias como Sandoz, Abbott e Monsanto produzem formulações
bioinseticidas à base de B. thuringiensis. A Tabela 1 relaciona alguns documentos de patentes
concedidas para produção de bioinseticidas.
Tabela 1. Algumas patentes relacionadas à produção de bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis.
N°. Documento Título Depositante Inventores Data
BR 102012001397-5 Método para produção de inseticidas
à base de B. thuringiensis (Bt).
Malaysian
Palm Oil
Board
MASRI,
M.M.M.;
WAHID, M.B.;
ARMAD, M.N.;
ALI, S.R.A.
2014
PI 0603879-4 Composição baseada em Bacillus
spp. e gêneros correlatos e seu uso no
controle de pragas.
Embrapa (BR,
DF)
MONNERAT,
R.G.; SOARES,
C.M.; BERRY,
C.
2008
PI 0417735-5 Composições proteicas e gênicas
inseticidas secretadas a partir de
Bacillus thuringiensis e seus usos.
Monsanto
Technology
(US)
DONOVAN,
J.C.;
DONOVAN,
W.P.;
ENGLEMAN,
J.T.; MALVAR,
T.; PITKIN,
J.W.
2007
PI 0307137-5 Formulações farmacêuticas de
bioinseticidas à base de Bacillus
thuringiensis e processos envolvidos
nas suas preparações.
Universidade
Estadual de
Londrina
ARANTES,
O.M.N.;
LOPES, J.
2005
PI 9611962-4 Produção de integrantes de Bacillus
thuringiensis.
Abbott
Laboratories
(US)
ADAMS, L.F.;
JORGENSEN,
P.L.; SLOMA,
A.P.;
JORGENSEN,
S.T.; THOMAS,
M.D.;
DIDERICHSEN
, B.K.;
WIDNER, W.R.
1999
PI 9502992-3 Processo de obtenção de formulações
flutuantes para esporos, cristais e
células de bactérias
entomopatogênicas.
Embrapa
(BR,DF)
MALDONADO,
G.G.;
MEDUGNO,
C.C.
1998
PI 9407067-9 Processo para a obtenção de um
integrante de Bacillus thuringiensis,
integrante de Bacillus thuringiensis
ou esporo do mesmo, composição
pesticida, processo para controlar
uma peste, construção de DNA e
Abbot
Laboratories
(US)
ADAMS, L.F.;
THOMAS,
M.D.; SLOMA,
A.P.; WIDNER,
W.R.
1996
34
vetor DNA recombinante.
PI 9006419 A Células de Bacillus thuringiensis
kurstaki HD 562, composição
inseticida, processo para a
transformação de células hospedeiras
de Bacillus thuringiensis, células de
Bacillus thuringiensis tenebrionis e
células de Bacillus thuringiensis
aizawai.
Sandoz JELLIS, C.L.;
BEERMAN,
N.D.; PLOT,
J.C.
1991
PI 8900938 Processo de obtenção de linhagens de
bactérias amilolíticas e proteolíticas
do gênero Bacillus que encerram
atividade específica letal para
algumas ordens de insetos;
composição de meios de cultura para
semeadura das ditas linhagens de
bactérias; processo de obtenção da
biomassa ativa de Bacillus
entomopatogênicos; composição para
cultivo bacteriano destinado à
produção da dita biomassa ativa e
composição bioinseticida à base de
bactérias amilolíticas e proteolíticas
do gênero Bacillus.
Fundação
Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ)
RABINOVITC
H, L.; SILVA,
M.H.L.;
GUAYCURUS,
T.V.; CASTRO,
V.R.M.
1990
PI 8806519 Processo para encapsular um material
biológico, composição e processo
para aplicar um material biológico à
superfície da folha de plantas.
Monsanto
Company
(US)
BAKER, C.A.;
BROOKS, A.A.;
GREENLEY,
R.Z.; HENIS,
J.M.S.
1989
PI 8605301 Células de Bacillus thuringiensis,
células bacterianas híbridas, processo
para sua preparação, composições
inseticidas e métodos para combater
insetos.
Sandoz KARAMATA,
D.; PLOT, J.C.
1987
O documento de patente PI 8900938 depositada pela Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ) (Rabinovitch et al. 1990) descreve uma composição bioinseticida utilizando
componentes que conferem à formulação a consistência de pasta. Esse produto pode decantar
facilmente ou ter dificuldades de espalhamento devido a essa característica.
A patente US 4797279 ou PI 8605301 (Karamata e Piot 1987), depositada por Sandoz,
trata de processos para fabricação de suspensão concentrada e uma formulação em pó
molhável, utilizando matérias primas alternativas como farinha de peixe, farinha de semente
de algodão, infusão de milho, que pode acarretar na formação de sólidos insolúveis na
formulação. Da mesma forma, a patente BR 10 2012 001397-5 de Malaysian Palm Oil Board
(Masri et al. 2014) relata a utilização de componentes como produtos e resíduos agrícolas na
formulação.
O documento EP 0320483B1 ou PI 8806519 depositado pela Monsanto (Baker et al.
1989) descreve processo para encapsulação de agentes biológicos do gênero Bacillus em
35
microestruturas poliméricas na tentativa de proteger os micro-organismos de agentes externos.
No entanto, esse processo é mais oneroso e ocorre perda de biomassa durante sua realização.
CONCLUSÃO
Apesar das inúmeras vantagens da utilização de B. thuringiensis para controle
biológico de insetos, ainda existem limitações ao seu uso que vão além do alto custo de
produção e concorrência com produtos químicos. É evidente a falta de investimento dos
setores público e privado no desenvolvimento de formulações deste tipo. Além disso, existem
poucos estudos publicados sobre formulações e acompanhamento de bioinseticidas, pois a
maioria das empresas que investem nessas pesquisas as mantêm sob sigilo industrial. Diante
disso, conclui-se que devem ser incrementados os estudos para desenvolvimento de
bioprocessos que compreendam a produção em escala industrial desses bioinseticidas bem
como sua estabilização e conservação, de maneira a torná-los economicamente competitivos e
tão eficientes quanto os inseticidas químicos utilizados em campo.
REFERÊNCIAS
Abdel-Hameed, A. A stirred tank culture of Bacillus thuringiensis H-14 for production of the mosquitocidal δ-
endotoxin: mathematical modelling and scalling-up studies. World J Microbiol Biotechnol. 2001; 17 (9): 857-
86.
Adams LF, Jorgensen PL, Sloma AP, Jorgensen ST, Thomas MD, Diderichsen BK, Widner WR. Abbot
Laboratories (US). Produção de integrantes de Bacillus thuringiensi. PI 9611962-4, 17 fev, 1999.
Adams LF, Thomas MD, Sloma AP, Winder WR. Abbot Laboratories (US) Processo para a obtenção de um
integrante de Bacillus thuringiensis, integrante de Bacillus thuringiensis ou esporo do mesmo, composição
pesticida, processo para controlar uma peste, construção de DNA e vetor DNA recombinante. PI 9407067-9,
13 ago, 1996.
Alavanja MC. Pesticides use and exposure extensive worldwide. Rev Environ Health. 2009; 24:303-309.
Alves LFA, Alves BA, Lopes RBL, Augusto NT. Estabilidade de uma formulação de Bacillus sphaericus
armazenada sob diferentes temperaturas. Scientia Agricola. 2001; 58 (1): 21-26.
Angelo EA, Vilas-Bôas GT, Castro-Gómes RJH. Bacillus thuringiensis: características gerais e fermentação.
Semin, Cienc Agrar. 2010; 31 (4): 945-958.
Arantes OMN, Lopes J. Universidade Estadual de Londrina (BR, PR). Formulações farmacêuticas de
bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis e processos envolvidos nas suas preparações. PI 0307137-5, 08
mar, 2005.
Arora NK, Khare E, Maheshwari DK. Plant growth promoting rhizobacteria: constraints in bioformulation,
commercialization, and future strategies. In: Maheshwari DK (ed) Plant growth and health promoting bacteria.
Berlin: Springer; 2010. p. 97–116.
Baker CA, Brooks AA, Greenley RZ, Henis JMS. Monsanto Company (US). Encapsulation method. EP
0320483B1, Jun. 14th, 1989 or BR n. PI 8806519-7 A2, Aug. 22nd, 1989.
Bashan Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture. Biotech Adv. 1998; 16 (4): 729-
770.
Behle R, Birthisel T. Formulations of Entomopathogens as Bioinsecticides. In: Morales-Ramos JA, Rojas MG,
Shapiro-Ilan DI (Ed). Mass Production of Beneficial Organisms – Invertebrates and Entomopathogens. San
Diego, Academic Press; 2014. p. 483-517.
Benoit TG, Wilson GR, Baugh CL. Fermentation During Growth and Sporulation of Bacillus thuringiensis HD-
1. Lett. Appl. Microbiol. 1990; 10:15-18.
36
Boyetchko S, Pedersen E, Punja Z, Reddy M. Fomulations of biopesticides. In: Hall FR, Menn JJ (Eds.).
Biopesticides: Uses and Delivery. Totowa, NJ: Humana Press; 1999. p. 487–508.
Bizzarri MF, Bishop AH. The ecology of Bacillus thuringiensis on the Phylloplane: colonization from soil,
plasmid transfer, and interaction with larvae of Pieris brassicae. Microb. Ecol. 2008; 56: 133-139.
Brobowski VL, Fiuza LM, Pasquali G, Bodanese-Zanettini MH. Bacillus thuringiensis genes: an approach to
confer insect resistence to plants. Cienc. Rural. 2003; 33(1): 843-850.
Brar SK., Verma M, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY. Biopesticides – Bacillus thuringiensis. In:
Sustainable Sludge Management. New Youk; 2009. p.168-202. doi: 10.1061/9780784410516.ch08 Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Surampalli RY, Barnabé S, Valéro JR. Bacillus thuringiensis proteases:
Production and role in growth, sporulation and synergism. Process Biochem. 2007; 42:773-790.
Brar SK., Verma M, Tyagi RD, Valéro JR. Recent advances in downstream processing and formulations of
Bacilluss thuringiensis based biopesticides. Process Biochem. 2006a; 41: 323-342.
Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Valero JR, Surampalli RY.. Efficient centrifugal recovery of Bacillus
thuringiensis biopesticides from fermented wastewater and wastewater sludge. Water Research. 2006b; 40 (6):
1310–1320.
Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Valero JR, Surampalli RY. Starch industry wastewater based stable Bacillus
thuringiensis liquid formulations. J Econ Entomol. 2005; 98(6): 1890–1898.
Bravo A, Gillb SS, Soberón M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential
for insect control. Toxicon. 2007; 49 (4): 423-435.
Bravo A, Likitvivatanavong S, Gills SS, Soberón M. Bacillus thuringiensis: A story of a successful
bioinsecticide. Insect Biochem Mol Biol. 2011; 30: 1-9.
Chandler D, Bailey AS, Tatchell GM, Davidson G, Greaves J, Grant WP. The development, regulation and use
of biopesticides for integrated pest management. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2011; 366: 1987-
1998.
Copping LG, Menn JJ. Review biopesticides: a review of their action, application and efficacy. Pest Manag Sci.
2000; 56 (5): 651-676.
Contreras E, Benito-Jardón M, López-Galiano MJ, Real MD, Rausell C. Tribolium castaneum immune defense
genes are differentially expressed in response to Bacillus thuringiensis toxins sharing common receptor
molecules and exhibiting disparate toxicity. Developmental & Comparative Immunology. 2015; 50 (2): 139-
145.
Couch TL. Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic bacteria. In: Charles JF (Org.).
Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field applications. New York: Kluwer Academic Publisnes;
2000. p. 297-316.
Couch TL, Jurat-Fuentes JL. Commercial Production of Entomopathogenic Bacteria. In: Morales-Ramos JA,
Rojas MG, Shapiro-Ilan DI (Ed). Mass Production of Beneficial Organisms – Invertebrates and
Entomopathogens. San Diego, Academic Press; 2014. p. 415-435.
Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH. Revision of the
nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev. 1998; 62:.807-
813.
Crickmore N, Baum J, Bravo A, Lereclus D, Narva K, Sampson K, Schnepf E, Sun M, Zeigler DR. Bacillus
thuringiensis toxin nomenclature, 2014. Available from:
http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.
Donovan JC, Donovan WP, Engleman JT, Malvar T, Pitkin JW. Monsanto Technology (US). Composições
protéicas e gênicas inseticidas secretadas a partir de Bacillus thuringiensis e seus usos. PI 0417735-5, 03 abril,
2007.
Dulmage HT. Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus thuringiensis var. alesti. J Invertebr Pathol.
1970, 15: 232-239.
Federici BA. Bacillus thuringiensis in Biological Control. In: Bellows TS and Fisher TW (eds). Handbook of
Biological Control. San Diego, Califórnia: Academic Press; 1999. p.575-593.
Finkler CLL, Controle de insetos: Uma breve revisão. An Acad Pernamb Ciên Agron. 2011/2012; 8 e 9: 169-
189.
Ghribi D, Zouari N, Trigui W, Jaoua S. Use of sea water as salts source in starch- and soya bean-based media,
for the production of Bacillus thuringiensis bioinsecticides. Process Biochem. 2007; 42: 374-378.
Glare TR, O’Callagham M. Bacillus thuringiensis, biology, ecology and safety. Chichester: John Wiley and
Sons; 2000.
Içgen Y, Içgen B, Özcengiz G. Regulation of crystal protein biosynthesis by Bacillus thutingiensis: II effects of
carbon and nitrogen sources. Res Microbiol. 2002; 153 (9): 605-609.
IPCS INCHEM [homepage on the internet]. International Programme on Chemical Safety, Word Health
Organization; [accessed in 15/12/2014]. Environmental Health Criteria 217. Bacillus thuringiensis. Available
from: http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc217.htm.
37
Jackson MA, Dunlap CA, Jaronski ST. Ecological considerations in producing and formulating fungal
entomopathogens for use in insect biocontrol. BioControl 2010; 55: 129– 145.
Jellis CL, Beerman ND, Plot JC. Sandoz. Células de Bacillus thuringiensis kurstaki HD 562, composição
inseticida, processo para a transformação de células hospedeiras de Bacillus thuringiensis, células de Bacillus
thuringiensis tenebrionis e células de Bacillus thuringiensis aizawai. PI 9006419 A, 24 set, 1991.
Jing-Wen Z, Ya- Fei C, Zheng-Hong X, Zi-Niu Y, Shou-Wen C. Production of thuringiensin by fed-batch
culture of Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis 032 with an improved pH-control glucose feeding
strategy. Process Biochem 2007; 42: 52–56.
Jurat-Fuentes JL, Jackson TA. Bacterial entomopathogens. In: Vega FE, Kaya HK (Eds.). Insect Pathology
second ed. San Diego: Academic Press, 2012. p. 265–349.
Karamata D, Piot J-C. Sandoz AG (UK). Insecticidal hybrid bacteria from B. t. kurstaki and B. t. tenebrionis. US
4797279, Jan. 10th, 1989 or BR n. PI 8605301-9, Jul. 28th, 1987.
Lambert B, Peferoen M. Insecticidal promise of bacillus thuringiensis. Bioscience. 1992; 42 (2): 112-122.
Maldonado-Blanco MG, Romero GS, Galán-Wong LJ. The effect of oxygen tension on the production of
Bacillus thuringiensis subsp israelensis toxin active agains Aedes aegypti larvae. World j Microbiol
Biotechnol. 2003; 19 (7): 671-674.
Maldonado GG, Medugno, CC. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA, BR, DF). Processo
de obtenção de formulações flutuantes para esporos, cristais e células de bactérias entomopatogênicas. PI
9502992-3, 03 nov, 1998.
Masri MMM, Wahid MB, Ahmad MN, Ali SRA. Malaysian Palm Oil Board (Malaysia). Metodo para obtenção
de inseticida a base de B. thuringiensis [Method for the obtaining of B. thuringiensis based insecticide]. BR n.
PI 102012 001397-5 A2, Jan. 21st, 2014 or MY PI 2011000307, Jan. 21st, 2011.
Mignone CF, Avignone-Rossa C. Analysis of Glucose Fluxes in Continous Cultures of Bacillus thuringiensis.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996; 46 (1): 78-84.
Mishra J, Tewari S, Singh S, Arora NK. Biopesticides: Where we stand? In: Arora NK. Plant Microbes
Symbiosis: Applied facets. India: Springer; 2015. p. 37-75.
Monnerat RG, Bravo A. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria Bacillus thuringiensis: modo de ação e
resistência. In: Melo IS, Azevedo JL. Controle Biológico. Jaguariúna, SP, Embrapa meio ambiente; v. 3, 2000.
p.163-200.
Monnerat RG, Soares CM, Berry C. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA, BR, DF).
Composição baseada em Bacillus spp. e gêneros correlatos e seu uso no controle de pragas. PI 0603879-4, 08
abril, 2008.
Mounsef JR, Salameh D, Louka N, Brandam C, Lteif R. The effect of aeration conditions, characterized by the
volumetric mass transfer coefficient KLa, on the fermentation kinetics of Bacillus thuringiensis kurstaki.
Journal of Biotechnology. 2015. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.06.387
Moreira GA, Micheloud GA, Beccaria AJ, Goicoechea HC. Optimization of the Bacillus thuringiensis var.
kurstaki HD-1 -endotoxins production by using experimental mixture design and artificial neural networks.
Biochemical Engineering Journal. 2007; 35: 48-55.
Obeta JAM, Okafor N. Medium for the Production of primary Power of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.
Appl. Environm. Microbiol. 1984; 47: 863-867.
Özkan M, Dilek FB, Yetis U, Ozcengiz G. Nutritional and Cultural parameters influencing antidipteran delta-
endotoxin production. Res. Microbiol. 2003; 154: 49-53.
Ozcan O, Icgen B, Ozcengiz G. Pretreatment of poultry litter improves Bacillus thuringiensis-based
biopesticides production. Bioresource Technology. 2010; 101: 2401-2404.
Prabakaran G, Hoti SL. Application of different downstream processing methods and their comparison for the
large-scale preparation of Bacillus thuringiensis var. israelensis after fermentation for mosquito control.
Biologicals. 2008; 36 (6): 412-415.
Pérez-García A, Romero D, Vicente A. Plant protection and growth stimulation by microorganisms:
biotechnological applications of Bacilli in agriculture. Current Opinion in Biotechnol. 2011; 22 (2): 187-193.
Polanczyk R, Alves S. Bacillus thuringiensis: Uma breve revisão. Agrociência. 2003; Vll (2): 1-10.
Praça LB, Batista AC, Martins ES, Siqueira CB, Dias DGS, Gomes ACMM, Falcão R, Monnerat RG.
Prospecção de estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepidóptera, coleóptera e
díptera. Boletim de pesquisa e Desenvolvimento, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 2003; 36p.
Praça LB, Morinaga C, Medeiros PT, Melatti VM, Martins ES, Dumas VF, Falcão R, Monnerat RG. Isolamento
e caracterização de estirpes de Bacillus thuringiensis coletadas em solos do oeste baiano. Universitas:
Ciências da Saúde. 2009; 7 (2): 1-18, 2009.
Rabinovitch L, Silva MHL, Guaycurucus TV, Castro VRM. Fundacao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ (Brasil).
Processo de obtencao de linhagens de bacterias amiloliticas e proteoliticas do genero Bacillus que encerram
atividade especifica letal para algumas ordens de insetos; composicao do meio de cultivo para semeadura das
ditas linhagens de bacterias; processo de obtencao da biomassa ativa de Bacillus entomopatogenicos;
38
composicao para cultivo bacteriano destinado a producao da dita biomassa ativa e composicao bioinseticida a
base de bactérias amiloliticas e proteoliticas do genero Bacillus. [Process for obtaining amylolytic and
proteolytic strains of the genus Bacillus with specific lethal activity against some insect orders; composition of
the culture medium for the cultivation of these bacterial strains; process for obtaining active enthomopatogenic
Bacillus biomass;composition for bacterial culture destined to the production of this active biomass and
bioinsecticidal composition based on amylolytic and proteolytic bacteria of the genus Bacillus.] BR n. PI
8900938-0, 09 out., 1990.
Raymond B, Johnston PR, Nielsen-Leroux C, Lereclus D, Crickmore N. Bacillus thuringiensis: an impotent
pathogen? Cell press [internet] 2010; 18 (5): 189-194. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20338765.
Rogoff M, Yousten AA. Bacillus thuringiensis: Microbiological Considerations. Ann. Rev. Microbiol. 1969; 23:
357-386.
Saksinchai S, Suphantharika M, Verduyn C. Application of a simple yeast extract from spent brewer’s yeast for
growth and sporulation of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki: a physiological study. World J Microbiol
Biotechnol. 2001; 17: 307-316.
Sauka DH, Benintende GB. Bacillus thuringiensis: generalidades: Un acercamiento a su empleo en el biocontrol
de insectos lepidópteros que son plagas agrícolas. Rev. Argent. Microbiol. 2008; 40 (2): 124-140.
Senthil-Nathan S. A review of biopesticides and their mode of action against insect pest. In: Thangavel P,
Sridevi G. Environmental Sustainability. India: Springer; 2015. p. 49-63.
Smitha RB, Jisha VN, Pradeep S, Josh MS, Benjamin S. Potato flour mediated solid-state fermentation for the
enhanced production of Bacillus thuringiensis. J. Biosci. Bioeng. 2013. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.05.008
Spadaro D, Gullino M.L. Improving the efficacy of biocontrol agents against soil borne pathogens. Crop Prot.
2005; 24: 601-613.
Tamez-Guerra P, Galán-Wong LJ, Medrado-Roldán H, García-Gutiérrez C, Rodríguez-Padilla C, Gómez-Flores
RA, Tamez-Guerra RS. Bioinsecticidas: su empleo, producción y comercialización em México. Ciência
UANL. 2001; 4 (2): 143-152.
Valicente FH. Controle biológico de pragas com entomopatógenos. Inf Agropecu. 2009; 30 (251): 48-55.
Velivelli SLS, De Vos P, Kromann P, Declerck S, Prestwich BD. Biological control agentes: from field to
market, problems, and challenges. Trends in Biotechnology. 2014; 32 (10): 493-496.
Vimala Devi PS, Ravinder T, Jaidev C. Barley-based médium for the cost-effective production of Bacillus
thuringiensis. World J. Microbiol. Biotechnol. 2005; 21: 173-178.
Vu KD, Tyagi RD, Surampalli RY, Valéro JR. Mathematical relationships between spore concentrations, delta-
endotoxin levels, and entomotoxicity of Bacillus thuringiensis preparations produced in different fermentation
media. Bioresource Technology. 2012; 123: 303–311.
Whiteley HR, Schnepf HE. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus
thuringiensis. Annu rev microbiol. 1986; 40: 549-576.
Xue JL, Cai QX, Zheng DS, Yuan ZM. The synergistic activity between Cry 1Aa and Cry 1C from Bacillus
thuringiensis against Spodoptera exigua and Helicoverpa armigera. Lett Appl Microbiol. 2005; 40: 460-465.
Yezza A, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY. Production of Bacillus thuringiensis-based biopesticides in
batch and fed batch cultures using wastewater sludge as a raw material. J Chem Technol Biotechnol 2005;
80:502–510. DOI: 10.1002/jctb.1204
Yezza A, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY. Correlation between entomotoxicity potency and protease
activity produced by Bacillus thuringiensis var. kurstaki grown in wastewater sludge. Process Biochem. 2006;
41:794-800.
39
CAPÍTULO 2
Cultivo de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 para produção de bioinseticida
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo estudar o cultivo de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
HD-1 para produção de bioinseticida. Foi avaliada inicialmente a influência da composição do
meio de cultivo no crescimento e esporulação. A modificação da fonte de nitrogênio,
acrescentando-se peptona ao extrato de levedura do meio original, não apresentou efeito
significativo. Já a modificação da fonte de carbono de glicose para sacarose resultou em
esporulação significativamente maior em frascos agitados (4,83.108 UFC/mL). Para a
fermentação em garrafões de 5 L comparando glicose e sacarose, não houve diferença entre as
concentrações máximas de esporos obtidas nos dois meios, entre 2.107 e 3.107 UFC/mL após
34 h, no entanto, não houve consumo da sacarose pelo micro-organismo. Em biorreator de
bancada (7,5 L) em batelada utilizando-se glicose como fonte de carbono, o pico de
esporulação ocorreu em 30 h (4,83.1010 UFC/mL). Já em batelada alimentada com glicose,
utilizando-se o mesmo meio, obteve-se valor máximo de esporulação após 72 h de cultivo
(4,44.1012 UFC/mL). Em ambos os cultivos, foi observada em gel de eletroforese a presença
de proteínas com peso molecular estimado em 70 kDa e 130 kDa, característicos das toxinas
bioinseticidas de interesse, visualmente em maior concentração nas amostras da batelada
alimentada. Foi proposta uma formulação para o caldo concentrado de Bt produzido em
batelada e batelada alimentada, a qual foi testada por meio de bioensaios com a lepidóptera
Spodoptera frugiperda para verificação da concentração letal (CL50). A CL50 da formulação
produzida em batelada foi 635.121 esporos/mL e a da formulação em batelada alimentada foi
10.994 esporos/mL.
Palavras-chave: Bioinseticida, cinética de crescimento, esporulação, batelada alimentada,
formulação, bioensaio.
40
ABSTRACT
This work aimed at studying the cultivation of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 for
biopesicide production. Initially the influence of the culture medium composition on the
growth and sporulation was evaluated. The modification in the nitrogen source, adding
peptone to the yeast exteract present in the original medium, did not present significant effect.
However the modification in the carbon source, from glucose to sucrose, resulted in
significantly higher sporulation in agitated flasks (4.83.108 UFC/mL). For the cultivation in
5 L bottles comparing glucose and sucrose, there was no difference between the maximum
concentrations of spores obtained in both media, between 2.107 and 3.107 UFC/mL after 34 h,
however, no consumption of sucrose by the microorganism was verified. In a bench-scale
bioreactor (7.5 L) in batch mode using glucose as carbon source, the sporulation peak occured
at 30 h (4.83.1010 UFC/mL). In fed-batch mode with glucose, using the same medium, the
maximum value of sporulation was obtained after 72 h of cultivation (4.44.1012 UFC/mL).
The presence of proteins with estimated molecular weights of 70 kDa and 130 kDa,
characteristic of the toxins of interest, was observed in electrophoresis gel, visually in higher
concentration in the samples of the fed-batch process. A formulation was proposed for the
concentrated broth of Bt produced in batch and fed-batch which was tested by bioassay with
the lepidoptera Spodoptera frugiperda in order to verify the lethal concentration (LC50). The
LC50 of the batch formulation was 635.121 spores/ mL and the one of the fed-batch was
10.994 spores/mL.
Keywords: Biopesticide, growth kinetics, sporulation, fed-batch, formulation, bioassay.
41
INTRODUÇÃO
Mesmo com o uso de alta tecnologia na agricultura, grandes são as perdas devidas ao
ataque de pragas. Em todo o mundo, anualmente as pragas na agricultura consomem a
quantidade de alimentos estimada para alimentar um bilhão de pessoas [4].
Existem alguns insetos que atacam culturas de grande importância, que muitas vezes
podem inviabilizar o cultivo por serem pragas chaves na agricultura. Alguns exemplos são
Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidade) em algodão, Anticarsia gemmatalis
(Lepidoptera: Noctuidae) na soja, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) em brássicas e
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) atacando principalmente o milho [28].
Bioinseticidas, componentes essenciais dos Programas de Manejo Integrado de Pragas,
estão recebendo especial atenção como um meio para redução da quantidade de agroquímicos
no controle de pragas e doenças na agricultura [22].
O organismo entomopatogênico Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva
formadora de esporos que produz proteínas cristalinas denominadas -endotoxinas ou
proteínas Cry, liberadas ao meio após lise da parede celular no final da esporulação. Essas
endotoxinas são capazes de causar a morte no inseto hospedeiro dentro de 48 horas após a
ingestão [17].
As características bioquímicas e morfológicas de B. thuringiensis, como a capacidade
de esporulação quando as condições do meio já se encontram desfavoráveis, justificam o fato
de a fermentação submersa descontínua, também conhecida como processo em batelada, ser a
mais utilizada para tal cultivo [3].
A temperatura ideal de cultivo é em torno de 30 ± 2°C [12]. Com relação ao pH,
recomenda-se que seja monitorado e mantido próximo à neutralidade pois há evidências de
baixa toxicidade da proteína inseticida atribuídas a condições não controladas de pH [5].
Devido ao grande consumo de oxigênio durante o cultivo, o controle deste parâmetro é
muito importante e sua concentração dissolvida no meio não deve ser inferior a 20%, pois se
sabe que a quantidade de oxigênio dissolvido exerce grande impacto na biossíntese das
proteínas Cry [10] e também na produção de biomassa.
A biomassa de B. thuringiensis, após separada do caldo fermentado por método
apropriado, é composta por um complexo de componentes orgânicos, mais especificamente as
protoxinas e os respectivos esporos. A pasta de fermentação concentrada é a base para estas
formulações. Essa pasta é normalmente estabilizada utilizando agente bacteriostático e
fungistático apropriado para evitar a fermentação secundária [11].
42
Métodos avançados como cromatografia líquida de alta performance ou mesmo
eletroforese são freqüentemente empregadas para medir a potência da formulação em termos
de presença da toxina. No entanto, estes métodos fornecem, muitas vezes, um resultado
positivo para a presença da proteína inseticida, mesmo que tenha sido desnaturada e já não
possua atividade. Esta é a principal razão pela qual produtos bioinseticidas atuais utilizam
técnicas de bioensaios em insetos [11]. De acordo com Vu et al. [35], o bioensaio não pode
ser dispensado mesmo diante de um bom resultado de esporulação, porque além da
composição do meio de cultivo poder influenciar na toxicidade da proteína produzida, deve
ser levada em consideração a ação de outros compostos solúveis produzidos por Btk como
proteínas Vip e quitinases que podem ter papel sobre a entomotoxicidade global.
O presente trabalho teve como objetivo estudar o cultivo de B. thuringiensis em meio
que viabilize o processo industrial, favorecendo a produção de esporos e δ-endotoxinas. Para
tanto, foram avaliadas modificações na fonte de carbono e nitrogênio do meio de cultura
GYS, bem como as cinéticas de crescimento e esporulação em batelada e batelada alimentada
com glicose como fonte de carbono. Além disso, foi evidenciada e caracterizada a síntese das
toxinas bioinseticidas através de eletroforese e uma formulação líquida concentrada foi
proposta e avaliada por meio de bioensaios, partindo-se de caldo bacteriano produzido nos
dois processos de cultivo.
MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismo
Utilizou-se a estirpe B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, originária do Banco de
Bactérias Entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF,
Brasil).
Preparo da cultura estoque
As culturas estoque foram obtidas por semeadura por estria simples em superfície de
Ágar Nutriente em tubos inclinados, incubados a 30 ± 2ºC por 24 h. Os tubos foram
armazenados em geladeira a aproximadamente 4°C.
43
Meios de cultura
Para manutenção da cultura e contagem do número de esporos, foi utilizado o meio
Ágar Nutriente cuja composição (g/L) é: extrato de carne 3,0; peptona de carne 5,0; ágar-ágar
18,0.
Para reativação, preparo do inóculo e fermentação, foi utilizado o meio GYS [31].
Neste trabalho, está sendo proposta uma modificação na fonte de carbono do meio referência,
trocando-se a glicose por sacarose, buscando-se uma alternativa mais econômica
industrialmente e por facilidade no processo, uma vez que com o uso de sacarose minimiza-se
a reação de Maillard observada na presença de glicose, não havendo a necessidade de
esterilizá-la separadamente. Também foram comparados os resultados obtidos com a
modificação da fonte de nitrogênio. A composição dos meios avaliados está descrita na
Tabela 1.
A esterilização dos meios foi realizada em autoclave a 121°C por 20 minutos. Para os
meios contendo glicose na composição, esta foi esterilizada separadamente, nas mesmas
condições.
Tabela 1 Composição em g/L dos meios de cultura comparados
Componente Meio GYS Modificação Fonte N Modificação Fonte C
Glicose 20 20 -
Sacarose - - 20
Extrato de levedura 12 5 12
Peptona - 5 -
(NH4)2SO4 3 3 3
CaCl2.2H2O 0,12 0,12 0,12
MgSO4.7H2O 1,5 1,5 1,5
MnSO4.H2O 0,09 0,09 0,09
K2HPO4 1,5 1,5 1,5
KH2PO4 1,5 1,5 1,5
44
Preparo do inóculo
Para reativação do micro-organismo (pré-inóculo), alíquotas da cultura estoque foram
transferidas para frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio GYS, os quais foram
incubados sob agitação (agitador de frascos Ethiktechnology mod. 109-3) a 145 rpm, a 30 ±
2ºC por 24 h. Os inóculos para cultivo em garrafões (5 L) e reator de bancada (7,5 L) foram
preparados em Erlenmeyer de 1 L contendo 450 mL de meio GYS, no qual foram
acrescentados 50 mL de pré-inóculo preparado conforme descrição anterior. Os frascos foram
vedados com tampão de algodão envolvido por camada de gaze e incubados sob agitação a
145 rpm, a 30 ± 2ºC por 24 h.
Comparação dos meios de cultura modificados em frascos agitados
Frascos Erlenmeyer de 250 mL de capacidade, contendo 50 mL dos meios de cultura,
foram inoculados com 5 mL de inóculo. Os frascos foram vedados com tampão de algodão
envolvido por camada de gaze e incubados sob agitação a 145 rpm, a 30 ± 2ºC por 72 h. Após
esse período, foram realizadas análises comparativas através da contagem de células e esporos
viáveis e aferição de pH para cada um dos meios. Além disso, foi realizada avaliação de
características morfológicas e esporulação através de microscopia com contraste de fases. Os
frascos contendo cada um dos diferentes meios foram inoculados em duplicata e as contagens
foram realizadas em triplicata.
Cinética de crescimento em garrafões de fermentação
Os garrafões de fermentação da marca Nalgene com capacidade para 10 L foram
preparados e esterilizados com 4,5 L de meio cada um e posteriormente inoculados com
500 mL de inóculo com 24 h de incubação. Foram incubados sob aeração (aproximadamente
2,5 vvm), a 30 ± 2°C por 72 h em meio GYS e no meio com sacarose. Foram realizadas
coletas de amostras imediatamente após a inoculação e após 5 h, 10 h, 24 h, 34 h, 48 h, 58 h e
72 h.
Foram feitas análises comparativas entre os dois meios através de contagem de células
viáveis, contagem de esporos viáveis, aferição do pH e dosagem de açúcar redutor para
verificação do consumo de açúcar pelo micro-organismo.
45
Batelada em biorreator de bancada
Com a finalidade de obter maior controle e padronização de parâmetros, realizou-se o
cultivo laboratorial em biorreator da marca Tecnal (Tec-Bio 7,5) com 7,5 L de capacidade
total. Foram preparados 4,5 L do meio GYS, que foi inoculado com 500 mL de inóculo com
24 h de incubação, obtendo-se assim um volume total de 5 L de caldo bacteriano.
O cultivo foi realizado a 30 ± 2°C [3, 12] durante 72 h. A taxa de aeração e agitação
foram controladas de maneira a manter 26% de oxigênio dissolvido durante o processo [3,
20].
O pH foi controlado e mantido em 6,5 durante a fermentação pela adição de ácido e
base (H3PO4 a 10% v/v e NaOH 3M). A produção de espuma foi controlada adicionando-se
antiespumante à base de silicone (Nitrogenius®).
Da mesma forma que no estudo da cinética nos garrafões, foram realizadas coletas de
amostras imediatamente após a inoculação, e depois de 4 h, 8 h, 24 h, 30 h, 48 h, 54 h e 72 h.
Foram efetuadas contagem de células viáveis, contagem de esporos viáveis, dosagem
de açúcar redutor para verificação do consumo de açúcar pelo micro-organismo, determinação
de biomassa seca e eletroforese para caracterização da presença das toxinas de interesse.
Posteriormente procedeu-se à formulação e avaliação por bioensaio.
Batelada alimentada em biorreator de bancada
Para a batelada alimentada, foram mantidos os mesmos parâmetros do cultivo anterior,
porém após 12 h de cultivo a batelada foi alimentada com solução de glicose em concentração
e volume suficientes para 20 g/L no fermentador. A velocidade de alimentação foi controlada
com base na concentração de oxigênio dissolvido.
A cinética foi acompanhada através de coletas de amostras imediatamente após a
inoculação, e depois de 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 30 h, 48 h, 54 h e 72 h.
Da mesma forma, foram efetuadas contagem de células viáveis, contagem de esporos
viáveis, dosagem de açúcar redutor para verificação do consumo de açúcar pelo micro-
organismo, determinação de biomassa seca, eletroforese para caracterização da presença das
toxinas de interesse e preparo da formulação para avaliação por bioensaio.
46
Acidificação e concentração da amostra
Ao final do cultivo, o pH foi acidificado até 4,5 antes de proceder a concentração da
amostra por centrifugação [6, 11]. Utilizando-se tubos cônicos estéreis de 50 mL de
capacidade, o caldo bacteriano foi centrifugado durante 15 min a 12000 g em centrífuga
laboratorial (MPW-350R).
Formulação
Após a centrifugação, procedeu-se a formulação através da mistura da pasta
concentrada a uma solução estabilizante na proporção de 30% (v/v) de amostra e 70% (v/v) de
solução. A solução foi preparada tendo como base goma xantana com características
espessante e adesiva, filtro para raios UV, substâncias estabilizantes de pH, conservante e
antiespumante.
Observação microscópica
Cada uma das etapas foi acompanhada pela avaliação microscópica da morfologia
bacteriana, formação de esporos, cristais e presença de contaminantes. A análise microscópica
foi realizada em preparações a fresco, utilizando-se microscópio óptico com contraste de fase
(Olympus CX41) com aumento de 400x e 1000x.
Aferição do pH
O pH das amostras foi aferido em pHmetro digital de bancada (Quimis Q400HM).
Contagem de células viáveis
Foi realizada diluição seriada decimal em tubos com solução salina (NaCl 0,9 %)
estéril, iniciando-se com 1 mL do produto em 9 mL de salina agitando-se em vórtex até a
diluição 10-10. Para cada contagem, a inoculação foi feita em duas placas de Petri com Ágar
Nutriente, onde foram inoculados 30 μL de cada diluição em três pontos distintos,
considerando cada ponto inoculado como repetição. As placas foram incubadas a 30 ± 2°C
47
por 24 h. O resultado foi considerado como a média das seis contagens de colônias,
multiplicadas pela diluição correspondente e expresso em UFC/mL.
Contagem de esporos viáveis
Para a contagem de esporos viáveis, as amostras foram submetidas a choque térmico,
sendo previamente incubadas em banho-maria a 80°C durante 10 min para eliminação das
formas vegetativas, seguido de resfriamento em banho de gelo. Posteriormente foram
realizadas diluições seriadas decimais em tubos com solução salina estéril, iniciando-se com
1 mL do produto em 9 mL de salina agitando-se em vórtex até a diluição 10-10 [15]. A
inoculação foi realizada em duas placas de Petri com ágar nutriente, onde foram inoculados
30 μL de cada diluição em três pontos distintos, considerando cada ponto inoculado como
repetição. As placas foram incubadas a 30 ± 2°C por 24 h. O resultado foi considerado como
a média das seis contagens de colônias, multiplicadas pela diluição correspondente e expresso
em UFC/mL.
Dosagem de açúcar redutor pelo método DNS
A medida da concentração de açúcares redutores totais no caldo de fermentação foi
feita pelo método do ácido 3,5 di-nitrosalicílico (DNS) [21].
Para análise das concentrações de açúcares redutores no meio contendo sacarose, foi
realizada primeiramente a hidrólise da sacarose. As amostras coletadas foram previamente
centrifugadas a 12.000 g durante 15 min (Centrífuga MPW-350R). Do sobrenadante foi
retirada uma alíquota de 1 mL à qual foi acrescentado 1 mL de HCl (2M) para hidrólise. Após
30 min em banho-maria a 65°C, as amostras foram neutralizadas com 1,0 mL de NaOH (4M)
e diluídas apropriadamente.
Após este procedimento, os carboidratos redutores totais foram analisados pelo
método de DNS. As reações foram feitas em triplicata, em microplacas de 96 poços onde a
60 µL das amostras adicionou-se 120 µL do reagente (DNS). A microplaca foi incubada em
termociclador a 95ºC durante 20 min. Na sequência, foi feita a leitura da absorbância em
espectrofotômetro a 543 nm, tendo como branco uma preparação idêntica contendo água
destilada em substituição à amostra.
48
Determinação da biomassa seca
A determinação da biomassa seca no caldo de fermentação foi realizada por
gravimetria. Em tubos cônicos previamente secos e pesados, foram centrifugados 3 mL do
caldo bacteriano a 12.000 g durante 15 min. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi
seco em estufa a 105°C até peso constante. As análises gravimétricas foram realizadas em
duplicata.
Caracterização e avaliação da expressão das endotoxinas
A caracterização e avaliação da expressão das endotoxinas produzidas pelo B.
thuringiensis foi realizada por eletroforese desnaturante (sódio dodecil sulfato) em gel de
poliacrilamida (SDS PAGE). As amostras coletadas durante a cinética em biorreator de
bancada foram mantidas congeladas até o momento da realização da eletroforese.
As proteínas de B. thuringiensis foram extraídas de acordo com Lecadet et al. [19].
Alíquotas de 20 μL das preparações de esporos-cristais foram fervidas por 5 min em tampão
de amostra de proteínas (1,5M Tris-HCl, pH 6,8, contendo 4% m/v de SDS, 10% v/v de
-mercaptoetanol, 20% v/v de glicerol e 0,004% m/v de azul de bromofenol) e submetidas a
eletroforese conforme descrito por Laemmli [18].
A eletroforese foi realizada sob corrente constante de 80 V no gel concentrador
(acrilamida 4,5% m/v, pH 6,8) e 150 V no gel separador (acrilamida 12% m/v, pH 8,8) O gel
foi corado em solução de azul de Comassie R-250 0,1% (m/v) em fixador composto por 40%
(v/v) metanol e 10% (v/v) ácido acético [30] durante 30 min.
Após descoloração em solução contendo 10% (v/v) de ácido acético e 30% (v/v) de
etanol, pode-se comparar as bandas que correspondem às massas moleculares dos
polipeptídeos (endotoxinas), com um padrão de massa molecular. B. thuringiensis kurstaki
HD-1 contém três toxinas Cry1 com peso molecular de 130 kDa e duas Cry2 de 70 kDa [14,
27].
O marcador de massa molecular utilizado foi Sigma-Aldrich® Prestained Molecular
Weight Marker (M.W. 26,600 – 180,000).
49
Bioensaios
Os bioensaios foram realizados no Laboratório de Bactérias Entomopatogênicas da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN) em Brasília (DF, Brasil).
Para os bioensaios foi utilizada a formulação após 30 dias de preparo, mantida em
temperatura ambiente. Utilizou-se o método das diluições decimais seriadas da amostra,
espalhando-se 35 µL de cada diluição na dieta distribuída previamente em placas de cultivo
de células com 24 poços [23]. A cultura bacteriana foi absorvida pela dieta e em seguida uma
larva de segundo ínstar da lepidóptera Spodoptera frugiperda foi colocada em cada poço.
Uma placa foi deixada sem inóculo, como controle negativo e as mesmas diluições foram
feitas com o produto Dipel® (Abbott Laboratories, USA) como controle positivo. As placas
foram devidamente fechadas com tampas de acrílico e ligas elásticas. A primeira leitura foi
feita 48 h após o início do ensaio, ocasião em que as lagartas foram transferidas para copinhos
de plástico de 50 mL, contendo dieta livre do bacilo. No sétimo dia do ensaio foi feita a
segunda e última leitura [29].
Análise de dados
Os dados obtidos para contagens de células totais e esporos foram submetidos ao teste
de normalidade Shapiro-Wilk, os quais não apresentaram distribuição normal, mesmo
realizando transformação dos dados. Desta forma, os dados foram submetidos ao teste
Kruskal-Wallis para verificar as diferenças entre os meios testados, utilizando o software
Statistica versão 7.0 (Statsoft, 2004). Para o cálculo da concentração letal (CL50), foi realizada
a análise de Probit com auxílio do sotware Polo Plus estabelecendo intervalo de confiança de
95%.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Comparação dos meios de cultura modificados em frascos agitados
Inicialmente foi realizado ensaio em frascos agitados como o objetivo de testar
modificações no meio GYS [31] citado na literatura como referência. Foram feitas
50
modificações na fonte de carbono e nitrogênio e comparadas as contagens de células totais e
esporos viáveis, além do pH após 72 h de incubação. Os resultados estão apresentados na
Tabela 2.
Tabela 2 Resultados comparativos das modificações nos meios de cultura, partindo de um inóculo com contagem
de 6,66 x 107 UFC/mL.
Meios Contagem de células
viáveis (UFC/mL)
Contagem de esporos
viáveis (UFC/mL)
pH final
GYS 4,44 x 108 a * 3,27 x 106 a 6,77
Modificação fonte N 8,88 x 108 a 4,16 x 106 ab 6,90
Modificação fonte C 5,00 x 108 a 4,83 x 108 b 8,94
Nota: *Letras minúsculas diferentes na mesma coluna diferem significativamente pelo teste de Kruskal-Wallis
(p<0,05).
Observou-se que a modificação da fonte de nitrogênio, acrescentando-se peptona ao
extrato de levedura do meio original, não apresentou efeito significativo no incremento de
biomassa e na esporulação. Já a modificação da fonte de carbono de glicose para sacarose não
exerceu impacto significativo na contagem total de células, no entanto a esporulação foi
significativamente mais expressiva nessas condições.
Nota-se também que ao final das 72 h de cultivo, ocorreu leve acidificação do meio
(inicialmente neutro), enquanto no meio com sacarose ocorreu alcalinização do mesmo. Essa
oscilação de pH pode justificar o incremento na esporulação.
Diante dos resultados apresentados, optou-se por manter a fonte de nitrogênio com
extrato de leveduras apenas, principalmente por razões de custo da produção, pensando-se em
escala industrial. Para melhor comparação entre as fontes de carbono glicose e sacarose
realizou-se, na sequência, cinética de cultivo em volume maior (5 L) em garrafões de
fermentação.
Cinética de crescimento em garrafões de fermentação
As cinéticas em garrafões foram utilizadas para comparação do comportamento do
micro-organismo frente às diferentes fontes de carbono: glicose e sacarose.
As cinéticas então descritas nas Figuras 1 e 2.
51
Fig. 1 Cinética de crescimento e esporulação em meio GYS em garrafão
No meio GYS com glicose como fonte carbono, houve um pico de produção de
biomassa (células viáveis) em 24 h, no entanto a esporulação foi incrementada a partir de 34 h
de cultivo, coincidindo com a acidificação gradativa do meio. O pH inicial foi 6,87
apresentando um declínio gradativo até um valor de 4,75 ao final do cultivo. No metabolismo
da glicose pelo B. thuringiensis ocorre acúmulo e consumo de ácidos orgânicos tais como
piruvato, acetato e citrato. O acúmulo de ácidos orgânicos e ácido glutâmico (principal
aminoácido encontrado no extracelular) pode provocar a queda do pH, enquanto o consumo
pode fazer com que o pH aumente [16].
A avaliação do consumo da glicose demonstrou que o valor máximo de esporulação
ocorreu quando a concentração da fonte de carbono no meio foi se tornando escassa, entre
24 h e 34 h. Foi observado valor residual de glicose no meio (6,59 g/L) ao final do cultivo,
que pode ser devido a provável deficiência de oxigenação durante o cultivo.
No meio contendo sacarose como fonte carbono, o pico de produção de biomassa
(células viáveis) e esporulação ocorreu em 48 h atingindo valores muito próximos aos obtidos
no meio com glicose em garrafão, coincidindo com maior alcalinidade do meio. O pH inicial
foi 6,96 com aumento gradativo atingindo valor máximo de 7,31 em 34 h. A partir desse
ponto, houve pequena queda chegando a valor de 6,89 ao final do cultivo.
Mudanças no pH durante o cultivo fornecem informações sobre a produção e
subsequente consumo de metabólitos intermediários ácidos, indicando que condições
ambientais direcionam o fluxo de substratos no sentido de atender às necessidades do micro-
5,00
7,00
9,00
11,00
13,00
15,00
17,00
19,00
21,00
1,00E+06
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organismo durante o cultivo. Além disso, a natureza e a característica da fonte de carbono e
de nitrogênio têm um papel importante no metabolismo bacteriano, afetando inclusive a
diferenciação de célula vegetativa para esporulada [2]. Em meios formulados com extrato de
levedura, a elevação do pH também pode ser justificada pela liberação de amônia durante a
desaminação dos aminoácidos usados no catabolismo [33].
Fig. 2 Cinética de crescimento e esporulação em meio com sacarose em garrafão
Com relação à esporulação, não houve diferença significativa entre as concentrações
máximas de esporos obtidas nos dois meios de cultivo, entre 2.107 e 3.107 UFC/mL após 34 h,
as quais foram menores que o valor obtido em frascos Erlenmeyer com a fonte de carbono
sacarose (4,8.108 UFC/mL). A única diferença observada foi que a concentração de esporos se
manteve estável no período entre 34 h e 48 h no meio com sacarose. Possivelmente o aumento
de escala tenha trazido outros fatores que influenciaram a produção de células e esporulação,
tais como a limitação de oxigênio.
Um fator muito interessante aqui observado foi a não utilização da sacarose pela
subespécie estudada, mantendo valores constantes durante o cultivo. Esse fato talvez possa
explicar as melhores taxas de esporulação no cultivo em frascos agitados, pois sem fonte de
carbono utilizável, o micro-organismo pode ter esporulado devido a essa condição
desfavorável.
No entanto, na literatura são encontrados alguns trabalhos onde a sacarose ou matérias
primas ricas em sacarose como melaços foram utilizadas no cultivo de diferentes subespécies
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de B. thuringiensis. Avaliando-se os diferentes trabalhos, constata-se que as variedades do
micro-organismo bem como as condições de cultivo podem influenciar no consumo de
açúcares. Além disso, sabe-se que o açúcar utilizado no meio de cultivo pode influenciar na
produção de endotoxinas [25].
Panarotto [26] verificou perfis de consumo para glicose e sacarose, em ensaios em
frascos agitados para B. thuringiensis subsp. israelensis. Em meio com glicose, houve
consumo total do carboidrato, enquanto altas concentrações residuais de açúcar foram
verificadas no meio com sacarose ao final do cultivo.
Sachidanandham et al. [32] realizaram ensaios em sistema descontínuo em biorreator
de bancada, para selecionar a fonte de carbono mais adequada para o cultivo de B.
thuringiensis galleriae. Foram testados glicose, maltose, frutose, galactose, lactose e sacarose.
O meio com glicose forneceu os melhores resultados seguido de maltose, frutose, galactose,
sacarose e lactose. Segundo esses autores, o fato de os dissacarídeos necessitarem ser
hidrolisados antes de serem metabolizados pode ser um fator limitante para a sua utilização.
Para B. thuringiensis kurstaki, Vora e Shetna [34] obtiveram resultados bastante
satisfatórios com a substituição de glicose por sacarose. Em ensaios em frascos agitados
houve uma antecipação na esporulação, mas com redução no rendimento de endotoxinas. Já
na fermentação realizada em biorreator de bancada, com melhores condições de aeração, o
meio com sacarose resultou em taxa de esporulação de 99% e maiores concentrações de
endotoxinas. No entanto, esse trabalho não traz um estudo do consumo da sacarose pelo
micro-organismo.
Diante dos resultados do presente trabalho, optou-se por utilizar apenas glicose nos
ensaios subsequentes, buscando como estratégia para melhorar o rendimento na produção a
comparação de resultados em batelada e batelada alimentada.
Batelada em biorreator de bancada
Um novo ensaio foi realizado em biorreator de bancada, com controle das principais
variáveis de processo. O objetivo foi avaliar o desempenho da bactéria sob condições não
limitantes de oxigênio e, desta forma, verificar a eventual influência negativa das condições
de aeração nos ensaios em frascos e garrafões sobre o metabolismo bacteriano. Os resultados
da cinética microbiana nesse ensaio estão na Figura 3.
54
Fig. 3 Cinética de crescimento e esporulação – Batelada em biorreator
A fase exponencial do cultivo encerrou-se na trigésima hora, quando foi atingida
máxima concentração celular (9,77.1010 UFC/mL). No entanto, a esporulação iniciou em 24 h,
sendo que nesse ponto os esporos ainda eram intracelulares. A partir de 30 h do cultivo,
observou-se o pico de esporulação (4,83.1010 UFC/mL) acompanhado de lise celular e
consequente predomínio de esporos extracelulares.
Vu et al. [35] obtiveram para B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, um pico de
5,6.108 UFC/mL de células em 15 h de cultivo e esporulação máxima de 4,3.108 UFC/mL em
48 h, utilizando um meio de cultivo à base de lodo secundário em 10 L de cultivo.
Mounsef et al. [24], em meio à base de subprodutos de moagem de cereais (CMB) em
biorreator de 2 L, obtiveram esporulação máxima de 1,9.109 UFC/mL em 28,5 h de cultivo,
condição obtida em valores mais altos de KLa testadas no experimento.
Brar et al. [8] obtiveram, para mesma subespécie, produção máxima de células de
1,67.109 UFC/mL e de esporos 8,0.108 UFC/mL em 48 h em meio à base de águas residuais
de indústria de amido em biorreator de 15 L. Neste experimento, relataram taxa de agitação
que variou entre 250 rpm e 400 rpm e aeração de 2,5 L/min a 3,5 L/min, sendo que as
variações maiores ocorreram durante a fase exponencial da fermentação e estabilizaram
durante a fase estacionária.
Yezza et al. [37] também fizeram cultivo de B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 em
100 L de volume de trabalho, comparando diferentes meios. A agitação variou entre 100-150
rpm, aeração 0,3 a 0,5 vvm e oxigênio dissolvido 30% de saturação. Após 48 h de cultivo,
obtiveram contagem máxima de células de 4,90.108 UFC/mL com esporulação de 4,17.108
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UFC/mL em meio comercial semi-sintérico à base de farelo de soja. Em meio à base de águas
residuais de indústria de amido obtiveram 1,69.109 UFC/mL de células totais e 6,60.108
UFC/mL de esporos. Já para meios com água residual de abatedouro a contagem de células
foi 2,93.108 UFC/mL enquanto que de esporos não ultrapassou 6,47.107 UFC/mL.
Sabe-se que condições controladas de aeração e agitação são essenciais para o
crescimento, esporulação e principalmente para produção da endotoxina. No presente
trabalho, para manter a taxa de oxigênio dissolvido em 26%, a agitação variou entre 200 rpm
e 650 rpm, sendo que o valor máximo foi atingido ao final da fase exponencial, coincidindo
com a máxima concentração de células, aproximadamente na trigésima hora de cultivo. Após
a esporulação, ou seja, na fase estacionária, a agitação manteve-se constante em
aproximadamente 200 rpm até o final das 72 horas. A aeração foi mantida constante em 10 L
ar/min. Os resultados obtidos neste experimento demonstraram que condições controladas de
aeração e agitação são essenciais para a cinética de B. thuringiensis.
Ghribi et al. [13] demonstraram em seu estudo que quanto melhores as condições de
oxigênio dissolvido no meio, melhor é a síntese de toxinas durante a esporulação,
independentemente do meio de cultura ou da concentração inicial da fonte de carbono para
Btk BNS3. Isso pode explicar os melhores resultados obtidos em condições não limitantes de
oxigênio. Esses pesquisadores utilizaram diferentes concentrações de glicose e extrato de
levedura no meio, as quais foram testadas em diferentes perfis de aeração, alcançando
esporulação máxima que variou entre 2,2.108 UFC/mL e 22,6.108 UFC/mL após 72 h de
cultivo. Para diferentes concentrações de glicerol e extrato de levedura, a esporulação variou
entre 20,0 e 27,8.108 UFC/mL dependendo do perfil de aeração, após 72 h de cultivo.
Boniolo et al. [10] relataram que o efeito da aeração é muito mais importante na
produção da endotoxina do que na esporulação. De fato, observaram um incremento máximo
de 16% na biomassa seca de B.thuringiensis israelensis, de uma fermentação com 5% de
oxigênio dissolvido para outra com 50%.
Maldonaldo Blanco et al. [20] afirmaram que altas concentrações de células e esporos
não garantem altas concentrações de toxinas Bt. Os resultados de Mounsef et al. [24]
corroboram com essa afirmativa. Esses pesquisadores estudaram a fermentação de B.
thuringiensis kurstaki em diferentes condições de KLa e observaram que o oxigênio não foi
fator limitante para crescimento celular, pois não variou muito nas diferentes condições de
aeração testadas, o que variou foi o tempo para atingir a concentração máxima de células (8,5
a 12 h) e o ciclo para liberação de esporos maduros que foi de 29 h para KLa de 65,5/h
enquanto que para KLa de 13,3/h ultrapassou 35 h de fermentação. Para todos os valores de
56
KLa testados (de 13,3/h até 106,2/h) a porcentagem de esporulação excedeu 98%, sem
diferença significativa entre as concentrações de esporos obtidas. Além disso, as quantidades
de cristais obtidas para diferentes valores de KLa não foram significativamente diferentes. No
entanto, foi observado um aumento na concentração máxima de proteína de 13,7% quando
KLa aumentou de 13,3/h para 65,5/h, o que sugere que os cristais formados para KLa igual a
65,5/h têm uma maior quantidade de proteínas. Ou seja, os cristais podem estar igualmente
presentes mas podem ser mais concentrados em proteínas de acordo com as condições de
aeração e agitação.
Diante dos dados apresentados na literatura, os resultados obtidos no presente
experimento foram bastante satisfatórios e podem-se observar resultados melhores que os
apresentados ao utilizar glicose como fonte de carbono, tanto em produção de células quanto
em esporulação.
Batelada alimentada em biorreator de bancada
A concentração de células e esporos e consequentemente a toxicidade pode ser
aumentada através de várias estratégias no processo operacional. A fermentação em batelada
alimentada fornece uma ferramenta para aumentar a produtividade e concomitantemente
diminuir custos na fabricação de produtos bioinseticidas [36].
Buscou-se através da batelada alimentada uma alternativa para incrementar ainda mais
a produção e esporulação de B. thuringiensis kurstaki. Os resultados podem ser visualizados
na Figura 4.
Nesta estratégia de cultivo, pode-se observar um significativo incremento na produção
celular e esporulação. O cultivo foi alimentado com glicose na décima segunda hora quando a
concentração de glicose no meio já estava bastante baixa (2,51 g/L). Dessa forma, o micro-
organismo consumiu mais fonte de carbono e consequentemente, a partir desse ponto, houve
um aumento de produção de biomassa que foi gradativo, atingindo o valor de 7,16.1012
UFC/mL de células totais e 4,44.1012 UFC/mL de esporos após 72 h de cultivo.
Nessa cinética, na décima segunda hora, a concentração de células no meio era de
9,88.1010 UFC/mL e esporulação de 1,34.106 UFC/mL. Em 24 h de cultivo a esporulação
começou intensificar paralelamente ao incremento na produção celular. No entanto, até a
trigésima hora os esporos apresentaram-se intracelulares. Em 48 h de cultivo, observou-se
início da lise celular que se intensificou a partir desse ponto até o final do cultivo (72 h),
quando predominaram esporos extracelulares.
57
Fig. 4 Cinética de crescimento e esporulação – Batelada alimentada em biorreator
Em um estudo de Yezza et al. [36], utilizando lamas de águas residuais como matéria
prima, foram obtidos 5,62.108 UFC/mL de esporos no tradicional processo descontínuo e
8,60.108 UFC/mL de esporos em batelada alimentada com incremento na atividade
bioinseticida. A estratégia utilizada para a alimentação foi baseada na medição de oxigênio
dissolvido durante o ciclo de fermentação. O oxigênio dissolvido teve decréscimo até o fim da
fase exponencial. Depois disso, começou a aumentar e quando chegou próximo à
estabilização (30% de saturação), foi realizada alimentação com lama residual previamente
esterilizada.
A princípio, a estratégia de cultivo por batelada alimentada pode ser uma alternativa
para obter preparações mais concentradas em termos de esporos e consequentemente de
proteínas para produção de bioinseticidas.
Consumo de glicose e concentração de biomassa seca em batelada e batelada alimentada
O consumo de glicose pelo micro-organismo bem como a produção de biomassa seca
em cultivo em batelada está representado na Figura 5.
Nessas condições, observou-se consumo intenso de glicose na fase exponencial do
crescimento bacteriano, sendo que em 24 h de cultivo a concentração foi de 2,00 g/L,
decaindo para 1,34 g/L ao final de 72 h. Em 24 h, observou-se maior concentração de
biomassa seca (7,57 g/L), que corresponde ao momento da cinética onde predominam células
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com esporos intracelulares. A partir daí, ocorreu lise celular e liberação de esporos. Observou-
se um decréscimo da biomassa seca depois de 30 h atingindo valor de 3,66 g/L ao final do
cultivo, resultante da lise.
Fig. 5 Consumo de glicose x produção de biomassa seca – Batelada em biorreator
O consumo de glicose pelo micro-organismo bem como a produção de biomassa seca
em cultivo em batelada alimentada está representado na Figura 6.
Fig. 6 Consumo de glicose x produção de biomassa – Batelada alimentada em biorreator
Em batelada alimentada, da mesma forma, em 24 h encontrou-se o valor máximo de
biomassa seca (13,08 g/L) que corresponde às células com início de esporulação ainda
intracelular. Esse valor expressivamente maior que no cultivo em batelada pode ser justificado
pela alimentação com 20 g/L realizada na décima segunda hora de cultivo. No momento da
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alimentação, a concentração de glicose no meio já estava em 2,51 g/L, quase entrando em fase
estacionária de crescimento. Esse incremento de glicose ao cultivo resultou em intensificação
da multiplicação celular nas próximas horas. No entanto, a esporulação foi mais expressiva a
partir da trigésima hora, quando gradativamente ocorreu lise celular, sendo bastante evidente
após 48 h de cultivo. Ao final de 72 h, obteve-se valor de 4,25 g/L de biomassa seca.
A Tabela 3 apresenta os resultados dos parâmetros cinéticos e de rendimento dos dois
processos. A taxa específica de crescimento (µmax) foi calculada pela diferença do logaritmo
neperiano das concentrações de biomassa seca no intervalo de tempo no qual µmax retratou o
maior resultado dessa relação (até 8 h). O coeficiente de rendimento (YX/S, g de biomassa
seca/g de substrato) e a produtividade (g de biomassa seca/Lh) globais foram calculados para
o tempo em que a concentração de biomassa atingiu seu valor máximo (24 h). Como era
esperado, as velocidades máximas de crescimento e os rendimentos globais foram
equivalentes nos dois processos. Verificou-se, porém, que o processo em batelada alimentada
apresentou produtividade aproximadamente 100% maior, em virtude da alimentação adicional
de fonte de carbono.
Tabela 3 Parâmetros cinéticos e de rendimentos em batelada e batelada alimentada.
Vel. crescimento
(µmax, h-1)
Rendimento global
(YX/S, g/g)
Produtividade global
(g/Lh)
Batelada 0,1868 0,35 0,26
Batelada Alimentada 0,1871 0,35 0,50
Nota: Velocidade específica de crescimento calculada em 8 h, rendimento e produtividade calculados em 24 h.
Caracterização e avaliação da expressão das endotoxinas
Embora a síntese do cristal proteico esteja intrinsecamente ligada ao processo de
esporulação, diversos autores sustentam que elevadas concentrações de esporos não implicam
necessariamente em alta atividade de toxinas no meio cultivado [10]. Então, para o
desenvolvimento de um bioinseticida, é essencial a caracterização e avaliação da síntese de
endotoxinas. Os resultados obtidos através das eletroforeses das amostras do cultivo em
batelada e batelada alimentada estão nas Figuras 7 e 8.
Em batelada, a partir de 30 h de cultivo, coincidindo com a esporulação, pode-se
observar no gel de eletroforese (Figura 7), por interposição às bandas do marcador, a presença
de proteínas com pesos moleculares estimados de 70 kDa e 130 kDa, característicos das
60
toxinas de B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 [14, 27]. Da mesma maneira, na batelada
alimentada, observam-se as proteínas de interesse (Figura 8), sendo que em 24 h evidenciou-
se o aparecimento das bandas que se intensificaram a partir da trigésima hora. A intensidade
das bandas sugere concentração maior de proteínas nesse cultivo.
Fig. 7 Eletroforese em gel de poliacrilamida - batelada
Fig. 8 Eletroforese em gel de poliacrilamida - batelada alimentada
Marcador 0h 4h 8h 24h 30h 48h 54h 72h
Marcador 0h 4h 8h 12h 24h 30h 48h 54h 72h
130 kDa
70 kDa
130 kDa
70 kDa
180 kDa
116 kDa
90 kDa
58 kDa
48,5 kDa
36,5 kDa
26,6 kDa
180 kDa
116 kDa
90 kDa
58 kDa
48,5 kDa
36,5 kDa
26,6 kDa
61
Bioensaios
Os resultados do ensaio biológico contra Spodoptera frugiperda estão apresentados na
Tabela 4.
Tabela 4 Estimativa da concentração letal (CL50*) da formulação produzida em batelada e batelada
alimentada.
Produto
CL50 (esporos/mL) Intervalo de confiança (95%)
Formulação batelada 635.121,00 218.026,00 – 1397.969,00
Formulação batelada alimentada 10.994,00 702,57 – 70.822,00
Dipel® (controle positivo)
212,68 18,56 – 482,80
*Concentração letal necessária para matar 50% dos insetos testados
Observa-se uma evidente melhora na atividade letal na formulação produzida em
batelada alimentada comparada à produzida em batelada simples. Como pode ser observado
anteriormente, por meio de eletroforese, a quantidade de proteína produzida em batelada
alimentada foi maior. No entanto, em ambas as condições de cultivo, possivelmente houve
incremento na produção de outros fatores que interferem na degradação dessas proteínas,
como as proteases.
O pH ácido dessas formulações parece não ter sido suficiente para inibir o efeito de
degradação em temperatura ambiente após 30 dias.
Brar et al. [6] relacionam um aumento de concentração celular com aumento de
produção de proteases. Isso porque as células terão que sintetizar mais proteases
extracelulares para hidrolisar proteínas em aminoácidos para o crescimento celular vegetativo.
Isso justifica o fato de proteases produzidas por Bt serem sintetizadas em grande quantidade
em meios ricos em fonte de nitrogênio. Esse é um ponto importante a ser levado em
consideração quando se busca aumento de rendimento na fermentação, como no presente
trabalho.
Para melhorar a atividade letal da formulação, deverão ser estudados inibidores de
proteases para formulação como fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) ou ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), para verificação de efeito da atividade de protease durante
o período de armazenamento.
Um estudo de Zouari e Jaoua [38] testou o efeito de PMSF e EDTA como inibidores
de protease em pH 7 e pH 9,5. Os resultados mostraram que 1mM de PMSF não inibiu a
atividade de todas as frações de proteases. Em contraste, o EDTA, quelante de metal inibidor
62
de proteases neutras, inibiu quase completamente todas as proteases produzidas por Btk
BNS3 nas condições testadas.
Além disso, algumas técnicas mais avançadas como a microencapsulação vêm sendo
estudadas com o objetivo de fornecer maior proteção contra condições ambientais extremas
(radiação UV, chuvas, etc.), melhorando estabilidade e toxicidade residual em virtude da
liberação lenta do ativo [7].
CONCLUSÃO
Apesar da obtenção de resultados de esporulação significativamente melhores
utilizando-se sacarose em frascos agitados, deve-se levar em consideração que 72 horas pode
não ter sido suficiente para a esporulação utilizando glicose devido à deficiência de
oxigenação nessa condição. Além disso, o cultivo em garrafões de 5 L demonstrou que a
subespécie em estudo não utilizou sacarose como fonte de carbono. Essa condição
desfavorável para o micro-organismo pode justificar os melhores resultados de esporulação
em menor escala, no entanto a não utilização dessa fonte de carbono pode impactar na
toxicidade da proteína.
No entanto, na bateada com glicose como fonte carbono, os resultados de produção
celular e esporulação foram bastante satisfatórios quando comparados aos de outros tipos de
meios, inclusive utilizando matérias primas alternativas. O cultivo em batelada alimentada
apresentou excelentes resultados em termos de produção celular e esporulação e pode ser
utilizado como alternativa para incrementar a produção de bioinseticidas.
As eletroforeses em gel de poliacrilamida demonstram que em ambos os cultivos,
batelada e batelada alimentada, as bandas que correspondem às proteínas bioinseticidas de
interesse aparecem a partir de 24 h de cultivo, sendo ainda mais expressivas no cultivo em
batelada alimentada.
O estudo de produtos com agentes biológicos não é uma tarefa fácil principalmente
devido à escassez de informações na literatura a respeito de acompanhamento de formulações.
Muitas vezes os bioensaios são realizados com o caldo bacteriano logo após o término da
fermentação e são raros os estudos publicados que focam em formulação e tempo de
prateleira, por se tratar na maioria das vezes de segredos industriais.
Nessa pesquisa ficou evidente que é possível aumentar o rendimento da produção,
utilizando-se de estratégias como a batelada alimentada. No entanto, o grande desafio é obter
63
uma formulação que viabilize a integridade das proteínas de interesse durante o
armazenamento.
Estudos posteriores devem focar em melhorias na formulação que busquem diminuir a
CL50 do produto. O ideal seria o acompanhamento desde o momento da formulação, ao longo
dos meses para estabelecer o prazo de validade do produto formulado.
REFERÊNCIAS
1. Abdel-Hameed AA (2001) Stirred tank culture of Bacillus thuringiensis H-14 for
production of the mosquitocidal δ-endotoxin: matematical modelling and scalling-up
studies. World J Microbiol Biotechnol 17(9):857-861.
2. Anderson RKI, Jayaraman K (2003) Influence of carbon and nitrogen sources on the
growth and sporulation of Bacillus thuringiensis var. galleriae for biopesticide
production. Chem Biochem Eng 17(3):225-231.
3. Angelo EA, Vilas-Bôas GT, Castro-Gómez RJH (2010) Bacillus thuringiensis:
características gerais e fermentação. Semina: Ciênc Agr 31(4):945-958.
4. Birch ANE, Begg GS, Squire GR (2011) How agro-ecological research helps to
address food security issues under new IPM and pesticide reduction policies for global
crop production systems. J Exp Bot 62: 3251–3261.
5. Brar SK., Verma M, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY (2009) Biopesticides –
Bacillus thuringiensis. In: Sustainable Sludge Management, New Youk, pp 168-202.
Downloaded from ascelibrary.org by New York University on 04/17/15. doi:
10.1061/9780784410516.ch08
6. Brar SK., Verma M, Tyagi RD, Surampalli RY, Barnabe S, Valéro JR (2007) Bacillus
thuringiensis proteases: Production and role in growth, sporulation and synergism.
Process Biochem 42: 773-790.
7. Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Valéro JR (2006) Recent advances in downstream
processing and formulations of Bacilluss thuringiensis based biopesticides. Process
Biochem 41: 323-342.
8. Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Valero JR, Surampalli RY (2005) Starch industry
wastewater based stable Bacillus thuringiensis liquid formulations. J Econ Entomol
98(6): 1890–1898.
9. Bravo A, Likitvivatanavong S, Gill SS, Soberón M (2011) Bacillus thuringiensis: a
story of a successful bioinsecticide. Insect Biochem Molec Biol 30:1-9.
64
10. Boniolo FS, Rodrigues RC, Prata AMR, López ML, Jacinto T, Silveira MM, Berbert-
Molina MA (2012) Oxygen supply in Bacillus thuringiensis fermentations: bringing
new insights on their impact on sporulation and delta-endotoxin production. Appl
Microbiol Biotechnol 94(3):625-36.
11. Couch TL, Jurat-Fuentes JL (2014) Commercial Production of Entomopathogenic
Bacteria. In: Morales-Ramos JA, Rojas MG, Shapiro-Ilan DI (ed) Mass Production of
Beneficial Organisms – Invertebrates and Entomopathogens, Academic Press, San
Diego, pp 415-435.
12. Couch TL (2000) Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic
bacteria. In: Charles JF (org.). Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field
applications, Kluwer Academic Publishers, New York, pp 297-316.
13. Ghribi D, Zouari N, Trabelsi H, Jaoua S (2007) Improvement of Bacillus thuringiensis
delta-endotoxin production by overcome of carbon catabolite repression through
adequate control of aeration. Enzyme Microb Tech 40:614-622.
14. Glare TR, O’Callagham M (2000) Bacillus thuringiensis, biology, ecology and safety.
Chichester: John Wiley and Sons.
15. Jallouli W, Sellami S, Sellami M, Tounsi S (2014) Impact of liquid formulation based
on ultrafiltration-recovered bioactive components on toxicity of Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki strain BLB1 against Ephestia kuehniella. Process Biochem 49(11):
2010-2015.
16. Jing-Wen Z, Ya- Fei C, Zheng-Hong X, Zi-Niu Y, Shou-Wen C (2007) Production of
thuringiensin by fed-batch culture of Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis 032
with an improved pH-control glucose feeding strategy. Process Biochem 42: 52–56.
17. Jisha VN, Smitha RB, Benjamin S (2013) An overview on the crystal toxins from
Bacillus thuringiensis. Adv. Microbiol. 3: 462-472.
18. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.
19. Lecadet MM, Chaufaux J, Ribier J, Lereclus D (1991) Construction of novel Bacillus
thuringiensis strains with different insecticidal activities by transduction and
transformation. Appl Environ Microbiol 58:840-849.
20. Maldonado-Blanco MG, Romero GS, Galán-Wong LJ (2003) The effect of oxygen
tension on the production of Bacillus thuringiensis supbs. israelensis toxin active
agains Aedes aegypti larvae. World J Microbiol Biotechnol 19(7):671-674.
21. Miller GL (1959) Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal Chem 31:426.
22. Mnif I, Ghribi D (2015) Potential of bacterial derived biopesticides in pest
management. Crop Prot 77: 52-64.
65
23. Monnerat RG, Batista AC, Medeiros PT, Martins ES, Melatti VM, Praça LB, Dumas
VF, Morinaga C, Demo C, Gomes ACM, Falcão R, Siqueira CB, Silva-Wernwck JO,
Berry C (2007) Screening of Brazilian Bacillus thuringiensis isolates active against
Spodoptera frugiperda, Plutella xylostella and Anticarsia gemmatalis. Biological
Control 41: 291-295.
24. Mounsef JR, Salameh D, Louka N, Brandam C, Lteif R (2015). The effect of aeration
conditions, characterized by the volumetric mass transfer coefficient KLa, on the
fermentation kinetics of Bacillus thuringiensis kurstaki. J Biotechnol. Doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.06.387
25. Özkan M, Dilek FB, Yetis U, Ozcengiz G (2003). Nutritional and Cultural parameters
influencing antidipteran delta-endotoxin production. Res. Microbiol. 154: 49-53.
26. Panarotto C (2006) Influência de parâmetros operacionais, fontes protéicas e
substratos energéticos sobre o cultivo de Bacillus thuringiensis var. israelensis.
Dissertação (Mestrado em Biotecnolgia). Instituto de Biotecnologia, Universidade de
Caxias do Sul, Caxias do Sul, RS, Brasil.
27. Polanczyk R, Alves S (2003) Bacillus thuringiensis: uma breve revisão. Agrociênc
VII (2):1-10.
28. Praça LB, Morinaga C, Medeiros PT, Melatti VM, Martins ES, Dumas VF, Falcão R,
Monnerat RG. (2009). Isolamento e caracterização de estirpes de Bacillus
thuringiensis coletadas em solos do oeste baiano. Universitas: Ciências da Saúde,
Brasília; 7 (2): 1-18.
29. Praça L.B (2003) Prospecção de estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis efetivas
contra insetos da ordem Lepidoptera, Coleoptera e Diptera. 117 p. Dissertação de
Mestrado. Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,
Brasília.
30. Robaina YB, Capalbo DMF, Nascimento RS (2009) Caracterización de cepas de
Bacillus thuringiensis berliner y actividad biológica hacia Spodoptera frugiperda (J.E.
Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) y Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera:
Noctuidae). Fitosanidad 13(3):187-192.
31. Rogoff M, Yousten AA (1969) Bacillus thuringiensis: microbiological considerations.
Ann Rev Microbiol 23: 357-386.
32. Sachidanandham R, Jenny K, Fiechter A (1997) Stabilization and increased
production of insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae in
stead- and transient-state continuous cultures. Appl Microbiol Biotechnol 47:12-17.
33. Saksinchai S, Suphantharika M, Verduyn C (2001) Application of a simple yeast
extract from spent brewer’s yeast for growth and sporulation of Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki: a physiological study. World J Microbiol Biotechnol 17: 307-316.
66
34. Vora D, Shethna YI (1999) Enhanced growth, sporulation and toxin production by
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in seed meal extract media containing cystine.
World J Microbiol Biotechnol 15:747-749.
35. Vu KD, Tyagy RD, Surampalli RY, Valéro JR (2012) Mathematical relationships
between spore concentrations, delta-endotoxin levels, and entomotoxicity of Bacillus
thuringiensis preparations produced in different fermentation media. Bioresour
Technol 123: 303–311.
36. Yezza A, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY (2005) Production of Bacillus
thuringiensis-based biopesticides in batch and fed batch cultures using wastewater
sludge as a raw material. J Chem Technol Biotechnol 80:502–510. DOI:
10.1002/jctb.1204
37. Yezza A, Tyagi RD, Valéro JR, Surampalli RY (2006) Correlation between
entomotoxicity potency and protease activity produced by Bacillus thuringiensis var.
kurstaki grown in wastewater sludge. Process Biochem 41:794–800.
38. Zouari N, Jaoua S (1999) Production and characterization of metalloproteases
synthesized concomitantly with d-endotoxin by Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
strain grown on gruel-based media. Enzyme Microb Tech 25:364–371.
67
CONCLUSÕES
B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 não utiliza sacarose como fonte de carbono. Isso pode
justificar melhores resultados de esporulação em pequena escala. No entanto, estudos
complementares são necessários para verificação da entomotoxicidade da proteína produzida
nessas condições;
Condições controladas de aeração e agitação durante o cultivo são essenciais para produção
da toxina inseticida;
As condições propostas para produção em batelada utilizando-se glicose como fonte de
carbono apresentaram resultados bastante satisfatórios quando comparados aos resultados
encontrados na literatura;
A produção em batelada alimentada utilizando glicose como fonte de carbono possibilita a
obtenção de um caldo mais concentrado em termos de células e consequentemente de
esporos e proteínas;
Com relação à formulação, faz-se necessário estudo de aprimoramento em termos de maior
proteção às endotoxinas de interesse. O ideal seria o acompanhamento da CL50 desde o
momento da formulação, ao longo dos meses para estabelecer o prazo de validade do
produto formulado.
68
REFERÊNCIAS
ABBOT LABORATORIES (US). Lee F. Adams; Per L. Jorgensen; Alan P. Sloma; Steen T.
Jorgensen; Michael D. Thomas; Borge K. Diderichsen; Willian R. Winder. Produção de
integrantes de Bacillus thuringiensi. PI 9611962-4, 17 fev. 1999.
ABBOT LABORATORIES (US). Lee Fremont Adams; Michel David Thomas; Alan P.
Sloma; Willian R. Widner. Processo para a obtenção de um integrante de Bacillus
thuringiensis, integrante de Bacillus thuringiensis ou esporo do mesmo, composição
pesticida, processo para controlar uma peste, construção de DNA e vetor DNA recombinante.
PI 9407067-9, 13 ago. 1996.
ABDEL-HAMEED, A. A stirred tank culture of Bacillus thuringiensis H-14 for production of
the mosquitocidal δ-endotoxin: matematical modelling and scalling-up studies. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 17, n. 9, p. 857-861, 2001.
ALAVANJA, M.C. Pesticides use and exposure extensive worldwide. Reviews on
Environmental Health, v. 24, p. 303-309, 2009.
ALVES, L.F.A.; ALVES, B.A.; LOPES, R.B.L.; AUGUSTO, N.T. Estabilidade de uma
formulação de Bacillus sphaericus armazenada sob diferentes temperaturas. Scientia
Agricola, v. 58, n. 1, p.21-26, 2001.
ANDERSON, R.K.I.; JAYARAMAN, K. Influence of carbon and nitrogen sources an the
growth and sporulation of Bacillus thuringiensis var. galleriae for biopesticide production.
Chemical and Biochemical Engineering, v. 17, n. 3, p. 225-231, 2003.
ANGELO, E.A.; VILAS-BÔAS, G.T.; CASTRO-GÓMEZ, R.J.H. Bacillus thuringiensis:
características gerais e fermentação. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 31, n. 4, p.
945-958, 2010.
ARORA, N.K.; KHARE, E.; MAHESHWARI, D.K. Plant growth promoting rhizobacteria:
constraints in bioformulation, commercialization, and future strategies. In: MAHESHWARI,
D.K. (Ed). Plant growth and health promoting bacteria. Berlin, Springer, p. 97-116, 2010.
BASHAN, Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture.
Biotechnology Advances, v. 16, p. 729-770, 1998.
BEHLE, R.; BIRTHISEL, T. Formulations of Entomopathogens as Bioinsecticides. In:
MORALES-RAMOS, J.A.; ROJAS, M.G.; SHAPIRO-ILAN, D.I. (Ed.). Mass Production of
Beneficial Organisms – Invertebrates and Entomopathogens. San Diego, Academic Press, p.
483-517, 2014.
BENOIT, T.G.; WILSON, G.R.; BAUGH, C.L. Fermentation During Growth and Sporulation
of Bacillus thuringiensis HD-1. Letters in Applied Microbiology, v. 10, p. 15-18, 1990.
BIRCH, A.N.E., BEGG, G.S., SQUIRE, G.R. How agro-ecological research helps to address
food security issues under new IPM and pesticide reduction policies for global crop
production systems. Journal of Experimental Botany, v. 62, p. 3251–3261, 2011.
69
BIZZARRI, M.F.; BISHOP, A.H. The ecology of Bacillus thuringiensis on the Phylloplane:
colonization from soil, plasmid transfer, and interaction with larvae of Pieris brassicae.
Microbial Ecology, v. 56, p. 133-139, 2008.
BONIOLO, F.S.; RODRIGUES, R.C.; PRATA, A.M.R.; LÓPEZ, M.L.; JACINTO, T.;
SILVEIRA, M.M.; BERBERT-MOLINA, M. A. Oxygen supply in Bacillus thuringiensis
fermentations: bringing new insights on their impact on sporulation and delta-endotoxin
production. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 94, n. 3, p. 625-36, 2012.
BOYETCHKO, S.; PEDERSEN, E.; PUNJA, Z.; REDDY, M. Fomulations of biopesticides.
In:HALL, F.R.; MENN, J.J. (Eds.). Biopesticides: Uses and Delivery. Totowa, NJ: Humana
Press, p. 487-508, 1999.
BROBOWSKI, V.L.; FIUZA, L.M.; PASQUALI, G.; BODANESE-ZANETTINI,
M.H. Bacillus thuringiensis genes: an approach to confer insect resistence to
plants. Ciência Rural, v. 33, n. 1, p. 843-850, 2003.
BRAR, S. K.; VERMA, M.; TYAGI, R. D.; VALÉRO, J. R.; SURAMPALLI R.Y.
Biopesticides – Bacillus thuringiensis. In: Sustainable Sludge Management. New Youk, p.
168-202, 2009. Available from: doi: 10.1061/9780784410516.ch08
BRAR, S.K.;VERMA, M.; TYAGI, R.D.; SURAMPALLI, R.Y.; BARNABÉ, S.; VALÉRO,
J.R. Bacillus thuringiensis proteases: Production and role in growth, sporulation and
synergism. Process Biochemistry, v.42, p.773-790, 2007.
BRAR, S. K.; VERMA, M.; TYAGI, R. D.; VALÉRO, J. R. Recent advances in downstream
processing and formulations of Bacilluss thuringiensis based biopesticides. Process
Biochemistry, v. 41, p. 323-342, 2006a.
BRAR, S.K.; VERMA, M.; TYAGI, R.D.; VALERO, J.R.; SURAMPALLI, R.Y. Efficient
centrifugal recovery of Bacillus thuringiensis biopesticides from fermented wastewater and
wastewater sludge. Water Research, v.40, n.6, p. 1310–1320, 2006b.
BRAR, S.K.; VERMA, M.; TYAGI, R.D.; VALERO, J.R.; SURAMPALLI, R.Y. Starch
industry wastewater based stable Bacillus thuringiensis liquid formulations.
Journal of Economic Entomology, v.98, n.6, p. 1890–1898, 2005.
BRAVO, A.; GILLB, S. S.; SOBERÓN, M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and
Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon, Amsterdam, v. 49, n. 4, p. 423-435,
2007.
BRAVO, A.; LIKITVIVATANAVONG, S.; GILL, S. S.; SOBERÓN, M. Bacillus
thuringiensis: A story of a successful bioinsecticide. Insect Biochemestry and Molecular
Biology, v. 30, p. 1-9, 2011.
CHANDLER, D., BAILEY, A.S., TATCHELL G.M., DAVIDSON, G., GREAVES J.,
GRANT W.P. The development, regulation and use of biopesticides for integrated pest
management. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., v. 366, p. 1987-1998, 2011.
70
COPPING, L.G.; MENN, J.J. Review biopesticides: a review of their action, application and
efficacy. Pest Management Science, v. 56, n. 5, p. 651-676, 2000.
CONTRERAS, E.; BENITO-JARDÓN, M.; LÓPEZ-GALIANO, M.J.; REAL, M.D.;
RAUSELL, C. Tribolium castaneum immune defense genes are differentially expressed in
response to Bacillus thuringiensis toxins sharing common receptor molecules and exhibiting
disparate toxicity. Developmental & Comparative Immunology, v. 50, n. 2, p. 139-145,
2015.
COUCH, T.L. Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic bacteria. In:
CHARLES, J.F. (Org.). Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field applications.
New York: Kluwer Academic Publisnes, p. 297-316, 2000.
COUCH, T.L.; JURAT-FUENTES, J.L. Commercial Production of Entomopathogenic
Bacteria. In: MORALES-RAMOS, J.A.; ROJAS, M.G.; SHAPIRO-ILAN, D.I. (Ed.). Mass
Production of Beneficial Organisms – Invertebrates and Entomopathogens. San Diego,
Academic Press, p.415-435, 2014.
CRICKMORE, N.; ZEIGLER, D.R.; FEITELSON, J.; SCHNEPF, E.; VAN RIE, J.;
LERECLUS, D.; BAUM, J.; DEAN, D.H. Revision of the nomenclature for the Bacillus
thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.
62, p. 807-813, 1998.
CRICKMORE, N.; BAUM, J.; BRAVO, A.; LERECLUS, D.;NARVA, K.; SAMPSON, K.;
SCHNEPF, E.; SUN, M.; ZEIGLER, D.R. Bacillus thuringiensis toxin nomenclature, 2014.
Disponível em: http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.
DULMAGE H. T. Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus thuringiensis var.
alesti. Journal of Invertebrate Pathology, n. 15, p. 232-239, 1970.
EMBRAPA. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (BR, DF). Rose Gomes Monnerat
Solon de Pontes; Carlos Marcelo Silveira Soares; Colin Berry. Composição baseada em
Bacillus spp. e gêneros correlatos e seu uso no controle de pragas. PI 0603879-4, 08 abril
2008.
EMBRAPA. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (BR, DF). Gaspar Gonzalez
Maldonado; Claudia Conti Medugno. Processo de obtenção de formulações flutuantes para
esporos, cristais e células de bactérias entomopatogênicas. PI 9502992-3, 03 nov. 1998.
EPA – Environmental Protection Agency, 2015. Disponível em:
http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/whatarebiopesticides.htm. Atualizado em 24 de
maio de 2015.
FEDERICI, B. A. Bacillus thuringiensis in Biological Control. In: BELLOWS, T.S.;
FISHER, T.W. (eds). Handbook of Biological Control. San Diego, Califórnia: Academic
Press, p. 575-593, 1999.
FINKLER, C.L.L. Controle de insetos: Uma breve revisão. Anais da Academia
Pernambucana de Ciências Agronômicas. v. 8 e 9, p. 169-189, 2011/2012.
71
FIOCRUZ. Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil). Leon Rabinovitch; Maria
Helena Luz da Silva; Thania Verginia Guaycurucus; Valéria Regina de Moura Castro.
Processo de obtenção de linhagens de bactérias amilolíticas e proteolíticas do gênero Bacillus
que encerram atividade específica letal para algumas ordens de insetos; composição do meio
de cultivo para semeadura das ditas linhagens de bactérias; processo de obtenção da biomassa
ativa de Bacillus entomopatogênicos; composição para cultivo bacteriano destinado à
produção da dita biomassa ativa e composição bioinseticida à base de bactérias amilolíticas e
proteolíticas do gênero Bacillus. BR n. PI 8900938-0, 09 out. 1990.
GHRIBI, D.; ZOUARI, N.; TRABELSI, H.; JAOUA, S. Improvement of Bacillus
thuringiensis delta-endotoxin production by overcome of carbon catabolite repression through
adequate control of aeration. Enzyme and Microbiol Technology, v. 40, p. 614-622, 2007.
GHRIBI, D.; ZOUARI, N.; TRIGUI, W.; JAOUA, S. Use of sea water as salts source in
starch- and soya bean-based media, for the production of Bacillus thuringiensis
bioinsecticides. Process Biochemistry, v. 42, p. 374-378, 2007.
GLARE, T.R.; O’CALLAGHAM, M. Bacillus thuringiensis, biology, ecology and safety.
Chichester: John Wiley and Sons, 2000.
IÇGEN, Y.; IÇGEN, B.; ÖZCENGIZ, G. Regulation of crystal protein biosynthesis by
Bacillus thutingiensis: II effects of carbon and nitrogen sources. Research in Microbiology,
v. 153, n. 9, p. 605-609, 2002.
IPCS INCHEM [homepage on the internet]. International Programme on Chemical Safety,
Word Health Organization; [accessed in 15/12/2014]. Environmental Health Criteria 217.
Bacillus thuringiensis. Available from:
http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc217.htm.
JALLOULI, W; SELLAMI, S.; SELLAMI, M.; TOUNSI, S. Impact of liquid formulation
based on ultrafiltration-recovered bioactive components on toxicity of Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki strain BLB1 against Ephestia kuehniella. Process Biochemistry, v. 49, n. 11,
p. 2010-2015, 2014a.
JACKSON, M.A.; DUNLAP, C.A.; JARONSKI, S.T. Ecological considerations in producing
and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol. BioControl, v. 55, p.
129-145, 2010.
JING-WEN, Z.; YA-FEI, C.; ZHENG-HONG, X.; ZI-NIU, Y.; SHOU-WEN, C. Production
of thuringiensin by fed-batch culture of Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis 032 with
an improved pH-control glucose feeding strategy. Process Biochemistry, v. 42, p. 52–56,
2007.
JISHA V.N., SMITHA R.B., BENJAMIN, S. An overview on the crystal toxins from
Bacillus thuringiensis. Adv. Microbiol., v. 3, p. 462-472, 2013.
JURAT-FUENTES, J.L.; JACKSON, T.A. Bacterial entomopathogens. In: VEGA, F.E.;
KAYA, H.K. (Eds.). Insect Pathology second ed. San Diego, Academic Press, p. 265-349,
2012.
72
LACEY, L.A.; GRZYWACZ, D.; SHAPIRO-ILAN, D.I.; FRUTOS, R.; BROWNBRIDGE,
M.; GOETTEL, M.S. Insect pathogens as biological control agents: back to the future.
Journal of Invertebrate Pathology, 2015. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2015.07.009
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, London, v.227, p. 680-685, 1970.
LAMBERT, B.; PEFEROEN, M. Insecticidal promise of Bacillus thuringiensis. Bioscience,
v. 42, n. 2, p. 112, 1992.
LECADET, M. M.; CHAUFAUX, J.; RIBIER, J.; LERECLUS, D. Construction of novel
Bacillus thuringiensis strains with different insecticidal activities by transduction and
transformation. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 58, p. 840-849,
1991.
MALAYSIAN PALM OIL BOARD (Malásia). Siti Ramlah Ahmad Ali; Mohamed Mazmira
Mohd Masri; Mohd Najib Ahmad; Mohd Basri Wahid. Método para obtenção de inseticida à
base de B. thuringiensis. BR n. PI 10 2012 001397-5 A2, 21 jan. 2014.
MALDONADO-BLANCO, M. G.; ROMERO, G. S.; GALÁN-WONG, L. J. The effect of
oxygen tension on the production of Bacillus thuringiensis supbs. israelensis toxin active
agains Aedes aegypti larvae. World journal of Microbiology & Biotechnology, Oxford, v.
19, n. 7, p. 671-674, 2003.
MIGNONE, C.F.; AVIGNONE-ROSSA, C. Analysis of Glucose Fluxes in Continous
Cultures of Bacillus thuringiensis. Applied Microbiology Biotechnology, v. 46, n. 1, p. 78-
84, 1996.
MNIF I., GHRIBI, D. Potential of bacterial derived biopesticides in pest management. Crop
Protection, v. 77, p. 52-64, 2015.
MILLER, G.L. Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, v. 31, p. 426-428, 1959.
MONNERAT, R. G., BATISTA, A.C., MEDEIROS, P.T., MARTINS, E.S., MELATTI,
V.M., PRAÇA, L.B., DUMAS, V.F., MORINAGA, C., DEMO, C., GOMES, A.C.M.,
FALCÃO, R., SIQUEIRA, C.B., SILVA-WERNWCK, J.O., BERRY, C. Screening of
Brazilian Bacillus thuringiensis isolates active against Spodoptera frugiperda, Plutella
xylostella and Anticarsia gemmatalis. Biological Control, v. 41, p. 291-295, 2007.
MONSANTO COMPANY (US). Jay Myls Stuart Henis; Carol Ann Baker; Robert
Ziolkowski Greenley; Albert Arthur Brooks. Processo para encapsular um material biológico,
composição e processo para aplicar um material biológico à superfície da folha de plantas.
EP 0320483 B1, Jun. 14th, 1989 ou BR n. PI 8806519-7 A2, 22 ago. 1989.
MONSANTO TECHNOLOGY LLC (US). Judith C. Donivan; Willian P. Donovan; James T.
Engleman; Thomas Malvar; John W. Pitkin. Composições protéicas e gênicas inseticidas
secretadas a partir de Bacillus thuringiensis e seus usos. PI 0417735-5, 03 abril 2007.
73
MOREIRA, G.A.; MICHELOUD, G.A.; BECCARIA, A.J.; GOICOECHEA, H.C.
Optimization of the Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 -endotoxins production by
using experimental mixture design and artificial neural networks. Biochemical Engineering
Journal. v.35, p. 48-55, 2007.
MOUNSEF J.R., SALAMEH D., LOUKA N., BRANDAM C., LTEIF R. The effect of
aeration conditions, characterized by the volumetric mass transfer coefficient KLa, on the
fermentation kinetics of Bacillus thuringiensis kurstaki. Journal of Biotechnology, 2015.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.06.387
MISHRA, J., TEWARI, S., SINGH S., ARORA, N.K. Biopesticides: Where we stand? In:
ARORA, N.K. Plant Microbes Symbiosis: Applied facets. India: Springer, p. 37-75, 2015.
OBETA, J.A.M.; OKAFOR, N. Medium for the Production of primary Power of Bacillus
thuringiensis subsp. israelensis. Applied and Environmental Microbiology, v. 47, p. 863-
867, 1984.
ÖZKAN, M.; DILEK, F.B.; YETIS, U.; OZCENGIZ, G. Nutritional and Cultural parameters
influencing antidipteran delta-endotoxin production. Research in Microbiology, v. 154, p.
49-53, 2003.
OZCAN, O.; ICGEN, B.; OZCENGIZ, G. Pretreatment of poultry litter improves Bacillus
thuringiensis-based biopesticides production. Bioresource Technology. v.101, p. 2401-2404,
2010
PANAROTTO, C. Influência de parâmetros operacionais, fontes protéicas e substratos
energéticos sobre o cultivo de Bacillus thuringiensis var. israelensis. 2006.
Dissertação (Mestrado em Biotecnolgia). Instituto de Biotecnologia, Universidade
de Caxias do Sul, Caxias do Sul, RS. Brasil. 2006.
PÉREZ-GARCÍA, A.; ROMERO, D.; VICENTE, A. Plant protection and growth stimulation
by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture. Current Opinion
in Biotechnology, v. 22, n. 2, p. 187-193, 2011.
POLANCZYK, R.; ALVES, S. Bacillus thuringiensis: Uma breve revisão. Agrociência
Vol.Vll, n.2 p.1-10, 2003
PRABAKARAN, G.; HOTI, S.L. Application of different downstream processing methods
and their comparison for the large-scale preparation of Bacillus thuringiensis var. israelensis
after fermentation for mosquito control. Biologicals, v. 36, n. 6, p. 412-415, 2008.
PRAÇA, L.B., BATISTA, A.C., MARTINS, E.S., SIQUEIRA, C.B., DIAS, D.G.S., GOMES,
A.C.M.M., FALCÃO, R., MONNERAT, R.G. Prospecção de estirpes de Bacillus
thuringiensis efetivas contra insetos da ordem lepdoptera, coleóptera e díptera. Boletim de
pesquisa e Desenvolvimento, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, n. 41, 2003.
PRAÇA, L.B. Prospecção de estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis efetivas contra
insetos da ordem Lepidoptera, Coleoptera e Diptera. 2003. 117 p. Dissertação de Mestrado.
Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Brasília, 2003.
74
PRAÇA L.B., MORINAGA C., MEDEIROS P.T., MELATTI V.M., MARTINS E.S.,
DUMAS V.F., FALCÃO R., MONNERAT R.G. Isolamento e caracterização de estirpes de
Bacillus thuringiensis coletadas em solos do oeste baiano. Universitas: Ciências da Saúde,
v.7, n. 2, p. 1-18, 2009.
RAYMOND, B.; JOHNSTON, P. R.; NIELSEN-LEROUX, C.; LERECLUS, D.;
CRICKMORE, N. Bacillus thuringiensis: an impotent pathogen? Cell press, v. 18, n. 5,
p.189-194, 2010.
ROBAINA, Y.B.; CAPALBO, D.M.F.; NASCIMENTO, R.S. Caracterización de cepas de
Bacillus thuringiensis Berliner y actividad biológica hacia Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae) y Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae).
Fitosanidad, Ciudad de la Habana, v. 13, n. 3, p. 187-192, 2009.
ROBERTSON, J. R.; PREISLER, H. K.; RUSSELL, M. Polo Plus. Probit and logit analysis
user´s guide. LeOra Software, Petaluna, CA. 2002
ROGOFF, M; YOUSTEN, A.A. Bacillus thuringiensis: Microbiological Considerations.
Annual Review of Microbiology, v. 23, p. 357-386, 1969.
SACHIDANANDHAM, R.; JENNY, K.; FIECHTER, A. Stabilization and increased
production of insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae in stead-
and transient-state continuous cultures. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 47, p.
12-17, 1997.
SAKSINCHAI, S.; SUPHANTHARIKA, M.; VERDUYN, C. Application of a simple yeast
extract from spent brewer’s yeast for growth and sporulation of Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki: a physiological study. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 17,
p. 307-316, 2001.
SANDOZ A.G. (CH) Cindy Lou Jellis; Noah Daniel Beerman; Jean-Chistoph Piot. Células de
Bacillus thuringiensis kurstaki HD 562, composição inseticida, processo para a transformação
de células hospedeiras de Bacillus thuringiensis, células de Bacillus thuringiensis tenebrionis
e células de Bacillus thuringiensis aizawai. PI 9006419 A, 24 set. 1991.
SANDOZ A.G. (Reino Unido). Dimitri Karamata; Jean-Christophe Piot. Células de Bacillus
thuringiensis, células bacterianas híbridas, processo para sua preparação, composições
inseticidas e método para combater insetos. BR n. PI 8605301-9, 28 jul.1987.
SAUKA, D. H.; BENINTENDE, G. B. Bacillus thuringiensis: generalidades: Un
acercamiento a su empleo en el biocontrol de insectos lepidópteros que son plagas agrícolas.
Revista Argentina de Microbiologia, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, v. 40, n. 2, jun.
2008.
SMITHA, R.B.; JISHA, V.N.; PRADEE, S.; JOSH M.S.; BENJAMIM, S. Potato flour
mediated solid-state fermentation for the enhanced production of Bacillus thuringiensis. J.
Biosci. Bioeng., 2013. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.05.008
75
SENTHIL-NATHAN, S. A review of biopesticides and their mode of action against insect
pest. In: THANGAVEL, P.; SRIDEVI, G. Environmental Sustainability. India: Springer;
2015. p. 49-63.
SPADARO, D.; GULLINO, M.L. Improving the efficacy of biocontrol agents against soil
borne pathogens. Crop Protection, v. 24, p. 601-613, 2005.
STATSOFT, Inc. Statistica Version 7.0. Statsoft®, Tulsa, OK, USA, 2004.
TAMEZ-GUERRA, P.; GALÁN-WONG, L.J.; MEDRADO-ROLDÁN, H.; GARCÍA-
GUTIÉRREZ, C.; RODRÍGUZ-PADILHA, C.; GÓMEZ-FLORES, R.Q.; TAMEZ-
GUERRA, R.S. Bioinsecticidas: su empleo, producción y comercialización em México.
Ciência UANL, v. 4, n. 2, p.143-152, 2001.
UEL. Universidade Estadual de Londrina (BR, PR). Olivia Marcia Nagy Arantes; José Lopes.
Formulações farmacêuticas de bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis e processos
envolvidos nas suas preparações. PI 0307137-5, 08 mar. 2005.
VALICENTE, F.H. Controle biológico de pragas com entomopatógenos. Informe
Agropecuário, v. 30, n. 251, p. 48-55, 2009.
VELIVELLI, S.L.S.; DE VOS, P.; KROMANN, P.; DECLERCK, S.; PRESTWICH, B.D.
Biological control agents: from field to market, problems, and challenges. Trends in
Biotechnology, v. 32, n.10, p.493-496, 2014.
VIMALA DEVI, P.S.; RAVINDER, T.; JAIDEV, C. Barley-based medium for the cost-
effective production of Bacillus thuringiensis. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, n. 21, p. 173-178, 2005.
VORA, D.; SHETHNA, Y.I. Enhanced growth, sporulation and toxin production by
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in seed meal extract media containing cystine.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, v.15, p.747-749, 1999.
VU, K.D.; TYAGI R.D.; SURAMPALLI, R.Y.; VALÉRO, J.R. Mathematical relationships
between spore concentrations, delta-endotoxin levels, and entomotoxicity of Bacillus
thuringiensis preparations produced in different fermentation media. Bioresource
Technology, v. 123, p. 303–311, 2012.
XUE, J.L.; CAI, Q.X.; ZHENG, D.S.; YUAN, Z.M. The synergistic activity between Cry 1Aa
and Cry 1C from Bacillus thuringiensis against Spodoptera exigua and Helicoverpa armigera.
Letters Applied Microbiology, n. 40, p. 460-465, 2005.
WHITELEY H. R.; SCHNEPF H. E. The molecular biology of parasporal crystal body
formation in Bacillus thuringiensis. Annual Review of Microbiology, v. 40, p. 549-576,
1986.
YEZZA, A.; TYAGI, R.D.; VALÉRO, J.R.; SURAMPALLI, R.Y. Production of Bacillus
thuringiensis-based biopesticides in batch and fed batch cultures using wastewater sludge as a
raw material. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 80, p. 502-510, 2005.
76
YEZZA, A.; TYAGI, R.D.; VALÉRO, J.R., SURAMPALLI, R.Y. Correlation between
entomotoxicity potency and protease activity produced by Bacillus thuringiensis var. kurstaki
grown in wastewater sludge. Process Biochemistry, v. 41, p. 794–800, 2006.
YILMAZ, S. Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its application in sustainable
agriculture. Journal of Biotechnology, v. 161S, p. 5-12, 2012.
ZOUARI, N.; JAOUA, S. Production and characterization of metalloproteases synthesized
concomitantly with d-endotoxin by Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain grown on
gruel-based media. Enzyme and Microbial Technology, v. 25, p. 364–371, 1999.
77
ANEXOS
Anexo 1
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
General Information
The journal Brazilian Archives of Biology and Technology – BABT publishes:
Original articles of research;
Short communications;
Review articles.
Aims and Scope The journal's aim is to advance and disseminate knowledge in all the related areas:
Agriculture, Agribusiness and Biotechnology;
Human and Animal Health;
Biological and Applied Sciences;
Food/Feed Science and Technology;
Environmental Sciences;
Engineering, Technology and Techniques.
The manuscript must be prepared in English only (We suggest that the manuscript should be
reviewed before its submission for the first time by an English speaker and, preferably,
scientific experience in the area).
The submission of a manuscript to the Brazilian Archives of Biology and Technology
implies that:
- The manuscript hasn' t been partial or entirely published. The manuscript should not be in
selection process for publishing in another journal and/or another language;
- The submission must have been approved for all the co-authors and whenever necessary, by
the authorities of the institution where the work was developed;
- Any study involving human subjects should have Ethic Institutional Review Board
Approval and the protocol number should be informed.
- When working with experimental animal the regulations should be observed and the work
should be approved by the local ethical committee. The protocol number should be informed.
- Authors must ensure that the manuscript does not represent misconduct like fabrication,
falsification, plagiarism or duplication of dates. In case of confirmed research misconduct,
we will issue a retraction notice to correct the scientific record. Please refer to Singapore
78
Statement at: http://www.singaporestatement.org/statement.html
- Manuscripts submitted to BABT should not contain plagiarism and other forms of scholarly
misconduct;
- The journal does not take responsibility and/or takes part in eventual lawsuits related to the
published articles.
-The veracity of the information and of the bibliographic citations is of exclusive
responsibility of the authors.
Submission of manuscripts will only be accepted when submitted electronically using
the following link:
http://mc04.manuscriptcentral.com/babt-scielo
The authors are entirely responsible for their texts and must sign and submit the Authorship
Responsibility and Copyright Transfer Statements in accordance with the attached model.
The BABT strongly condemns plagiarism and self-plagiarism. Authors must make sure that
the content is unpublished and original. Previously published ideas should be properly cited
in accordance with the norms.
The submitted manuscripts are pre-evaluated in its conformity to the norms, grammatical
quality and English language. The authors need to observe the content referring to scientific
relevance and/or technological and originality. Manuscripts accepted in this stage will be
forwarded for review by specialists and sent for judgment by at least two referees.
When submitting a manuscript, please check:
- The names of the authors must appear only in the register and not in the manuscript, to
double-blind trial
- The authors should indicate five specialists of the same area of the manuscript who may
eventually contribute to the evaluation process.
Authorship
Any changes regarding the inclusion, exclusion or reorganization of names of authors in the
manuscript must be formally requested during the process of evaluation. The document might
be forwarded by the Scielo system (ScholarOne plataform), dated and signed by all authors,
still including the confirmation of inclusion or exclusion, containing:
- Article title;
- Reason for the change;
- Names of the authors organized.
Publication Ethics Statement
Scientific Research Publishing (SCIRP) is committed to maintain high standard through a
rigorous peer-review together with strict ethical policies. Any infringements of professional
ethical codes, such as plagiarism, fraudulent use of data, bogus claims of authorship, should
be taken very seriously by the editors with zero tolerance. SCIRP follows the Code of
79
Conduct of the Committee on Publication Ethics (COPE), and follows the COPE Flowcharts
for Resolving Cases of Suspected Misconduct. The submitted manuscript should not have
been previously published in any form and must not be currently under consideration for
publication elsewhere.
Organization of the manuscript
The manuscript must be organized according to the following categories
Research paper: the file must contain Title, Running title, Abstract (maximum 250 words),
Key words (three to six), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion,
Acknowledgments and References. The maximum numbers of the pages are 12 (single space
typed using Times New Roman font).
Short communications: the file must contain title, authors and affiliations, abstract
(maximum 50 words), three to six key-words; text not divided in topics; acknowledgements
(optional), references. The maximum numbers of the pages are 6 (single space typed using
Times New Roman font).
Reviews: the file must contain title, authors and affiliations, abstract (up to 250 words), six
key-words, text with subtitles, acknowledgements (optional) and references. The maximum
numbers of the pages are 12 (single space typed using Roman Font).
The manuscript must be arranged in the following order:
Title Must be precise, clearly reflecting the content of the manuscript.
Running Title Must be short, reflecting the content of the manuscript.
Abstract Must be prepared as concise as possible, describing the goal and the results of the study.
Key-words Must presented terms or subjects that represent the content of the manuscript, which will be
used in the index of the article.
Introduction Must present the purpose of the study, clearly presenting the explanations and objectives of
the article, offering information, which allows the reader to properly evaluate the presented
results, specifying what new progress was obtained from research. The introduction must not
contain data or conclusions from the referred manuscript.
Materials and Methods Must offer, in a clear and concise way, enough information allowing other researchers to
80
reproduce the study. Standardized techniques don' t need to be described in details.
Results and Discussion These sections can be presented separately or in a combined way.
Results Must offer a concise description of the results obtained in the necessary experiments to
sustain the conclusions of the research. The section can be divided in sub-sections, each of
them with a subtitle. Do not repeat in the text all the data presented in tables or illustrations
that may be used when necessary.
Discussion This section should be limited to the content of the new information, relating them to the pre-
existing knowledge. Only the indispensable citations must be included.
Conclusions The main conclusions must be presented in a concise and clear way.
Acknowledgments This section is optional. Must be brief, used to thank/quote people, scholarships, projects and
support received from organisms of promotion. The names of the financing organizations
must be fully written.
References Only the citations included in the text must be presented, being referenced and organized in
alphabetic order, considering the last name of the first author. Non-published results must not
be included in the references list. Only article in ahead of print and with d.o.i or e-pub can be
refereed. Observe that all references given in the list should be cited in the text and vice
versa.
Preparation of the manuscript
The manuscript must be prepared in one column with maximum 12 pages (single space typed
using Times New Roman font) for original and review manuscripts and maximum 6 pages
(single space typed using Times New Roman font) for short notes (including tables, graphics,
figures, images and references) in MS-Word (.doc) format, paper size A-4 (210x297 cm),
with margins (2.5 cm left, right 2.0 cm, top and bottom 3.0 cm).
* Save the file in doc Format.
* * The journal is published in printed form only in gray scale. In online publication, figures
can be in color form.
* * * Abbreviations of terms and symbols should follow the recommendations of the units
according to SI (International Systems of Units).
* * * * Scientific names: The International Code of Zoological Nomenclature and
International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants must be observed.
Title (Font 18 and Bold) With initials capitalized up to 250 words.
81
Running title (Font 12): with up to 40 words.
Authors and institutional affiliation There must not be information that identifies authorship, institutional address or e-mail in the
manuscript. These informations are registered at the moment of the submission of the
manuscript and put in the article only after its acceptation.
Abstract (Font 12 and bold) Text - Font 10, italicized with up to 200 words (100 words for short notes). The Font style
must be normal for scientific names, being highlighted in the text.
Key-words (Font 10 and bold) Font 10, separated by a comma. There must be at least 3 (three) and up to 6 (six) terms.
INTRODUCTION (Font 12, bold and caps lock) Text - Font 11, 1 column, simple space and no retreat in the paragraphs.
MATERIAL AND METHODS (Font 12, bold and caps lock) Text - Font 11, one column, simple space and no retreat in the paragraphs.
For Titles and Subtitles, use the following levels:
• First level - Other sections can be created: uppercase, font 12, bold.
• Second level: only the first letter of each word is uppercase, font 11, bold
• Third level: only the first letter of each word is uppercase, font 11, italicized.
RESULTS AND DISCUSSION (Font 11, bold and caps lock) Text - Font 11, 1 column, simple space and no retreat in the paragraphs.
CONCLUSIONS (Font 12, bold and caps lock) Text - Font 11, 1 column, simple space and no retreat in the paragraphs.
ACKNOWLEDGMENTS (Font 12, bold and caps lock) Text - Font 11, simple space and no retreat in the paragraphs.
REFERENCES (Font 12) Reference list should be in Font 10, with special retreat of 0.3 cm, being referenced and
organized in alphabetic order, considering the last name of the first author. The full list of
references, at the end of the article, must follow the Vancouver style see link below:
(http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html).
The titles of the journals must be abbreviated as like: Braz Arch Biol Technol.
The abbreviation of the journal list of abbreviations to be consulted:
• In the specific journal, or
• ISI Journal Title Abbreviations. http://www.efm.leeds.ac.uk/~mark/ISIabbr/ ; or
• Biological Journals and Abbreviations, or
• Index Medicus - abbreviations of journal titles, or
82
• Title Word Abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-online.php
All references cited in the text should be in the references list and vice versa.
- For citation in the text, use the author' s last name and the date:
One author: Bacila (1946) or (Bacila 1946).
Two authors: (Maack and Bodziak 1946) or Maack and Bodziak (1946).
Three or more authors: Last name of the first author followed by et al. Bacila et al.
(1946) or (Bacila et al. 1946).
Obs 1: more than one reference from the same author (s) in the same year, must be identified
by the letters "a", "b", "c", etc, put after the year of publication. (Bacila et al. 1910a, 1910b)
Obs 2: When several authors are cited in the text, the citation should be presented in
chronologically order (George et al. 2004; Ilahy et al. 2011; Pinela et al. 2012).
- List of references: The full list of references, at the end of the article, must follow the Vancouver style
(http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html) and should be placed first
alphabetically, then numbered chronologically.
Important Note: All the cited references should be from the journals in English language (no non-English
language reference should be included).
Journal Article Author(s) of the article. Title of the article. Title of the journal, abbreviated italicized. Date of
publication; volume (number/supplement): initial-final page of the article.
Examples: - One author up to six authors: Pandey A. Recent developments in solid-state fermentation.
Process Biochem. 1992; 27: 109-117.
Halpern SD, Ubel PA, Caplan AL. Solid-organ transplantation in HIV-infected patients. N
Engl J Med. 2002; 347(4): 284-287.
- More than six authors: (list the first six authors followed by "et al.") Arakaki AH,
Vandenberghe LPS, Thomaz Soccol V, Masaki R, Rosa Filho EF, Gregório A, et al.
Optimization of Biomass Production with Copper Bioaccumulation by Yeasts in Submerged
Fermentation. Braz Arch Biol Technol. 2011; 54(5): 1027-1032.
Web article Author(s) of the article. Title of the article. Title of the journal abbreviated italicized [journal
in the internet]. Date of publication [date of accession]; volume (number): number of pages.
Available from: address of the website.
Example:
83
Nandan A, Gaurav A, Pandey A, Nampoothiri KM. Arginine specific aminopeptidase from
Lactobacillus brevis. Braz Arch Biol Technol [Internet]. 2010 [cited 2011 Oct. 19]; 53 (6):
1443-1450. Available from:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_pdf&pid=S151689132010000600021&lng=pt&nr
m=iso&tlng=en
In books Authors. Book title. Edition. City: Publisher; Year.
Example: Soccol CR, Pandey A, Larroche C. Fermentation Processes Engineering in the Food Industry.
1. ed. New York: CRCPress, 2013, 510p .
Chapter in book Authors. Chapter Title. In: Editors. Book title. Edition. City: Publisher; Year. Pages of
citation.
Example: Tengerdy RP. Solid substrate fermentation for enzyme production. In: Pandey A, editor.
Advances in Biotechnology. New Delhi: Educational Publishers & Distributors; 1998. p. 13-
16.
In conferences Author(s) of the work. Title of the presented work. In: responsible editor(s) for the event (if
any). Title of the event: Proceedings of … title of the event; date of the event; place of the
event. City of publication: Publisher; Year of publication. Initial- final page of the work.
Example: Vitola, FMD, Miyaoka M, Bellettini MB; Santos LF; Thomaz-Soccol V, Soccol, CR.
Vermiculite as a support for the cryopreservation of Agaricus subrufescens mycelium. In: VII
International Symposium on mushrooms in Brazil, 2013, Manaus. Anais VII International
Symposium on mushrooms in Brazil. Brasília: Embrapa; 2013. v. 1. p. 386-386.
Part of Website/ homepage Author(s) of the homepage (if any). Title [homepage on the internet]. City: institution; date(s)
of register [date of the last update with the expression "updated in"; date of access with the
expression "accessed in"]. Title of the part of the homepage. Available from: website
address.
UNITS AND ABBREVIATIONS The "SI" system must be used. In the case of other units, they must be added in parentheses.
Only the standard abbreviations for the units must be used. Dots must not be included in the
abbreviations.
TABLES Must be numbered consecutively in Arabic digits and inserted in proper place in the text. A
brief and descriptive title must be included above each table and the explanations put below
as a subtitle.
Formatting of Tables:
84
- Title and content: Font Times New Roman 10.
- Footnotes: Font Times New Roman 9.
- Width 16.5 cm.
- Vertical and Diagonal lines must not be used in tables.
- The tables must be elaborated and edited in cells, using the resources of the text editor.
Observation: Tables in figure format (jpg, tiff or png) are not accepted, or that contain lines
drawn
FIGURES Must be numbered consecutively in Arabic digits and cited in the text in numerical order.
- Figures must be presented in gray scale, clear and with high contrast, in press form. Only
online publication the figures can be in color form.
- Letters and numbers must have readable size after reduction or print, use the following
fonts: Times New Roman, 18.
-Images must be adjusted to the width (16.5 cm) of the page, and must be smaller than the
page to allow the inclusion of the subtitle.
- Figures must presented in separated file and in tiff format with a minimum of 300 dpi
Illustrations must be cited in the text with the word "Figure", without being abbreviated when
it is part of a sentence. When it appears in parentheses, it must be abbreviated "(Fig.)".
- When figures present different parts, each one must be indicated by uppercase (Fig. 1 A, B,
C, etc).
- Page charges: there will be no page charges.
-Proofs: After the layout, the manuscript is converted to pdf (proof sheet) and forwarded to
the authors for approval. The Proofs must return to the Editorial Production in the stipulated
date (72 hours). Other changes in the original manuscript won' t be accepted in this stage.
Prof. Dr. Carlos R. Soccol Brazilian Archives of Biology and Technology
Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader 3775-CIC
81350-010 Curitiba-PR, Brazil
Tel.: +55-41-3316-3012/3316-3052
Email: mailto:[email protected]
85
Anexo 2
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology
Official Journal of the Society for Industrial Microbiology and Biotechnology
Editor-in-Chief: Ramon Gonzalez
ISSN: 1367-5435 (print version)
ISSN: 1476-5535 (electronic version)
Journal no. 10295
Instructions for Authors
Authorship Policy
Authorship should incorporate and should be restricted to those who have contributed
substantially to the work in one or more of the following categories:
• Conceived of or designed study
• Performed research
• Analyzed data
• Contributed new methods or models
• Wrote the paper
Editorial Procedure
Upon receipt, manuscripts will be assigned a manuscript tracking number and forwarded to a
Senior Editor. The corresponding author will be notified via e-mail when the manuscript is
received and informed of the manuscript tracking number and the Senior Editor who will be
handling the review. Queries regarding the review and revisions of the manuscript should be
directed to the Senior Editor. The manuscript tracking number should be included in all
correspondence regarding the submission.
The Senior Editor advises the corresponding author of his/her and the reviewers’ comments.
If minor or major revisions are recommended, revised manuscripts should be returned to the
Senior Editor handling the manuscript. Revised manuscripts should be submitted directly to
the Senior Editor as e-mail attachments. At this point in the review process, higher-quality
figures may be requested if necessary. Accepted manuscripts will not be forwarded to the
publisher without an electronic copy of the final revision. Papers that do not conform to the
journal norms will be returned to the authors for revision before being considered for
publication. When the Senior Editor is satisfied that the manuscript is ready for acceptance,
s/he forwards it to the Editor-in-Chief for final acceptance.
Types of Papers
The journal accepts manuscripts for the following sections:
Original Papers should normally not exceed 16 printed pages (one printed page corresponds to
about 4300 characters respectively 750 words, font size 10 point Times Roman of text or 3
illustrations with their legends).
Short Communications should not exceed 3 printed pages.
Letters to the Editor should not exceed 2 printed pages.
Review Papers, including mini-reviews, should be critical reviews on subjects of interest to
industrial and applied microbiologists. The length of the article will depend on the subject.
Authors considering preparation of a review should contact the Editor-in-Chief in advance to
determine the suitability of the topic.
All manuscripts are subject to copy-editing after acceptance.
86
Manuscript Submission
Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before;
that it is not under consideration for publication anywhere else; that its publication has been
approved by all co-authors, if any, as well as by the responsible authorities – tacitly or
explicitly – at the institute where the work has been carried out. The publisher will not be held
legally responsible should there be any claims for compensation.
Permissions
Authors wishing to include figures, tables, or text passages that have already been published
elsewhere are required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and
online format and to include evidence that such permission has been granted when submitting
their papers. Any material received without such evidence will be assumed to originate from
the authors.
Online Submission
Please follow the hyperlink “Submit online” on the right and upload all of your manuscript
files following the instructions given on the screen.
In case a multi-author manuscript is submitted authors should state that all authors have
agreed to submit this manuscript to the "Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology”.
Title Page
The title page should include:
The name(s) of the author(s)
A concise and informative title
The affiliation(s) and address(es) of the author(s)
The e-mail address, telephone and fax numbers of the corresponding author
Abstract
Please provide an abstract of 100 to 150 words. The abstract should not contain any undefined
abbreviations or unspecified references.
Keywords
Please provide up to 5 keywords which can be used for indexing purposes.
Text
Text Formatting
Manuscripts should be submitted in Word.
Use a normal, plain font (e.g., 10-point Times Roman) for text.
Use italics for emphasis.
Use the automatic page numbering function to number the pages.
Do not use field functions.
Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.
Use the table function, not spreadsheets, to make tables.
Use the equation editor or MathType for equations.
Save your file in docx format (Word 2007 or higher) or doc format (older Word versions).
Manuscripts with mathematical content can also be submitted in LaTeX.
LaTeX macro package (zip, 182 kB)
87
Headings
Please use no more than three levels of displayed headings.
Abbreviations
Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter.
Footnotes
Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a
reference included in the reference list. They should not consist solely of a reference citation,
and they should never include the bibliographic details of a reference. They should also not
contain any figures or tables.
Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by
superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data).
Footnotes to the title or the authors of the article are not given reference symbols.
Always use footnotes instead of endnotes.
Acknowledgments
Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section on the
title page. The names of funding organizations should be written in full.
Please keep the description of any acknowledgments or grants as short as possible.
Please note: Any grant that requires acknowledgement should be mentioned.
Additional Formatting Instructions for JIMB
Please note that all lines need to be sequentially numbered and double-spaced.
References
Citation
Reference citations in the text should be identified by numbers in square brackets. Some
examples:
1. Negotiation research spans many disciplines [3].
2. This result was later contradicted by Becker and Seligman [5].
3. This effect has been widely studied [1-3, 7].
Reference list
The list of references should only include works that are cited in the text and that have been
published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works
should only be mentioned in the text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for a
reference list.
Reference list entries should be alphabetized by the last names of the first author of each work
and numbered consecutively.
Journal article
Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009) Effect
of high intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent children. Eur J
Appl Physiol 105:731-738. doi: 10.1007/s00421-008-0955-8
Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long author
lists will also be accepted:
Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med
965:325–329
Article by DOI
Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J
Mol Med. Doi:10.1007/s001090000086
Book
South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London
Book chapter
88
Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern
genomics, 3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257
Online document
Doe J (1999) Title of subordinate document. In: The dictionary of substances and their
effects. Royal Society of Chemistry. Available via DIALOG. http://www.rsc.org/dose/title of
subordinate document.
Accessed 15 Jan 1999
Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title
Word Abbreviations, see
ISSN.org LTWA
If you are unsure, please use the full journal title.
For authors using EndNote, Springer provides an output style that supports the formatting of
in-text citations and reference list.
Endnote style (zip, 2 kB)
Tables
All tables are to be numbered using Arabic numerals.
Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.
For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the table.
Identify any previously published material by giving the original source in the form of a
reference at the end of the table caption.
Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or asterisks for
significance values and other statistical data) and included beneath the table body.
Artwork and Illustrations Guidelines
Electronic Figure Submission
Supply all figures electronically.
Indicate what graphics program was used to create the artwork.
For vector graphics, the preferred format is EPS; for halftones, please use TIFF format.
MSOffice files are also acceptable.
Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.
Name your figure files with "Fig" and the figure number, e.g., Fig1.eps.
Line Art
89
Definition: Black and white graphic with no shading.
Do not use faint lines and/or lettering and check that all lines and lettering within the figures
are legible at final size.
All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide.
Scanned line drawings and line drawings in bitmap format should have a minimum resolution
of 1200 dpi.
Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.
Halftone Art
Definition: Photographs, drawings, or paintings with fine shading, etc.
If any magnification is used in the photographs, indicate this by using scale bars within the
figures themselves.
Halftones should have a minimum resolution of 300 dpi.
90
Combination Art
Definition: a combination of halftone and line art, e.g., halftones containing line drawing,
extensive lettering, color diagrams, etc.
Combination artwork should have a minimum resolution of 600 dpi.
Color Art
Color art is free of charge for online publication.
If black and white will be shown in the print version, make sure that the main information will
still be visible. Many colors are not distinguishable from one another when converted to black
and white. A simple way to check this is to make a xerographic copy to see if the necessary
distinctions between the different colors are still apparent.
If the figures will be printed in black and white, do not refer to color in the captions.
Color illustrations should be submitted as RGB (8 bits per channel).
Figure Lettering
To add lettering, it is best to use Helvetica or Arial (sans serif fonts).
Keep lettering consistently sized throughout your final-sized artwork, usually about 2–3 mm
(8–12 pt).
Variance of type size within an illustration should be minimal, e.g., do not use 8-pt type on an
axis and 20-pt type for the axis label.
Avoid effects such as shading, outline letters, etc.
Do not include titles or captions within your illustrations.
Figure Numbering
All figures are to be numbered using Arabic numerals.
Figures should always be cited in text in consecutive numerical order.
Figure parts should be denoted by lowercase letters (a, b, c, etc.).
If an appendix appears in your article and it contains one or more figures, continue the
consecutive numbering of the main text. Do not number the appendix figures,
"A1, A2, A3, etc." Figures in online appendices (Electronic Supplementary Material) should,
however, be numbered separately.
Figure Captions
91
Each figure should have a concise caption describing accurately what the figure depicts.
Include the captions in the text file of the manuscript, not in the figure file.
Figure captions begin with the term Fig. in bold type, followed by the figure number, also in
bold type.
No punctuation is to be included after the number, nor is any punctuation to be placed at the
end of the caption.
Identify all elements found in the figure in the figure caption; and use boxes, circles, etc., as
coordinate points in graphs.
Identify previously published material by giving the original source in the form of a reference
citation at the end of the figure caption.
Figure Placement and Size
Figures should be submitted separately from the text, if possible.
When preparing your figures, size figures to fit in the column width.
For most journals the figures should be 39 mm, 84 mm, 129 mm, or 174 mm wide and not
higher than 234 mm.
For books and book-sized journals, the figures should be 80 mm or 122 mm wide and not
higher than 198 mm.
Permissions
If you include figures that have already been published elsewhere, you must obtain
permission from the copyright owner(s) for both the print and online format. Please be aware
that some publishers do not grant electronic rights for free and that Springer will not be able
to refund any costs that may have occurred to receive these permissions. In such cases,
material from other sources should be used.
Accessibility
In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your figures,
please make sure that
All figures have descriptive captions (blind users could then use a text-to-speech software or a
text-to-Braille hardware)
Patterns are used instead of or in addition to colors for conveying information (colorblind
users would then be able to distinguish the visual elements)
Any figure lettering has a contrast ratio of at least 4.5:1
Electronic Supplementary Material
Springer accepts electronic multimedia files (animations, movies, audio, etc.) and other
supplementary files to be published online along with an article or a book chapter. This
feature can add dimension to the author's article, as certain information cannot be printed or is
more convenient in electronic form.
Submission
Supply all supplementary material in standard file formats.
Please include in each file the following information: article title, journal name, author names;
affiliation and e-mail address of the corresponding author.
To accommodate user downloads, please keep in mind that larger-sized files may require very
long download times and that some users may experience other problems during
downloading.
Audio, Video, and Animations
Resolution: 16:9 or 4:3
Maximum file size: 25 GB
Minimum video duration: 1 sec
Supported file formats: avi, wmv, mp4, mov, m2p, mp2, mpg, mpeg, flv, mxf, mts, m4v, 3gp
Text and Presentations
Submit your material in PDF format; .doc or .ppt files are not suitable for long-term viability.
92
A collection of figures may also be combined in a PDF file.
Spreadsheets
Spreadsheets should be converted to PDF if no interaction with the data is intended.
If the readers should be encouraged to make their own calculations, spreadsheets should be
submitted as .xls files (MS Excel).
Specialized Formats
Specialized format such as .pdb (chemical), .wrl (VRML), .nb (Mathematica notebook), and
.tex can also be supplied.
Collecting Multiple Files
It is possible to collect multiple files in a .zip or .gz file.
Numbering
If supplying any supplementary material, the text must make specific mention of the material
as a citation, similar to that of figures and tables.
Refer to the supplementary files as “Online Resource”, e.g., "... as shown in the animation
(Online Resource 3)", “... additional data are given in Online Resource 4”.
Name the files consecutively, e.g. “ESM_3.mpg”, “ESM_4.pdf”.
Captions
For each supplementary material, please supply a concise caption describing the content of
the file.
Processing of supplementary files
Electronic supplementary material will be published as received from the author without any
conversion, editing, or reformatting.
Accessibility
In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your
supplementary files, please make sure that
The manuscript contains a descriptive caption for each supplementary material
Video files do not contain anything that flashes more than three times per second (so that
users prone to seizures caused by such effects are not put at risk)
After acceptance
Upon acceptance of your article you will receive a link to the special Author Query
Application at Springer’s web page where you can sign the Copyright Transfer Statement
online and indicate whether you wish to order OpenChoice, offprints, or printing of figures in
color.
Once the Author Query Application has been completed, your article will be processed and
you will receive the proofs.
Open Choice
In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal
and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer
provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice
article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made
available publicly through Springer’s online platform SpringerLink.
Springer Open Choice
Copyright transfer
Authors will be asked to transfer copyright of the article to the Publisher (or grant the
Publisher exclusive publication and dissemination rights). This will ensure the widest possible
protection and dissemination of information under copyright laws.
Open Choice articles do not require transfer of copyright as the copyright remains with the
author. In opting for open access, the author(s) agree to publish the article under the Creative
Commons Attribution License.
Offprints
93
Offprints can be ordered by the corresponding author.
Color illustrations
Online publication of color illustrations is free of charge. For color in the print version,
authors will be expected to make a contribution towards the extra costs.
Proof reading
The purpose of the proof is to check for typesetting or conversion errors and the completeness
and accuracy of the text, tables and figures. Substantial changes in content, e.g., new results,
corrected values, title and authorship, are not allowed without the approval of the Editor.
After online publication, further changes can only be made in the form of an Erratum, which
will be hyperlinked to the article.
Online First
The article will be published online after receipt of the corrected proofs. This is the official
first publication citable with the DOI. After release of the printed version, the paper can also
be cited by issue and page numbers.
Ethical Responsibilities of Authors
This journal is committed to upholding the integrity of the scientific record. As a member of
the Committee on Publication Ethics (COPE) the journal will follow the COPE guidelines on
how to deal with potential acts of misconduct.
Authors should refrain from misrepresenting research results which could damage the trust in
the journal, the professionalism of scientific authorship, and ultimately the entire scientific
endeavour. Maintaining integrity of the research and its presentation can be achieved by
following the rules of good scientific practice, which include:
The manuscript has not been submitted to more than one journal for simultaneous
consideration.
The manuscript has not been published previously (partly or in full), unless the new work
concerns an expansion of previous work (please provide transparency on the re-use of
material to avoid the hint of text-recycling (“self-plagiarism”)).
A single study is not split up into several parts to increase the quantity of submissions and
submitted to various journals or to one journal over time (e.g. “salami-publishing”).
No data have been fabricated or manipulated (including images) to support your conclusions
No data, text, or theories by others are presented as if they were the author’s own
(“plagiarism”). Proper acknowledgements to other works must be given (this includes
material that is closely copied (near verbatim), summarized and/or paraphrased), quotation
marks are used for verbatim copying of material, and permissions are secured for material that
is copyrighted.
Important note: the journal may use software to screen for plagiarism.
Consent to submit has been received explicitly from all co-authors, as well as from the
responsible authorities - tacitly or explicitly - at the institute/organization where the work has
been carried out, before the work is submitted.
Authors whose names appear on the submission have contributed sufficiently to the scientific
work and therefore share collective responsibility and accountability for the results.
In addition:
Changes of authorship or in the order of authors are not accepted after acceptance of a
manuscript.
Requesting to add or delete authors at revision stage, proof stage, or after publication is a
serious matter and may be considered when justifiably warranted. Justification for changes in
authorship must be compelling and may be considered only after receipt of written approval
from all authors and a convincing, detailed explanation about the role/deletion of the
new/deleted author. In case of changes at revision stage, a letter must accompany the revised
manuscript. In case of changes after acceptance or publication, the request and documentation
94
must be sent via the Publisher to the Editor-in-Chief. In all cases, further documentation may
be required to support your request. The decision on accepting the change rests with the
Editor-in-Chief of the journal and may be turned down. Therefore authors are strongly
advised to ensure the correct author group, corresponding author, and order of authors at
submission.
Upon request authors should be prepared to send relevant documentation or data in order to
verify the validity of the results. This could be in the form of raw data, samples, records, etc.
If there is a suspicion of misconduct, the journal will carry out an investigation following the
COPE guidelines. If, after investigation, the allegation seems to raise valid concerns, the
accused author will be contacted and given an opportunity to address the issue. If misconduct
has been established beyond reasonable doubt, this may result in the Editor-in-Chief’s
implementation of the following measures, including, but not limited to:
If the article is still under consideration, it may be rejected and returned to the author.
If the article has already been published online, depending on the nature and severity of the
infraction, either an erratum will be placed with the article or in severe cases complete
retraction of the article will occur. The reason must be given in the published erratum or
retraction note.
The author’s institution may be informed.
Compliance with Ethical Standards
To ensure objectivity and transparency in research and to ensure that accepted principles of
ethical and professional conduct have been followed, authors should include information
regarding sources of funding, potential conflicts of interest (financial or non-financial),
informed consent if the research involved human participants, and a statement on welfare of
animals if the research involved animals.
Authors should include the following statements (if applicable) in a separate section entitled
“Compliance with Ethical Standards” when submitting a paper:
Disclosure of potential conflicts of interest
Research involving Human Participants and/or Animals
Informed consent
Please note that standards could vary slightly per journal dependent on their peer review
policies (i.e. single or double blind peer review) as well as per journal subject discipline.
Before submitting your article check the instructions following this section carefully.
The corresponding author should be prepared to collect documentation of compliance with
ethical standards and send if requested during peer review or after publication.
The Editors reserve the right to reject manuscripts that do not comply with the above-
mentioned guidelines. The author will be held responsible for false statements or failure to
fulfill the above-mentioned guidelines.
Disclosure of potential conflicts of interest
Authors must disclose all relationships or interests that could have direct or potential
influence or impart bias on the work. Although an author may not feel there is any conflict,
disclosure of relationships and interests provides a more complete and transparent process,
leading to an accurate and objective assessment of the work. Awareness of a real or perceived
conflicts of interest is a perspective to which the readers are entitled. This is not meant to
imply that a financial relationship with an organization that sponsored the research or
compensation received for consultancy work is inappropriate. Examples of potential conflicts
of interests that are directly or indirectly related to the research may include but are not
limited to the following:
Research grants from funding agencies (please give the research funder and the grant number)
Honoraria for speaking at symposia
Financial support for attending symposia
95
Financial support for educational programs
Employment or consultation
Support from a project sponsor
Position on advisory board or board of directors or other type of management relationships
Multiple affiliations
Financial relationships, for example equity ownership or investment interest
Intellectual property rights (e.g. patents, copyrights and royalties from such rights)
Holdings of spouse and/or children that may have financial interest in the work
In addition, interests that go beyond financial interests and compensation (non-financial
interests) that may be important to readers should be disclosed. These may include but are not
limited to personal relationships or competing interests directly or indirectly tied to this
research, or professional interests or personal beliefs that may influence your research.
The corresponding author collects the conflict of interest disclosure forms from all authors. In
author collaborations where formal agreements for representation allow it, it is sufficient for
the corresponding author to sign the disclosure form on behalf of all authors. Examples of
forms can be found
here:
The corresponding author will include a summary statement in the text of the manuscript in a
separate section before the reference list, that reflects what is recorded in the potential conflict
of interest disclosure form(s).
See below examples of disclosures:
Funding: This study was funded by X (grant number X).
Conflict of Interest: Author A has received research grants from Company A. Author B has
received a speaker honorarium from Company X and owns stock in Company Y. Author C is
a member of committee Z.
If no conflict exists, the authors should state:
Conflict of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest.
Research involving human participants and/or animals
1) Statement of human rights
When reporting studies that involve human participants, authors should include a statement
that the studies have been approved by the appropriate institutional and/or national research
ethics committee and have been performed in accordance with the ethical standards as laid
down in the 1964 Declaration of Helsinki and its later amendments or comparable ethical
standards.
If doubt exists whether the research was conducted in accordance with the 1964 Helsinki
Declaration or comparable standards, the authors must explain the reasons for their approach,
and demonstrate that the independent ethics committee or institutional review board explicitly
approved the doubtful aspects of the study.
The following statements should be included in the text before the References section:
Ethical approval: “All procedures performed in studies involving human participants were in
accordance with the ethical standards of the institutional and/or national research committee
and with the 1964 Helsinki declaration and its later amendments or comparable ethical
standards.”
For retrospective studies, please add the following sentence:
“For this type of study formal consent is not required.”
2) Statement on the welfare of animals
The welfare of animals used for research must be respected. When reporting experiments on
animals, authors should indicate whether the international, national, and/or institutional
guidelines for the care and use of animals have been followed, and that the studies have been
96
approved by a research ethics committee at the institution or practice at which the studies
were conducted (where such a committee exists).
For studies with animals, the following statement should be included in the text before the
References section:
Ethical approval: “All applicable international, national, and/or institutional guidelines for
the care and use of animals were followed.”
If applicable (where such a committee exists): “All procedures performed in studies involving
animals were in accordance with the ethical standards of the institution or practice at which
the studies were conducted.”
If articles do not contain studies with human participants or animals by any of the authors,
please select one of the following statements:
“This article does not contain any studies with human participants performed by any of the
authors.”
“This article does not contain any studies with animals performed by any of the authors.”
“This article does not contain any studies with human participants or animals performed by
any of the authors.”
Informed consent
All individuals have individual rights that are not to be infringed. Individual participants in
studies have, for example, the right to decide what happens to the (identifiable) personal data
gathered, to what they have said during a study or an interview, as well as to any photograph
that was taken. Hence it is important that all participants gave their informed consent in
writing prior to inclusion in the study. Identifying details (names, dates of birth, identity
numbers and other information) of the participants that were studied should not be published
in written descriptions, photographs, and genetic profiles unless the information is essential
for scientific purposes and the participant (or parent or guardian if the participant is incapable)
gave written informed consent for publication. Complete anonymity is difficult to achieve in
some cases, and informed consent should be obtained if there is any doubt. For example,
masking the eye region in photographs of participants is inadequate protection of anonymity.
If identifying characteristics are altered to protect anonymity, such as in genetic profiles,
authors should provide assurance that alterations do not distort scientific meaning.
The following statement should be included:
Informed consent: “Informed consent was obtained from all individual participants included
in the study.”
If identifying information about participants is available in the article, the following statement
should be included:
“Additional informed consent was obtained from all individual participants for whom
identifying information is included in this article.”
Does Springer provide English language support?
Manuscripts that are accepted for publication will be checked by our copyeditors for spelling
and formal style. This may not be sufficient if English is not your native language and
substantial editing would be required. In that case, you may want to have your manuscript
edited by a native speaker prior to submission. A clear and concise language will help editors
and reviewers concentrate on the scientific content of your paper and thus smooth the peer
review process.
The following editing service provides language editing for scientific articles in all areas
Springer
publishes in:
Edanz English editing for scientists
Use of an editing service is neither a requirement nor a guarantee of acceptance for
publication.
97
Please contact the editing service directly to make arrangements for editing and payment.
Edanz English editing for scientists
For Authors from China
文章在投稿前进行专业的语言润色将对作者的投稿进程有所帮助。作者可自愿选择使
用Springer推荐的编辑服务，使用与否并不作为判断文章是否被录用的依据。提高文章
的语言质量将有助于审稿人理解文章的内容，通过对学术内容的判断来决定文章的取
舍，而不会因为语言问题导致直接退稿。作者需自行联系Springer推荐的编辑服务公司
，协商编辑事宜。
理文编辑
For Authors from Japan
ジャーナルに論文を投稿する前に、ネイティブ・スピーカーによる英文校閲を希望
されている方には、Edanz社をご紹介しています。サービス内容、料金および申込方
法など、日本語による詳しい説明はエダンズグループジャパン株式会社の下記サイ
トをご覧ください。
エダンズグループジャパン
For Authors from Korea
영어 논문 투고에 앞서 원어민에게 영문 교정을 받고자 하시는 분들께 Edanz 회사를
소개해 드립니다. 서비스 내용, 가격 및
신청 방법 등에 대한 자세한 사항은 저희 Edanz Editing Global 웹사이트를 참조해
주시면 감사하겠습니다.
Edanz Editing Global
Multi-author Manuscript
In case a multi-author manuscript is submitted authors should state in the
"Acknowledgments" that all authors have agreed to submit this manuscript to the "Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology”.