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INTRODUÇÃO

O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é o agente causal da

leucemia/linfoma de células T de adultos e da mielopatia associada ao HTLV-

1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) (Osame, M. et al., 1986). Cerca de 10 a

20 milhões de indivíduos em todo o mundo são infectados por este vírus e Salvador,

a capital do estado da Bahia tem a mais alta prevalência de infecção por HTLV-1 no

Brasil, com uma frequência de 1,83% na população geral (Galvão-Castro, B. et al.,

1997; Dourado et al., 2003).

A HAM/TSP é caracterizada clinicamente por paraparesia espástica, que é

progressiva e pode eventualmente evoluir para dependência de cadeira de rodas

(Osame, M. et al., 1986; Araujo, A. et al., 1993). Outras manifestações associadas a

infecção pelo HTLV-1 incluem Síndrome de Sjogren ou Síndrome Seca, polimiosite,

uveíte, manifestações urológicas e disfunção erétil (Eguchi, K. et al., 1992; Morgan,

O. S. et al., 1989; Mochizuky, M. et al., 1992; Castro, N. M. et al., 2007; Castro, N. et

al., 2013). Pacientes com HAM/TSP apresentam carga pro viral e produção de IFN-

y, uma importante citocina pro inflamatória do perfil Th1, mais elevados comparados

com indivíduos portadores do HTLV-1 (Yoshida, M. 2004; Santos, S. B. et al., 2004).

Em modelo experimental tem sido demonstrado que a infecção pelo S. mansoni ou a

injeção de ovos ou proteínas do parasita previne doenças inflamatórias associadas à

resposta Th1, a exemplo da diabete tipo 1, psoríase e colite ulcerativa (Cooke, A. et

al., 1999; Atochina, O. H. D. 2006). Nessa linha, nosso grupo tem demonstrado que

antígenos do Schistosoma mansoni são capazes de modular “in vitro” a resposta

imune inflamatória em indivíduos com Leishmaniose cutânea (Báfica, A. M. B. et al.,

2011).

2

Atualmente muitos estudos mostram a importâncias das células TCD4+ na

homeostase da resposta imune de indivíduos saudáveis. Essas células participam

da manutenção da tolerância imunológica por suprimir a expansão e ativação de

linfócitos reativos que podem causar doenças autoimunes (Sakaguchi, S. et al.,

2001; Shevach, E. M. 2002). Elas podem expressar CD25 (o receptor da cadeia α de

IL-2) em sua superfície (CD4+CD25+) sendo que 1-2 % da população de células

CD4+CD25high exibe funções regulatórias em humanos (Baecher-Allan, C. et al.,

2001). As células T regulatórias não proliferam em resposta a estimulação antigênica

“in vitro” e podem potencialmente suprimir a proliferação de outras células TCD4+ e

TCD8+ induzidas por estimulação policlonal ou antígeno específicas (Sakaguchi, S.

et al., 2001; Shevach, E. M. 2002).

Algumas células T regulatórias expressam especificamente gene para Foxp3

(forkhead transcription factor) que é requerido para o seu desenvolvimento e função

(Hori, S. et al., 2003; Khattri, R. et al., 2003, Fontenot, J. D. et al., 2003). Tem sido

reportado também que a expressão do gene que transcreve o receptor GITR

(products of glucocorticoid-induced TNF receptor family-related) e CTLA-4 (cytotoxic

T lymphocyte-associated antigen 4) conferem atividade regulatória as células T

(Shimizu, J. et al., 2002; McHugh, R. S. et al., 2002; Read, S. et al., 2000; Salamon,

B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000).

Indivíduos com HAM/TSP apresentam algumas particularidades na resposta imune,

a exemplo da linfoproliferação espontânea de células TCD4+ “in vitro” e grande

produção de citocinas pro inflamatórias (Yamano, Y. et al., 2005), características

imunológicas estas semelhantes ao que ocorre com camundongos mutantes para

Foxp3 (Lyon, M. F. et al., 1990; Kanangat, S. et al., 1996; Clark, L. B. et al., 1999) e

camundongos deficientes em CTLA-4 (Tivol, E. A. et al., 1995; Waterhouse, P. et al.,

3

1995). Adicionalmente, as células CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP

produzem elevadas concentrações de citocinas pro inflamatórias, a exemplo do

Interferon-gama (IFN-y) e interleucina 2 (IL-2) (Yamano, Y. et al., 2005).

A expressão de RNAm para Foxp3 nas células TCD4+CD25+ de indivíduos com

HAM/TSP é menor do que em indivíduos saudáveis. Elas têm menores níveis de

expressão da proteína Foxp3 e de outros marcadores de células T regulatórias a

exemplo do CTLA-4 e GITR (Yamano, Y. et al. 2005).

Altos níveis de DNA pro viral ou RNAm para o gene Tax, do vírus, tem sido

detectado em pacientes com envolvimento neurológico quando comparado a

indivíduos portadores assintomáticos (Toulza, F. et al., 2008; Nagai, M. et al., 2001;

Takenouchi, N. et al., 2003). Em indivíduos infectados pelo HTLV-1 a expressão de

Foxp3 em células TCD4+ foi inversamente correlacionada com o DNA pro viral para

o gene Tax do HTLV-1. Esses resultados sugerem que a baixa expressão de Foxp3

pode contribuir para o desenvolvimento da doença inflamatória durante a infecção

pelo HTLV-1 (Oh, U. et al., 2006).

Muitos estudos tem avaliado o papel das células T CD4+ regulatórias nas doenças

infecciosas, mas, pouco se sabe a respeito do fenótipo e função das células T CD8+

regulatórias nessas doenças. Em humanos (Suzuki, M. et al., 2008) e em modelo

animal, linfócitos regulatórios CD8+CD25+Foxp3+ naturais e induzidos já foram

descritos (Pomie, C. et al., 2008). Células naive TCD8+CD25- podem se diferenciar

em células T CD8+CD25+ regulatórias após o encontro com o antígeno (Mills, K. H.

et al., 2004). Por outro lado, células TCD8+ humanas ativadas pelo Mycobacterium

sp coexpressam os marcadores de células T regulatórias CD25 e Foxp3, suprimem

a resposta proliferativa antígeno-específico das células TCD4+ do tipo Th1 (Boer, M.

C. et al., 2013). Também em humanos infectados pelo Mycobacterium já foram

4

encontradas células T regulatórias CD8+ nos linfonodos e no sangue. Estas células

foram isoladas das células mononucleares do sangue periférico (CMSP),

estimuladas com BCG e elas coexpressam marcadores clássicos como CD25 e

Foxp3, sendo capazes de inibir a capacidade efetora das células Th1 (Boer, M. C. et

al., 2013). Outro estudo mostrou que em macacos infectados pelo M. tuberculosis as

células T regulatórias CD8+CD25+Foxp3+ foram encontradas juntamente com as

células TCD4+ no sangue periférico e no pulmão (Chen, C. Y. et al., 2012). Células T

regulatórias CD4+ e CD8+ foram encontradas em lesões cutâneas de pacientes com

hanseníase Virchoviana e foram capazes de suprimir a resposta das células CD4+

do tipo Th1 (Ottenhoff, T. H. et al., 1986; Modlin, R. L. et al., 1986). Pouco se sabe

sobre o papel destas células na infecção pelo HTLV-1.

Revisão Bibliográfica

O vírus HTLV-1: caracterização e distribuição geográfica

O HTLV-I tem capacidade de infectar diversos tipos celulares incluindo linfócitos B,

fibroblastos, células dendríticas e monócitos (Matsuoka, M. 2005), mas, possui

tropismo especial pelas células T CD4+. É um retrovirus complexo pertencente ao

gênero Deltaretrovirus e à subfamília Orthoretrovirinae. Está constituído por um

envelope e um capsídeo, que contem no seu interior duas cópias de RNA de fita

simples associadas a uma molécula de tRNA e as enzimas virais (Cann, A. J. et al.,

1996). O genoma do HTLV-I, com 9,03Kb, possui os genes gag, pol, e env e a

região pX e, nos extremos, duas seqüências denominadas seqüências terminais

repetitivas (long terminal repeats - LTRs). Tais seqüências contêm os promotores

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virais e outros elementos regulatórios. A região pX, localizada na extremidade 3’,

contém os genes que codificam para as proteínas virais tax, rex, HBZ (HTLV-I bZIP

factor), p12, p13, p30 e p21 (Matsuoka, M. et al., 2007).

O HTLV-I integra o seu material genético no genoma da célula infectada para poder

expressar os genes virais. Como o seu material genético é RNA, este se transcreve

em DNA de fita dupla pela enzima transcriptase reversa viral no citoplasma da célula

infectada e posteriormente se transporta para o núcleo onde, após reorganização, se

integra no DNA genômico da célula hospedeira pela ação da integrase viral. O DNA

viral, uma vez integrado, chama-se DNA proviral. A capacidade infectiva das

partículas virais extracelulares do HTLV-I é baixa e a infecção de novo é pouco

efetiva. A propagação do vírus no individuo portador acontece de célula infectada

para célula não infectada através de sinapses virológicas (Banghan, C. H. 2003),

onde o RNA viral e outros componentes virais se transferem em forma de complexos

para a célula não infectada, sem a produção e liberação de partículas víricas

(Igakura, T. et al., 2003). No entanto, o mecanismo principal que o vírus usa para

aumentar a carga viral é a indução da proliferação clonal dos linfócitos T CD4+

infectados (Matsuoka, M. 2005).

O primeiro retrovírus humano, o vírus linfotrópico de células T humanas tipo I (HTLV-

1) foi identificado em 1980 (Gray, G. S. et al., 1990), mas, além deste vírus o HTLV

do tipo II foi descoberto em 1982 (Poiesz, B. J. et al., 1980) e dois novos tipos de

HTLV, 3 e 4, foram identificados em populações da África Central em 2005 (Calattini,

S. et al., 2005; Wolfe, N. et al., 2005). A prevalência varia de acordo com a região

geográfica, os padrões sócio-comportamentais e étnicos das populações e esta

infecção caracteriza-se, também, por ser mais frequente em mulheres e aumentar

com a idade (Proietti, F. A. et al., 2005).

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Este vírus se transmite por três vias: a) sexual, com maior eficiência de transmissão

de homem para mulher. Estima-se que essa eficiência seja de cerca de 60%, sendo

de 4% no sentido inverso; b) sanguínea, através de transfusão de sangue ou pelo

uso de agulhas e/ou seringas contaminadas e c) perinatal, da mãe par ao filho,

principalmente pelo aleitamento materno. Para que ocorra a infecção há a

necessidade da presença de células infectadas (Proietti, F. A. et al., 2005).

As principais áreas endêmicas da infecção compreendem África, América do Sul e

Central, Caribe, Japão, Melanésia e Oriente Médio. Na América do Sul e Central se

destacam Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia, Honduras, Panamá, Peru e

Venezuela (Proietti, F. A. et al., 2005). A província equatorial do Congo apresenta a

prevalência mais elevada desta infecção na África (Goubau, P. et al., 1990). Foram

detectadas infecções em tribos de pigmeus que vivem isolados em áreas remotas da

república Centro Africana, Camarões e nordeste do Congo (Salemi, M. et al., 1998).

Baseado na existência destas infecções na África Equatorial e em descendentes de

africanos no Caribe e na América Latina sugere-se que a África seria a fonte

primária deste vírus (Verger, P. 1968).

O vírus do HTLV-I foi detectado pela primeira vez no Brasil, em imigrantes japoneses

na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul em 1986 (Kitagawa, T. et al.,

1986). Posteriormente foi constatado em outros grupos populacionais (Catalan-

Soares, B. C. et al., 2001). A maioria dos dados epidemiológicos da infecção no

Brasil refere-se à prevalência em populações específicas. Em doadores de sangue

observa-se um gradiente de indivíduos infectados, com taxas mais elevadas nas

regiões norte/nordeste e as mais baixas na região sul (Catalan-Sores, B. et al., 2005)

Figura 1. Salvador e São Luiz são as cidades que apresentam as maiores

prevalências em doadores de sangue no território nacional (Catalan-Soares, B. et al.,

7

2005, Galvãoo-Castro, B. et al., 1997). Baseados nos dados de prevalência em

doadores de sangue estima-se que no Brasil existam 2,5 milhões de portadores de

HTLV-I (Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2002; Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2006) e

estima-se que 40 mil pessoas estejam infectadas em Salvador (Dourado, I. et al.,

2003). Tem sido, também, demonstrando a presença do HTLV-I em outras cidades

do estado da Bahia (Britto, A. P.C.R. et al., 1998; Magalhães, T. et al., 2008; Rego,

F. F. et al., 2008).

Figura 1- Distribuição geográfica do HTLV-1 no Brasil (Catalan-Soares et. al.,

2005)

8

Manifestações clínicas

O HTLV-I tem sido considerado um vírus com pouca patogenicidade visto que é

descrito que menos de 5% dos infectados desenvolvem doenças graves associadas

a esta infecção, a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) (Hinuma, Y. et al.,

1981) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP)

(Manns, A. et al., 1999, Orland, J. R. et al., 2003).

Além das apresentações classicamente descritas, condições inflamatórias

associadas ao HTLV-I são relatadas, como a síndrome de Sjogren (Eguchi, K. et al.,

1992), uveítes (Mochizuki, M. et al., 1992), polimiosite, artropatias (Morgan, O. S. et

al., 1989), disfunção erétil (Castro, N. et al., 2013), sintomas urinários (Castro, N. M.

et al., 2007) e alterações neurológicas que não preenchem os critérios para

HAM/TSP (Zunt, J. R. et al., 1999). Estudo realizado em portadores de HTLV-I

considerados assintomáticos identificou uma prevalência maior de parestesias,

sintomas urinários, artralgias, disfunção erétil, gengivite e periodontite quando

comparado com um grupo de indivíduos soronegativos (Caskey, M. F. et al., 2007).

A infecção por HTLV-I está associada com uma série de manifestações clínicas,

sugerindo que os portadores assintomáticos não correspondem a maioria dos

indivíduos infectados, como anteriormente pensado.

Estudos de coorte, entretanto, identificaram um risco para progressão para

HAM/TSP menor que 5%, com a maioria dos pacientes permanecendo

assintomáticos durante longo período de acompanhamento (Orland, J. R. 2003).

9

Características da HAM/TSP

Inicialmente, a HAM/TSP foi descrita em 1985, na Martinica, Jamaica e Colômbia,

após a constatação da presença de anticorpos anti-HTLV-I no soro de mais de 60%

dos pacientes com paraparesia espástica tropical – TSP (Gessain, A. et al., 1985).

Em 1986, no Japão, foi descrita com a denominação de mielopatia associada ao

HTLV-I – HAM (1). Somente em 1988 foi reconhecida pela Organização Mundial de

Saúde (OMS) e denominada de HAM/TSP, por concluírem que se tratava de uma

mesma doença.

Ela apresenta-se como uma síndrome de desmielinização de início insidioso,

caracterizada por rigidez ou fraqueza progressiva dos membros inferiores,

espasticidade e hiperreflexia. Os indivíduos infectados podem apresentar dor

lombar, leves sintomas sensitivos (perda ou redução da sensibilidade superficial e/ou

profunda) e incontinência urinária. No processo de evolução da doença surge

obstipação intestinal, diminuição da libido e da potência sexual. O desenvolvimento

da HAM/TSP ocorre em cerca de 1 a 5% de indivíduos infectados pelo HTLV-I,

afetando freqüentemente mais as mulheres que os homens, na proporção 2,5:1 a

3:1. O período de latência para HAM/TSP é mais curto do que para ATLL. Acomete

indivíduos predominantemente na 4ª e 5ª décadas de vida e raramente antes dos 20

ou após os 70 anos. Cerca de 30% dos pacientes com HAM/TSP tornam-se

paraplégicos e confinados ao leito, cerca de dez anos após a instalação da doença

(Carneiro-Proietti, A. B. et al., 2002).

A HAM/TSP tem como característica marcante o comprometimento da medula

torácica inferior. Estudos histopatológicos evidenciam uma intensa infiltração

linfocitária, um processo de desmielinização, degeneração axonal e gliose. Tem sido

10

descrito um processo de degeneração da substância branca, caracterizada por

intenso exsudado, e pouco envolvimento da substância cinzenta. Associado a este

quadro observa-se um intenso processo inflamatório com predominância de células

mononucleares, principalmente linfócitos T CD4+ e CD8+. Nos casos mais

avançados ou de longa duração predominam o processo de degeneração sobre o

processo inflamatório com a substituição do padrão celular por um padrão mais

atrófico - atrofia medular de moderada à grave (Yoshioka, A. et al., 1993).

A HAM/TSP foi descrita como lentamente progressiva e é considerada uma doença

de baixa letalidade. Apesar de alguns aspectos da fisiopatologia do vírus ainda

serem desconhecidos, admitem-se três hipóteses para explicar o papel do HTLV-I no

desenvolvimento da HAM/TSP: a primeira hipótese aponta para um mecanismo de

citotoxicidade direta, onde células T CD8+ citotóxicas, específicas para antígenos do

HTLV-I, cruzariam a barreira hematoencefálica e destruiriam, por mecanismos

citotóxicos diretos ou via produção de citocinas, as células da glia infectadas pelo

HTLV-I (Ijichi, S. et al., 1995; Nakamura, S. et al., 1993; Furukawa, Y. et al., 2003); a

segunda hipótese, denominada de autoimune, aponta para um processo de

mimetismo molecular no qual a semelhança entre uma proteína neuronal

(ribonucleoproteina nuclear heterogênea, hnRNP-A1) do hospedeiro e a mais

importante proteína do vírus, o antígeno Tax, acarretaria um processo inflamatório

de auto-imunidade com lesão neuronal (Levin, M. C. et al., 2002), a terceira e última

hipótese, a mais aceita delas, também denominada de dano circundante ou

“bystander” envolveria os linfócitos T CD4+ infectados e os linfócitos T CD8+

específicos para a proteína viral Tax, que juntos atravessariam a barreira

hematoencefálica e produziriam grande quantidade de citocinas próinflamatórias

levando a um processo de intensa inflamação e destruição tecidual (Osame, M.

11

2002; Kubota, R. et al., 2003; Nagai, M. et al., 2003). Dando suporte a esta hipótese

estão os estudos que mostram que mediadores potencialmente inflamatórios

(citocinas, quimiocinas e metaloproteinases), quando produzidos em altas

concentrações em locais como o tecido nervoso, podem ser altamente tóxicos

(Biddison, W. W. et al., 1997)

Resposta Imune desencadeada pelo HTLV-1

A infecção pelo HTLV-1 envolve aspectos imunológicos ainda não completamente

elucidados, embora seja amplamente aceito que fatores imunológicos e virais

participam da imunopatogênese da infecção pelo HTLV-I, sendo os principais

estudos neste sentido aqueles relacionados com a HAM/TSP (Tanajura, D. et al.,

2009). O HTLV-I tem sido descrito como capaz de infectar, tanto in vitro como in

vivo, um grande número de tipos celulares. Todavia os linfócitos T CD4+, e numa

menor extensão os linfócitos T CD8+, são considerados como os principais alvos do

HTLV-I (Richardson, J. H. et al., 1990; Nagai, M. et al., 2001). Foi demonstrado que

células dendríticas (célula dentrítica plasmocitóide - pDC; mieloide - myDC e a

derivada de monócitos - MDDC) também são facilmente infectadas pelo HTLV-I e

capazes, in vitro, de eficientemente transmitir o vírus para as células T (Jones, K. S.

et al., 2008).

Ao infectar as células T CD4+, a proteína Tax do vírus induz ativação e proliferação

celular. As células T CD8+ específicas atuam sobre as células T CD4+ infectadas no

sentido de conter a infecção. Todavia o persistente estado de ativação das células T

CD4+ e T CD8+, associado a uma incapacidade de modulação da resposta imune,

leva ao desenvolvimento de uma resposta imune exagerada e ao dano tecidual

12

(Cartier, L. et al., 2005). Como esta ativação é persistente, os linfócitos T infectados

pelo vírus ficam hiperativados e proliferam intensamente, fenômeno este

demonstrado, in vitro, pela linfoproliferação espontânea das células infectadas,

mesmo na ausência de estímulos exógenos (Prince, H. et al., 1990).

O envolvimento das células T CD4+ infectadas, como células produtoras de citocinas

do tipo 1, e participantes da imunopatogênese da HAM/TSP tem sido publicado em

estudos que mostram um aumento da produção de IFN-γ, Fator de necrose tumoral

(TNF), Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e

Interleucina 1 (IL-1) pelas células T CD4+ de pacientes com HAM/TSP (Nishiura, Y.

et al., 1996; Watanabe, H. et al., 1995). Isso sugere a presença de uma intensa e

exagerada resposta imune celular inflamatória nestes pacientes (Santos, S. B. et al.,

2004). Este e outros achados sugerem que células T com perfil Th1, mais do que

células Th2 (Linfócitos T auxiliares tipo 2), predominam na população de células T

CD4+ dos pacientes com HAM/TSP (Furukawa, Y. et al., 2003; Nishiura, Y. et al.,

1996).

Na infecção pelo HTLV-I a resposta desencadeada por células T CD8+ específicas

para o HTLV-I, é reconhecida como um evento importante no desenvolvimento da

HAM/TSP. Estas células estão cronicamente ativadas e a maioria reconhece a

proteína viral Tax (Hanon, E. et al., 2000; Tivol, E. A. 1995). A ativação dos linfócitos

T CD8+ específicos para Tax induz uma intensa produção de citocinas pró-

inflamatórias e este fenômeno parece, também, estar diretamente envolvido no

desenvolvimento da HAM/TSP (Kubota, R. et al., 1998; Biddison, W. E. et al., 1997).

Linfócitos T CD4+ e CD8+ infectados pelo HTLV-I presentes no sangue periférico são

capazes de infiltrar a medula espinhal e produzir citocinas pró-inflamatórias como

IFN-γ, TNF-α e Interleucina 6 (IL-6), mediadores capazes de causar dano tecidual

13

como os observados na HAM/TSP (Kubota, R. et al., 1998; Osame, M. 2002). A

barreira hematoencefálica constitui a interface entre o sangue e o sistema nervoso

central (SNC). Na HAM/TSP a perda da integridade desta barreira é descrita em

estudos que evidenciam a infecção das células endoteliais pelo HTLV-I e a

passagem de linfócitos infectados através do endotélio cerebral (Afonso, P. V. et al.,

2008; Cavrois, M. et al., 2000).

Além das citocinas pró-inflamatórias, as quimiocinas, pequenas proteínas envolvidas

no tráfego normal dos leucócitos e no recrutamento de leucócitos para sítios de

lesão, têm sido reconhecidas por contribuir para a resposta inflamatória observada

na HAM/TSP (Narikawa, K. et al., 2005; Montanheiro, P. et al., 2007). Estudos

desenvolvidos pelo nosso grupo demonstraram que Chemokine C-X-C motif ligand 9

(CXCL-9) e Chemokine C-X-C motif ligand 10 (CXCL-10), quimiocinas reconhecidas

como importantes no recrutamento de células Th1, estavam aumentadas no soro de

pacientes com HAM/TSP, quando comparadas com os portadores assintomáticos do

HTLV-I ou controles saudáveis. Estes sugerem que a presença destas moléculas

pode levar a um aumento no recrutamento de fatores pró-inflamatórios para o tecido

medular, contribuindo para os danos observados no desenvolvimento da HAM/TSP

(Guerreiro, J. B. et al., 2006; Shevach, E. M. 2002).

Alternativamente, a patogênese da infecção pelo HTLV-I poderia estar também

relacionada a uma ativação de células T e B auto reativas e consequentemente

desenvolvimento de reações auto-imunes. Um dos aspectos importantes que deram

apoio ao papel de fenômenos auto-imunes na patogenia da infecção pelo HTLV-I foi

a elevada frequência de síndrome de Sjogren e de artrite reumatóide reportada em

pacientes infectados por este vírus (Tanajura, D. et al., 2009).

14

Células T regulatórias

As células Treg são uma população de células T CD4+ CD25+, que têm uma função

inibitória sobre o sistema imune. Estas células parecem estar relacionadas ao

controle da resposta imune de uma forma mais ampla, modulando a “amplitude” da

resposta, tanto na fase de expansão quanto na de constrição (Sakaguchi, S. et al.

2001). A função inibitória das células Tregs sobre as células T pode ser tanto pela

secreção de citocinas imuno supressoras como IL-10 e TGF-, quanto pelo contato

célula a célula, via CTLA-4 ou TGF- de membrana (Nakamura, K. et al., 2001; Chen

et al. 2003).

As células T regulatórias são caracterizadas pela expressão constitutiva das

moléculas forkhead transcription factor (Foxp3), glucocorticoid-induced TNF receptor

family-related (GITR), cytotoxic T limphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) e altos

níveis de CD25 (revisto por Cruvinel, W. M. et al., 2008; Hori, S. et al., 2003; Khattri,

R. et al., 2003; Fontenot, J. D. et al., 2003; Shimisu, J. et al., 2002; McHugh, R. S. et

al., 2002; Read, S. et al., 2000; Salomon, B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000).

As células T regulatórias (Treg) são divididas em dois grupos: células T regulatórias

que ocorrem naturalmente CD4+CD25+ (células Treg naturais) que normalmente se

desenvolvem no timo. Estão presentes no hospedeiro antes da exposição ao

patógeno e regula a reatividade de células T na periferia e são importantes para a

manutenção da tolerância imunológica e, células T regulatórias induzíveis ou

adaptativas, são ativadas nos tecidos linfóides periféricos, supostamente em

resposta ao estímulo antigênico e desempenham um papel importante na

modulação da resposta imune contra agentes infecciosos, como as células T CD4+

convencionais, após exposição de sinais como citocinas regulatórias, drogas

15

imunossupressoras, células apresentadoras de antígenos (APCs) ou condicionadas

por produtos microbianos (O’Garra, A. et al., 2004; Grassi, M. F. R. et al., 2009). A

população de células T regulatórias induzíveis inclui: células T regulatórias 1 (Tr1),

células T helper 3 (TH3) e células T regulatórias FOXP3 (forkhead Box P3)

convertidas (revisto por Belkaid, Y. 2007). Figura 2.

Figura 2- Tipos de células T regulatórias induzíveis. Adaptado de Noh & Lee,

2011.

As células Treg expressando CD25 (receptor de IL-2 cadeia α) constitui 1-2% da

população de CD4+ periférica em humanos, sendo que as CD4+CD25high são

aquelas que exibem funções regulatórias (Baecher-Allan, C. et al., 2001), enquanto

que as CD25Low representam células T ativadas (Baecher-Allan, C. et al., 2001;

Viglietta, M. et al., 2004; Lindley, S. et al., 2005).

As Treg não proliferam em resposta a estimulação antigênica in vitro e podem

suprimir a proliferação de outras células T induzida por estímulo especifico ou

policlonal (Sakaguchi, S. et al., 2001;Shevach, E. M. 2002).

16

Já foi mostrado que camundongos mutantes para Foxp3 e para CTLA-4 apresentam

disfunções de células TCD4+ e doenças autoimunes (Lyon, M. F. et al., 1990;

Kanangat, S. et al., 1996; Clark, L.B. et al., 1999; Tivol, E.A. et al., 1995;

Waterhouse, P. et al., 1995).

Os pacientes com HAM/TSP apresentam características imunológicas semelhantes

a aqueles encontrados em camundongos mutantes para Foxp3 e deficientes para

CTLA-4, incluindo linfoproliferação espontâneas de células TCD4+ e manifestações

clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico

em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias (Yamano, Y. et

al., 2005;). Nestes pacientes as células CD4+CD25+ são o principal reservatório de

HTLV-1, com mais de 90% desta população contendo DNA proviral do HTLV-1

(Yamano, Y. et al., 2005; Yamano, Y. et al., 2004).

A expressão de mRNA para Foxp3 nas células CD4+CD25+ de pacientes com

HAM/TSP é menor do que em indivíduos saudáveis. É também menor a expressão

de GITR e CTLA-4 (Yamano, Y. et al., 2005). Uma menor expressão de Foxp3 em

células CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP sugere três possibilidades: O

HTLV-1 tem um efeito inibitório na expressão de Foxp3; a população das

CD4+CD25+ é diminuída em pacientes com HAM/TSP; e pacientes com HAM/TSP

tem geneticamente baixa expressão do gene Foxp3 (Yamano, Y. et al., 2005).

As células T regulatórias CD8+ são ainda pouco conhecidas. Entretanto as células

TCD8+CD25+ são descritas em humanos (Suzuki, M. et al., 2008), camundongos

(Pomie, C. et al., 2008), e pouco se sabe sobre o seu papel regulatório. As Células T

CD8+CD25- (naive) podem se diferenciar em T reg CD8+CD25+ após o encontro com

antígeno (Mills, K. H. 2004).

17

Resposta Imune na infecção pelo Schistosoma

A infecção pelo Schistosoma spp ocorre através da penetração das cercarias pela

pele (ver ciclo do S. mansoni, Figura 3). Após este processo as cercarias perdem a

cauda e transformam-se em esquistossômulos que ganham a circulação e realizam

o ciclo pulmonar. Em seguida migram para o sistema porta, aonde chegam a fase

adulta. Estes parasitos vivem no sistema porto-mesentérico, põem os ovos nos

capilares intestinais e estes aparecem nas fezes após passar pelos tecidos da

mucosa intestinal, principalmente na região colônica. Os ovos ainda podem ganhar

a circulação porta-hepática e alcançarem os espaços porta, levando a formação de

granulomas, que são caracterizados pela reação inflamatória a antígenos do ovo,

seguida da produção de colágeno, podendo evoluir para um quadro de fibrose

periportal hepática (Wynn, T. A. et al., 1995).

Figura 3- Ciclo de vida do Schistossoma.

18

Durante a fase aguda a resposta imune desencadeada pelo parasita é do tipo Th1,

com produção das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e TNF. Logo após a ovoposição

a resposta imune muda para o perfil Th2 com a produção de Interleucina 4 (IL-4),

interleucina 5 (IL-5), interleucina-13 (IL-13), com uma forte resposta Th2, mas, logo

em seguida ocorre uma baixa da resposta Th2 e um aumento da resposta

regulatória, com o aumento de células T regulatórias e produção das citocinas

regulatórias Fator de crescimento de transformação β (TGF-β) e Interleucina-10 (IL-

10) e se mantém assim durante toda a fase crônica (Dunne, D. W. et al., 2005).

Em modelo experimental a infecção pelo Schistosoma mansoni ou injeção de seus

produtos leva a uma diminuição na produção de IFN-γ, TNF e outras citocinas pro-

inflamatórias, e aumento da produção de IL-10 e TGF-β, importantes citocinas

modulatórias (Dunne, D. W. et al., 2005). Esse perfil modulatório desencadeado por

helmitos vem despertando o interesse em estudos de modulação da resposta imune

em várias doenças de base imunológica, a exemplo do Diabetes tipo 1, Esclerose

Múltipla, Doença de Crohn e Asma brônquica (Elliott, et al. 2007).

HIPÓTESE

A hipótese do presente estudo é que antígenos do Schistosoma spp são capazes de

modular negativamente a resposta imune inflamatória em indivíduos infectados pelo

HTLV-1, através da expressão de células e citocinas regulatórias da resposta imune.

19

JUSTIFICATIVA

Antígenos de S. mansoni induzem a produção de IL-10 (Araujo, M. I. et al., 1996;

Correa-Oliveira, R. et al., 1998; Gazzinelli, G. et al., 1992; Williams, M. E. et al.,

1994) e existem evidências de que a IL-10 modula a resposta imune envolvida nas

doenças que cursam com a exacerbação da resposta imune do tipo Th1 (Elliott, D.

E. et al., 2003; La Flamme, A. C. et al., 2003; Sewell, D. et al., 2003), e do tipo Th2

(Araujo, M. I. et al., 2004; Royer, B. et al., 2001). Estes achados justificariam a busca

da identificação de antígenos de S. mansoni capazes de induzir a modulação das

respostas inflamatórias, na tentativa de futuro desenvolvimento de uma vacina capaz

de prevenir ou até mesmo atenuar as manifestações destas doenças.

A escolha dos antígenos recombinantes do S. mansoni Sm29, ShTSP2 e PIII para

serem utilizados neste estudo decorreu do fato de todos eles serem localizados na

membrana e/ou tegumento do verme adulto. Proteínas secretadas ou localizadas na

superfície de Schistosoma spp, que estão em íntimo contato com os tecidos do

hospedeiro provavelmente são mais eficazes em desencadear processos

imunorregulatórios como mecanismo de escape do sistema imune.

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Avaliar a capacidade de antígenos recombinantes do Schistosoma spp. em modular

a resposta imune do tipo Th1/inflamatória in vitro, na infecção pelo HTLV-1.

20

Objetivos específicos

Em indivíduos infectados pelo HTLV- 1, assintomáticos e com HAM/TSP, avaliar:

1. A capacidade dos antígenos do Schistosoma spp. Sm29, shTSP2 e PIII em

alterar a produção de IFN-γ, TNF e IL-10 e das quimiocinas CXCL9 e CXCL10 por

CMSP de pacientes com HTLV-1;

2. A capacidade destes antígenos em induzir um perfil regulatório nos linfócitos

TCD4+ e TCD8+ de pacientes infectados pelo HTLV-1, através da expressão das

moléculas modulatórias CD25, Foxp3 e CTLA-4 nessas células.

3. A frequência de células CD4+, CD8+, Monócitos e Linfócitos B expressando IL-10.

METODOLOGIA

População do estudo

Um total de 26 indivíduos infectados pelo HTLV-1 provenientes do Ambulatório

multidisciplinar de HTLV-1 do Serviço de Imunologia da Universidade Federal da

Bahia, localizado na cidade de Salvador, estado da Bahia no Brasil, com idade entre

10 a 60 anos, não infectados pelo S. mansoni e nenhum outro tipo de helminto, não

portadores de doenças crônicas, que não estejam em uso de drogas

imunossupressoras, do gênero masculino e mulheres não gestantes, foram incluídos

neste estudo.

Todos os pacientes doaram sangue para a separação das Células Mononucleares

do Sangue Periférico (CMSP) e estas foram cultivadas na presença e ausência dos

21

antígenos do Schistosoma spp. (rSm29, rShTSP2 e PIII). Após 72 horas de

incubação, a 37ºC e 5% CO2 foi recolhido o sobrenadante para a avaliação da

produção das citocinas IFN-γ, TNF e IL-10 e das quimiocinas CXCL9 e CXCL10,

através da técnica de ELISA Sanduiche. Após aproximadamente 20 horas, nas

mesmas condições acima, também foi avaliada a expressão de moléculas em

linfócitos TCD4+ e TCD8+ (CD25, Foxp3, CTLA-4) e a produção de IL-10 pelas

células TCD4+, TCD8+, Linfócitos B e monócitos, através da citometria de fluxo.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Maternidade Climério de Oliveira

da Universidade Federal da Bahia e o consentimento de participação do estudo foi

obtido de todos os pacientes.

23

Avaliação Laboratorial

Detecção da infecção pelo HTLV-1

Anticorpos anti HTLV-1 foram detectados utilizando a técnica de ELISA (Cambridge

Biotech Corp, Worcester, Mass., USA). Os resultados positivos foram confirmados

usando Western blot (HTLV blot 2.4, Genelabs, Science Park Drive, Singapore).

Antígenos de Schistosoma spp

Os antígenos usados neste estudo foram o rSm29, uma proteína recombinante do S.

mansoni, glicoproteína de membrana localizada no tegumento do verme adulto e no

estágio de esquistossômulo (Cardoso, F. C. et al., 2006), o rShTsp-2 uma proteína

recombinante (tetraspanina) do tegumento do S. haematobium (Rinaldi, G. et al.,

2011) e o PIII que é uma fração do antígenos solúvel do verme adulto do S. mansoni

(SWAP) obtido por cromatografia iônica (Hirsch, C. et al., 1996).

As proteínas recombinantes Sm29 e ShTsp-2 foram clonadas em Escherichia coli e

o nível de contaminação por lipopolissacarídeo foi avaliado através de um Kit

comercial (chromogenic LAL end-point assay kit - Cambrex, Charles City, Iowa,

USA) e foi <0,25 ng/ml. Para neutralizar o potencial efeito dos lipopolissacarídeos

encontrados em baixos níveis nos antígenos recombinantes de Schistosoma a

polimixina B foi adicionada as culturas de células a cada 12 horas, como

estabelecido previamente (Cardoso, L. S. et al., 2007).

24

Culturas de CMSP e dosagem de citocinas e quimiocinas

Os antígenos rSm29 (5 μg/ml), rShTSP2 (5 μg/ml) e PIII (10 μg/ml) foram

adicionados a culturas de CMSP (Células Mononucleares do Sangue Periférico) (3 x

106células/ml) de indivíduos infectados pelo HTLV-1, contendo RPMI 1640 (Gibco,

Grand Island, N.Y., USA) mais 10% soro AB Rh+ humano inativado (Sigma

Chemical Co., St. Louis, Mo., USA), antibióticos e glutamina. As células foram

incubadas a 37 °C em atmosfera de 5% CO2 em placas de 24 poços por 72 h. O

sobrenadante foi coletado para posterior dosagem de citocinas.

Níveis das cintocias IFN-γ, TNF, IL-10 e das quimiocinas CXCL-9, CXCL-10 foram

medidos pela técnica de ELISA sanduiche, usando Kit comercial (OptEIA; BD

Bioscience, San Jose, Calif., USA). Os resultados foram expressos em picogramas

por mililitros (pg/ml), com base na curva padrão.

Culturas de CMSP, avaliação das células T regulatórias e expressão de IL-10

nos linfócitos e monócitos

Os marcadores das células TCD4+ e TCD8+, CD25, Foxp3 e CTLA-4 e a expressão

de IL-10 nestas células e nos linfócitos B e monócitos, foram avaliados usando a

Citometria de Fluxo (FACS Canto II). Os antígenos rSm29 (0.5 ug/mL), rShTSP2

(0.5 ug/mL) e PIII (1 ug/mL) foram adicionados as culturas de CMSP (3 x 105

cells/mL) de indivíduos infectados pelo HTLV-1, com RPMI 1640 (Gibco, Grand

Island, NY, USA) mais 10% soro AB humano inativado Rh+ (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), antibióticos e glutamina. As células foram incubadas a 37oC em

atmosfera de 5% CO2 em places de 96 poços por 16 horas.

25

Para a marcação de superfície celular, 3 x105 células foram incubaddas com

anticorpos anti CD4+, CD8+, CD25+, CD14+ e CD19+ por 20 minutos a 4°C e, para a

marcação intracelular, foram usados anti CTLA-4. Foxp3, IL-10 de acordo com as

instruções do protocolo do kit (BD Pharmingen and eBioscience). Para distinguir

claramente as populações de células TCD4+, TCD8+, CD25+, CTLA-4+, Foxp3+ e

TCD4-, TCD8-, CD25-. CTLA-4-, Foxp3-, foi utilizado o isotipo controle de acordo com

as recomendações. As analises foram feitas usando FACS Canto II com o Software

Diva (BD Pharmingen), e o Flowjo (Treestar).

Os anticorpos usados foram obtidos da BD Pharmingen (mouse anti human CD4

(Clone RPA-T4), CD8 (RPA-T8), CD25 (M-A251), CD19 (555412), CD14 (555399),

IL-10 (559339) e da eBioscience anti-human CD152 (CTLA-4) (14D3), CD3

(UCHT1), Foxp3 (PCH101), HLA-DR (LN3).

Análise estatística

O teste não paramétrico de Wilcoxon signed-rank test foi utilizados para analisar o

efeito da adição de antígenos de Schistosoma spp. na produção de IFN-γ, TNF, IL-

10, CXCL-9, CXCL-10 e na expressão das moléculas: CD25, CTLA-4, Foxp3 nas

células TCD4+, TCD8+ e na produção de IL-10 pelos Linfócitos, B, CD4+, CD8+ e

monócitos. O teste exato de Fisher (Fisher exact test) foi usado para comparar

proporções. Um erro alfa (α) de 5% (p < 0,05) foi considerado como estatisticamente

significante. O software SPSS 9.0 (IBM Software, New York, N.Y., USA) foi utilizado

para a realização das análises estatísticas.

26

RESULTADOS

1- Estudo da modulação da resposta inflamatória do tipo Th1 na infecção

pelo HTLV-1

Dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 incluídos neste estudo dezessete eram

portadores assintomáticos do vírus (65%) enquanto que nove (35%) tinha a forma

HAM/TSP. A média de idade não diferiu entre os portadores do vírus e os com

HAM/TSP (47 ± 10 e 50 ± 6 anos, respectivamente; p>0,05). No grupo dos

indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do sexo

masculino (56% x 29%; p<0,05).

As concentrações de citocinas foram avaliadas no sobrenadante das culturas de

CMSP através de ELISA sanduíche. Observamos que os níveis de IFN-y foram

mais altos em culturas de CMSP não estimuladas (3.334 ± 3.822 pg/ml) quando

comparadas com culturas estimuladas com o antígeno rShTSP-2 (2.188 ± 2.560

pg/ml, 34% de redução; p = 0,004; Tabela I). Não foram observadas diferenças

estatisticamente significantes nos níveis médios de IFN-y entre culturas não

estimuladas e estimuladas com rSm29 ou PIII (Tabela I).

Em relação ao TNF, seus níveis também foram mais altos nas culturas não

estimuladas (436 ± 184 pg/ml) quando comparadas as culturas estimuladas: rSm29

(252 ± 163 pg/ml, 42% de redução; p = 0,018), rShTSP-2 (251 ± 130 pg/ml, 42% de

redução; p = 0,043) e PIII (190 ± 205 pg/ml, 56% de redução; p = 0,008; Tabela I).

Por outro lado, os níveis médios de IL-10 foram mais baixos em culturas não

estimuladas (123 ± 157 pg/ml), quando comparados com os níveis desta citocina em

27

culturas estimuladas com rSm29 (223 ± 391 pg/ml, 81% de aumento; p = 0,008) ou

com rShTSP-2 (556 ± 502 pg/ml, 352% de aumento; p = 0,0001; Tabela I).

Tabela I- Efeito da adição dos antígenos de Schistotoma spp sobre a produção de IFN-y, TNF e IL-10 pelas CMSP de indivíduos infectados pelo HTLV-1

Niveis de citocinas (pg/ml)

média ± DP

Redução/ Aumento

(%)

Valor de p*

sem antigenos

3.334 ± 3.822 - -

Redução de rSm29 2.802 ± 3.769 16 0,104

IFN-γ rShTSP-2 2.188 ± 2.560 34 0,004

PIII 2.812 ± 2.741 17 0,534

sem antigenos

436 ± 184 - -

Redução de rSm29 252 ± 163 42 0,018

TNF rShTSP-2 251 ± 130 42 0,043

PIII 190 ± 205 56 0,008

sem antigenos

123 ± 157

- -

Aumento de rSm29 223 ± 391 81 0,008

IL-10 rShTSP-2 556 ± 502 352 0,0001

PIII 125 ± 185 16 0,07

* Niveis de citocinas em culturas não estimuladas X culturas estimuladas com antigenos de Schistosoma spp. Wilcoxon Signed-Rank Test.

A frequência de indivíduos que apresentaram uma redução significativa nos níveis

de IFN-y quando os antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII foram adicionados as culturas

foram 50%, 69% e 50%, respectivamente (Tabela II). A redução apresentada nos

níveis desta citocina foi de 59% quando as culturas foram estimuladas com rSm29;

47% de redução após estimulação com rShTSP-2 e 35% de redução na presença do

PIII (Tabela II). Já para TNF, esta frequência, quando os antígenos rSm29, rShTSP-

2 e PIII foram adicionados as culturas foram 41%, 29% e 53%, respectivamente

(Tabela II). A redução apresentada nos níveis desta citocina foi de 43% quando as

28

culturas foram estimuladas com Sm29; 45% de redução após estimulação com

rShTSP-2 e 45% de redução na presença do PIII (Tabela II).

A respeito da produção de IL-10, a frequência de indivíduos que apresentaram

significante aumento nos níveis desta citocina após estimulação com rSm29,

rShTSP-2 e PIII foi de 74%, 62% e 44%, respectivamente (Tabela II). E o aumento

nos níveis desta citocina foi de 327%, 573% e 35% em resposta ao rSm29, rShTSP-

2 e PIII, respectivamente (Tabela II).

Tabela II- Frequência de indivíduos que apresentaram mudanças nos niveis de

IFN-, TNF e IL-10 na presença dos antígenos do Schistosoma spp nas culturas Antígenos

de

Schistosoma spp

Redução/Aumento dos níveis de Citocinas

Número de pacientes (%) / Percentagem de redução/Aumento

Redução de rSm29 13 (50 %) / 59% IFN-γ rShTSP-2 18 (69 %) / 47%

PIII 13 (50 %) / 35%

Redução de rSm29 07 (41 %) / 43%

TNF rShTSP-2 5 (29 %) / 45%

PIII 9 (53 %) / 45%

Aumento de rSm29 4 (57 %) / 71% IL-10 rShTSP-2 3 (60 %) / 79% PIII 4 (44 %) / 0%

A partir destes resultados foram comparadas as manifestações clínicas e os dados

laboratoriais dos indivíduos que apresentaram redução nos níveis de IFN-γ e TNF

com aqueles que não tiveram redução nos níveis destas citocinas na presença dos

antígenos de Schistosoma spp (Tabela III e Tabela IV, respectivamente).

A mediana da idade e a distribuição do gênero não diferiram entre os dois grupos

para nenhum dos antígenos testados (Tabela III e IV). Adicionalmente, a frequência

de pacientes com HAM/TSP entre os indivíduos que tiveram redução dos níveis de

29

IFN-y e TNF na presença de rSm29, rShTSP-2 e PIII foram similares a aqueles que

não apresentaram inibição na produção destas citocinas (Tabela III e Tabela IV).

Foi observado, entretanto, que os níveis basais de IFN-y e TNF foram menores no

grupo de indivíduos que tiveram uma diminuição nos níveis desta citocina na

presença de rSm29 nas culturas [mediana, (valores de IFN- y mínimo e máximo) =

469 pg/ml (63 – 3.277 pg/ml)], [mediana, (valores de TNF mínimo e máximo) = 190

pg/ml (190 (41 – 518 pg/ml)] quando comparados aos grupos de pacientes que não

tiveram redução na produção de citocinas [IFN- y 3.133 pg/ml (479 – 17.297 pg/ml);

p < 0,01 e TNF 1.677 pg/ml (280 – 2.082 pg/ml); p < 0,01; Tabelas III e IV

respectivamente]. Os níveis basais de IL-10 em indivíduos que mostraram

diminuição nos níveis de IFN-y e TNF quando os antígenos de Schistosoma foram

adicionados às culturas não diferiram significativamente daqueles que não tiveram

redução nos níveis de IFN-y e TNF pela presença dos antígenos (Tabela III e IV).

Também não foram encontradas diferenças na carga pro viral de HTLV-1 entre os

indivíduos que tiveram e não tiveram redução na produção de IFN-y e TNF (Tabela

III e IV).

30

Tabela III - Características dos indivíduos que apresentaram ou não inibição na produção de IFN-y pela adição dos antígenos do Schistosoma spp nas culturas.

Indivíduos que apresentaram inibição da produção de IFN-γ

Indivíduos que não apresentaram inibição da produção de IFN-γ

rSm29 (n=13/26)

rShTSP-2 (n=18/26)

PIII (n=13/26)

rSm29 (n=13/26)

rShTSP-2 (n=8/26)

PIII (n=13/26)

Idade em anos mediana( mínimo e máximo)

48 (23 - 58)

48 (23 - 58)

48 (23 - 58)

49 (23 - 59)

53 (35 - 59)

50 (43 - 59)

Gênero masculino n (%)

5 (38) 7 (39) 3 (23) 5 (38) 3 (38) 7 (54)

HAM/TSP n (%)

6 (46) 7 (39) 4 (31) 3 (23) 2 (25) 5 (39)

IFN-γ (pg/ml) mediana (mínimo e máximo)

469 (63 - 3.277)a

667 (54 - 6.566)

656 (41 - 7.898)

3.133 (479 - 17.297)a

959 (348 – 9.991)

1.783 (690 - 8.650)

Aumento de IL-10 n (%)

10 (77) 13 (72) 4 (31) 10 (77) 8 (100) 8 (62)

Carga proviral (Log do número de cópias x 106 células) média (mínimo e máximo)

4,94 (4,33 – 5,84)

4,63 (3,62 – 5,59)

4,6 ( 3,62 – 5,84)

4,54 (1,54 - 5,53)

4,73 ( 1,54 – 5,53)

5,02 (1,54 – 5,59)

a Indivíduos que apresentaram inibição na produção de IFN-γ após a adição de Sm29 nas culturas de

CMSP vs Indivíduos que não apresentaram inibição na produção de IFN-γ; p<0,01, Mann-Whitney test.

31

Tabela IV- Características dos indivíduos que apresentaram ou não inibição na produção de TNF pela adição dos antígenos do Schistosoma spp nas culturas.

Indivíduos que apresentaram inibição da produção de TNF

Indivíduos que não apresentaram inibição da produção de TNF

rSm29

(n=7/17)

rShTSP2

(n=5/17)

PIII

(n=9/17)

rSm29

(n= 10/17)

rShTSP2

(n=12/17)

PIII

(n=8/17)

Idade em anos mediana( mínimo e máximo)

51

(23-55)

55

(46 – 60)

52

(23 – 60)

50

(38 – 60)

43

(23 – 59)

51

(23 – 59)

Gênero masculino n (%)

2 (29) 0 (0) 2 (22) 4 (40) 6 (50) 4 (50)

HAM/TSP n (%)

2 (29) 2 (40) 4 (44) 6 (60) 6 (50) 4 (50)

TNF (pg/ml) mediana (mínimo e máximo)

190

(41 – 518)a

399

(299 – 518)

1.035

(41 – 2.082)

1.677

(280 – 2.082) a

493

(41 - 2.082)

493

(41 - 1.271)

Aumento de IL-10 n (%)

5 (71) 3 (60) 5 (56) 7 (70) 9 (75) 7 (88)

Carga proviral (Log do número de cópias x 106 células) média (mínimo e máximo)

4,66

(4,43 - 5,53)

5,1

(4,33 - 5,84)

4,72

(1,54 – 5,84)

5

(1,54 - 5,84)

4,84

(1,54 – 5,59)

4,97

(4,6 – 5,59)

a Indivíduos que apresentaram inibição na produção de TNF após a adição de Sm29 nas culturas de

CMSP vs Indivíduos que não apresentaram inibição na produção de TNF; p<0,01, Mann-Whitney test.

Para analisar o balanço entre a resposta do tipo Th1 e as citocinas regulatórias, foi

avaliada a razão entre os níveis de IFN-y/IL-10 e TNF/IL-10 nas culturas não

estimuladas e estimuladas com os antígenos de Schistosoma spp. (Figura 4 e 5,

respectivamente). Foi observado que a razão entre os níveis de IFN-y/IL-10 no total

dos indivíduos infectados pelo HTLV-1, incluídos no estudo, foi maior nas culturas de

CMSP sem antígenos de Schistosoma (razão IFN-y/IL-10, média ± DP = 116 ±

207,1) que em culturas estimuladas com os antígenos rSm29 e rShTSP-2 (72.2 ±

207,7 e 14,3 ± 25,1, respectivamente; p<0,001. Figura 4A). Não foram observadas

diferenças estatisticamente significantes na razão dos níveis de IFN-y/IL-10 quando

32

o PIII foi adicionado às culturas (75,5 ± 121,9; Figura4A). Nos indivíduos portadores

de HTLV-1 observou-se também uma mais alta razão nos níveis de IFN-y/IL-10 em

culturas não estimuladas (79,8 ± 85,6), comparadas àquelas estimuladas com

rSm29 e rShTSP-2 (0,17 ± 0,49 e 15,1 ± 20,5, respectivamente; p<0,001. Figura 4B).

A adição de PIII às culturas não alterou a razão entre IFN-y/IL-10 (69,4 ± 96,7) em

relação as culturas não estimuladas. Entretanto, em indivíduos com HAM/TSP a

razão IFN-y/IL-10 foi mais baixa em culturas estimuladas com o rSm29 (0,44 ± 0,48)

do que em culturas sem antígenos (148,3 ± 311; p=0,01, Figura 4C). Não foram

encontradas diferenças significativas na razão dos níveis de IFN-y/IL-10 na presença

de rShTSP-2 (12,7 ± 32) e PIII (87,2 ± 158,1) quando comparado as culturas não

estimuladas (148,3 ± 311; p>0,05. Figura 4C).

Com relação à razão entre os níveis de TNF/ IL-10 no total dos indivíduos infectados

pelo HTLV-1, esta foi maior nas culturas de CMSP não estimuladas (razão TNF/IL-

10, média ± DP = 10 ± 11) que em culturas estimuladas com o antígeno rShTSP-2 (3

± 5; p<0,001. Figura 5A). Não foram observadas diferenças estatisticamente

significantes na razão dos níveis de TNF/IL-10 quando o Sm29 e PIII foram

adicionados às culturas (7 ± 9 e 8 ± 9; p>0,05, respectivamente, Figura 5A). Nos

indivíduos portadores de HTLV-1 foi observado também uma mais alta razão nos

níveis de TNF/IL-10 em culturas não estimuladas (11 ± 11), comparadas àquelas

estimuladas com rShTSP-2 (6 ± 8; p<0,001. Figura 5B). A adição de rSm29 e PIII as

culturas não alterou a razão entre TNF/IL-10 (6 ± 8 e 2 ± 2; p>0,05, respectivamente;

Figura 5B) em relação as culturas não estimuladas. O mesmo foi observado nos

indivíduos com HAM/TSP na razão TNF/IL-10, que também foi mais alta em culturas

de CMSP não estimuladas (13 ± 11) do que em culturas estimuladas com rShTSP-2

(3 ± 4; p=0,02, Figura 5C). Não foram encontradas diferenças significativas na razão

33

dos níveis de TNF/IL-10 na presença de Sm29 (9 ± 10) e PIII (13 ± 10) quando

comparado as culturas não estimuladas (p>0,05; Figura 5C).

Figura 4- Razão entre níveis de IFΝ-γ/IL-10 no sobrenadante das culturas de CMSP sem estímulo (W/Ag) e culturas estimuladas com os antígenos do Schistosoma spp. no total dos indivíduos (A), nos portadores (B) e nos indivíduos com HAM/TSP (C). *p=0,0001, **p=0,02.

Total de indivíduos A

Portadores B C

HAM/TSP

34

Figura 5- Razão entre níveis de TNF/IL-10 no sobrenadante das culturas de CMSP sem estímulo (W/Ag) e culturas estimuladas com os antígenos do Schistosoma spp. no total dos indivíduos avaliados (A), nos portadores do HTLV-1 (B) e nos indivíduos com HAM/TSP (C). **p=0,02.

2- Avaliação da produção de quimiocinas no sobrenadante de cultura de

CMSP de pacientes infectados pelo HTLV-1, na presença dos antígenos

do Schistosoma spp.

Para a análise da expressão de CXCL9 e CXCL10 foram utilizados os

sobrenadantes de culturas de CMSP de 30 indivíduos com HTLV-1, sendo 23 (77%)

A

B C

35

portadores do vírus e sete (23%) com a forma HAM/TSP. A média de idade não

diferiu significativamente entre os portadores do vírus e aqueles com HAM/TSP (45,3

± 10,6 e 52,3 ± 4,4 anos, respectivamente; p>0,05). No Grupo dos indivíduos com

HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do sexo masculino (71%)

em relação aos portadores do vírus (35%; p>0,05).

Foi observado uma diminuição na produção de CXCL9, no sobrenadante das CMSP,

após a adição dos antígenos rSm29 (18.167 ± 9.727 pg/ml, p=0,044) e rShTSP-2

(16.136 ± 9.233, p=0,031) em relação as células não estimuladas (19.745 ± 9.729),

no total dos indivíduos analisados (Figura 6A). A adição do PIII não alterou a

produção desta quimiocina (19.298 ± 10.048, p>0,05). No grupo dos indivíduos

portadores do vírus a adição do rShTSP-2 resultou em diminuiu da produção desta

quimiocina (13.977 ± 8.857, p=0,026) (Figura 6B), o que não foi observado após a

adição do rSm29 (17.537 ± 10.520, p>0,05) e do PIII (18.177 ± 10.926, p>0,05) em

relação as células não estimuladas (18.121 ± 10.508).

No grupo dos indivíduos com HAM/TSP a adição do rSm29 diminuiu a produção de

CXCL9 (20.237 ± 6.023, p=0,028) no total dos indivíduos (Figura 6C), em relação as

células não estimuladas (25.078 ± 2.392), a adição dos antígenos rShTSP-2 (23.230

± 6.477, p>0,05) e PIII (22.982 ± 4.771, p>0,05) não alterou a produção desta

quimiocina.

36

Figura 6 - Produção de CXCL9 pelas CMSP de indivíduos com HTLV-1, antes e após a adição de antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos analisados (A), nos portadores do vírus (B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,031, **p=0,044, ***p=0,026, ****p=0,028.

Com relação à produção de CXCL10 observou-se que não houve alteração nos

níveis desta quimiocina pela presença dos antígenos do Schistosoma spp. nas

culturas de células (rSm29 = 872 ± 650; rShTSP-2 = 760 ± 563; PIII = 815 ± 632;

p>0.05 respectivamente) em relação as células não estimuladas (733 ± 610), no total

dos indivíduos analisados (Figura 7A), no grupo dos portadores (rSm29 = 876 ± 658;

rShTSP-2 = 760 ± 569; PIII = 702 ± 640; p>0.05 respectivamente; sem estímulo =

689 ± 619) (Figura 7B) e no grupo com HAM/TSP (rSm29 = 890 ± 662; rShTSP-2 =

A

B C

*

**

*** ****

37

683 ± 543; PIII = 1.104 ± 501; p>0.05 respectivamente; sem estímulo = 824 ± 598)

(Figura 7C).

Figura 7 - Produção de CXCL10, pelas CMSP de indivíduos com HTLV-1, antes e após a adição de antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos analisados (A), nos portadores do vírus (B) e naqueles com HAM/TSP (C).

3- Células TCD4+ e TCD8+ regulatórias, na infecção pelo HTLV-1, em

resposta aos antígenos do Schistosoma spp.

A

B C

38

Foram incluídos no estudo de expressão de células T regulatórias CD4+ e CD8+

dezoito pacientes com HTLV-1 sendo, onze portadores do vírus (61%) e sete (39%)

com a forma HAM/TSP. A média de idade não diferiu entre os portadores do vírus e

aqueles com HAM/TSP (44 ± 11 e 50 ± 7 anos, respectivamente; p>0,05). No grupo

dos indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do

sexo masculino (43% x 27%; p<0,05).

A estratégia para a avaliação da frequência da população de células TCD4+ e TCD8

expressando as moléculas CD25, é mostrado na figura 8.

Figura 8- Estratégia para seleção da população de linfócitos TCD3+TCD4+ e TCD3+TCD8+ da expressando a molécula CD25.

Foi analisada a frequência de células TCD4+ expressando as moléculas CD25,

CTLA-4 e Foxp3, na presença e ausência dos antígenos do Schistosoma. Observou-

se uma diminuição da frequência de células CD4+CD25- após a adição do rSm29 às

39

culturas de CMSP dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (91,7%) em relação as

células não estimuladas (93%; p=0,02) no total de indivíduos analisados, não

havendo diferenças após a adição do rShTSP-2 e PIII (92,8% e 93,3%,

respectivamente); Tabela V.

Tabela V- Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD4+CD25- de indivíduos infectados pelo HTLV-1

Células TCD4

+ CD25

-

Indivíduos com HTLV-1

N Antígenos Média % Valor de p

CD4+CD25

- Total 18 Sem antígenos 93,3 -

rSm29 91,7 0,020

rShTsp2 92,8 ns

PIII 93,3 ns

Portadores 11 Sem antígenos 92,4 -

rSm29 90,1 ns

rShTsp2 92,0 ns

PIII 92,7 ns

HAM/TSP 07 Sem antígenos 96,3 -

rSm29 95,4 ns

rShTsp2 95,7 ns

PIII 96,1 ns

CD4+CD25

-CTLA4

+ Total 18 Sem antígenos 0,451 -

rSm29 0,718 0,001

rShTsp2 0,654 0,018

PIII 0,703 0,022


rSm29 0,775 0,006

rShTsp2 0,654 0,05

PIII 0,803 ns


rSm29 0,628 ns

rShTsp2 0,654 ns

PIII 0,546 ns

CD4+CD25

-Foxp3

+ Total 18 Sem antígenos 0,414 -

rSm29 0,660 ns

rShTsp2 0,556 ns

PIII 0,741 ns


rSm29 0,905 ns

rShTsp2 0,756 ns

PIII 0,889 ns


rSm29 0,274 ns

rShTsp2 0,241 ns

PIII 0,509 ns

ns= Não significativo

40

Quando se dividiu os indivíduos em dois grupos (grupo de indivíduos portadores do

HTLV-1 e grupo de indivíduos com HAM/TSP), foi observado que no grupo de

indivíduos portadores do vírus a adição dos antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII às

culturas de células não alterou a frequência de células CD4+CD25- (90,1%, 92% e

92,7, respectivamente), não diferindo em relação as culturas não estimuladas

(92,4%); Tabela V. O mesmo foi observado em relação a frequência de células

CD4+CD25- no grupo dos indivíduos com HAM/TSP nas culturas não estimuladas

(96,3%), em relação as culturas estimuladas com os antígenos de Schistosoma;

rSm29 (95,4%), rShTSP-2 (95,7%) e PIII (96,1%); Tabela V.

Analisando a frequência das células CD4+CD25-, expressando CTLA4+ foi verificado

que os três antígenos foram capazes de aumentar a frequência destas células

(rSm29= 0,718% - p=0,001; rShTSP-2 = 0,654% - p=0,018; PIII = 0,703% - p=0,022)

em relação as células não estimuladas (0,451%); Tabela V. No grupo dos indivíduos

portadores, o rSm29 (0,775% - p=0,006) e o rShTSP-2 (0,654% - p=0,05) quando

adicionados as culturas de células, aumentaram a frequência das mesmas em

relação as culturas não estimuladas (0,443%); Tabela V. A adição do PIII não alterou

a frequência destas células no grupo dos portadores do HTLV-1 (0,803%). No grupo

dos indivíduos com HAM/TSP não houve alteração na frequência de CD4+CD25-

CTLA4+ após a adição dos três antígenos analisados (rSm29 = 0,628%, rShTSP-2 =

0,654% e PIII = 0,546%; p<0,05, respectivamente) em relação as culturas não

estimuladas (0,463%); Tabela V.

Em relação a frequência das células CD4+CD25-, expressando Foxp3+, os três

antígenos analisados não foram capazes de causar alteração na frequência destas

células (rSm29 = 0,660%, rShTSP-2 = 0,556% e PIII = 0,741%, p<0,05

respectivamente) em relação as culturas não estimuladas (0,414%); Tabela V. O

41

mesmo foi observado para o grupo dos indivíduos portadores do vírus (rSm29 =

0,905%, rShTSP-2 = 0,756%, PIII = 0,889%; p<0,05 respectivamente; sem estímulo

= 0,480%) e para o grupo dos indivíduos com HAM/TSP (rSm29 = 0,274%, rShTSP-

2 = 0,241%, PIII = 0,509%, p<0,05 respectivamente; sem estímulo = 0,309%);

Tabela V.

Com relação a frequência de células CD4+CD25Low, não foi observada alteração na

frequência destas células após a adição dos antígenos de Schistosoma às culturaas

de células do total de indivíduos (rSm29 = 5,80%, rShTSP-2 = 5,89% e PIII = 5,21%,

p>0,05 respectivamente), nos indivíduos portadores (rSm29 = 4,79%, rShTSP-2 =

4,30% e PIII = 4,34%, p>0,05, respectivamente) e nos indivíduos com HAM/TSP

(rSm29 = 7,40%, rShTSP-2 = 8,38% e PIII = 6,59%, p>0,05, respectivamente) em

relação as células não estimuladas (5,01%, 4,28%, 6,16, respectivamente); Tabela

VI.

As células CD4+CD25Low expressando CTLA-4+ mostraram um aumento da sua

frequência após a adição dos antígenos rSm29 (5,59%, p= 0,006) e PIII (5,84%,

p=0,035) em relação as células não estimuladas (4,58%) no total de indivíduos

analisados. A adição do rShTSP-2 não resultou em diferenças (5,29%, p>0,05). Os

antígenos analisados não alteraram a frequência destas células nos indivíduos

portadores (rSm29 = 4,78%, rShTSP-2 = 4,59% e PIII = 4,93%, p>0,05

respectivamente, 3,84% sem antígenos). Nos indivíduos com HAM/TSP, o rSm29 e

o PIII foram capazes de aumentar a frequências das células CD4+CD25LowCTLA-4+

(4,92%, p=0,018; 7,18, p=0,018, respectivamente) em relação as células não

estimuladas (5,74%), sendo que o rShTSP-2 não levou a nenhuma diferença

(6,39%, p>0,05); Tabela VI.

42

Os antígenos rSm29, rShTSP-2 e PIII foram capazes de aumentar a frequência das

células CD4+CD25Low, expressando Foxp3+, no total de indivíduos (4,92%, p=0,05;

6,00%, p=0,003, 5,63%, p=0,006, respectivamente) e no grupo dos portadores de

HTLV-1 (6,50%, p=0,033; 7,08%, p=0,021; 6,48%, p=0,033, respectivamente) em

relação as células não estimuladas (3,09%, 3,48%, respectivamente). Já no grupo

dos indivíduos com HAM/TSP, somente o rShTSP-2 e o PIII foram capazes de

aumentar a frequência destas células (4,31%, p=0,018; 4,29, p=0,021,

respectivamente). O rSm29 não foi capaz de alterar a frequência destas células

(2.43%, p>0.05), em relação as células não estimuladas (2,47%); Tabela VI.

43

Tabela VI - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD4+CD25Low de indivíduos infectados pelo HTLV-1.

Células T CD4+CD25Low Indivíduos com HTLV-1

N Antígenos Média %

Valor de p

CD4+CD25Low- Total 18 Sem antígenos 5,01 -

rSm29 5,80 ns

rShTsp2 5,89 ns

PIII 5,21 ns


rSm29 4,79 ns

rShTsp2 4,30 ns

PIII 4,34 ns


rSm29 7,40 ns

rShTsp2 8,38 ns

PIII 6,59 ns

CD4+CD25Low CTLA-4+ Total 18 Sem antígenos 4,58 -

rSm29 5,59 0,006

rShTsp2 5,29 ns

PIII 5,84 0,035


rSm29 4,78 ns

rShTsp2 4,59 ns

PIII 4,93 ns


rSm29 6,86 0,018

rShTsp2 6,39 ns

PIII 7,28 0,018

CD4+CD25Low Foxp3+ Total 18 Sem antígenos 3,09 -

rSm29 4,92 0,05

rShTsp2 6,00 0,003

PIII 5,63 0,006


rSm29 6,50 0,033

rShTsp2 7,08 0,021

PIII 6,48 0,033


rSm29 2,43 ns

rShTsp2 4,31 0,018

PIII 4,29 0,021

ns=não significativo

No que diz respeito as células CD4+CD25High (Figura 9), os três antígenos

analisados foram eficientes para aumentar a frequência, tanto no total dos indivíduos

44

analisados (rSm29 = 0,712%, p=0,002; rShTSP-2 = 0,767%, p=0.00027; PIII =

0,883%, p=0,002; respectivamente), quanto no grupo dos portadores (rSm29 =

0,792%, p=0,18; rShTSP-2 = 0,884%, p=0,004; PIII 0,797%, p=0,021;

respectivamente) e no grupo de HAM/TSP (rSm29 = 0,586, p=0,042; rShTSP-2 =

0,584%, p=0,017; PIII = 1,02%, p=0,043; respectivamente) em relação as células

não estimuladas (0,443%, 0,512%, 0,335: respectivamente); Figura 9.

Figura 9- Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD4+CD25High de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores (B) e com HAM/TSP (C).*p=0,002, **p=0,00027, ***p=0,02, ****p=0,004, *****p=0,04.

A

B C

*

*

**

***

****

***

***

*****

*****

45

Com relação as células CD4+CD25High expressando CTLA-4+ (Figura 10), o rSm29

aumentou sua frequência no total dos indivíduos analisados e no grupo com

HAM/TSP (25%, p=0,039; 30%, p=0,042, respectivamente), em relação as células

não estimuladas (21%; 24%) Já no grupo dos indivíduos portadores do vírus, a

presença do rSm29 não alterou esta população de células (22%, p>0,05 e sem

estímulo = 19%). A adição ds antígenos rShTSP-2 e PIII não resultou em alteração

da frequência das células CD4+CD25High quando adicionados as culturas, no total de

indivíduos (rShTSP-2 = 24; PIII = 27%; não estimuladas = 21%, p>0,05,

respectivamente), no grupo de portadores (rShTSP-2 = 20%; PIII = 24%; não

estimuladas = 19%; p>0,05, respectivamente) e de HAM/TSP (rShTSP-2 = 30%; PIII

= 33%; não estimuladas = 24%; p>0,05, respectivamente); Figura 10.

46

Figura 10 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD4+CD25HighCTLA4+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores do HTLV-1 (B) e aqueles com HAM/TSP (C).*p=0,04.

A adição dos três antígenos utilizados neste estudo levou ao aumento da frequência

das células CD4+CD25High expressando Foxp3+ (Figura 11) no total de indivíduos

(rSm29 = 18%, p=0,004; rShTSP-2 = 24%, p=0,0004; PIII = 26%, p=0,012; sem

estímulo = 13%, respectivamente) e nos portadores (rSm29 = 23%, p=0,005;

rShTSP-2 = 30%, p=0,003; PIII = 29%, p=0,047; sem estímulo = 17%,

respectivamente). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP, somente o rShTSP-2 foi

capaz de aumentar a frequência das células CD4+CD25HighFoxp3+ (15%, p=0,046).

A

B

C

*

*

47

O rSm29 e o PIII não alteraram a frequência destas células (11%, 20%, p>0,05,

respectivamente); Figura 11.

Figura 11 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD4+CD25High Foxp3+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores do vírus (B) e pacientes com HAM/TSP (C).*p=0,004,**p=0,0004,***p=0,01, ****p=0,005,*****p=0,003, ******p=0,046.

Analisando o efeito da adição dos antígenos de Schistosoma sobre o perfil das

células TCD8+ (Tabela VII) foi observado que não houve alteração da frequência das

células CD8+CD25- no total de indivíduos (rSm29 = 95,7%; rShTSP-2 = 95,7%; PIII =

95.9%, p>0,05, em relação as células não estimuladas = 95.2%, respectivamente),

A

B C

*

**

***

****

*****

****** ******

48

nos grupos dos portadores (rSm29 = 95%; rShTSP-2 = 95.2%; PIII = 95.2%, p>0,05,

em relação as células não estimuladas = 94.6%, respectivamente) e com HAM/TSP

(rSm29 = 96.7%; rShTSP-2 = 96.6; PIII = 97%, p>0,05, em relação as células não

estimuladas = 96,1%, respectivamente). Com relação às células CD8+CD25-

expressando Foxp3+ foi observado um aumento na sua frequência após a adição de

rSm29 e rShTSP-2 nas culturas (3,27%, p= 0,031; 2,77%, p= 0,025,

respectivamente) em relação as células não estimuladas (0,819%), no total de

indivíduos, embora o PIII não tenha aumentado a frequência destas células (1,47%,

p>0,05). No grupo dos portadores do HTLV-1 (rSm29 = 3,41%; rShTSP-2 = 2,53%;

PIII = 1,57%, p>0,05 respectivamente; não estimuladas = 0,682%) e dos indivíduos

com HAM/TSP não houve alteração na frequência das células CD8+CD25-Foxp3+

quando os antígenos foram adicionados às cultura (rSm29 = 3,05%; rShTSP-2 =

2,61%; PIII = 1,31%, p>0,05 respectivamente; não estimuladas = 1,03%); Tabela VII.

49

Tabela VII - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD8+CD25- de indivíduos infectados pelo HTLV-1

Células T CD8+CD25- Indivíduos com HTLV-1


CD8+CD25-- Total 18 Sem antígenos 95,2 -

rSm29 95,7 ns

rShTsp2 95,7 ns

PIII 95,9 ns


rSm29 95 ns

rShTsp2 95,2 ns

PIII 95,2 ns


rSm29 96,7 ns

rShTsp2 96,6 ns

PIII 97 ns

CD8+CD25-Foxp3+ Total 18 Sem antígenos 0,819 -

rSm29 3,27 0,031

rShTsp2 2,57 0,025

PIII 1,47 ns


rSm29 3,41 ns

rShTsp2 2,53 ns

PIII 1,57 ns


rSm29 3,05 ns

rShTsp2 2,61 ns

PIII 1,31 ns


As células CD8+CD25Low (Tabela VIII) não alteraram sua frequência quando os três

antígenos de Schistosoma foram adicionados as culturas tanto no total de indivíduos

analisados (rSm29 = 3,19%; rShTSP-2 = 3,31%; PIII = 3,22%, p>0,05

respectivamente), quanto nos grupos de portadores (rSm29 = 4,01%; rShTSP-2 =

3,66%; PIII = 3,93%, p>0,05 respectivamente) e com HAM/TSP (rSm29 = 2,01%;

rShTSP-2 = 2,77%; PIII = 2,20%, p>0,05 respectivamente) em relação as culturas

não estimuladas (3,82%, 4,12%, 3,35%, respectivamente). Já as células

CD8+CD25Low, expressando Foxp3+ (Tabela VIII), tiveram sua frequência aumentada na

50

presença de rSm29 no total dos indivíduos incluídos no estudo (15,6%, p=0,007; em

relação as células não estimuladas = 7,62%) e no grupo dos portadores (13,9%,

p=0,011, em relação as células não estimuladas 5,36), mas, não alterou no grupo

com HAM/TSP (18,1%, p>0,05; sem estímulo = 11,2%). O rShTSP-2 aumentou a

frequência no total de indivíduos (12,9%, p=0,004), mas não alterou nos grupos do

portadores (9,38%, p>0,05) e com HAM/TSP (18,4%, p>0,05). O antígeno PIII não

alterou a frequência destas células em nenhum dos grupos acima (14,4%, 13,8%,

15,4, respectivamente). Tabela VIII.

Tabela VIII - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD8+CD25Low, de indivíduos infectados pelo HTLV-1

Células T CD8+CD25Low Indivíduos com HTLV-1


CD8+CD25Low Total 18 Sem antígenos 3,82 -

rSm29 3,19 ns

rShTsp2 3,31 ns

PIII 3,22 ns


rSm29 4,01 ns

rShTsp2 3,66 ns

PIII 3,93 ns


rSm29 2,01 ns

rShTsp2 2,77 ns

PIII 2,20 ns

CD8+CD25Low Foxp3+ Total 18 Sem antígenos 7,62 -

rSm29 15,6 0,007

rShTsp2 12,9 0,004

PIII 14,4 ns


rSm29 13,9 0,011

rShTsp2 9,38 ns

PIII 13,8 ns


rSm29 18,1 ns

rShTsp2 18,4 ns

PIII 15,4 ns


51

Para a população de células CD8+CD25High (Figura 12), os antígenos rSm29 e

rShTSP-2 foram eficientes em aumentar a sua frequência (0,655%, p= 0,031;

0,759%, p=0,018, respectivamente), em relação as células não estimuladas

(0,505%) no total dos indivíduos analisados, mas, estes antígenos não alteraram a

frequência destas células nos indivíduos portadores do HTLV-1 (0,777%, 0,834%,

p>0,05 respectivamente e sem estímulo = 0,640%) e nos indivíduos com HAM/TSP

(0,482%, 0,643%, p>0,05, respectivamente e sem estímulo = 0,293%). A presença

do PIII não levou a alteração da frequência destas células, em nenhum dos grupos

analisados (total de indivíduos 0,686%, p>0,05, portadores 0,800%, p>0,05 e com

HAM/TSP 0,524%, p>0,05); Figura 12.

A

B C

*

**

***

52

Figura 12 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD8+CD25High de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores (B) e pacientes com HAM/TSP (C).*p=0,018, **p=0,031, ***p=0,043.

No que se refere as células CD8+CD25High expressando Foxp3+ (Figura 13), foi

observado que os três antígenos foram eficientes em aumentar a frequência destas

células, no total de indivíduos analisados (rSm29 = 31%, p=0,011; rShTSP-2 = 32%,

p=0,026; PIII = 33%, p=0,026) em relação as células não estimuladas (21%).

Entretanto, nos indivíduos portadores, somente o rSm29 foi capaz de aumentar a

frequência destas células (30%, p=0,046, sem estímulo = 21%). Os outros antígenos

não mostraram diferença em relação as culturas não estimuladas (rShTSP-2 = 31%;

PIII = 35%, p>0,05, respectivamente). Nos indivíduos com HAM/TSP, somente o PIII

foi capaz de aumentar a frequências das células CD8+CD25HighFoxp3+ (31%,

p=0,043 em relação as células não estimuladas 22%). Os outros antígenos não

induziram diferença (rSm29 = 31; rShTSP-2 34%, p=0,05 respectivamente); Figura

13.

53

Figura 13 - Efeito da adição dos antígenos de Schistosoma na frequência de células CD8+CD25HighFoxp3+ de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (A), portadores (B) e pacientes com HAM/TSP (C). *p=0,026, **p=0,011, ***p=0,046, ****p=0,043.

4- Produção de IL-10 por CMSP em indivíduos infectados pelo HTLV-1 na

presença de antígenos do Schistosoma spp.

Foi analisada a fonte produtora de IL-10 nos pacientes com HTLV-1 em 12

indivíduos, sendo oito (67%) portadores do vírus e quatro (33%) com a forma

HAM/TSP. A média de idade diferiu significativamente entre os portadores do vírus e

aqueles com HAM/TSP (45 ± 8,6 e 56 ± 3,1 anos, respectivamente; p=0,017). No

A

B C

*

*

**

*** ****

54

Grupo dos indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos

do sexo masculino (75%) em relação aos portadores do vírus (25%), p<0,05.

A frequência de células expressando IL-1 foi avaliada e observou-se uma maior

frequência de monócitos expressando IL-10 (20,7 ± 24,9), quando comparados aos

Linfócitos TCD4+ (5,4 ± 6,5), TCD8+ (9,5 ± 19,4) e B (6,7 ± 11,8), no total dos

indivíduos, p<0.05 (Figura 14A). Analisando os indivíduos portadores (Figura 14B),

foi observada, também, uma maior frequência de monócitos expressando IL-10 (21,7

± 24,7) em relação as TCD4+ (6,3 ± 7,5), TCD8+ (4,9 ± 8,6), p<0.05, entretanto, não

foi observada diferença em relação aos linfócitos B (8,1 ± 14,1; p>0.05).

No grupo dos indivíduos com HAM/TSP não foi observada alterações de frequência

celular expressando IL-10 (Figura 14C) (monócitos = 19 ± 25,1; CD4+ = 3,6 ± 3;

CD8+ = 18,8 ± 29,2; linfócitos B = 4,1 ± 3, p>0.05), apesar de se observar uma

tendência para uma maior frequência das células CD8+ e monócitos expressando IL-

10.

55

Figura 14 - Frequência de células CD4+, CD8+, Monócitos e Linfócitos B expressando IL-10, de indivíduos infectados pelo HTLV- 1, no total dos indivíduos analisados (A), nos portadores do vírus (B) e nos pacientes com HAM/TSP (C).*p=0,019, **p=0,05, ***p=0,036, ****p=0,012.

Ao analisar se os antígenos de Schistosoma spp são capazes de aumentar a

frequência de células expressando IL-10 foi observado que, nas células TCD4+ os

antígenos rSm29 e rShTSP-2 aumentaram a frequência destas células expressando

IL-10 (Figura 15A) (7,3%, p=0.034; 7,5%, p=0.023; respectivamente), em relação as

*

* **

***

****

56

células sem estímulo (5,4%), no total dos indivíduos analisados, sendo que a adição

do PIII não mostrou diferença (6,5%). No grupo dos indivíduos portadores do vírus, o

rSm29 aumentou a frequência das células TCD4+ expressando IL-10 (8,9%; p=0,05)

em relação as células não estimuladas (6,3%) (Figura 15B). Já os antígenos

rShTSP-2 e PIII não mostraram diferença (8,3%; 7,8%, respectivamente, p>0,05).

No grupo da HAM/TSP os três antígenos analisados não alteraram a frequência de

TCD4+, expressando IL-10, (Figura 15C) (4,2%; 6%; 4%; respectivamente, p>0,05)

em relação às células não estimuladas (3,6%).

Figura 15 - Frequência de células CD4+ expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma spp.

No total dos indivíduos (A), no grupo dos portadores (B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,023, **p= 0,034, ***p=0,05.

Avaliando a adição dos antígenos sobre a frequência das células TCD8+

expressando IL-10 foi observado que o rShTSP-2 e PIII foram eficiente em aumentar

essa frequência (Figura 16A) (13,1%, p=0,034; 10,9%, p=0,034, respectivamente),

em relação as células não estimuladas (9,5%), no total dos indivíduos analisados. A

adição do rSm29 não mostrou diferença em relação as células não estimuladas

(13,9, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores (Figura 16B) a adição do PIII

*

*** **

57

aumentou a frequência das células TCD8+ expressando IL-10 (6,9%, p=0,017), em

relação as células não estimuladas (4,9%). O rSm29 e o rShTSP-2 não alteraram a

frequência destas células (10,9%; 9,1%; respectivamente, p>0.05). No grupo dos

indivíduos com HAM/TSP (Figura 16C) nenhum dos três antígenos aumentou a

frequência destas células (rSm29 = 19,9%; rShTSP-2 = 21%; PIII = 18,9%; p>0,05

respectivamente) em relação as células não estimuladas (18,8%).

Figura 16 - Frequência de células CD8+ expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus (B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,034, **p=0,017.

Os antígenos analisados não alteraram a frequência dos linfócitos B expressando IL-

10 (rSm29 = 6%; rShTSP-2 = 10%; PIII = 5%; respectivamente, p>0,05) em relação

as células não estimuladas (7%), no total dos indivíduos analisados; (Figura 17A) . O

mesmo foi observado no grupo dos indivíduos portadores (Figura 17B) (rSm29 =

5,3%; rShTSP-2 = 10,8%; PIII = 4,9%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo =

8,05%) e no grupo com HAM/TSP (Figura 17C) (rSm29 = 7,4%; rShTSP-2 = 7,6%;

PIII = 4,3%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo = 4,1%).

*

* **

58

Figura 17- Frequência de Linfócitos B expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1. Antes e após a adição dos antígenos do Schistosoma spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus (B) e no grupo com HAM/TSP (C).

A adição do rSm29 aumentou a frequência de monócitos expressando IL-10 (Figura

18A) (20,1%, p=0,05) em relação as células não estimuladas (19,8%), no total dos

indivíduos analisados. O rShTSP-2 e o PIII não alterou a frequência destas células

(25,2%, 22,2%; respectivamente, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores

(Figura 18B) os três antígenos não foram capazes de aumentar essa frequência

(25,5%; 24,8%, 25,2%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não

estimuladas (21,7%). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP (Figura 18C) os

antígenos não aumentaram a frequência destas células (rSm29 = 30,8%; 30,03%;

20%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não estimuladas (18,9%).

B

59

Figura 18- Frequência de Monócitos expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma spp, no total dos indivíduos (A), nos portadores do vírus (B) e no grupo com HAM/TSP (C). *p=0,05.

*

60

DISCUSSÃO

Neste estudo nós avaliamos se antígenos do Schistosoma spp são capazes de

alterar in vitro a produção de citocinas e o perfil nas células mononucleares do

sangue periférico (CMSP) de indivíduos infectados pelo HTLV-1.

A forte resposta imune que ocorre na infecção pelo HTLV-1 explica o fato de alguns

indivíduos infectados desenvolvem sérias complicações, enquanto aqueles que

permanecem assintomáticos durante boa parte de suas vidas e, a produção de

citocinas nestes indivíduos é variável. Estudos tem mostrado que indivíduos

infectados pelo HTLV-1 têm altos níveis de produção das citocinas IFN-γ e TNF,

mesmo sem adição de estímulo In vitro às culturas de CMSP, quando comparadas

às culturas de células de doadores de sangue soro negativos para HTLV-1 (Santos,

S. B. et al., 2004; Carvalho, E. M. et al., 2001).

Concentrações elevadas de citocinas pró-inflamatórias, ou que induzem a

proliferação de linfócitos, a exemplo da IL-2, TNF, IFN-γ, e IL-15, entre outras e,

expressão do receptor de IL-2, têm sido relatadas tanto em pacientes com

HAM/TSP, quanto em indivíduos assintomáticos (Azimi, M. et al., 1999; Carvalho, E.

M. et al., 2001; Nishiura, Y. et al., 1996). Existem, entretanto, evidências de que uma

resposta imune exagerada participa da imunopatogênese da HAM/TSP, com a

documentação de que em relação aos portadores da infecção, pacientes com

HAM/TSP produzem níveis mais elevados de TNF e IFN-γ, além de IL-6 e IL-2

detectadas no soro e no líquor (Nagai, M. et al., 2001; Lima, M. A. et al., 2005; Ohbo,

K. et al., 1991; Andrada-Serpa, M. J. et al., 1996; Nishimoto, N. et al., 1990). Eles

também apresentam um maior número de células T CD4+ e T CD8+ expressando

estas citocinas (Lima, M. A. et al., 2005). Adicionalmente existe uma diminuição da

61

capacidade regulatória da resposta imune exacerbada, por IL-10 e TGF-β nestes

pacientes (Lima, M. A. et al., 2005).

Ainda não existem tratamentos satisfatórios ou uma forma de prevenir o

desenvolvimento da doença nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 e a resposta

imune exacerbada é à base desta patologia (Castro, N. M. et al., 2006). Estratégias

capazes de reduzir a resposta imune inflamatória do tipo Th1 se fazem necessárias.

Um estudo prévio conduzido pelo Serviço de Imunologia da Universidade Federal da

Bahia mostrou que em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e coinfectados com S.

mansoni os níveis de IFN-y no sobrenadante de culturas de CMSP não estimuladas

foram mais baixos do que em indivíduos com HTLV-1 não co-infectados (Porto, A. F.

et al., 2005).

Foi também demonstrado previamente, que os antígenos do Schistosoma mansoni,

Sm29 e PIII são capazes de induzir a produção de IL-10 pelas CMSP de indivíduos

infectados pelo S. mansoni (Cardoso, L. S. et al., 2006; Cardoso, L. S. et al., 2011) e

que eles suprimem a resposta inflamatória do tipo Th2 em um modelo experimental

de asma alérgica (Cardoso, L. S. et al., 2010).

Os antígenos Sm29, ShTSP-2 e PIII foram testados neste estudo para verificar a

capacidade de induzir a produção de IL-10 e suprimir a resposta do tipo Th1 in vitro

pelas CMSP de indivíduos infectados pelo HTLV-1.

Nós observamos que a adição do rShTSP-2 nas culturas de células resultou na

redução dos níveis de IFN-y e TNF. Os três antígenos utilizados, foram capazes de

diminuir a produção destas citocinas em uma significativa proporção de indivíduos

avaliados. Além disso, o modulação negativa da produção de IFN-y por Sm29 e

ShTSP-2 foi seguida por um aumento da produção de IL-10 na maioria dos

indivíduos e, este aumento na produção de IL-10 alcançou mais de 300%. A redução

62

da produção de IFN-y pelo uso do rSm29 e do PIII nas culturas de CMSP e o

aumento dos níveis de IL-10 pelo uso de rSm29 também foi vista em pacientes com

Leishmaniose cutânea, uma doença cuja patologia também está associada com uma

forte resposta imune do tipo Th1 (Báfica, A. M. B. et al., 2011).

Avaliando possíveis características dos indivíduos associadas com a habilidade

destes antígenos em modular negativamente a produção de IFN-y, nós observamos

que indivíduos que apresentaram inibição na produção destas citocinas pela

presença de rSm29 nas culturas foram aqueles que tiveram menores níveis basais

de IFN-y, quando comparados à aqueles que não apresentaram inibição na

produção de IFN-y. Inesperadamente, não observamos nenhuma outra diferença

clínica, imunológica ou de carga viral entre os grupos de indivíduos que tiveram

redução nos níveis de IFN-y e aqueles que não tiveram. Em pacientes com

Leishmaniose cutânea (Báfica, A. M. B. et al., 2011), a adição de rSm29 e PIII as

culturas de células estimuladas com o antígeno solúvel de Leishmania (SLA)

resultou em uma redução da produção de IFN-y e TNF independentemente das

concentrações basais desta citocina e da apresentação clínica dos pacientes..

A relação entre a infecção pelo HTLV-1 e S. mansoni não está bem estudada e

existem dados controversos. Por exemplo, a frequência de infecção pelo S. mansoni

em indivíduos com HTLV-1 de um banco de doadores de sangue é maior que em

indivíduos negativos do mesmo banco de sangue. Entretanto, a frequência de

indivíduos com HAM/TSP, nesta mesma casuística, foi menor em indivíduos

infectados pelo S. mansoni, comparados com aqueles não infectados (Porto, A. F. et

al., 2005).

Nós mostramos que os antígenos rSm29 e rShTSP-2 usados neste estudo foram

capazes de induzir in vitro a produção de IL-10 e este resultado está de acordo com

63

outros estudos, mostrando que o antígeno rSm29 induziu maior produção de IL-10

pelas CMSP de indivíduos infectados com S. mansoni do que nos indivíduos não

infectados (Cardoso, L. S. et al., 2006).

A IL-10 tem um importante papel na manutenção do estado de portador nos

indivíduos infectados pelo HTLV-1, balanceando a produção de IFN-γ, uma

importante citocina pro-inflamatória (Britto-Melo, G. E. P. et al., 2007). Recentemente

foi descrito uma incapacidade de IL-10 recombinante humana em modular

negativamente a produção de IFN-γ in vitro em indivíduos com HAM/TSP (Santos, S.

B. et al., 2006). A baixa razão entre IFN-γ/IL-10 por alguns antígenos de

Schistosoma spp neste estudo sustenta a hipótese de que estes antígenos podem

ser utilizados para prevenir patologias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (Lima,

L. M. et al., 2013).

As quimiocinas também participam do processo inflamatório na infecção pelo HTLV-

1. Já foi demonstrado, por exemplo, que a quimiocina CXCL9, juntamente com a

CXCL10, reconhecida como importante no recrutamento de células Th1, estavam

aumentadas no soro de pacientes com HAM/TSP, quando comparado com os

portadores assintomáticos do HTLV-I ou com controles saudáveis. O dado sugere

que a presença destas moléculas pode levar a um aumento no recrutamento de

moléculas pró-inflamatórias para o tecido medular, contribuindo para o dano

associado ao desenvolvimento da HAM/TSP (Guerreiro, J. B. et al., 2006; Shevach,

E. M. 2002). Neste estudo observamos que a adição dos antígenos rSm29 e

rShTSP-2 as culturas de células resultou em diminuição da produção de CXCL-9 no

sobrenadantes das CMSP, em relação as células não estimuladas, nos indivíduos

com HTLV-1, tanto no total dos indivíduos analisados, quanto nos portadores e nos

indivíduos com HAM/TSP.

64

Estes resultados mostram que os antígenos de Schistosoma spp usados neste

estudo são capazes de modular negativamente a resposta imune exacerbada do tipo

Th1 in vitro em uma alta porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta

modulação negativa pode ser explicada pelo aumento da produção de IL-10.

Existe ainda a possibilidade de existir outros mecanismos induzidos pelos antígenos

de Schistosoma spp que podem estar envolvidas na modulação negativa da

resposta imune do tipo Th1 na infecção pelo HTLV-1. Estudos mostram, em um

modelo de asma induzida pela ovoalbumina, que antígenos de S. mansoni induzem

a expansão da população de células regulatórias T CD4+CD25+Foxp3+ (Pacífico, L.

G. et al., 2009; Porto, A. F. et al., 2005).

Em outra etapa deste estudo avaliamos a capacidade dos antígenos de

Schistosoma spp em aumentar a frequência das células TCD4+ e TCD8+ com perfil

modulatório.

As células TCD4+ participam da manutenção da tolerância imunológica por suprimir

a expansão e ativação de linfócitos reativos que podem causar doenças autoimunes

(Sakaguchi, S. et al., 2001; Shevach, E. M. 2002). As Células TCD4+ com perfil

regulatório incluem aquelas que expressam a molécula CTLA-4 (cytotoxic T

limphocyte-associated antigen 4) (Shimizu, J. et al., 2002; McRugh, R. S. et al.,

2002; Read, S. et al., 2000; Salomon, B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000). As

células que expressam esta molécula podem ter um papel modulatório nas doenças

inflamatórias, a exemplo da infecção pelo HTLV-1.

O Foxp3 (forkhead transcription factor) também é requerido para o desenvolvimento

e função das células T regulatórias (Hori, S. et al., 2003; Khattri, R. et al., 2003;

Fontenot, J. D. et al., 2003). O aumento da expressão desta molécula em células

com perfil modulatório poderá diminuir a linfoproliferação espontânea de células

65

TCD4 e manifestações clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada

por infiltrado linfocítico em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas

proinflamatórias observadas em indivíduos com HAM/TSP (Yamano, Y. et al., 2005).

Já se sabe que pacientes com HAM/TSP apresentam características imunológicas

semelhantes a camundongos mutantes para Foxp3 e deficientes para CTLA-4,

incluindo linfoproliferação espontâneas de células TCD4+ e manifestações clínicas

associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico em

múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias (Yamano, Y. et al.,

2005).

Os três antígenos analisados aumentaram a população destas células expressando

CTLA-4 no total dos indivíduos do estudo, o rSm29 e o rShTSP-2 nos portadores.

A expressão da molécula CD25 nas células T podem conferir diferentes

propriedades a estas células, dependendo da intensidade da expressão. As células

expressando CD25 constituem 1-2% da população de CD4+ periférica. As

CD4+CD25Low representam células T ativadas (Beacher-Allan, C. et al., 2001;

Viglietta, V. et al., 2004; Lindley, S. et al., 2005). Os antígenos rSm29 e PIII foram

eficientes no presente estudo, em aumentar a população destas células

expressando CTLA-4, o que dá a elas características modulatórias. Os antígenos

utilizados neste estudo também foram capazes de aumentar a população das

células CD4+CD25Low expressando Foxp3 no total de indivíduos, nos portadores e, o

rShTSP-2 e o PIII aumentaram a frequência destas células nos indivíduos com

HAM/TSP.

Todos os antígenos analisados foram capazes de aumentar a frequência das células

CD4+CD25high , que são as que classicamente exibem funções regulatórias

(Baecher-Allan, C. et al., 2001), em todos os indivíduos analisados, inclusive nos

66

pacientes com HAM/TSP. Também foram capazes de aumentar a frequência destas

células T regulatórias expressando CTLA-4 e Foxp3. Tem sido demonstrado que em

pacientes com HAM/TSP expressão menores quantidades de mRNA para Foxp3 e

CTLA-4 nas células CD4+CD25+, quando comparado com indivíduos saudáveis

(Yamano, Y. et al., 2005). Nossos resultados mostram que os antígenos do

Schistosoma spp. podem aumentar a expressão destas moléculas nas células de

pacientes com HTLV-1. O fato da menor expressão de Foxp3 em células

CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP sugere que o HTLV-1 possa ter um efeito

inibitório na expressão de Foxp3, que a população das CD4+CD25+ possa ser

diminuída em pacientes com HAM/TSP, ou alternativamente que pacientes com

HAM/TSP possam ter geneticamente baixa expressão do gene Foxp3 (Yamano, Y.

et al., 2005).

Em relação às células T CD8+CD25-, os antígenos analisados também foram

capazes de aumentar a frequência destas células expressando Foxp3+, no total dos

indivíduos analisados.

Avaliamos também neste estudo o perfil das células TCD8+ frente aos antígenos do

Schistosoma spp. Houve um aumento da frequência das células TCD8+ regulatórias

(TCD8+CD25High) na presença dos antígenos no total dos indivíduos e nos indivíduos

com HAM/TSP. Adicionalmente, a frequência de células regulatórias expressando

Foxp3 (CD8+CD25HighFoxp3+) aumentou em todos os indivíduos analisados.

Já havíamos demonstrado que antígenos do Schistosoma spp. são capazes de levar

a diminuição da produção de IFN-y in vitro e ao aumento de IL-10 pelas CMSP

(Lima, L. M. et al., 2013) e, observamos também que as células T com perfil

modulatório (TCD4+ e TCD8+) parecem estar associadas a este processo.

67

Alguns estudos tem demonstrado que antígenos de helmintos induzem a produção

de IL-10 por macrófagos em modelo de asma e colite aguda. A depleção destas

células reverte este efeito, mostrando que os macrófagos, além das células Treg são

as principais responsáveis pela produção de IL-10 após tratamento com antígenos

parasitários (Schnoeller, C. et al., 2008).

A fonte produtora de IL-10 foi também avaliada no presente estudo, uma vez que

esta é uma importante citocina modulatória e que é altamente produzida pela adição

dos antígenos do Schistosoma spp. avaliados neste estudo (Lima, L. M. et al., 2013).

Foi observado que os monócitos são a principal fonte produtora de IL-10 nos

indivíduos infectados pelo HTLV-1, seguido pelas células TCD4+, TCD8+ e linfócitos

B. Esse estudo mostrou, também, que nos indivíduos com HAM/TSP existe uma

tendência para que os monócitos, juntamente com as células CD8+ sejam as

principais fontes produtoras de IL-10.

Tem sido demonstrado que a produção de IL-10 é maior em indivíduos com HTLV-1

em relação aos indivíduos não infectados (Carvalho, E. M. et al., 2001) e que essa

produção é maior nos indivíduos portadores em relação aos indivíduos com

HAM/TSP (Santos, S. B. et al., 2004). A adição de IL-10 em estudos in vitro resultou

na diminuição da produção de IFN-y pelas CMSP de indivíduos portadores do vírus

(Santos, S. B. et al., 2006). Essas são evidências de que a IL-10 é uma citocida

chave no controle do processo inflamatório induzido pelo HTLV-1.

Existe também a documentação de mais alta frequência de células TCD8+

expressando IL-10 nos portadores do HTLV-1 coinfectados com helmintos, em

relação aos não coinfectados (Porto, A. F. et al., 2005). Os antígenos do

Schistosoma spp utilizados no presente estudo foram também eficientes em

68

aumentar a produção de IL-10 pelas células CD4+, CD8+ e monócitos, nos indivíduos

com HTLV-1.

69

CONCLUSÃO

Os antígenos do Schistosoma spp utilizados neste estudo foram capazes de modular

negativamente a resposta imune exacerbada do tipo Th1 in vitro em uma alta

porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta modulação foi coincidente

com o aumento da produção de IL-10, citocina esta produzida principalmente pelas

células Treg e monócitos. Estes achados podem contribuir para o desenvolvimento

de novas estratégias para a prevenção do processo inflamatório induzido pela

infecção pelo HTLV-1 e a cosequente progressão para as formas mais graves da

doença, a exemplo da HAM/TSP.

70

REFERÊNCIAS

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ANEXOS

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