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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Dissertação de Mestrado
OBTENÇÃO DE QUELANTES ATRAVÉS DA OXIDAÇÃO
ENZIMÁTICA DE LIGNINA DE BAGAÇO DE CANA
Mauro Alfredo Soto Oviedo
Lorena -SP-Brasil
Outubro-1998
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Dissertação de Mestrado
OBTENÇÃO DE QUELANTES ATRAVÉS DA OXIDAÇÃO
ENZIMÁTICA DE LIGNINA DE BAGAÇO DE CANA
Mauro Alfredo Soto Oviedo
Lorena -SP-Brasil
Outubro-1998
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
OBTENÇÃO DE QUELANTES ATRAVÉS DA OXIDAÇÃO
ENZIMÁTICA DE LIGNINA DE BAGAÇO DE CANA
Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora
lJ't~ ~l~J. Dr. Adilson Robertó Gonçalves
(orientador e presidente da banca)
Lorena -SP-Brasil
Outubro-1998
---- --------------------- . --·---- --·----- - -----·. - . - ·-··
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Adilson R. Gonçalves pela orientação e a discussão dos resultados
desta tese.
À Ora. Angela Machuca Herrera, pelas sugestões e discussões desta tese.
Aos Drs. André Ferraz, André Cotrim e Flávio Teixeira da Silva pelo auxílio e
sugestões apresentadas durante a realização deste trabalho.
Aos amigos e colegas de curso Jussara, José Moreira, José Carlos, Luane,
Hellen, Ana María, Márcia, Marta, Carmen, Ernesto, Andersen, Régis e Ely,
pela amizade, apoio e convivência fraterna.
Aos demais funcionários do Departamento de Biotecnologia.
À CAPES e FAPESP pela bolsa e apoio financeiro concedidos.
CONTÉÓDO
Lista de tabelas....................................................................................... v
Lista de figuras........................................................................................ viii
Resumo................................................................................................... xii
Abstract.................................................................................................... xiii
1.-INTRODUÇÃO..................................................................................... 1
li.- OBJETIVOS....................................................................................... 15
11. 1. -Objetivos específicos........................................................................ 15
Ili.- MATERIAIS E MÉTODOS................................................................. 16
111.1.-Ligninas estudadas no presente trabalho....................................... 16
111.1.a.- Lignina Acetosolv de bagaço de cana.................................... 16
111.1.b.- Lignina de explosão a vapor de bagaço de cana.................... 16
111.2.- Determinação da atividade enzimática da fenolase por métodos
padrão........................................................................................... 17
111.3.- Estudo da atividade enzimática em meio tampão aquoso:dioxano 18
111.4.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela fenolase 18
111.5.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela fenolase
em presença de glicerol e oxigênio................................ 19
111.6.- Oxidação enzimática da lignina Acetosolv em presença de polióis 19
Ili. 7.- Estudo por planejamento fatorial.................................................... 19
111.8.-Análise e caracterização das ligninas e dos produtos de oxidação 20
111.8.1.- Distribuição da massa molar................................................... 20
111.8.1.1.- Calibração da coluna cromatográfica de GPC..................... 21
111.8.1.2.- Cálculo dos valores de Mn, Mw e D (dispersidade).......... 21
111.9.- Quantificação das capacidades de quelação da ligflina oxidada
por cromatografia de permeação em gel...................................... 22
ii
__ j
111.1 O.- Características Espectrais............................................................ 23
111.10.1.- Espectrocopia de UV-visível................................................. 23
111.10.2.- Espectroscopia de infravermelho.......................................... 23
111.10.2.1.- Método de análise por componentes principais (PCA)...... 24
111.11.- Caracterização química das ligninas............................................ 24
111.11.1.- Determinação de grupos hidroxilas totais............................. 24
111.11.2.- Determinação de hidroxilas fenólicas................................... 25
111.11.3.- Determinação de hidroxilas alifáticas.................................... 26
111.11.4.- Determinação de metoxilas................................................... 26
111.11.5.- Determinação de carbonilas................................................. 27
IV.- RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................ 29
IV.A- Estudo do poder de retenção de Cu2+ pela lignina........................ 29
IV.A 1.- Quantificação de íons Cu2+ ligados à lignina.......................... 29
IV.A2.- Estudo da oxidação de lignina pela fenolase......................... 33
IV.A2.1.- Estudo preliminar da oxidação da lignina pela fenolase
em fase homogênea........................................................... 33
IV.A2.2.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela
fenolase empresença de glicerol e oxigênio...................... 37
IV.A.3.- Estudo da capacidade de quelação das ligninas Acetosolv
oxidadas............................................................................. 38
IV.A4.- Estudo da massa molar média das ligninas original e
oxidadas com fenol ase....................................................... 40
IV.AS.- Estudo dos efeitos de polióis na oxidação da lignina pela
fenolase.............................................................................. 45
IV. 8. - Estudo da oxidação com base em um planejamento
experimental....................................................................... 50
IV.8.1.- Estudo das reações de oxidação das ligninas Acetosolv e
de explosão a vapor conforme o planejamento fatorial 24-1
fracionário............................................................................... 50
IV.8.2.- Influência das condições de reação na distribuição de
massas molares das ligninas Acetosolv e de explosão a
vapor........................................................................................ 56
iii
IV.B.3.- Influência das condições de reação de oxidação no poder
deretenção de Cu2+ pelas ligninas Acetosolv e de explosão
a vapor oxidadas.................................................................... 59
IV.B.4.- Espectrocopia de infravermelho............................................. 66
IV.C.- Estudos das características químicas das ligninas Acetosolv
e de explosão a vapor............................................................ 78
V.- CONCLUSÕES.................................................................................. 85
VI.- REFERÉNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 87
iv
····---·-------··--~-~--···-····---------·----·--·------- . . . . . ------~-------------------
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Solubilidade da lignina de bagaço de cana obtida por explosão a vapor, precipitada com dois tipos diferentes de ácido 12
Tabela 2: Níveis das variáveis usadas no planejamento experimental para a oxidação das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor... 20
Tabela 3: Matriz de planejamento fatorial fracionário 24-1....................... 20
Tabela 4: Áreas sob a curva do cromatograma obtido para a retenção de íons Cu2+ para diferentes ligninas, obtidas a partir do trabalho de GONÇALVES et ai., 1997........................................... 32
Tabela 5: Concentrações de íons Cu2+ retido pelas diferentes ligninas analisadas por GPC...................................................................... 32
Tabela 6: Parâmetros de oxidação e capacidade de retenção das lignina Acetosolv oxidadas............................................................ 39
Tabela 7: Valores de massa molar média em massa (Mw ), massa molar média em número ( Mn ) e dispersidade (O) das ligninas ... 43
..,_ -. ,._
Tabela 8: Porcentagem de lignina que apresenta uma determinada faixa de massa molar . 44
Tabela 9: Concentrações de íons Cu2+ retido pelas diferentes ligninas analisadas por GPC........................................ .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Tabela 1 O: Valores da massa molar média em massa ( Mw ), massa molar média em número ( Mn) e dispersidade (O) das ligninas Acetosolv oxidadas....................................................................... 50
Ta bela 11 : Matriz de planejamento fatorial fracionário e respostas obtidas (rendimento, massa molar e poder quelante) das reações de oxidação da lignina Acetosolv com fenolase.............. 51
Tabela 12: Matriz de planejamento fatorial fracionário e respostas obtidas (rendimento, massa molar e poder quelante) das reações de oxidação da lignina de explosão a vapor com fenolase........................................................................................ 52
Tabela 13: Efeitos das variáveis testadas no rendimento de oxidação da lignina Acetosolv pela fenolase, calculados a partir dos dados mostrados na tabela 11...................................................... 53
V
------· -- - -----··---------------------------
Tabela 14: Efeitos das variáveis testadas no rendimento de oxidação da lignina de explosão a vapor pela fenolase, calculados a partir dos dados mostrados na tabela 12...................................... 54
Tabela 15: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados experimentais mostrados na tabela 12......................................... 56
Tabela 16: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina Acetosolv pela fenolase em relação às massas molares, calculados a partir da tabela 11.................................................... 58
Tabela 17: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina de explosão a vapor oxidada pela fenolase em relação às massas molares, calculados a partir dos dados mostrados na tabela 12.................................................................................................. 59
Tabela 18: Estudo de complexação molar (mol de quelante/ mole de Cu2+).............................................................................................. 61
Tabela 19: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina Acetosolv pela fenolase em relação ao poder quelante, calculados a partir dos dados mostrados na tabela 11................. 62
Tabela 20: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados experimentais mostrados na tabela 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Tabela 21: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina de explosão a vapor pela fenolase em relação ao poder quelante, calculados a partir dos dados mostrados na tabela 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Tabela 22: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados experimentais mostrados na tabela 12......................................... 66
Tabela 23: Atribuição das bandas apresentadas no infravermelho pelas ligninas originais e oxidadas............................................... 67
Tabela 24: Absorbâncias relativas das bandas em 1653 e 1716 crn' para as ligninas Acetosolv............................................................ 70
Tabela 25: Absorbâncias relativas das bandas em 1680 e 1691 crn' para as ligninas de explosão a vapor........................................... 71
Tabela 26: Porcentagem da variância explicada por PCA nos espectros de FTIR das ligninas Acetosolv.................................... 72
Tabela 27: Porcentagem da variância explicada por PCA nos espectros de FTIR das ligninas de explosão a vapor................... 72
vi
Tabela 28: Análise dos grupos funcionais presentes na lignina Acetosolv (ensaio 5) e lignina de explosão a vapor (ensaio 5).... 79
vii
-------------------------------------------
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema representativo de um complexo de derivado do aldeído salicílico com íon metálico M..... ... .. .. . . .. . . . . .. ... .. . . . ... .. ... . ..... 1
Figura 2: Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler (1977), destacando-se alguns tipos de ligações existentes 4
Figura 3: Esquema representativo da constituição e separação dos materiais lignocelulósicos............................................................. 5
Figura 4: Produtos químicos obtidos a partir da lignina (GOLDSTEIN, 1981 )............................................................................................. 7
Figura 5: Representação de alguns tipos de produtos obtidos da oxidação ([O]) e hidrólise (H+) da lignina.................. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Figura 6: Oxidação de fenóis pelas polifenoloxidases (Burton, 1994).... 10
Figura 7: Mecanismo de oxidação pela polifenoloxidase (Solomon e Lowery, 1993)....... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Figura 8: Esquema representativo da camada de hidratação da enzima em meio orgânico com baixo conteúdo de água........................... 13
Figura 9 : Curva de calibração para a determinação dos íons Cu2+ ligados à lignina................. .. . . . . .. . . . .. .. . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . 30
Figura 1 O: Cromatograma da lignina Acetosolv original. Coluna Sephadex G-10 de 60 x 1,1 cm, eluída com tampão Tris-NaCI pH 8 a 0,5 ml min-1................................................................... .... 31
Figura 11: ln[absorbância] em função do tempo de reação para os diferentes comprimentos de onda estudados, no intervalo de O a 2 h................................................................................................. 36
Figura 12: ln[absorbância] em função do tempo de reação para os diferente comprimentos de onda estudados, no intervalo de 3 a 4 h................................................................................................. 36
Figura 13: ln[absorbância] em função do tempo de reação para os diferentes comprimentos de onda estudados, no intervalo de 2 a 3 h................................................................................................. 37
Figura 14: Espectro de UV para a lignina Acetosolv oxidada com fenolase e oxigênio em ausência (A) e em presença de glicerol
viii
(8). Espectro feito a partir de uma soluções de 0,2 gL·1 em ácido acético galcial. . 38
Figura 15: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina Acetosolv oxidada com fenolase em presença de oxigênio. Coluna Sephadex G-10, eluída com tampão Tris-NaCI pH 8 a 0,5 ml rnin" . 39
Figura 16: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv original (lignina 1 ). Coluna de Sephadex G-50, eluída com NaOH 0,5 M a 0,5 ml min" . 41
Figura 17: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv oxidada com fenolase em presença de ar (lignina 6). Coluna de Sephadex G-50, eluída com NaOH 0,5 M a 0,5
L . -1 m m1n . 41
Figura 18: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv oxidada com fenolase em presença de oxigênio (lignina 7). Coluna de Sephadex G-50, eluída com NaOH 0,5 M a 0,5 ml min" . 42
Figura 19: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv oxidada com fenolase em presença de oxigênio e glicerol (lignina 8). Coluna de Sephadex G-50, eluída com NaOH 0,5 M a 0,5 ml rnin" . 42
Figura 20: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina oxidada em presença de fenolase, oxigênio e glicerol. Coluna Sepadex G-10, (52 x 1,2 cm) eluída com tampão Tris-NaCI pH 8 a 0,5 ml
. -1 46 m1n .
Figura 21: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina oxidada em presença de fenolase, oxigênio e polietilenoglicol. Coluna de Sephadex G-10, (52 cm x 1,2 cm) eluída com tampão Tris- NaCI pH 8 a 0,5 ml min-1.............................................................. 47
Figura 22: a) desnaturação da enzima em meio orgânico e b) Efeito do poli oi na estabilização da enzima................................................. 48
Figura 23: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv oxidada em presença de glicerol (lignina 9). Coluna de Sephadex G-50, (57 x 1,8 cm) eluída com NaOH a 0,4 ml
. -1 49 m1n .
Figura 24: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv oxidada em presença de polietilenoglicol (lignina 1 O).
ix
Coluna de Sephadex G-50, (57 x 1,8 cm) eluída com NaOH a 0,4 ml min·1.... .•. . . . . .. . .. .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . .. .. .. .. 49
Figura 25: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolvensaio 2 ( +, -, -, +)....................................................... 57
Figura 26: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina de explosão a vapor ensaio 6 ( +, -, +, -)........................................... 57
Figura 27: Espectro de infravermelho da lignina Acetosolv original. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr................................. 68
Figura 28: Espectro de infravermelho da lignína Acetosolv oxidada (ensaio 4: +, +, -, -). Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr 68
Figura 29: Espectro de infravermelho da lignina de explosão a vapor original. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr................... 69
Figura 30: Espectro de infravermelho da lignina de explosão a vapor oxidada (ensaio 4: +, +, -, -). Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr............................................................................ 69
Figura 31: Gráfico de CP2 em função de CP1 para as ligninas Acetosolv original (a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8)............... 74
Figura 32: Gráfico de CP3 em função de CP1 para as ligninas Acetosolv original (a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8)............... 74
Figura 33: Gráfico de CP3 e CP2 em função de CP1 para as ligninas Acetosolv original {a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8)............... 75
, Figura 34: Loading de CP1 e CP2 dos espectros de FTIR em função do comprimento de onda para as ligninas Acetosolv.................... 76
Figura 35: Gráfico de CP3 em função de CP1 para as ligninas de explosão a vapor original (a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8).... 77
Figura 36: Gráfico de CP3 e CP2 em função de CP1 para as ligninas de explosão a vapor original (a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8)................................................................................................... 77
Figura 37: Loading de CP1 e CP2 dos espectros de FTIR em função do comprimento de onda para as ligninas de explosão a vapor... 78
Figura 38: Espectro UV diferencial da lignina Acetosolv original. Espectro feito a partir de uma solução com 0,056 gl·1 em dioxano/água 50%........................................................................ 80
X
Figura 39: Curva titulométrica da determinação do teor de carbonila da lignina de explosão a vapor ensaio 5............................................ 81
Fifura 40: Espectro de UV da lignina Acetosolv e de explosão a vapor original. Espectros feitos a partir de uma solução de 0,03 gl-1
em dioxano/água 50%................................................................... 83
xi
OBTENÇÃO DE QUELANTES ATRAVÉS DA OXIDAÇÃO ENZIMÁTICA DE LIGNINA DE BAGAÇO DE CANA. Mauro A. Soto Oviedo. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson R. Gonçalves (CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André L. Ferraz e Dr. Sergio P. Campana. Outubro de 1998.
Resumo
Ligninas de bagaço de cana obtidas por polpação Acetosolv e explosão a vapor foram oxidadas pela fenolase a fim de se obter quelantes. A oxidação foi realizada de acordo com um planejamento fatorial fracionário 24-1, onde as variáveis estudadas foram quantidade de enzima (X1), tempo de reação (X2), concentração de estabilizante (XJ) e concentração de oxidante (Xi). Os quelantes obtidos foram avaliados quanto ao poder de retenção de íons Cu2+ através de análise por cromatografia de permeação em gel. As ligninas oxidadas obtidas foram caracterizadas por técnicas espectroscópicas, determinação de grupos funcionais e distribuição de massa molar.
Um modelo não linear utilizando-se um método de estimativa quasi-Newton foi proposto considerando-se as variáveis que apresentaram efeitos no poder de retenção de Cu2+ (y) para as ligninas Acetosolv e de explosão a vapor, equação 1 e equação 2, respectivamente.
y = (293,33 ± 14, 16) + (-17,63 ± 8,67) X1 + (-44,38 ± 8,67) X2 + (-30,88 ± 8,67) XJ +(-17, 13 ± 8,67) X1 Xi+ (-76,96 ± 16,61) X/ (eq.1)
y = (204,00± 8,56) + (-24,75 ± 5,24) X1 + (-39,25 ± 5,24) X2 + (30,25 ± 5,24) X1X2 +(29,00 ± 5,24) X1 XJ + (74,75 ± 10,03) X/ (eq.2)
A porcentagem de variância explicada indica que os modelos propostos permitem descrever a região experimental analisada com 95% de confiança.
A análise por componentes principais dos espectros de infravermelho das ligninas originais e oxidadas indica que existem diferenças nos espectros entre essas
' ligninas. As ligninas oxidadas podem ser agrupadas de acordo com diferenças na concentração de estabilizante utilizado na reação de oxidação com fenolase. O mesmo fato foi observado nas ligninas de explosão a vapor oxidadas, embora elas não possam ser agrupadas de forma definitiva, já que suas características espectrocópicas dependem das condições da reação de oxidação.
O teor de grupos carbonilas das ligninas oxidadas é maior que o apresentado pelas lignina Acetosolv e de explosão a vapor originais. Esse aumento deve-se à ação catalítica da enzima (cresolase e catecolase) que leva a um incremento dos grupos carbonilas e hidroxilas na lignina, levando conseqüentemente a um aumento da retenção dos íons Cu2+.
Todas as ligninas oxidadas apresentam um perfil bimodal de distribuição de massas molares, onde a área de cada fração varia em função do nível das variáveis testadas. A massa molar média das ligninas oxidadas é menor e em alguns casos próxima à das ligninas originais, tanto para a lignina Acetosolv como de explosão a vapor.
xii
OBTENTION OF CHELATING AGENTS THROUGH THE ENZVMATIC OXIDATION OF SUGARCANE BAGASSE LIGNIN. Mauro A Soto Oviedo. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson R. Gonçalves (CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André L Ferraz e Dr. Sergio P. Campana. Outubro de 1998.
Abstract
Sugarcane bagasse Lignins obtained by Acetosolv pulping and steam- explosion were oxidized by phenolase to obtain chelating agents. The oxidation was carried in accordance with a 24-1 fractional factorial design where the variables studied were quantity of enzyme (X1), reaction time(X2), stabilizer concentration (XJ) and oxidizer concentration (~). The chelating agents obtained were evaluated through gel permeation chromatography regarding their ability to retain Cu2• ions. The lignins obtained were characterized by spectroscopic techniques, evaluation of functional groups and molecular weight distribution.
A non-linear using quasi-Newton estimate was proposed considering the variables that affected the ability of the Acetosolv and steam-explosion lignins to retain Cu2 + íons ( y) (equations 1 and 2, respectively).
y = (293.33 ± 14.16) + (-17.63 ± 8.67) X1 + (-44.38 ± 8.67) X2 + (-30.88 ± 8.67) XJ +(-17.13 ± 8.67) X1 x, + (-76.96 ± 16.61) X/ (eq.1)
y = (204.00± 8.56) + (-24.75 ± 5.24) X1 + (-39.25 ± 5.24) X2 + (30.25 ± 5.24) X1X2 +(29.00 ± 5.24) X1 XJ + (74.75 ± 10.03) X/ (eq. 2)
- -_.,.,
The percentage of explained variance indicates that the models proposed make it possible to describe the experimental region analyzed with 95% confidence.
The principal component analysis of FTIR spectra of the original and oxidized lignins indicate spectral differences between these lignins. The oxidized lignins can be grouped together according to differences in the concentration of the stabilizer used in 'the oxidation with phenolase. This also happens to steam-explosion lignins, although they can not be grouped definitively, since their spectral characteristics depend on the reactions conditions.
The quantity of carbonyl groups of oxidized lignins is higher than that exhibited by the original Acetosolv and steam-explosion lignins. This increase in quantity is due to the catalytic action of the enzyme (cresolase and cathecolase), which leads to an increase in the carbonyl and hydroxyl groups in the lignins, and consequently to an increase in the ability to retain Cu2• ions.
Ali the oxidized lignins present a bimodal profile of molecular weight distribution, where the area of each fraction change as a function of the leveis of the variables studied. The average molecular weight of oxidized lignins is smaller than or near to that of the original Acetosolv and steam-explosion lignins.
xiii
1.- INTRODUÇÃO
Nos últimos anos os agentes quelantes têm sido extensamente
investigados visando uma aplicação tecnológica, devido a seu comportamento
como seqüestrantes de íons metálicos presentes em soluções aquosas
(LEVINE, 1986; LO e CHEN, 1990; GECKELER e VOLCHEK, 1996). Entende-
se por quelante a substância que provoca a formação de compostos anelares
através da coordenação de sítios presentes na molécula dessa substância com
íons metálicos.
Dentre as substâncias que apresentam uma alta capacidade quelante
destacam-se as que possuem grupos funcionais com alta densidade
eletrônica, tais como ácidos carboxílicos, compostos carbonilados, aminas,
tióis, compostos hidroxilados e substâncias contendo anéis aromáticos. Esses
compostos possuem átomos coordenantes de íons metálicos como o oxigênio,
nitrogênio e enxofre (GECKELER et ai., 1980; GECKELER et ai., 1988;
GECKELER e VOLCHEK, 1996), como exemplificado na figura 1 para um
derivado do aldeído salicílico como quelante.
o, 2+ M =o/
Figura 1: Esquema representativo de um complexo de derivado do aldeído
salicílico com íon metálico (M).
Há um crescente interesse da comunidade científica internacional em
relação ao uso de quelantes em questões ambientais. Através de técnicas
como a precipitação e a floculação é possível a utilização desses
seqüestrantes na descontaminação de certos efluentes industriais contendo
íons metálicos pesados como Hg2+, Pb2+, Cd2+ e Cu2+ entre outros. Além disso,
1
os quelantes podem ser utilizados na recuperação e reaproveitamento dos
íons metálicos mais nobres.
O processo de quelação é governado por diferentes fatores tais como a
natureza da estrutura molecular do quelante, o tipo e número de grupos
quelantes, fatores estéricos e volume dinâmico adquirido pela macromolécula.
Em quetantes do tipo resina há ainda a possibilidade de formação de ligações
cruzadas entre cadeias lineares vizinhas, o que torna o processo de quelação
ainda mais complexo. A macromolécula do quelante a ser usada na remoção
de metais pode estar em solução ou na forma de uma suspensão,
caracterizando um processo de extração líquido-líquido ou sólido-líquido,
respectivamente.
Uma das características essenciais dos complexos [macromolécula-íon]
é sua constante de estabilidade. Exemplificando-se para o caso de Cu2+ em
presença de um ligante neutro L têm-se os seguintes equilíbrios envolvidos:
+2 K1 +2 Cu + L ~ Cul
+2 K2 +2 Cul + L ~ Cul
2 +2 K3 +2
Cul + L ~ Cul 2 3
+2 K. +2 Cul + L ~ Cul
3 4
sendo K1, K2, K3 e K4 as constantes de estabilidade em cada etapa.
(eq. 1)
(eq. 2)
(eq. 3)
(eq. 4)
No caso de macromoléculas, as constantes não podem ser
determinadas já que o mecanismo da formação do complexo entre o íon Cu2+ e
a macromolécula não é por etapas, existindo um equilíbrio quase
exclusivamente entre [ CuL4t2 e íons Cu2+ (equação 5). Para esse tipo de
equilíbrio tem-se uma constante de estabilidade efetiva (Ket ) definida pela
equação 6.
Ket Cu+2 + 4 L ~ [ CuL/2] (eq. 5)
2
Ket =~~~~~~~~~~~~~ ([Cuo] - [CuL4t2) · ( y[Lo I 4] - [CuL4t2)
(eq. 6)
sendo : [Cuo]= concentração inicial de íons Cu2·,
[Lo] = concentração da macromolécula, e
y = fração máxima de ligantes presentes na macromolécula
A constante de estabilidade Ket é, nesse caso, um parâmetro efetivo e
não pode ser comparada com as outras quatro constantes. Isso porque Ket
depende da composição e da conformação da macromolécula, da força iônica
da solução e da temperatura, fatores que podem influenciar na concentração
de centros ligantes da macromolécula (KIRSH et ai., 1974; WALSH et ai.,
1983).
Um dos compostos orgânicos que apresenta a vantagem de possuir
uma alta quantidade de grupos funcionais e as condições anteriormente
mencionadas é a lignina. A lignina é uma macromolécula heterogênea natural,
opticamente inativa, formada por unidades p-propilfenólicas Cs-C3 interligadas
por diversas ligações covalentes aril-éter, aril-aril e carbono-carbono, como
mostrado na figura 2 para a lignina de abeto (Picea abies).
3
HC
HOC~H lp_5 ']\
HC ~ 1 1 OC H3
HC-- O
u3coJ$ "•fº" 0--CH
1
o
HCOH
,@ H 3co I
HC-----0 1
HCOH C:O
H3CO~OCH3 OH OH
[o-e]
Figura 2: Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por ADLER
(1977), destacando-se alguns tipos de ligações existentes.
Depois da celulose, a lignina é o composto orgânico mais abundante
dentre os materiais lignocelulósicos. Ela possui uma função estrutural no
complexo celular da parede de plantas superiores, agindo como uma cola que
confere coesão ao conjunto de células. A quantidade de lignina varia entre as
diferentes espécies de plantas superiores e também entre plantas da mesma
espécie (FENGEL e WEGENER, 1989). A produção em larga escala de lignina
está restrita à indústria de polpa, sendo que a lignina é obtida como resíduo,
mas quase totalmente queimada na própria indústria para produzir energia.
4
Outra fonte de lignina em larga escala ainda não explorada
adequadamente são os resíduos agrícolas denominados genericamente por
materiais lignocelulósicos. No Brasil um desses resíduos de maior produção é
o bagaço de cana, com uma quantidade estimada de 5 a 12 milhões de
toneladas de bagaço por ano (SURGI, 1988; MOLINA et ai., 1995). Esse
bagaço é utilizado na obtenção de compósitos (LEÃO et ai., 1997), como
suplemento em rações (LACORTE et ai., 1986), na obtenção de energia para a
própria usina de açúcar e álcool (ARMAS e BIANCHI, 1990), na obtenção de
xilitol (SENE, 1996) e em outros setores de menor importância. Mesmo assim,
as usinas de álcool produzem um grande excedente de bagaço de cana, o que
causa sérios problemas de estocagem, além do impacto ao meio ambiente.
As características do bagaço de cana, composição e disponibilidade têm
impulsionado diferentes grupos de pesquisas a desenvolver tecnologias
alternativas que busquem seu aproveitamento, principalmente aquelas que
envolvem processos biotecnológicos, a fim de produzir compostos químicos,
como ácidos orgânicos, furfural, fenóis e outros compostos aromáticos, de
maior valor econômico que a biomassa bruta (CAPEK-MÉNARD et ai., 1992).
A otimização da utilização dos diferentes componentes dos materiais
lignocelulósicos requer sua separação seletiva. Isso implica na ruptura do
complexo [lignina-carboidrato] e na remoção de cada fração por técnicas de
pré-tratamento e deslignificação, como é esquematizado na figura 3.
PROCESSOS
TÉRMICO OU QUÍMICO
ººº ººº +
+ •• • • ••• ••• LIGNINA MATERIAL LIGNOCELULÓSICO
CELULOSE (FIBRAS) POLIOSES
Figura 3: Esquema representativo da constituição e separação dos materiais
lignocelulósicos.
Os processos de separação dos componentes de materiais
lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos, biológicos ou uma
5
combinação desses, o que dependerá do grau de separação requerido e do
fim proposto (CLARK et ai., 1989; CAPEK-MÉNARD et ai., 1992; KOKTA e
AHMED, 1992; HEITNER et ai., 1993; FERRAZ et ai., 1998).
Os tratamentos químicos em meio básico tendem a extrair e solubilizar
as polioses e a lignina, separando-as da celulose. Em meio ácido, a tendência
é a hidrólise e a solubilização dos polissacarídeos. Diversas opções de pré-
tratamento têm sido propostas, incluindo extração alcalina, oxidação, hidrólise
ácida e extração com solventes orgânicos (WOOD e SADDLER, 1988;
McDOUGALL et ai., 1993).
Devido ao seu caráter alifático e principalmente aromático, a lignina
pode servir como uma fonte de reagentes químicos, os quais são agora
obtidos do petróleo e do gás natural. Uma produção em grande escala de
produtos de baixa massa molar a partir da lignina, em competição com os
produtos petroquímicos, é restrita devido a questões econômicas e
tecnológicas. Para a degradação de ligninas a compostos aromáticos e
alifáticos simples são necessários processos com elevada demanda de
energia, obtendo-se produtos químicos puros com baixos rendimentos,
representados de forma esquemática na figura 4 (GOLDSTEIN, 1981 ).
6
vanilina
ácido vanílico
siringaldeído
fenol
guaiacol
2, 6-dimetoxifenol
t
fenóis
ácidos carboxílicos
alcatrão
oxidação hidrólise alcalina fusão alcalina
t
componentes de resinas
Pirólise
/ ~ 400-SO<Jle
fenóis fenol
óleo ___.. benzeno
alcatrão
monóxido de carbono ~ gaseificação ....- __. hidrogenólise
hidrogênio
adesivos agentes dispersantes e emulsificantes
700-IOOó'C
fenóis gás de síntese
eteno
benzeno
metano
monóxido de carbono
semi-coque carvão vegetal
Figura 4: Produtos químicos obtidos a partir da lignina (GOLDSTEIN, 1981).
Alguns grupos de pesquisa têm estudado o uso de lignossulfonatos e
, lignina modificada quimicamente como agentes quelantes de íons metálicos,
obtendo resultados promissores na quelação de íons Cu2• na faixa de pH entre
2 e 6, com uma porcentagem de retenção maior que 80 % (CHANG e ALLAN,
1971; COTRIM et ai., 1995). Outro grupo de pesquisa tem estudado o poder de
retenção de íons metálicos como Pb2+ e Cd2+, utilizando lignina fórmica (obtida
por polpação de madeira de eucalipto com ácido fórmico) funcionalizada com
grupos -CH2COOH, obtendo-se resultados promissores (GÓMEZ et ai., 1997).
A modificação química através da oxidação propicia a incorporação de grupos
carbonil bastante efetivos como grupos de coordenação com íons metálicos,
como mostrado de forma esquemática na figura 5.
7
H2~-0-Lignina
HOCH 1
CH30~ 0-Lignina
[O] -:
COOH
(g}OCH3 OUgrina
HO~-CH2-0-Lignina
©10CH3 OH
Figura 5: Representação de alguns tipos de produtos obtidos da oxidação ([O])
e hidrólise (H+) da lignina.
·•. -· - Neste trabalho uma das ligninas a ser modificada é a obtida do bagaço
de cana pela técnica de explosão a vapor. Essa técnica é conhecida como
polpação de alto rendimento por explosão, utilizada para a produção de polpas
de madeiras duras, de madeiras moles e de gramíneas, como o bagaço de
' cana. Usualmente o material é impregnado com ácidos, bases ou solventes
orgânicos, introduzido num reator de alta pressão sob vapor de água a
temperaturas entre 180 e 200ºC e em seguida submetido a uma
descompressão súbita (TOMASEC e KOKTA, 1991; KOKTA e AHMED, 1992;
HEITNER et ai., 1993). Em uma modificação do processo, o bagaço de cana é
pré-tratado por explosão a vapor em um sistema auto-catalisado sem a adição
de ácidos ou bases. A lignina é obtida em uma etapa posterior por extração
alcalina e precipitada com ácido mineral (SILVA, 1995).
Outra lignina a ser utilizada é a obtida pelo processo Acetosolv, que
consiste no cozimento de bagaço de cana com ácido acético 93 % e pequenas
quantidades de HCI como catalisador, seguido de extração com ácido acético
a quente, para solubilizar a lignina, que é recuperada por precipitação em
8
água quente (BENAR, 1992). Ambas as técnicas de obtenção de lignina de
bagaço de cana têm sido estudadas e otimizadas em nosso grupo de pesquisa
(FERRAZ et ai., 1992; SILVA, 1995; URBANO et ai., 1996ª).
A oxidação química do licor de polpação Acetosolv de bagaço de cana
havia sido iniciada com resultados promissores em nosso grupo de pesquisa,
obtendo-se como produtos macromoléculas com um maior número de grupos
carbonílicos na lignina (URBANO et ai., 1995; URBANO et ai., 1996b).
Com o objetivo de promover uma oxidação mais seletiva da lignina de
bagaço de cana, aproveitando-se o caráter aromático (grupos fenólicos) da
lignina e ao mesmo tempo introduzindo-se grupos funcionais oxigenados mais
polares (principalmente grupos carbonílicos e carboxílicos) para melhorar as
propriedades quelantes da lignina, iniciou-se um estudo da oxidação
enzimática em meio aquoso utilizando a enzima polifenoloxidase, obtendo-se
resultados promissores (GONÇALVES et ai., 1996).
As polifenoloxidases são enzimas heterogêneas que podem ser
encontradas em várias partes das células de fungos, bactérias e plantas,
podendo estar ligadas às membranas de organelas ou solúveis dentro do
complexo celular (ROBB e LONTIE, 1984; BURTON, 1994). Na maioria dos
casos, a enzima encontra-se em mais de uma forma ativa e muitas dessas
formas são poliméricas. A heterogeneidade ou multiplicidade de formas
observadas nas polifenoloxidases é decorrente de vários graus de agregação
de subunidades de diferentes massas molares (BURTON, 1994). Para a
polifenoloxidase de batata tem-se uma multiplicidade de formas, originada da
agregação de duas, quatro, oito e dezesseis subunidades com diferentes
massas molares (MAYER e HAREL, 1979). As polifenoloxidases são
monooxigenases que contêm cobre e que catalisam duas reações (KERTESZ
e ZITO, 1965):
1) a inserção de um oxrqerno na posição orto em relação à hidroxila
existente no fenol ( orto-hidroxilação de fenóis ), que é conhecida como
atividade cresolase (figura 6) e,
9
ü) a oxidação de o-difenóis à respectiva quinona, que é conhecida como
atividade catecolase (figura 6).
OH OH o
6 º2 ~00 +H 2 o 1/20 2 &º. H20 .-. ..
polifeaoloxidase polífenoloxidase atividade cresolase atividade catecolase
Figura 6: Oxidação de fenóis pelas polifenoloxidases (BURTON, 1994).
Os nomes tirosinase, fenoloxidase, polifenolase e fenolase são também
comumente utilizados com o mesmo significado de polifenoloxidase (BURTON,
1994). A classificação das polifenoloxidases é ambígua. As enzimas que
exibem atividade monofenoloxidase são classificadas como EC 1.14.18.1,
porém as que apresentam atividade catecoloxidase como EC 1.10.3.2. A
classificação de todas as monooxigenases que contêm cobre e são aceptoras
de dois elétrons é EC 1.14.18.1 (BURTON, 1994).
Uma elucidação ainda não completa da estrutura da polifenoloxidase
tem sido reportada, devido a dificuldades inerentes de purificação das multi-
subunidades e da multiplicidade que a enzima apresenta. A composição e a
, seqüência de aminoácidos para a tirosinase de Neurospora e Streptomyces
têm sido publicadas (LERCH, 1982; HUBBER et ai., 1985; LERCH et ai., 1986;
BURTON, 1994). Devido à ausência de cristais suficientemente puros para
cristalografia de raios-X a estrutura do estado sólido da proteína permanece
indefinida.
A polifenoloxidase é uma enzima pertencente ao grupo de proteínas de
cobre tipo Ili. Essas proteínas são caracterizadas por dois íons cobre anti-
ferromagneticamente acoplados, situados no sítio ativo e capazes de unir
dioxigênio para formar um complexo dicobre(ll)-dioxigênio (SOLOMON et ai.,
1992; SOLOMON e LOWERY, 1993; BURTON, 1994) (figura 7). Foi sugerido
que o substrato fenólico se coordena inicialmente pela posição axial
perpendicular ao plano do sítio ativo, doando a densidade eletrônica para o
10
orbital molecular não ocupado de menor energia (LUMO) da unidade dicobre-
dioxigênio (1 ), o qual é perpendicular ao plano formado pelas ligações
oxigênio-oxigênio e cobre-oxigênio. A transferência inicial de oxigênio para a
posição orlo do anel fenólico leva à formação do derivado catecol (2). A
transferência de elétrons do derivado catecol para os átomos de cobre origina
os sítios deóxi e libera o-quinona (3). Os sítios deóxi se coordenam com 02
molecular regenerando o sítio catalític
o da enzima (figura 7).
H-~
tel e ... o ... pro "" ~cu2+···' 1 .,,,, eu2+ proteína proteina/ ····, ,,111 <proteína '•1 Q,•'
proteína , cu1+
proteína/ 1 + < proteína Cu
proteína >º< o o proteína / \ / proteína
t · >eu eu pro ema '-. / <, proteína
º' 2
/
Q o o
3
Figura 7: Mecanismo de oxidação de fenol pela polifenoloxidase
(SOLOMON e LOWERY, 1993).
11
A inserção de um grupo hidroxila em posição orto a uma hidroxila já
existente é uma reação praticamente exclusiva dessa enzima. Este é, portanto,
o motivo principal da escolha da polifenoloxidase.
O progresso no campo da enzimologia em meio não-aquoso tem
revelado que a versatilidade do uso de biocatalisadores em meio orgânico é
uma atrativa via para a produção de o-quinonas, utilizando polifenoloxidase
em meio orgânico com baixa porcentagem de água (KAZANDJIAN e
KLIBANOV, 1985; DODDEMA, 1988; VULFSON et ai., 1991; DORDICK, 1992;
NARAYAN e KLIBANOV, 1993; BURTON et ai., 1993; BURTON e DUNCAN,
1995). Devido à maior solubilidade da lignina de bagaço de cana em solventes
orgânicos como mostrado na tabela 1 (SILVA et ai., 1992), é de interesse
realizar um estudo da oxidação enzimática num meio orgânico com baixa
porcentagem de água.
Tabela 1: Solubilidade da lignina de bagaço de cana obtida por explosão a
vapor, precipitada com dois tipos diferentes de ácido.
Solvente Solubilidade da lignina (g L-1 )
Acetona 7 Acetona: água (3: 1 ) 21
Acetona: água (4:1) 21
Dioxano 13
Dioxano: tampão fosfato
(pH 6,6) 3:1 10
Etanol (95 %) 6
Etanol Absoluto 5
lsopropanol 2
Metanol 9
N'N-Dimetilsulfóxido 22
Piridina 20
Tolueno <1
12
Existem evidências que sugerem que a enzima em solução aquosa é
totalmente hidratada, após ser rodeada por algumas camadas de água. A
dimensão da espessura da camada de água está sujeita a especulação. Uma
hipótese é que a enzima requer apenas uma pequena camada hidratante que
atue como componente primário de seu microambiente. Essa camada atua
como um compatibilizador entre a superfície da enzima e o meio reacional.
Baseado nesse argumento, na biocatálise em fase orgânica deveria ser
possível manter uma enzima totalmente hidratada e ativa conservando uma
pequena proporção de água no meio reacional. A vantagem obtida com o uso
de solventes orgânicos inclui o aumento da solubilidade de substratos e
reagentes hidrófobos, o que é de relevância no caso de certos fenóis
substituídos - substratos potenciais da polifenoloxidase (LAANE et ai., 1987;
DORDICK et ai., 1987; ESTRADA et ai., 1991; POPP et ai., 1991; GORMAN e
DORDICK, 1992; KE etal., 1998ª; LEE etal., 1998; KE etal., 1998b) (figura 8).
.,---:- ... MEIO ORGÂNICO
CAMADA DE ÁGUA
Figura 8: Esquema representativo da camada de hidratação da enzima em
meio orgânico com baixo conteúdo de água.
Além da viabilidade do uso de misturas aquosas de solventes orgânicos,
há um vasto estudo da termoestabilidade da polifenoloxidase, incluindo
13
imobilização da enzima, modificação química e a inclusão de aditivos, a fim de
se manter sua atividade catalítica (VOLKIN et ai., 1991; VULFSON et ai., 1991;
DORDICK, 1992; ESTRADA et ai., 1993; BURTON e DUCAN, 1995).
Substâncias como polióis, glicerol, eritrol e etilenoglicol têm sido estudadas
como aditivos protetores da enzima. Essas substâncias podem afetar a
estrutura macromolecular da enzima por interação direta com a macromolécula
ou por ação indireta através de efeitos na estrutura e propriedades do solvente
ou por uma combinação de ambos mecanismos. Dessa forma, a relevância da
concentração do aditivo como agente protetor depende na natureza do aditivo,
sendo que o efeito protetor diminui quando o número de átomos de carbono
aumenta (ESTRADA et ai., 1993).
14
li.- OBJETIVOS
O presente trabalho tem por objetivo a oxidação de ligninas de bagaço
de cana, obtidas por explosão a vapor e por polpação pelo processo
Acetosolv, utilizando-se a enzima fenolase. Foram obtidas macromoléculas
com um elevado número de grupos oxigenados que foram testadas quanto à
eficiência de quelação de íons Cu(II) em solução.
11.1.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Estudo da atividade da fenolase sobre as ligninas de bagaço de cana em
meio orgânico.
- Determinação das condições ótimas de oxidação das ligninas pela fenolase.
- Realização das reações de oxidação correspondentes ao planejamento
fatorial 2 4-1 para as ligninas Acetosolv e explosão a vapor.
- Quantificação da retenção dos íons metálicos Cu2+ pelas ligninas oxidadas
através de cromatografia por permeação em gel.
- Estudo por espectroscopia de infravermelho das ligninas oxidadas através da
técnica de análise dos componentes principais (PCA).
- Determinação da distribuição de massa molar das ligninas originais e
oxidadas através de cromatografia por permeação em gel.
- Caracterização química e espectroscópica (UV, FT-IR) das ligninas oxidadas.
15
111.- MATERIAIS E MÉTODOS
111.1.- Ligninas estudadas no presente trabalho
111.1.a.- Lignina Acetosolv de bagaço de cana
A lignina Acetosolv de bagaço de cana já estava disponível em nosso
laboratório. Essa lignina foi obtida por processo de polpação Acetosolv pela
técnica otimizada por BENAR (1992). O bagaço de cana seco foi misturado
com ácido acético 93 % e O, 11 % de HCI e o sistema mantido sob refluxo a
11 SºC por 2 h. Posteriormente, a suspensão foi filtrada em funil de Büchner
para separar a polpa do licor de cozimento. A polpa foi prensada e lavada com
ácido acético glacial até que esse não mais apresentasse coloração.
Ao licor concentrado adicionou-se água a 80ºC lentamente e sob
agitação. O precipitado (lignina Acetosolv) foi filtrado em funil de Büchner e
lavado exaustivamente com água a 80ºC, seguido de secagem ao ar por 24 h e
secagem em estufa a 60ºC.
111.1.b.- Lignina de explosão a vapor de bagaço de cana
A lignina de explosão a vapor de bagaço de cana também estava
,disponível em nosso laboratório. Essa lignina foi obtida pela técnica otimizada
por SILVA (1995). O pré-tratamento do bagaço de cana em escala piloto é
realizado em um reator revestido de aço inox 316, com capacidade para 240 l.
Foram transferidos para o reator de explosão a vapor, previamente aquecido à
temperatura de operação, 1 O kg de bagaço de cana (base seca) pesado com
precisão de 0,05 kg. O reator foi fechado e o vapor injetado até que o reator
atingisse a temperatura de 190ºC. Após 15 min a válvula de entrada de vapor
foi fechada e a válvula de saída do reator foi aberta subitamente através do
controle automático. O bagaço ejetado para o ciclone, em função da
descompressão do reator, foi removido para um tambor de 100 l, e depois
transferido para uma centrifuga semi-contínua, marca MINERALMAQ. Os
solúveis impregnados no bagaço pré-tratado foram separados por
16
centrifugação e o bagaço pré-tratado foi lavado com água e centrifugado
novamente. Esta operação foi repetida 5 vezes. Após esse procedimento o
bagaço pré-tratado foi abundantemente lavado com água, durante a operação
de centrifugação, até a água de lavagem tornar-se incolor. O bagaço pré-
tratado foi armazenado em sacos de polietileno, que foram fechados e
estocados em geladeira até serem usados nas reações de deslignificação.
As reações de deslignificação do bagaço de cana em escala piloto
foram realizadas em um reator revestido de aço inox 316, com capacidade
para 300 L. Uma massa de 1 O kg de bagaço de cana pré-tratado, base seca,
medida com precisão de 0,05 kg, foi transportada para o reator, contendo
200 L de uma solução de NaOH 1 % pré-aquecida à temperatura de 1 OOºC. A
mistura permaneceu a 1 OOºC durante 1 h sob agitação de 100 rpm. Após a
deslignificação, o resíduo celulósico foi separado do licor em uma centrífuga
semi-contínua marca MINERALMAQ. O resíduo celulósico foi retirado da
centrífuga, ressuspendido em água (50 L) e então centrifugado novamente.
Essa operação foi repetida mais duas vezes com 50 L e 30 L de água. Os
licores contendo a lignina (280 L) foram transferidos para uma doma de 500 L
e a lignina foi precipitada através da adição de HCI concentrado, em porções
de O, 1 L até que o meio atingisse pH 2. O ácido foi adicionado lentamente sob
agitação de forma a evitar a elevação da temperatura. Após a decantação, a
lignina precipitada foi separada do licor em um filtro-prensa marca PEGE-28
'com placas de 0,015 m3, usando filtros de polipropileno nº 4021-T, da REMAE.
A lignina retirada no filtro foi lavada até que a água de lavagem saísse com pH
entre 4 e 5. A lignina obtida foi seca a 60ºC em uma estufa de ventilação
forçada até apresentar massa constante.
- --....
111.2.- Determinação da atividade enzimática da fenolase por métodos
padrão
Foi utilizada enzima comercial da Sigma, obtida a partir de extratos de
batata e que recebe o nome de fenolase EC 1.10.3.1. A preparação comercial
contém 570 unidades por mg de sólido, sendo 1 unidade definida como a
17
variação de 0,01 unidade de absorbância a 265 nm produzida por minuto,
usando ácido clorogênico como substrato (SIGMA, 1996). A preparação
comercial contém 60% de proteína (0,877 mg de sólido) e foi solubilizada em
25 mL de tampão fosfato 50 mmol L·1 a pH 7,5 (solução A).
Para medição da atividade da fenolase, 1 mL da solução A foi misturada
com 0, 1 mmoll," (concentração final) de ácido clorogênico (ácido(3-[3,4-
diidroxicinamato]-1,3,4,5-tetraidroxicicloexanocarboxílico)) e 50 mrnoll," de
tampão fosfato pH 7,5 até completar um volume final de 2 ml . A atividade
também foi determinada nas mesmas condições anteriores, porém em pH 7,0.
Essa atividade foi expressa como a variação (aumento) da absorbância por
minuto de acordo com a definição da Sigma.
111.3.- Estudo da atividade enzimática em meio tampão aquoso: dioxano
O estudo da atividade da fenolase foi realizado em uma solução de
tampão fosfato pH 7,0:1,4-dioxano, 3:1 (v/v), utilizando-se como substrato
ácido clorogênico para uma concentração final de O, 1 mmol L·1 e 1 ml da
solução A (solução enzima em tampão), sendo o volume final de 2 ml. A
absorbância em função do tempo foi medida em 265 nm .
r 111.4.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela fenolase
Na oxidação da lignina pela fenolase foram utilizados 30 mg de lignina e
1 mL da solução A (enzima em solução tampão pH 7,5) com uma razão de
tampão fosfato (pH 7,0):dioxano, 3:1 (v/v) e um volume final de 3 ml. O
experimento foi realizado em um tubo de ensaio a uma temperatura de 28ºC
por 4 h aberto ao ar. A lignina oxidada foi precipitada com 32 ml de HCI O, 1 N sob agitação mecânica e a mistura foi centrifugada a 8000 rpm por 20 min. A
lignina oxidada obtida (lignina 2) foi seca em estufa a 60ºC por 6 h. O
rendimento da reação de oxidação (em %), foi obtido pela diferença entre a
massa da lignina original e a massa da lignina obtida após oxidação
enzimática, dividida pela massa da lignina original multiplicado por 100%.
. 18
111.5.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela fenolase
em presença de glicerol e oxigênio
A oxidação da lignina foi realizada com a fenolase em tampão fosfato
(pH 7, O): 1,4-dioxano, 3: 1 (v/v) no volume total de 3 ml. Utilizaram-se 30 mg
de lignina, 0,0210 mg de enzima (1 ml da solução A, ver parte 111.2) e 30 ml
min" de 02 na ausência (lignina 3) e na presença de 1 % (m/v) de glicerol
(lignina 4). Os experimentos foram realizados a 25ºC por 4 h. As ligninas
oxidadas obtidas foram tratadas posteriormente como está descrito na seção
111.4.
111.6.- Oxidação enzimática da lignina Acetosolv em presença de polióis
A oxidação da lignina Acetosolv de bagaço de cana foi realizada com
fenolase em tampão fosfato (pH 7,0): 1,4-dioxano, 3:1 (v/v) no volume total de
3 ml. Utilizaram-se 30 mg de lignina, 0,0210 mg de enzima, 0,1% de glicerol
ou O, 1 % de polietilenoglicol (massa molar de 10000 g/mol) e 30 ml mín" de
02. Os experimentos foram realizados a 25ºC por 4 h. As ligninas oxidadas
foram precipitadas com 32 ml de HCI O, 1 N sob agitação mecânica e a mistura
foi centrifugada a 8000 rpm por 20 min. A lignina oxidada obtida foi seca em
estufa a 60ºC por 6 h e caracterizada quanto ao poder de retenção de Cu2+.
Ili. 7.- Estudo por planejamento fatorial
Foram realizadas reações de oxidação de acordo com um planejamento
fatorial experimental 24-1 com um ponto central em triplicada. Na tabela 2 são
apresentados os níveis das variáveis usadas no planejamento experimental
para a oxidação das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor. Na tabela 3
apresenta-se a matriz do planejamento fatorial fracionário.
19
Tabela 2: Níveis das variáveis usadas no planejamento experimental para a
oxidação das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor.
Fator nível (-) nível(+) ponto central
1.- Quantidade de
enzima 0,0105 mg 0,0210 mg 0,0158 mg
2.- Tempo de reação 60 min 240 min 150 min
3.- Concentração de
estabilizante
4.- Concentração
de oxidante (02)
21 % 100 % 61 %
Tabela 3: Matriz de planejamento fatorial fracionário 24-1
Ensaio X1 Xi X3 X4 1 2 + + 3 + + 4 + + 5 + + 6 + + 7 + + 8 + + + +
pto central (a) o o o o pto central (b) o o o o pto central ( c) o o o o
onde: X1, X2, XJ, e Xi representam os valores codificados das variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração de oxidante, respectivamente.
111.8.- Análise e caracterização das ligninas e dos produtos de oxidação
111.8.1.- Distribuição da massa molar
A distribuição de massa molar foi determinada utilizando-se uma coluna
cromatográfica de vidro de 57 cm x 1,8 cm recheada com Sephadex G-50.
20
Como fase móvel foi utilizada uma solução de NaOH 0,5 mol L-1 a um fluxo de -1
0,5 ml min . As amostras foram injetadas no topo da coluna (500 µL de uma
solução de 1 g L-1 em NaOH 0,04 mol L-1 ). Foram coletadas frações de 4,5 ml
e a absorbância de cada fração em 280 nm ( comprimento de onda de
absorção máxima da lignina) foi medida em um espectrofotômetro UV-Visível
CINTRA 20. A coluna cromatográfica foi previamente calibrada com uma série
de padrões de proteínas (albumina de 66000 Da, anidrase carbônica de 29000
Da, citocromo C de 12400 Da e aprotinina de 6500 Da).
111.8.1.1.- Calibração da coluna cromatográfica de GPC
A coluna de cromatografia foi calibrada com proteínas de massa molar
conhecida. As proteínas foram aplicadas na coluna nas mesmas condições da
amostra. O volume de eluição das proteínas foi transformado em um valor que
é independente do tamanho da coluna (Kd) conforme a equação 7.
Kd=--- (eq. 7)
onde: -Vel = volume de eluição, -Vo = volume de exclusão total determinado com azul de dextrana de
2000000 Da, e -Vac = volume de permeação total determinado com acetona
111.8.1.2.- Cálculo dos valores de Mn, Mw e D (dispersidade)
Os cromatogramas obtidos foram integrados em frações de 4,5 ml
utilizando-se uma planilha de cálculo feita no programa EXCEL 5.0. Os valores
de Mw (massa molar média em massa), Mn (massa molar média em número)
e Mw I Mn ( dispersidade, D) foram calculados pelas equações 8, 9 e 1 O,
respectivamente.
21
LaiXM Mw= (eq. 8)
z, s,
Mn= (eq. 9) Lai/ M
D =Mw/Mn (eq. 10)
onde: - ai = área do cromatograma sob uma fração "i" - Mi = massa molar da fração "i" obtida por interpolação na curva de
calibração.
A fração de lignina em determinadas faixas de massa molar foi também
calculada usando-se a mesma planilha.
111.9.- Quantificação das capacidades de quelação das ligninas oxidadas
por Cromatografia de Permeação em Gel
A quantificação dos complexos solúveis foi efetuada em uma coluna de
vidro de 60 cm x 1, 1 cm preenchida com uma suspensão de Sephadex G-1 O
,(fase estacionária) em tampão Tris com Cu2+ (fase móvel) (DEACON e
SMYTH, 1993). A fase móvel foi composta de 0,58 g de NaCI, 1,21 g de Tris
(hidroximetilamino metano) e 0,128 g de CuCb x 2 H20 em 800 ml. A solução
foi titulada com HCI 0,05 mol L"1 até pH 8,0 e completada para 1 L com água
destilada. As amostras foram preparadas contendo 17 mg de lignina original ou
oxidada em 10 ml de uma solução 0,04 mol L"1 de NaOH. 500 µL dessa
solução foram injetadas no topo da coluna. Foram coletadas frações de 1 ml
durante a eluisão e um volume exato de 500 µL de cada fração foi adicionado
a 5 ml de dietilditiocarbamato de sódio (O, 1019 g para 100 ml) e avolumado a
25 ml com água destilada. A formação do complexo foi acompanhada pelo
desenvolvimento de cor, a que permitiu sua quantificação em um
22
espectrofotômetro UV-Visível CINTRA 20 por medidas da absorbância em um
comprimento de onda de 440 nm.
Esse mesmo estudo da capacidade de quelação por CPG foi realizado
para agentes quelantes mais simpless: EDTA (ácido etilenodiaminotetracético),
hidroquinona (1,4-benzenodiol) e catecol (1,2-benzenodiol). As amostras foram
preparadas contendo 11,5 mg de agente quelante em 10 ml de uma solução
0,04 mol L-1 de NaOH. O poder quelante foi medido como foi descrito
anteriormente para as ligninas.
Previamente foi realizada uma curva de calibração usando-se 6
soluções padrões de Cu2+ de diferentes concentrações. 500 µL de cada
solução foram injetadas no topo da coluna. Foram coletadas frações de 1 ml
durante a eluição e um volume exato de 500 µL de cada fração foi adicionado
a 5 ml de dietilditiocarbamato de sódio (O, 1019 g para 100 ml) e avolumado a
25 ml com água destilada. A formação do complexo foi acompanhada pelo
desenvolvimento de cor, a que permitiu sua quantificação como descrito
anteriormente para as ligninas.
111.10.- Características Espectrais
,111.10.1.-Espectroscopia de UV-visível
Foram obtidos espectros na região do UV-visível das ligninas original e
oxidadas em um espectrofotômetro UV-Visível CINTRA 20.
111.10.2.- Espectroscopia no infravermelho
Foram preparadas pastilhas contendo 1,5 mg de lignina (original e
oxidada) e 300 mg de KBr, compactadas a 10 kgf/cm2 sob vácuo. A seguir foi
obtido o espectro de infravermelho na região de 4000 a 400 cm" em um
espectrofotômetro FTIR Nicolet 520. A linha base dos espectros foi corrigida
utilizando-se uma linha poligonal com zeros em 361 O, 2705, 703 e 401 cm'.
23
Os espectros foram normalizados em relação à absorbância a 1514 cm",
correspondente à absorção de anéis aromáticos, e analisados por
componentes principais (PCA).
111.10.2.1.- Método de Análise por Componentes Principais (PCA)
Os espectros de FTIR foram analisados como um conjunto de dados
formados por uma coluna correspondente aos números de onda e outra coluna
com os respectivos valores de absorbância. A matriz consistia de valores de
intensidade de absorção medidos a cada 4 cm", fornecidos pelo
espectrofotômetro FTIR. Os espectros normalizados foram digitalizados e
analisados pelos softwares de análise multivariada BIOTEC e FAEN
desenvolvidos por BRUNS (1994). De cada espectro foi utilizada a região de
702 a 1900 cm" (impressão digital), contendo 622 variáveis.
111.11. Caracterização Química das Ligninas
111.11.1.- Determinação de Grupos Hidroxilas Totais
A determinação de teor de hidroxilas totais foi realizada através de uma
modificação do método descrito por BARNET et ai. (1992), que baseia-se na
acetilação das ligninas pelo anidrido acético e posterior dosagem do ácido
acético residual.
Em um tubo com tampa foram adicionados 0,03 g de lignina seca e
0,24 ml de reagente piridina/anidrido acético 3: 1 O (v/v). O reagente foi
previamente tratado com um fluxo de nitrogênio durante 1 O min. A mistura foi
colocada em estufa a 65ºC por 12 h. Após este período, a mistura reacional foi
transferida para um erlenmeyer com adição de 15 ml de acetona e 15 ml de
água destilada. Esta mistura foi deixada à temperatura ambiente por 1 h para
total destruição do anidrido acético residual.
O ácido acético formado foi titulado com uma solução padrão de
hidróxido de sódio O, 1 mol L-1, usando-se fenolftaleína como indicador.
24
Este procedimento foi efetuado sem a presença de lignina para a
obtenção do branco.
O teor de hidroxilas totais foi determinado pela equação 13.
% OH total= [ (V1 - V2) X e X 1.7] I ma (eq. 13)
onde: - % OH tota1 = porcentagem de hidroxilas totais, - V1 = volume de NaOH consumido pelo branco (ml}, -V1 = volume de NaOH consumido pela amostra com lignina (ml), - C = concentração de NaOH (mol L-1), e - ma = massa da amostra de lignina (g).
111.11.2.- Determinação de Hidroxilas Fenólicas
Este método consiste da varredura de um espectro da solução de
lignina em meio básico contra a mesma solução em meio ácido em um
espectrofotômetro de duplo feixe. A determinação de OH fenólico é feita
baseando-se na absortividade média de compostos modelo de lignina
conforme decrito por WEXLER (1964).
Uma solução estoque foi preparada pesando-se aproximadamente 0,2 g
de lignina que foi dissolvido em 50 ml de dioxano 96%. A solução estoque foi
diluída 1 O vezes com dioxano/água 1: 1 (v/v) e ajustada a pH 13 com NaOH
1 mol L·1 . Um branco foi feito na mesma diluição, porém em pH 1, ajustado
pela adição de ácido clorídrico 1 mol L·1 . A varredura foi realizada utilizando-
se um espectrofotômetro FTIR Cintra 20. O teor de hidroxilas fenólicas foi
calculado pela equação 14:
% OH fenólico = ( ~ Abs 250 nm x O, 192 )/ Clignina (eq.14)
onde: - % OH fenólico = porcentagem de hidroxilas fenólicas, - ~ Abs 2sonm= Absorbância da solução em 250 nm, subtraída da
absorbância relativa à linha base do espectro, - O, 192 = relação de porcentagem de OH fenólico por absortividade
em 250 nm (L 9·1 cm"), determinada para vários compostos modelos (WEXLER, 1964), e
- Crignina = concentração da solução de lignina (g L-1).
25
111.11.3.- Determinação de Hidroxilas Alifãticas
As hidroxilas alifáticas foram determinadas pela diferença entre as
hidroxilas totais e fenólicas.
111.11.4.- Determinação de Metoxilas
O teor de metoxilas foi determinado de acordo com a metodologia
descrita por FERRAZ et ai. (1997). Cerca de 8 mg de lignina foram pesados
diretamente em tubo de vidro de 3 ml com tampa de rosca de septo de
silicone. A essa amostra foram adicionados 0,25 ml de ácido iodídrico 47%
(m/m). A mistura foi aquecida a 125 ºC em banho de óleo de silicone por
30 min. Após o término da reação, os frascos foram resfriados em gelo por 1 O
min. Em seguida foram adicionados, através dos septos, 0,9 ml de CHC'3 e
1,0 ml de água, com o auxílio de uma seringa. Os frascos foram agitados e
abertos para a adição de O, 1 ml de 2-iodopropano [4% (v/v) em CHC'3],
utilizado como padrão interno. Os frascos foram rapidamente fechados e
agitados. A fase de clorofórmio foi analisada por cromatografia gasosa en um
cromatrógrafo CG mod. 3537 equipado com detector de ionização de chama e
integrador MINIGRATOR. Como fase estacionária foi usada uma coluna
CG 2193 (30% Carbowax 1500 em chromosorb W; 1,5 m x 3,18 mm). Como
fase móvel foi utilizado N2 a 27,9 ml rnin".
O fator de resposta para o CH31 foi obtido a partir da equação 15 com
padrões analíticos em concentrações entre 1 e 20 g L1 , mantendo-se
constante a concentração do padrão interno (CH3CHICH3) a 6,0 g L·1.
McH31 I MPrl = f x A CH31 I Aprl (eq.15)
onde: - McH31
- MPrl
-AcHEI
-Aprl
= massa de iodeto de metila (g), = massa de iodeto de propila (g), = área do pico do iodeto de metila, e = área do pico do iodeto de propila.
26
Através do gráfico da razão das massas em função da razão das áreas
foi possível obter o valor de f, utilizado para calcular a porcentagem de
metoxila através da equação 16.
% OCH3 = [ (0,22) x (AcH31 I Ap,) x f Mp,J / M lig (eq.16)
onde: - %ocH3 = porcentagem de metoxilas, - M ,;9 = massa de lignina (g), - M P1 = massa de iodeto de propila (g), - A cH31 = área do pico do iodeto de meti la (g), -Ap1 = área do pico do iodeto de propila (g), e - f = fator de resposta para CH3I
O método para a determinação das metoxilas foi aferido com 3-metoxi-
4-hidroxibenzaldeído (vanilina, usado como composto modelo para lignina), no
qual a porcentagem de metoxilas teórico é de 20%. Os resultados
experimentais revelaram um teor de 23,08%, com um desvio relativo de 15,4%.
Esse desvio foi considerado dentro de limites aceitáveis para a finalidade
desse trabalho.
111.11.5.- Determinação de Carbonilas
O teor de carbonilas foi determinado conforme descrito por GIERER e
LENZ (1965). A 200 mg de lignina foram adicionados 20 ml de etanol 95% e o
pH ajustado em 4,0 com HCI O, 1 mol L"1•
Uma solução de cloreto de hidroxilamônio (2,0 mmol diluídos em 40 ml
de etanol 80%) foi preparada separadamente e o pH ajustado em 4,0.
As duas soluções foram termostatizadas a 40 ± 1 ºC, misturadas e
mantidas a essa temperatura, com agitação constante, durante todo o tempo
de reação. O pH da reação foi mantido em 4,0 pela adição de uma solução
padrão de NaOH 0,02 mol L"1 , utilizando-se um controlador automático de pH,
New Brunswick Scientific Co. INC Model Nº PH 40.
A reação foi acompanhada por um período de 24 h e o volume de NaOH
consumido foi determinado, de acordo com a equação 17.
27
%cARBONILA = [ CNaOH x VNaOH x 28 x 100 ]/ m LS (eq.17)
onde: - CNaOH
-VNaOH
-28
= concentração de NaOH (mal L-1 ),
= volume de NaOH consumido (L), = massa molar da carbonila, e = massa de lignina seca (g)
A metodologia empregada na determinação das carbonilas também foi
testada com 3-metoxi-4-hidroxibenzaldeído (vanilina), com porcentagem de
carbonilas igual a 19,8 %. Os resultados experimentais revelaram um teor de
20%, com um desvio relativo de O, 1 %. Esse desvio foi considerado dentro de
limites aceitáveis para a finalidade desse trabalho.
28
IV.- RESULTADOS E DISCUSSÃO
A parte inicial do presente trabalho envolveu o estabelecimento do
método de quantificação de íons Cu2+ ligados à lignina por Cromatografia de
Permeação em Gel. Na segunda parte foram avaliadas as variáveis estudadas
no planejamento fatorial 24-1 para a reação de oxidação da lignina Acetosolv e
de explosão a vapor pela fenolase. Na seção seguinte centrou-se na
caracterização química das ligninas oxidadas que apresentaram um maior
poder de retenção de íons Cu+2.
IV.A.-Estudo do poder de retenção de Cu2+ pela lignina
IV.A.1.- Quantificação de íons Cu2+ ligados à lignina
Para quantificação por Cromatografia de Permeação em Gel de íons
Cu2+ ligados à lignina, primeiramente obteve-se uma curva de calibração que
relacionou a quantidade de íons Cu2+ de amostras padrão com as diferentes
áreas sob a curva apresentada no cromatograma. O segundo passo foi a
quantificação do poder de quelação de ligninas oxidadas mediante diferentes
condições obtidas em outro trabalho (GONÇALVES et. ai, 1997), a fim de se
observar a reprodutibilidade do método.
Na obtenção da curva de calibração foram usadas 6 soluções de Cu2+
de diferentes concentrações e a curva de calibração obtida é apresentada na
figura 9. O cromatograma apresenta apenas o pico positivo que corresponde
ao acréscimo de íons Cu2+ na coluna. A área do pico é proporcional à
concentração de Cu2+.
As amostras de ligninas de bagaço de cana obtidas através do processo
de polpação Acetosolv e oxidadas sob diferentes condições (GONÇALVES et.
ai, 1997) foram analisadas quanto ao seu poder de quelação de íons Cu2+ por
cromatografia de permeação em gel (GPC) e um exemplo do cromatograma
obtido para a lignina Acetosolv original é mostrado na figura 1 O. O
... -· -
29
cromatograma mostra a variação da concentração de Cu2• em função do
volume de eluição. Pode-se constatar que a linha base até 20 ml permaneceu
constante e que posteriormente há um notável aumento da concentração de
Cu2·, com máximo em 26 ml, seguido de uma deficiência, com mímino em
34 ml, até voltar a ser constante após 42 ml. Essa alteração deve-se à ação
quelante da lignina, sendo o pico positivo correspondente ao cobre que é
quelado pela lignina oriundo da fase móvel e o pico negativo refere-se à
deficiência de Cu2• na fase móvel. Após a saída da fração eficiente de Cu2•, a
concentração de Cu2• na coluna permanece constante.
400 íii 350 l'CI 'i:
'"' 3X) .:: :s 250 .. l'CI CII 200 GI 't:I
150 l'CI 't:I 'E 100 a l'CI 50 GI .. < o
o
y = 1,2401x + 103,12 R2 = 0,9918
50 100 150 200
Concentração de Cu 2•(ppm) 250
Figura 9: Curva de calibração para a determinação dos íons Cu2• ligados à
lignina.
30
225----~~~~~~~~~~~~~~~~ Ê 200 a. ,S: 175
., •••• • • - ~ o
CII ,, ,g 100
l!' 75 e 50 g o 25 o
150 ..... _ ........... .......... ·.--~. 125
...... . ..... •• • • • •• .....
Figura 10: Cromatograma da lignina Acetosolv original. Coluna Sephadex G-10
de 60 x 1, 1 cm, eluída com tampão Tris-NaCI pH 8 a 0,5 ml rnín".
10 50 60
Teoricamente as áreas das partes positiva e nagativa deveriam ser
iguais. Foi tomada como mais representativa a área sob a curva positiva, uma
vez que essa corresponde ao complexo formado. Também foi verificado que a
parte negativa sofre influência da curva anterior, correspondente ao produto da
quelação do Cu2+, como mostrado pelos maiores valores de desvio padrão
(tabela 4).
Com base na calibração da coluna de Sephadex G-10 com as diferentes
soluções padrão de Cu2+, foi estimada a concentração de íons Cu2+ que é
retida pelas ligninas oxidadas ( obtidas do trabalho de GONÇALVES et ai., 1997) e pela lignina Acetosolv original a partir da área do pico positivo do
cromatograma mostrado na tabela 5.
20 30 40 o Volume (ml)
31
Tabela 4: Áreas sob a curva do cromatograma obtido para a retenção de íons
Cu2+ para diferentes ligninas, obtidas a partir do trabalho de
GONÇALVES et ai., 1997.
Lignina
1
2
3
4
5
Area sob a curva Area sob a curva
do pico positivo do pico negativo (unidades arbitrárias) unidades arbitrárias)
396 ± 4 412 ± 13
407 366
300 ± 4 394 ± 96
103 ± 5 75 ± 17
534 519
Tabela 5: Concentrações de íons Cu2+ retido pelas diferentes ligninas
analisadas por GPC.
Lignina Parâmetros de oxidação Aumento dos Área sob a curva Retenção de Cu2+ (mg
Paraldeído Catalisador HBr grupos carbonilos (unidades de Cu2+ /g de lignina)
(mmol) (mmol) (mmol) (%) a arbitrárias)
1 Lignina Acetosolv original 392,95 132,2
2 o 7.5 37.5 7.5 406,83 138,5
3 75 7.5 37.5 21.6 303,17 287,0b
4 o 15.0 75.0 11.6 106,45 1,5
5 75 15.0 75.0 16.4 533,79 196,Sb
Catalisador= Co(OAc)2'Mn(OAc)2 (9:1) (a) = com respeito à lignina 1, determinado por FT-IR (GONÇALVES et ai., 1997) (b) = o valor para a retenção de Cu2+ foi calculado em relação à parte solúvel da lignina
oxidada obtida (sendo cerca de 50 o/o da lignina solúvel).
Os resultados são coerentes pois com um aumento no número de
grupos carbonil tem-se um incremento na retenção de íons Cu2+ (ligninas 1 e
3). Os grupos carbonil são um dos responsáveis pela quelação de íons
metálicos, como foi mostrado na figura 1. Cabe destacar que para a lignina 4 e
5 tem-se uma diminuição do poder de quelação devido, provavelmente, à
32
incorporação do próprio catalisador utilizado na oxidação da lignina, uma vez
que a quantidade utilizada foi o dobro das demais. Ao realizar-se um estudo da
reprodutibilidade dos valores obtidos para o cálculo das áreas sob a curva
(pico positivo) apresentada pelas diferentes ligninas, obteve-se um desvio
padrão de 4 % para as análises em triplicata.
IV.A.2.- Estudo da oxidação de lignina pela fenolase
IV.A.2.1.- Estudo preliminar da oxidação da lignina pela fenolase em fase
homogênea
A água constitui, em muitos casos, um solvente pouco apropriado para a
indústria química, isso porque muitos compostos orgânicos de interesse
comercial são pouco solúveis e freqüentemente instáveis em solução aquosa,
devido a desfavoráveis equilíbrios de reação. Por isso, nos últimos anos houve
um crescente interesse para o desenvolvimento de processos catalíticos em
solventes orgânicos.
Os sistemas monofásicos estão formados pela enzima presente na água
e um solvente orgânico miscível. Em geral, os solventes miscíveis com água,
isto é, com alto grau de hidrofilicidade interagem com a enzima e provocam
uma diminuição da atividade enzimática. Isso é mais intenso à medida que a
concentração do solvente orgânico aumenta (KLIBANOV, 1986; LAANE et et.,
1987 e ZACK et ai., 1990).
Em vários trabalhos tem-se estudado a hidroxilação aromática de fenóis
usando-se uma polifenoloxidase (tirosinase) adsorvida sobre pérolas de vidro,
as quais foram suspensas em clorofórmio para oxidar os substratos às
quinonas correspondentes, que podem ser posteriormente reduzidas aos
compostos hidroxilados com ácido ascórbico. Desta forma, foram obtidas
quantidades consideráveis de 4-metilcatecol a partir de p-cresol. Esta reação é
impossível de realizar-se em solução aquosa, devido a polifenoloxidase ser
rapidamente inativada durante a reação de hidroxilação, provavelmente pela
inibição por parte de um polímero que as o-quinonas formam quando
·• -· -
33
encontram-se em fase aquosa. Os solventes orgânicos anidros não permitem
que as quinonas polimerizem e inativem a enzima (KAZANDJAN et ai. , 1985 e
DORDICK, 1989).
Neste trabalho, para a oxidação enzimática da lignina de bagaço de
cana foi utilizada a fenolase, já que seus substratos potenciais são os
compostos aromáticos como os polifenóis, utilizando-se uma fase homogênea
composta de água/dioxano na razão 3: 1, fase na qual a lignina é completamente solúvel.
No estudo da atividade enzimática apresentada pela fenolase em meio
tampão fosfato pH 7,5 e tampão fosfato pH 7,0 os valores de atividade foram
235,8 U e de 425 U, respectivamente. As atividades apresentadas foram
menores que a reportada no produto comercial. Isto pode ser devido às
diferentes condições da reação, como exemplo a temperatura da reação e a
concentração de substrato, além de possíveis problemas na armazenagem.
Uma vez que a enzima apresentou maior atividade em tampão fosfato pH 7,0,
esse foi utilizado no estudo da oxidação da lignina. O valor da atividade da
fenolase apresentada em tampão fosfato pH 7,0 foi mantido como referência
para o estudo da atividade da enzima em meio orgânico.
A atividade enzimática da fenolase em tampão fosfato
(pH 7,0):1,4-dioxano (3:1) é de 20 U (oxidação de ácido clorogênico), que
corresponde a aproximadamente 5% do valor de referência. Essa queda na
atividade é devida à presença de solvente orgânico no meio da reação, o que
pode levar a uma diminuição da afinidade da enzima pelo substrato (ácido
clorogênico), por afetar as interações enzima-substrato. A conformação da
molécula da enzima em solução está determinada por complexas interações
que ocorrem tanto no interior da proteína como na superfície, principalmente
ligações hidrogênio, ligações de dissulfeto, interações eletrostáticas e
interações de Van der Waals. Essas complexas interações afetam a
conformação e a estabilidade da enzima no meio estudado. Quando as
proteínas encontram-se em um ambiente aquoso, a solvatação de seus
resíduos carregados tende a ser máxima, e em conseqüência, sua estabilidade
aumenta. Em um ambiente hidrofóbico, as pontes salinas são muito instáveis e
os pares iônicos deverão estabilizar-se com suas cargas eletrostáticas
34
complementares, dentro do ambiente polar da proteína. Além disso, as
interações não covalentes, determinantes na estabilidade da estrutura terciária
da enzima, alcançarão um novo equilíbrio no solvente orgânico, o que resulta
na perda da atividade catalítica (ARNOLD, 1990 e ILLANES e BARBERIS,
1994).
Em um ensaio preliminar, a oxidação da lignina de bagaço de cana
( obtida do processo Acetosolv) foi realizada com fenolase em uma mistura
tampão fosfato (pH 7,0):dioxano 3:1. Para isso utilizou-se 0,0210 mg da
enzima (1 ml da solução A, parte Ili.A) para 30 mg de lignina em um volume
total de 3 ml.
Espectros de absorção na região UV das amostras foram obtidos a cada
30 min para um tempo total de 4 h. Observou-se que as absorbâncias a 215,
250, 300 e 350 nm aumentaram até 2 h com uma diminuição até 3 h, seguida
de um novo aumento até 4 h. Para um estudo da cinética da reação de
oxidação da lignina pela fenolase, realizou-se um ajuste dos dados de
absorbância obtida em função do tempo de reação. Entre O e 2 h e entre 3 e
4 h obtém-se uma relação logarítmica mostrando que a reação é de pseudo-
primeira ordem (figuras 11 e 12). Entre 2 e 3 h não há uma relação que possa
ser expressa por meio de uma equação simples (figura 13). Por UV não se
pode avaliar exatamente como é a cinética da oxidação enzimática e como ela
varia ao longo da reação.
35
o 0,5 1,5
1 (1) y = 0,5205x - 0,5984
R2 =0,9973
2 (2) y = 0,4545x - 1,179 R2=0,9968
3 (3) y = 0,4716x - 1,6
4 R2=0,997
(4) y=0,4466x-1,5512 R2=0,9973
2 • 215 nm •250 nm
A 300 nm -350 nm
0,5
o -;;- ü Jã -0,5 .a ... o .! -1 ..!!!. .5 -1,5
Tempo (h)
Figura 11: ln(absorbância] em função do tempo de reação para os diferentes
comprimento de onda estudados, no intervalo de O a 2 h.
0,5 (1) y = 0,8333x - 3,0905 IIJ
~; R2 = 1 u o (2) y = 0,7304x - 3,4156 e
<IIJ .a -0,5 R2 = 0,9888 .. o (3) li) -1
~4 y = 0,7435x - 3,8503 .a
IIJ R2 = 0,9894 .5 -1,5 (4)
-2 y = 0,6942x - 3,6816
2 3 4 5 R2 = 0,9866
Tempo (h) • 215 nm • 250 nm
"300 nm -350nm
Figura 12: ln[absorbância] em função do tempo de reação para os diferentes
comprimento de onda estudados, no intervalo de 3 a 4 h.
36
2
l .215nm •250nm I • 1
-350nm I 1,5 J ~300 nm 1
"' ·u • e: '"' .e ... 1 o .. .e • e(
• • 0,5 ... • • • o
o 2 3 4 Tempo (h)
Figura 13: Absorbância em função do tempo de reação para os diferentes
comprimento de onda estudados, no intervalo de 2 a 3 h.
IV.A.2.2.- Estudo preliminar da oxidação de lignina Acetosolv pela
fenolase em presença de glicerol e oxigênio
- -_.,,,
O aspecto das diferentes ligninas obtidas foi similar e, posteriormente à
precipitação em HCI, o sólido obtido é denominado lignina oxidada. O aumento
da quantidade de ligações a, ~-insaturadas e a-carbonilfenólicas na estrutura
da lignina foi medido pelas absorbâncias no UV a 280 nm e 310 nm (figura 14).
A oxidação da lignina Acetosolv com fenolase em presença de glicerol gerou
uma lignina com absorção maior nessas duas regiões, quando comparada com
a oxidação sem glicerol. O glicerol exerce um efeito estabilizante sobre a
enzima que permanece na forma ativa por um período de tempo maior.
37
0.8
0.7
0.6
l'IS 0.5 ü e .c,s 0.4 .CI .... o
UI 0.3 .CI < 0.2
0.1
o 225
· - . - - - · Lig. oxid.( A)
--Lig. oxid. (8)
250 275 300 325 350 375
Comprimento de onda {nm)
Figura 14 : Espectro de UV para a lignina Acetosolv oxidada com fenolase e
oxigêno em ausência (A) e em presença de glicerol (8). Espectro
feito a partir de soluções de 0,2 g L-1 em ácido acético glacial.
IV.A.3.- Estudo da capacidade de quelação das ligninas Acetosolv
oxidadas
A capacidade quelante das ligninas Acetosolv, original e oxidadas
enzimaticamente nesta parte preliminar do trabalho, foi determinada pela
quantidade de íons Cu2+ unidos à lignina. A quantificação foi realizada por
cromatografia de permeação em gel. Os cromatogramas mostram um idêntico
comportamento entre si, diferenciando-se somente na área sob a curva
apresentada pelos picos. Na figura 15 mostra-se o cromatograma obtido para
uma dessas ligninas com o mesmo perfil discutido anteriormente.
Utilizando-se a curva de calibração obtida a partir de soluções padrão
de Cu2+ de diferentes concentrações (figura 9), foram obtidos os resultados
sobre a capacidade de quelação apresentada pelas ligninas estudadas
(tabela 6).
38
Ê 250 D. S: 200 - :r o 150 GI
"CI o 100 ,cu u, Ili ...
50 - e GI u e o o o o
..... • • • ......... . ······· • • • ...
Figura 15: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina Acetosolv oxidada
com fenolase em presença de oxigênio. Coluna de Sephadex
G-10, eluída com tampão Tris-NaCI pH 8,0 a 0,5 ml mín".
30 40 50
Tabela 6 : Parâmetros de oxidação e capacidade de retenção das ligninas
Acetosolv oxidadas.
Lignina Enzima Oxigênio Glicerol Rendimento Capacidade quelante
(mg) (mL mín") (% m v·1) (%) (mg de cu2• I g de lignina)
1 lignina Acetosolv original 95.0 132 6 0,0210 95.0 155 7 0,0210 30 96.0 229 8 0,0210 30 1,0 96.0 279
10 20 Tempo de eluição (min)
Todas as ligninas estudadas apresentam uma alta retenção dos íons
Cu2+, sendo que a utilização de oxigênio na oxidação levou a um incremento
no poder de quelação de 48% (ligninas 6 e 7). Isso foi devido à atividade
catecolase apresentada pela polifenoloxidase em presença de oxigêno que
leva à formação de o-quinonas nas estruturas fenólicas da lignina. Grupos
carbonilados apresentam uma alta densidade eletrônica, e portanto uma alta
capacidade de quelação dos íons Cu2+. Ao se comparar as capacidades de
quelação da lignina oxidada em presença de oxigênio e glicerol (lignina 8) com
39
as demais, tem-se que seu poder de retenção dos íons Cu2+ foi o maior. Como
foi evidenciado pela absorção no UV a ação do glicerol presente no meio de
oxidação tem um efeito de proteção da estrutura ativa da enzima, isto porque a
enzima está em um meio com alta porcentagem de solvente orgânico, o qual
pode causar uma mudança da estrutura quaternária da enzima, perdendo seu
efeito catalítico. Por outro lado, a medida da atividade enzimática na presença
de glicerol apresentou um valor baixo (1 O U). Com esse valor, o glicerol não
deveria exercer o efeito desejado, o que não foi demonstrado, pois nessas
condições (lignina 8), o poder de retenção dos íons Cu2+ alcançou um valor
máximo de 279 mg de Cu2+/g de lignina. Acreditamos que, para ocorrer a
estabilidade da enzima, as interações são mais complexas, envolvendo o
glicerol e o próprio substrato.
O rendimento em lignina oxidada foi próximo a 100% para todos os
experimentos (tabela 6), mostrando que apenas uma pequena fração de
lignina é perdida como compostos solúveis de baixa massa molar.
IV.A.4.- Estudo da massa molar média das ligninas original e oxidadas
com fenolase
Para a determinação das massas molares das ligninas oxidadas, a
coluna cromatográfica utilizada foi calibrada com proteínas de massas molares
conhecidas. As proteínas foram escolhidas como uma alternativa para a
calibração, pois em solução aquosa elas são globulares, presumivelmente,
como a lignina. Em adição, elas são solúveis em soluções alcalinas, o que não
acontece com os poliestirenos (FORSS et ai. 1988). A curva de calibração
obtida é apresentada na equação 18:
log M = -2,99 Kd + 4,75
r2 = 0,998
(eq.18)
A distribuição da massa molar da lignina Acetosolv original é mostrada
na figura 16, na qual se observa uma pequena fração ( < O, 1 % ) que eluiu com
valores de Kd inferiores ao limite de exclusão do sistema de coluna (valores de
40
Kd «O). Entretanto, foi observado um nítido padrão bimodal para a eluição das
ligninas obtidas após a oxidação enzimática. Nas figura 17, 18 e 19 mostram-
se os cromatogramas da eluição por exclusão molar das ligninas Acetosolv
oxidadas com fenolase nas diferentes condições de reação.
0.35 ,-... 0.3 s e 0.25 o 00 N 0.2 "-"
c,:s ·g 0.15 <C,:S .e 0.1 ... o "' .e 0.05 <
o -0.5 o 0.5 1.5 2
Kd
Figura 16: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
original (lignina 1 ). Coluna de Sephadex G-50, eluída com
NaOH 0,5 M a 0,5 ml rnin".
0.25 -- E 0.2 i: o 00 c-..:i 0.15 '-' ~ ·13
(tã 0.1 .e e <ll 0.05 .e -<
o -0.5 o 0.5 1.5
Kd
Figura 17: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
oxidada com fenolase em presença de ar (lignina 6). Coluna de
Sephadex G-50, aluída com NaOH 0,5 M a 0,5 ml rnín".
41
0.16 - 0.14 E e: 0.12 o
00 0.1 N '-' ~ 0.08 ºõ
<fã 0.06 ./:) ... o 0.04 Cll ./:)
< 0.02 o -0.5 o 0.5 1 1.5
Kd
Figura 18: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
oxidada com fenolase em presença de oxigênio (lignina 7).
Coluna de Sephadex G-50, eluída com NaOH 0,5 M a
0,5 ml min",
0.16 ,-... 0.14 E e:: 0.12 o 00 0.1 N '-" ~ 0.08 ·5 e:: 0.06 (~ -e 0.04 o e,:,
..o 0.02 -< o -0.5 o 0.5 1 1.5
Kd
Figura 19: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
oxidada com fenolase em presença de oxigênio e glicerol
(lignina 8). Coluna de Sephadex G-50, aluída com NaOH 0,5 M a
0,5 ml mín".
42
A massa molar média em massa ( Mw ), massa molar média em número
( Mn) e dispersidade (D) das ligninas foram calculadas utilizando-se uma
curva de calibração obtida com padrões de proteínas e os resultados são
mostrados na tabela 7.
Tabela 7 : Valores de massa molar média em massa (Mw), massa molar
média em número ( Mn) e dispersidade (D) das ligninas.
Lignina Mw Mn D
(Da) (Da)
1 5175 3707 1,39
6 1122 211 5,32
7 1906 190 10,04
8 2419 314 7,70
Valores de Mw diferentes foram obtidos para as ligninas oxidadas
em diferentes condições. Todas as ligninas oxidadas apresentam valores de
Mw menores que a lignina original, indicando uma inibição de reações de
polimerização que aumentariam a massa molar. Outra explicação é a
, diminuição da agregação entre as moléculas de lignina após a ação
enzimática. A lignina que foi oxidada com fenolase em presença de ar (lignina
6) apresentou o menor valor de Mw . Essa lignina também apresentou um
baixo poder de retenção dos íons Cu2+, provavelmente devido ao baixo número
de grupos hidroxila e carbonila incorporados na macromolécula da lignina. A
lignina oxidada com fenolase em presença de oxigênio e glicerol (lignina 8)
apresenta o dobro do valor da Mw que a lignina 6, conduzindo a um aumento
na capacidade de retenção dos íons Cu2+ em mais de 100% (tabela 6),
comparando-se com a lignina original. Esse resultado mostra que a enzima
permaneceu ativa por mais tempo, o que pode ser atribuído à ação do
estabilizante adicionado ao meio de reação. Tal efeito levaria, à maior
incorporação de hidroxilas vicinais e também favoreceria a oxidação para
43
quinonas. Por outro lado, haveria uma maior chance de polimerização das
quinonas, aumentando-se a massa molar.
Os resultados também mostram que as ligninas obtidas após a oxidação
enzimática apresentam uma dispersidade muito maior em comparação à
lignina original.
Através do estudo das frações de massa molar da lignina, pode-se
observar melhor as diferenças entre as ligninas oxidadas com fenolase e a
lignina original. Tem-se que as ligninas oxidadas apresentam uma fração
abundante de massa molar menor que 1000 Da, ausente na lignina Acetosolv
original (tabela 8) o que mostra que a lignina original estaria sofrendo
hidrólise. Isso poderia ser devido ao rompimento das ligações etér 13-0-4 entre
unidades p-propilfenólicas, uma das ligações mais comuns na lignina. Por
outro lado, a hidrólise da lignina é feita normalmente em condições mais
drásticas, em meio mais ácido. Aproximadamente 85% da lignina Acetosolv
original apresenta uma fração de Mw entre 2000 e 10000 Da, enquanto que as
ligninas oxidadas presentam de 8 a 26% dentro da mesma fração de Mw.
Tabela 8: Porcentagem de lignina que apresenta uma determinada faixa de
massa molar.
lignina (%)
Fração de Mw (Da) 1 6 7 8
< 1000 0,00 77,93 65,59 53,54
1000-2000 5,78 10,91 14,74 11,87
2000-4000 40,76 5,61 7,05 14,68
4000-10000 44,37 2,63 8,63 11,02
>10000 9,08 2,92 3,99 6,09
Ao aumentar a porcentagem de frações com Mw entre 2000 a 10000 Da
(ligninas 6, 7 e 8), tem-se um aumento da capacidade de retenção dos íon
Cu2+. A lignina possui uma estrutura globular em função das várias ligações
de hidrogênio dentro da molécula (JURASEK, 1997). Ao ser introduzidos
44
grupos hidroxilas vicinais, diminui a interação entre as unidades devido à
ligação de hidrogênio entre esses grupos hidroxilas vicinais. Presumivelmente
há uma distorção da estrutura tridimensional da lignina, aumentando seu
volume hidrodinâmico, que é a grandeza efetivamente medida na
cromatografia por exclusão molar. Assim, os maiores valores de Mw
correspondem na verdade à distorção na macromolécula de lignina, em função
da incorporação de grupos polares. As possíveis reações de polimerização
anteriormente mencionadas são evitadas e, como conseqüência, há o aumento
do poder quelante.
IV.A.5.- Estudo dos efeitos de polióis na oxidação da lignina Acetosolv
pela fenolase
A aplicação de enzimas na análise e na produção de substâncias
químicas tem sido estimulada. Uma das limitações para uma aplicação ainda
mais extensa é que as enzimas podem ser desnaturadas por pequenas
mudanças do meio tais como temperatura, pressão, pH, força iônica e natureza
do solvente.
O desenvolvimento de técnicas para manter a estabilidade das enzimas
é um dos principais objetivos de estudo nessa área e foi abordado em nosso
trabalho através da adição de polióis. A seleção do aditivo depende da
natureza da enzima, mas o aumento na estabilidade da enzima é
freqüentemente observado pela adição de açúcares ou polióis (MATSUMOTO
et ai., 1997). Os polióis são os solventes aquosos menos desnaturantes e
contribuem significativamente para a manutenção da conformação nativa da
enzima.
A fim de aumentar a estabilidade da enzima nos solventes utilizados, foi
estudado o efeito da adição de glicerol ou de polietilenoglicol na reação de
oxidação da lignina pela fenolase. Uma forma de se observar o efeito ~o poliol
utilizado é quantificar o poder de quelação apresentado pela lignina oxidada.
Com uma maior estabilidade da enzima deverá ocorrer uma maior oxidação da
lignina e, portanto, um maior número de grupos carbonila serão introduzidos, o
45
que deverá aumentar a capacidade de retenção de íons Cu2+. Outra forma
seria a medida da atividade enzimática na presença do poliol. Como discutido
no item IV.A.3 isso foi feito e a ação estabilizante do glicerol não pôde ser
confirmada. Além disso, o substrato utilizado (ácido clorogênico) é totalmente
diferente da lignina, impedindo um estudo real da atividade.
Os cromatogramas das ligninas oxidadas mostram muita semelhança,
diferenciando-se somente quanto às áreas dos picos. Nas figuras 20 e 21
mostram-se os cromatogramas obtidos para essas ligninas. Como já discutido,
o pico positivo corresponde à quelação dos íons Cu2+ pela lignina e o pico
· negativo é devido à ausência de íons Cu2+ na fase móvel, produto do
desbalanço na concentração do íon pela quelação.
240-.--~~~~~~~~~~~ Ê §: 200 .\ :::: .. - 160 • ::::, . ~ 120 ~·~., o ~ 80 jg 5l 40 u e o u
. ... .... • •• • • ••
0+-~~~+-~~~~~~~ o 20 40 60
Figura 20: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina oxidada em
presença de fenolase, oxigênio e gicerol. Coluna de Sephadex
G-10 (52 cm x 1,2 cm), eluída com tampão Tris-NaCI pH 8,0 a
0,5 mL mín".
Tempo de eluição (min)
46
220
:i' 190 .-... o 160 QI • • ,, - ....... ,, • r·· o E 130 • 1(11 ~ e,. ~ f- 100 ., e QI ~ u 70 e o o 40
o 20 40 60 Tempo de eluição (min)
Figura 21: Cromatograma de retenção do Cu2+ pela lignina oxidada em
presença de fenolase, oxigênio e polietilenoglicol. Coluna de
Sephadex G-10, eluída com tampão Tris-NaCI pH 8,0 a
0,5 ml rnin".
A partir da curva de calibração obtida com soluções padrão de Cu2+ de
diferentes concentrações, foram obtidos os resultados de capacidade de
quelação das ligninas estudadas e os resulltados estão mostrados na tabela 9.
Tabela 9: Concentrações de íons Cu2+ retidos pelas diferentes ligninas
analisadas por GPC.
Lignina fenol ase 02 poliol Retenção de Cu2+
(mg) (mL min') (0,1% rnv') (mg de Cu2+ I g de lignina)
1 lignina Acetosolv original 132 9 0,0210 30 glicerol 279
10 0,0210 30 polietilenoglicol 154
A lignina Acetosolv original apresenta uma capacidade quelante de
132 mg de Cu2+/g de lignina. A oxidação da lignina usando-se fenolase, 02 e
um poliol melhorou a capacidade de quelação apresentada pela lignina,
mostrando que o poliol aumenta a estabilidade da fenolase na fase
homogênea de reação, composta por cerca de 25 % de solvente orgânico. As
ligninas oxidadas em presença de polietilenoglicol e glicerol apresentaram
47
aumentos de 17% e de 111 % na capacidade de retenção de íons Cu2+, em
relação à lignina Acetosolv original, respectivamente. A diferença entre os
polióis usados deve-se ao número de carbonos na cadeia. Isso leva a uma
mudança na interação do poliol com a enzima. Uma vez que o glicerol é de
menor massa molar, existe uma maior interação com a enzima mantendo por
maior tempo sua estrutura quaternária (ver figura 22). Além disso, a alta
viscosidade do polietilenoglicol leva a sua incapacidade de dissolver
substratos de baixa polaridade e suas moléculas possuem altas propriedades
nucleofílicas (ILLANES e BARBERIS, 1994).
a b
- tampão fosfato
solvente orgânico
Figura 22: a) Desnaturação da enzima em meio orgânico
b) Efeito do poliol na estabilização da enzima
O rendimento em lignina oxidada foi maior que 90% para todos os
experimentos, mostrando-se que apenas uma pequena fração de lignina é
perdida como compostos de baixa massa molar.
As ligninas foram caracterizadas quanto à distribuição da massa molar.
Nas figuras 23 e 24 mostram-se os cromatogramas da eluição por exclusão
molar das ligninas oxidadas em presença de glicerol e polietilenoglicol,
respectivamente.
Nos cromatogramas pode-se observar que há uma fração que elui com
valores de Kd inferiores ao limite de exclusão do sistema de coluna (valores de
Kd <O). Entretanto, foi observado um padrão bimodal para a eluição das
ligninas obtidas após a oxidação enzimática
48
Os valores de massa molar média em massa (Mw ), massa molar média
em número ( Mn) e dispersidade (D) das ligninas entre Kd O e 1 são mostrados
na tabela 10.
Ê 0,16 e - o co N C'IS 'ü e CIS e o U) ..Q
~ ......... llt----+~~~--t-~~~-t------1 ... ~ -0,5 o 0,5
Kd
1,5
Figura 23: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
oxidada em presença de glicerol (lignina 9). Coluna Sephadex G-50
(57 x 1 ,8 cm) eluída com NaOH 0,5 M a 0,4 ml min".
Ê .s o co N CV 'ü E
<CV .a ... o Ili .a <
-0,5 o 1 1,5 0,5
Kd
Figura 24: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
oxidada em presença de polietilenoglicol (lignina 1 O). Coluna
Sephadex G-50 (57 x 1 ,8 cm) eluída com NaOH 0,5 M a 0,4 ml mín",
49
Tabela 1 O: Valores da massa molar média em massa ( Mw ), massa molar
média em número ( Mn) e dispersidade (D) das ligninas Acetosolv
oxidadas.
Amostra Mw (Da) Mn (Da) D
1 5175 3707 1,39 9 2419 314 7,70 10 3350 438 7,65
* 1 = lignina Acetosolv original 9= lignina Acetosolv oxidada com fenolase em presença de 02 e glicerol
1 O= lignina Acetosolv oxidada com fenol ase em presença de 02 e polietilenoglicol
Valores de Mw diferentes foram obtidos para as ligninas oxidadas, o
que depende das características da reação de oxidação. Ambas ligninas
apresentam valores de Mw menores que a lignina original, indicando uma
inibição das reações de polimerização que aumentariam a massa molar.
Ao relacionar as propriedades quelantes das ligninas com a massa
molar média em massa tem-se que a capacidade de retenção de Cu2+
aumentou com a diminuição da massa molar do poliol utilizado na
estabilização da enzima. Essa diminuição da massa molar das ligninas
Acetosolv oxidadas deve-se provavelmente à perda da agregação das
macromoléculas de lignina devido à diminuição da tensão superficial pela , presença do poliol.
IV.B.- Estudo da oxidação com base em um planejamento experimental
IV.B.1.-Estudo das reações de oxidação das ligninas Acetosolv e de
explosão a vapor conforme o planejamento fatorial fracionário 24-1
Para se determinar a influência das variáveis quantidade de enzima,
tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração de oxidante,
no rendimento da reação de oxidação, massa molar e poder quelante das
ligninas Acetosolv e de explosão a vapor, foram realizadas reações de
50
oxidação de acordo com um planejamento fatorial experimental 24-1 com ponto
central em triplicada. Nas tabelas 11 e 12 são apresentadas as respostas
obtidas para as ligninas oxidadas Acetosolv e de explosão a vapor,
respectivamente.
Tabela 11: Matriz de planejamento fatorial fracionário e respostas obtidas
(rendimento, massa molar e poder quelante) das reações de
oxidação da lignina Acetosolv com fenolase.
ensaio X1 X2 X3 Xi Rend. Massa Molar Poder de retenção de cu2•
(%) (Da) (mg cu" / g lignina)
1 96 1800 274 2 + + 83 2440 275 3 + + 91 1860 234 4 + + 80 1270 206 5 + + 86 1510 285 6 + + 79 1190 209 7 + + 73 1500 143 8 + + + + 92 1450 105
Pto ctrl(a) o o o o 86 2810 312 Pto ctrl(b) o o o o 84 3150 306 Pto ctrl(c) o o o o 78 3100 262
onde: X1, X2, ~. e Xt representam os valores codificados das variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração de oxidante, respectivamente.
51
Tabela 12: Matriz de planejamento fatorial fracionário e respostas obtidas
(rendimento, massa molar e poder quelante) das reações de
oxidação da lignina de explosão a vapor com fenolase.
ensaio X1 X2 X3 Xi Rend. Massa Molar Poder de retenção de Cu2 ..
(%) (Da) (mg Cu2 .. / g lignina)
1 87 4180 385 2 + + 80 3090 222 3 + + 83 4280 259 4 + + 65 3710 207 5 + + 83 3730 361 6 + + 87 3730 304 7 + + 77 3700 209 8 + + + + 78 3950 283
Pto ctrl(a) o o o o 81 3330 199 Pto ctrl(b) o o o o 84 2830 206 Pto ctrl(c) o o o o 84 3100 207
onde: X1, X2, ~. e ~ representam os valores codificados das variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração de oxidante, respectivamente.
Os rendimentos obtidos nas reações de oxidação das ligninas foram
elevados, maiores que 65%, mostrando-se que uma fração de lignina é
perdida como compostos de baixa massa molar solúveis na fase homogênea.
Através da análise estatística é possível observar os efeitos principais e
as respectivas interações das variáveis estudadas no rendimento de oxidação
da lignina Acetosolv. Essas respostas são mostradas na tabela 13.
O desvio padrão (e) foi estimado através das replicatas autênticas para
o ponto central ( efeitos mostrados na tabela 11) sendo igual a 4, 16. Segundo
BARROS NETO et ai. (1995), para um nível de 95 % de confiança, somente
são considerados significativos os efeitos cujos valores forem maiores que (t, x
o), onde t, é o valor do teste t para v graus de liberdade. Portanto, uma vez
que o valor do teste t para 2 graus de liberdade (t2) ao nível de 95 % de
confiança é 4,30265 (BARROS NETO et ai., 1995), pode-se concluir que
somente os efeitos maiores que 17, 90 são significativos. Dessa forma,
52
nenhuma das variáveis estudadas apresenta um efeito significativo no
rendimento das reações de oxidação, para um nível de 95 % de confiança.
Esse fato é devido aos altos rendimentos obtidos nas reações de oxidação.
Pelas respostas apresentadas anteriormente (tabela 11) não foi possível
obter um modelo linear para descrever o comportamento da região
experimental analisada.
Tabela 13: Efeitos das variáveis testadas no rendimento de oxidação da lignina
Acetosolv pela fenolase, calculados a partir dos dados mostrados
na tabela 11 .
variável efeito estimado
Média 84,36 ± 1,25
1 -3,0
2 -2,0
3 -5,0
4 6,0
12+34 7,0
13+24 9,0
14+23 2,0
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem respectivamente às variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração do oxidante.
Esse mesmo estudo foi realizado para a oxidação da lignina de
explosão a vapor. O cálculo dos efeitos principais e suas respectivas
interações foram estudadas. Essas respostas foram calculadas através dos
dados da tabela 12 e são mostrados na tabela 14.
53
Tabela 14: Efeitos das variáveis testadas no rendimento da oxidação da lignina
de explosão a vapor pela fenolase, calculados a partir dos dados
mostrados na tabela 12.
variável efeito estimado
Média 80,82 ± 0,52
1 -5,0
2 -8,5
3 2,5
4 2,0
12+34 -3,5
13+24 7,5
14+23 1,0
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem às variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração do oxidante, respectivamente.
O desvio padrão (o) foi estimado a partir das replicatas do ponto central
para os efeitos mostrados na tabela 12 e foi igual a 1, 73. O valor do teste t
para 2 graus de liberdade (t2) ao nível de 95% de confiança é 4,30265, pode-
se concluir que somente os efeitos, em módulo, maiores que 7,44 são
~ignificativos. Dessa forma, somente o efeito principal da variável de tempo de
reação é significativo ao nível de 95% de confiança. Além disso, a interação
entre as variáveis quantidade de enzima e concentração de estabilizante mais
a interação entre tempo de reação e concentração de oxidante, também é
importante. Essas duas últimas variáveis influem diretamente na quantidade de
enzima que encontra-se ativa, isso devido à manutenção de sua estrutura
quaternária.
Um modelo não linear utilizando-se um método de estimativa quasi-
Newton, foi ajustado aos dados da tabela 12, considerando-se as variáveis que
apresentaram efeitos no rendimento da reação de oxidação da lignina de
explosão a vapor. A equação 19 apresenta o modelo ajustado aos dados da
tabela 12.
54
y = (83,0 ± 1,38) + (-2,5 ± 0,84) X1 + (-4,25 ± 0,84) X2 + (-1,75 ± 0,84) X1 X2 +
(3,75 ± 0,84) X1 X3 + (-3,0 ± 1,61) X/ (eq.19)
onde: y = é o rendimento da reação de oxidação da lignina estimado, X1 = variável quantidade de enzima, X2 = variável tempo de reação,e ~ = concentração de estabilizante.
A tabela 15 apresenta a análise de variância para o modelo não linear
proposto na equação 19. Um modelo matemático é satisfatório para descrever
a superfície estudada quando ele apresenta alta regressão ao mesmo tempo
que a falta de ajuste não seja significativa, ao nível de confiança estipulado
(BARROS NETO et ai. (1995). Uma maneira para testar a regressão e a falta
de ajuste é através da comparação entre a MOR/ MOr e a MO fai I MO ep com o
valor do teste de Fisher para os mesmos números de graus de liberdade.
Assim, quanto maior for a diferença entre o valor de MOR I MOr e o valor do
teste F, com 95% de confiança, mais significativa é a regressão. Do mesmo
modo quanto menor o valor de MO fai I MO ep em relação ao teste F menor será
a falta de ajuste para o modelo. Portanto, pode-se observar na tabela 15 que o
valor da relação entre a média quadrática devido a regressão (MOR) e a média
quadrática dos resíduos (MOr) deixados pelo modelo (12,32) é maior que o ' valor limite para o teste F ao nível de 95% de confiança para o mesmo número
de graus de liberdade (Fs;s = 5,05). O valor da relação entre a média
quadrática da falta de ajuste (MO raj) e a média quadrática devido ao erro puro
(MO ep) é 2,50 e é muito menor que o valor limite para o teste F no nível de
95% de confiança (F3;2 = 19, 16). Esses valores mostram que a regressão
apresentada pelo modelo foi significativa e que não existe uma falta de ajuste.
Esses resultados, somados à porcentagem de variância explicada (86,03%)
indicam que o modelo não-linear proposto na equação 19 é adequado para
descrever a região experimental analisada.
55
Tabela 15: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados
experimentais mostrados na tabela 12.
fonte de soma graus de média Fcrítico com variação quadrática liberdade quadrática relação 95% de
(MQ) confiança
Regressão 351, 1364 5 70,23 12,32 5,05
resíduos 28,50 5 5,70
falta de ajuste 22,50 3 7,50 2,50 19,16
erro puro 6,0 2 3,00
total 408, 1364 10
% variação explicada 86,03%
% máx. variação explicável 98,53%
IV.8.2.- Influência das condições de reação na distribuição de massas
molares das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor
Foram obtidos cromatogramas de permeação em gel para cada lignina
oxidada obtida nos diferentes níveis das variáveis quantidade de enzima,
tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração do oxidante. A
análise desses cromatogramas mostra que de maneira geral todas as ligninas
obtidas apresentaram um perfil bimodal de distribuição de massas molares e
também composta por uma fração eluída no volume de exclusão, e outra
eluída dentro do volume de permeação da coluna cromatográfica. O estudo
dos cromatogramas mostra que as áreas dessas duas frações variam em
função do nível das variáveis testadas.
Devido à impossibilidade de se calcular a massa molar média das
frações eluídas no volume de exclusão da coluna, os cromatogramas foram
divididos em fração de alta massa molar, composta pelos fragmentos excluídos
pela coluna (área próxima a Kd igual a O), e fração de massa molar
intermediária, composta pelas moléculas eluídas no volume de permeação
(área com Kd de O a 1 ). Como exemplo são mostrados cromatogramas para a
56
lignina Acetosolv oxidada (ensaio 2 e tabela 11) e para lígnína de explosão a
vapor oxidada (ensaio 6 e tabela 12), figuras 25 e 26, respectivamente.
0,25
Ê s. e:, OQ N ftl 'ü e 2 .. o u, .e -e
1,5 -0,5 o 0,5
Kd
Figura 25: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina Acetosolv
ensaio 2 (+, - , - , +).
Ê .;. o ~ .. ü e ~ g !
-0,5 o 1,5
Figura 26: Cromatograma de eluição por exclusão molar da lignina de
explosão a vapor ensaio 6 ( + , - , + , -).
0,5 Kd
57
Um estudo estatístico foi realizado com respeito às massas molares
( Mw) obtidas em cada sistema, lignina Acetosolv e de explosão a vapor. Na
tabela 16 são mostrados os efeitos principais das variáveis estudadas e suas
interações para a lignina Acetosolv, calculadas a partir dos dados mostrados
na tabela 11 .
Tabela 16: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina Acetosolv
pela fenolase em relação às massas molares, calculados a partir
da tabela 11.
variável efeito estimado
média 2007 ± 55,35
1 -80
2 -215
3 -430
4 375
12+34 -240 •, _, -. ,....
13+24 -105
14+23 340
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem às variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração do oxidante, respectivamente.
O desvio padrão (o) foi estimado a partir das replicatas do ponto central
para os efeitos mostrados na tabela 15 e foi igual a 183,57. O valor do teste t
para 2 graus de liberdade (t2) ao nível de 95% de confiança é 4,30265 e pode-
sa concluir que somente os efeitos em módulo maiores a 789,84 são
significativos. Dessa forma, nenhuma das variáveis estudadas tem efeito de
forma significativa no valor de Mw das ligninas Acetosolv oxidadas, para um
nível de 95% de confiança, na região experimental analisada.
Para o estudo estatístico da Mw das ligninas de explosão a vapor
oxidadas, na tabela 17 são mostrados os efeitos principais das variáveis
analisadas e suas interações, calculadas a partir dos dados mostrados na
tabela 12.
58
Tabela 17: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina de explosão a
vapor oxidada pela fenolase em relação às massas molares,
calculados a partir dos dados mostrados na tabela 12.
variável efeito estimado
média 3062,72
1 -352,5
2 227,5
3 -37,5
4 -67,5
12+34 192,5
13+24 477,5
14+23 -132,5
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem as variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração de oxidante, respectivamente.
O desvio padrão (e) foi estimado a partir das replicatas do ponto central,
para os efeitos mostrados na tabela 17 e foi igual a 250,26. O valor do teste t
para 2 graus de liberdade (t2) ao nível de 95% de confiança é 4,30265 e pode-
se concluir que somente os efeitos em módulo maiores a 1076, 78 são
significativos. Dessa forma, nenhuma das variáveis estudadas tem efeito de
forma significativa no valor de Mw das ligninas de explosão a vapor oxidadas
para um nível de 95% de confiança, na região experimental analisada.
IV.8.3.-lnfluência das condições de reação de oxidação no poder de
retenção de Cu2+ pelas ligninas Acetosolv e de explosão a vapor
oxidadas
O poder de retenção de Cu2+ pelas ligninas Acetosolv e ligninas de
explosão a vapor oxidadas estão nas tabelas 11 e 12, respectivamente.
A capacidade quelante das ligninas oxidadas, tanto para as Acetosolv
como as de explosão a vapor, é dependente das condições da reação de
oxidação. Para as ligninas Acetosolv obtém-se um máximo de poder de
59
retenção de Cu2+ para as ligninas do ensaio 5 e do ponto central. Ligninas de
explosão a vapor apresentam um máximo no poder quelante para as ligninas
do ensaio 1 e do ensaio 5. Essas ligninas apresentariam uma alta quantidade
de grupos quelantes como carbonilas e hidroxilas, formando complexos com o
íon metálico Cu2+. Os volumes hidrodinâmicas apresentados pelos complexos
[lignina-Cu2+] na fase móvel do sistema cromatográfico para ambos tipos de
ligninas são iguais, pois o volume de exclusão de ambos complexos é idêntico,
pois são totalmente excluídos na coluna G-10.
Com o objetivo de se comparar os poderes de retenção de Cu2+ das
ligninas estudadas com quelantes mais simples, realizou-se um estudo do
poder quelante de Cu2+ apresentado pela hidroquinona e EDTA
( etilenodiaminatetracetato de sódio). Para a hidroquinona obteve-se uma
capacidade quelante de 129 mg de Cu2+/g de hidroquinona e para o EDTA de
240 mg de Cu2+/g de EDTA. Esses resultados estão dentro da região de
respostas obtidas para ambos os tipos de ligninas estudadas. Destaca-se que
o poder de quelação das ligninas do ensaio 5 para ambos os sistemas é
comparável ao valor apresentado pelo EDTA, que é um dos melhores agentes
quelantes de íons metálicos utilizados industrialmente.
No estudo da relação da complexação molar (mol de Cu2+/ mol de
quelante) tem-se que o EDTA apresenta o maior valor, devido ao seu alto
poder de retenção de íons Cu2+ (tabela 18). Cabe destacar que o sistema não
' se encontra em equilíbrio, propiciando-se a formação de complexos com um
íon Cu2+ e mais de uma molécula de EDT A A hidroquinona por apresentar os
grupos hidroxilas em posição para possui uma relação mol de Cu2+/ mol de
quelante muito baixa. Isso é devido à alta ionização da hidroquinona em pH
elevado. Tem-se então que, por átomo de cobre, existem 4 moléculas de
hidroquinona formando um complexo provavelmente quadrado planar. O
catecol apresenta um valor intermediário entre os dois agentes quelantes
mencionados anteriormente, devido ao fato deste possuir os grupos hidroxilas
em posição orlo, permitindo a formação de pontes de hidrogênio
intramolecular. Esse tipo de ligação é provavelmente mais forte que a ligação
com o íon metálico. As ligninas oxidadas apresentam um valor maior para a
relação mol de Cu2+ / mol de quelante que a hidroquinona e menor que o
60
EDTA, dependendo das condições de oxidação. Os valores apresentados são
estimados, pois para essa determinação utilizou-se a massa molar das
unidades Cs das ligninas originais determinadas em outros trabalhos. Cabe
destacar que pelos valores apresentados, as ligninas oxidadas podem ser
usadas como agentes quelantes de íons metálicos.
Tabela 18: Estudo da complexação molar (molde quelante/ molde Cu2+}.
Massa molar
Agente quelante mg de Cu2+ /g de quelante (g/mol) mol de quelante/ mol de Cu2+
Hidroquinona 129,10 110, 11 4,5
EDTA 239,92 372,24 0,7
Catecol 733,58 110, 11 0,8
Lig. Acetosolv
original 132,20 180 ª 2,7
Lig. Acetosolv
oxidada 104,85 - 311,57 180 b 1,1 - 3,3
Lig. de explosão
a vapor original 32,92 183 e 10
Lig. de explosão
a vapor oxidada 199,25 - 384,70 183 b 0,9-1,7
a) massa molar de uma unidade C9 da lignina Acetosolv (GONÇALVES, 1995) b) massa molar não determinada. Utilizou-se a massa molar de uma unidade Cg da lignina
original, só para efeito comparativo. e) massa molar de uma unidade Cg da lignina de explosão a vapor (SOUZA, 1994)
Para o estudo estatístico do planejamento experimental da lignina
Acetosolv, os cálculos dos efeitos principais das variáveis e suas respectivas
interações sobre o poder quelante foram realizados através dos dados
experimentais da tabela 11 e são mostrados na tabela 19.
61
Tabela 19: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina Acetosolv
pela fenolase em relação ao poder quelante, calculados a partir
dos dados mostrados na tabela 11 .
variável efeito estimado
média 237,36 ± 8,23
1 -35,25
2 -88,75
3 -61,75
4 16,75
12+34 2,25
13+24 -21,75
14+23 -34,25
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem às variáveis quantidade de enzima, tempo de reação, concentração de estabilizante e concentração do oxidante, respectivamente.
O desvio padrão (e) foi estimado a partir das replicatas do ponto central
e para os efeitos mostrados na tabela 18 foi igual a 27,30. O valor do teste t
para 2 graus de liberdade (t2) ao nível de 95% de confiança é 4,30265; pode-
se concluir que somente os efeitos em módulo maiores que 117,46 são
significativos. Dessa forma nenhuma das variáveis tem efeito significativo ao
nível de 95% de confiança, no poder de retenção de Cu2+ pelas ligninas
Acetosolv oxidadas, para um modelo linear.
Um modelo não linear utilizando-se um método de estimativa quasi-
Newton, foi ajustado aos dados da tabela 19, considerando algumas variáveis
que afetariam o poder de retenção de Cu2+ da lignina Acetosolv oxidada. A
equação 20 apresenta o modelo ajustado aos dados da tabela 18.
y = (293,33 ± 14, 16) + (-17,63 ± 8,67) X1 + (-44,38 ± 8,67) X2 + (-30,88 ± 8,67) N +(-17, 13 ± 8,67) X1 Xi+ (-76,96 ± 16,61) X/ (eq.20)
62
= é o poder de retenção de Cu2+ da lignina Acetosolv estimado, = variável quantidade de enzima, = variável tempo de reação, = concentração de estabilizante.e = concentração de oxidante.
A tabela 20 apresenta a análise de variância para o modelo não linear
proposto na equação 20. Observa-se na tabela 20 que o valor da relação entre
a média quadrática devido a regressão (MQR) e a média quadrática dos
resíduos (MOr) deixados pelo modelo (13,67) é maior que o valor limite para o
teste F ao nível de 95% de confiança para o mesmo número de graus de
liberdade (Fe.s = 5,05 ). O valor da relação entre a média quadrática da falta de
ajuste (MQ raj) e a média quadrática devido ao erro puro (MQ ep) é 0,68 e menor
que o valor limite para o tete F ao nível de 95% de confinça (F3;2 = 19, 16).
Esses valores mostram que a regressão apresentada pelo modelo foi
significativa e que não existe uma falta de ajuste. Esses resultados, somados à
porcentagem de variância explicada (87,24%) indicam que o modelo não linear
proposto na equação 20 é adequado para descrever a região experimental
analisada. Dessa forma as variáveis quantidade de enzima, tempo de reação,
concentração de estabilizante e as interações entre tempo de reação e
concentração de oxidante têm efeito significativo ao nível de 87,24% de
variância explicada e 96,84% de variância explicável, no poder de retenção de
Cu2+ pelas ligninas Acetosolv oxidadas.
O poder de retenção de Cu2+ pelas ligninas de explosão a vapor
oxidadas, e as variáveis estudadas são mostrados na tabela 12. Para o estudo
estatístico o cálculo dos efeitos principais destas variáveis e suas respectivas
interações foram realizados através dos dados da tabela 12 e são mostrados
na tabela 21.
63
Tabela 20: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados
experimentais mostrados na tabela 11 .
fonte de soma graus de média Fcrítico com
variação quadrática liberdade quadrática relação 95% de
(MQ) confiança
Regressão 41132,54 5 8226,51 13,67 5,05
resíduos 3008,04 5 601,60
falta de ajuste 1517,37 3 505,79 0,68 19, 16
erro puro 1490,67 2 745,33
total 47148,62 10
o/o variação explicada 87,24%
o/o máx. variação explicável 96,84%
Tabela 21: Efeitos das variáveis testadas na oxidação da lignina de explosão a
vapor pela fenolase em relação ao poder quelante, calculados a
partir dos dados mostrados na tabela 11.
variável efeito estimado
média 258,36 ± 1,31
1 -49,50
2 -78,50
3 21,00
4 5,00
12+34 60,30
13+24 58,00
14+23 -8,00
(*) 1, 2, 3 e 4 correspondem às variáveis quantidade de enzima, tempo de reação,
concentração de estabilizante e concentração do oxidante, respectivamente.
O desvio padrão (o) foi estimado a partir das replicatas do ponto central,
para os efeitos mostrados na tabela 21 e foi igual a 4,36. O valor do teste t
para 2 graus de liberdade (h) ao nível de 95% de confiança é 4,30265; pode-
64
se concluir que somente os efeitos em módulo maiores a 18, 76 são
significativos. Dessa forma as variáveis quantidade de enzima, tempo de
reação, concentração de estabilizante e as interações entre elas têm efeito
significativo ao nível de 95% de confiança, no poder de retenção de Cu2+ pelas
ligninas de explosão a vapor oxidadas.
Um modelo não linear utilizando-se um método de estimação quasi-
Newton, a equação 21 apresenta o modelo ajustado aos dados da tabela 21.
y = (204,00± 8,56) + (-24,75 ± 5,24) X1 + (-39,25 ± 5,24) X2 + (30,25 ± 5,24) X1X2
+(29,00 ± 5,24) X1 ~ + (74,75 ± 10,03) X/ (eq.21)
onde: y = é o poder de retenção de Cu2+ da lignina de explosão a vapor
estimado, = variável quantidade de enzima, = variável tempo de reação,e = concentração de estabilizante.
A tabela 22 apresenta a análise de variância para o modelo não linear
proposto na equação 21. Observa-se na tabela 22 que o valor da relação entre
a média quadrática devido a regressão (MQR) e a média quadrática dos
resíduos (MOr) deixados pelo modelo (39,59) é muito maior que o valor limite
, para o teste F ao nível de 95% de confiança para o mesmo número de graus
de liberdade (Fs.s = 5,05 ). O valor da relação entre a média quadrática da falta
de ajuste (MQ raj) e a média quadrática devido ao erro puro (MQ ep) é 18,60 e
menor que o valor limite para o tete F ao nível de 95% de confiança (F3 ;2 = 19, 16). Esses valores mostram que a regressão apresentada pelo modelo é
significativa e que não existem evidências claras de uma falta de ajuste. Esses
resultados, somados à porcentagem de variância explicada (95, 19%) indicam
que o modelo não linear proposto na equação 21 é adequado para descrever a
região experimental analisada.
65
Tabela 22: Tabela de ANOVA para análise de regressão dos dados
experimentais mostrados na tabela 12.
fonte de soma graus de média Fcrítico com variação quadrática liberdade quadrática relação 95% de
(MQ) confiança
Regressão 43464,49 5 8692,90 39,59 5,05 resíduos 1098,00 5 219,60
falta de ajuste 1060,00 3 353,33. 18,60 19, 16 erro puro 38,00 2 19,00
total 45660,49 10
o/o varação explicada 95,19% o/o máx. Varação explicável 99,92%
IV.B.4.-Espectroscopia no infravermelho
Os espectros de infravermelho das lignina Acetosolv e de explosão a
vapor, originais e oxidadas, apresentam as absorções típicas de ligninas do
tipo HGS (guaiacil-siringil-p-hidroxicumaril). Esse tipo de lignina apresenta
uma banda próxima a 1170 cm", atribuída a vibrações de C-0 em ésteres, que
não é definida em ligninas tipo G (guaiacil) e GS (guaiacil-siringil). Além disso,
. apresenta uma banda bem definida a 834 cm" atribuída a vibrações de C-H de
anéis aromáticos fora do plano e duas bandas de aproximadamente igual
intensidade a 1500 e 1600 cm". Os espectros somente apresentam diferenças
quanto à intensidade da absorbância. A atribuição das bandas é mostrada na
tabela 23 e foi feita de acordo com FAIX (1991 ).
66
Tabela 23: Atribuição das bandas apresentadas no infravermelho pelas
ligninas originais e oxidadas.
Número de onda Origem da banda
3429 a 3040 estiramento de OH
1703
deformação axial de C-H
deformação axial de C=O não conjugado
3030 a 2960
1690 e 1679
1599 e 1513
deformação axial de C=O conjugado
1463
1424
1381
1328
vibrações de C-C de anel aromático
deformação assimétrica de C-H
vibração de aromáticos
vibração de C-H alifático
vibração de anel siringil e anéis guaiacil condensados
1266 estiramento C-0 em anel do tipo guaiacil
1172 estiramento C-0 em éster conjugado
1032
947
deformação de C-H aromático
deformação de C=C fora do plano
Como exemplo mostram-se os espectros obtidos para as ligninas
Acetosolv original, Acetosolv ensaio 4, de explosão a vapor original e de
explosão a vapor ensaio 4 (figuras 27, 28, 29 e 30, respectivamente).
67
1,50 1,30 1, 10 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10
-0,10 -030 1--~r--~-r--~-,-~-r-~~~~~----r-~--,
' 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1 000 500 o número de onda (crrr')
Figura 27: Espectro de infravermelho da lignina Acetosolv original. Espectro
obtido a partir de pastilhas de KBr.
(U 'õ e ~ o 1/l .e (U
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
-0,20 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 O
Figura 28: Espectro de infravermelho da lignina Acetosolv oxidada ( ensaio 4:
+;+;-;-). Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr.
número de onda (crrr')
•
68
0,00
-0,20 r--.----.---,----,----,,-----,------,-----,
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 O
·~ 0,80 e ~ 0,60 o ~ 0.40 m
1,20
1,00
0,20
número de onda (crrr")
Figura 29: Espectro de infravermelho da lignina de explosão a vapor original.
Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr.
1,50 1,30 1,10 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10
-0,10 -0,30
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 O
número de onda (cm ')
Figura 30: Espectro de infravermelho da lignina de explosão a vapor oxidada
(ensaio 4: +;+;-;-). Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr.
Inicialmente foi feito o estudo da variação da absorbância em 1653 cm"
e 1716 crn', correspondentes à absorção de ligações C=O conjugadas e não
conjugadas, respectivamente. Os valores apresentados são relacionados à
absorbância em 1514 cm". Para a lignina Acetosolv (tabela 24) observa-se
69
que os valores obtidos com a triplicata da amostra original apresentam um
desvio padrão de 4,3 % e, portanto, não é possível uma comparação absoluta
com as ligninas oxidadas. Ao se realizar esse estudo para a lignina de
'explosão a vapor, observa-se que não houve tendência de aumento ou
diminuição das absorções das ligações C=O conjugadas ou não conjugadas,
região de 1680 a 1691 cm" (ver tabela 25).
Tabela 24: Absorbâncias relativas das bandas em 1653 e 1716 cm" para as
ligninas Acetosolv.
Amostra A1ss3 I A1s14 A111s/A1s14
fig. original (1) 0,4798 0,7791
lig. original (2) 0,4862 0,7689
lig. original (3) 0,4511 0,7662
lig. oxidada 1 (-; - ; - ; -) 0,3916 0,7414
lig. oxidada 2 (+ ; - ; - ; +) 0,4358 0,7502
lig. oxidada 3 (-; +; - ; +) 0,4264 0,7543
lig. oxidada 4 (+; +; - ; -) 0,4210 0,7444
lig. oxidada 5 (-; - ; +; +) 0,4465 0,7609
lig. oxidada 6 (+ ; - ; + ; -) 0,4554 0,7562
lig. oxidada 7 (-; + ; + ; -) 0,4519 0,7443
lig. oxidada 8 (+; +; +; +) 0,4678 0,7503
70
Tabela 25: Absorbâncias relativas das bandas em 1680 e 1691 cm" para as
ligninas de explosão a vapor.
Amostra A16ao I A1s14 A1591 I A1s14
lig. original (1) 0,5133 0,5594
lig. original (2) 0,5049 0,5238
lig. original (3) 0,4691 0,4947
lig. oxidada 1 (-; -; -; -) 0,5142 0,5578
lig. oxidada 2 (+ ; - ; - ; +) 0,4910 0,5352
lig. oxidada 3 (-; +; - ; +) 0,5082 0,5509
lig. oxidada 4 (+ ; + ; - ; -) 0,5019 0,5474
lig. oxidada 5 (-; - ; +; +) 0,5052 0,5387
lig. oxidada 6 (+ ; - ; + ; -) 0,4987 0,5368
lig. oxidada 7 (-; +; +; -) 0,4643 0,5131
lig. oxidada 8 (+ ; +; + ; +) 0,4811 0,5283
O tratamento de dados espectrais por análise de componentes
· principais é uma necessidade básica em espectros FTIR de ligninas, pois as
diferenças espectrais observadas são basicamente pequenas mudanças nas
intensidades de absorção de algumas bandas. Essas mudanças de
intensidade não podem ser analisadas de forma qualitativa e, através de
técnicas estatísticas de análise multivariada, pode-se obter equações
empíricas que relacionem dados de espectroscopia de FTIR com a quantidade
de grupos funcionais que mais variam nas ligninas oxidadas sob diferentes
condições.
A modelagem utilizando-se a técnica de PCA mostrou que apenas os
dois primeiros componentes principais explicam mais de 90 % da variância
total dos espectros para os dois conjuntos de ligninas estudados (lignina
71
Acetosolv e lignina de explosão a vapor), como é mostrado nas tabelas 26 e
27, respectivamente.
Tabela 26: Porcentagem da variância explicada por PCA nos espectros de
FTIR das ligninas Acetosolv.
Componente principal Variância(%)
1
2
3
4
5
71,0
20,0
3,9
2,5
0,2
Tabela 27: Porcentagem da variância explicada por PCA nos espectros de
FTIR das ligninas de explosão a vapor.
Componente principal Variância (%) - - 1 78,9
2 15,4
3 2,8
4 1,3
5 0,7
6 0,4
Após a redução no número de variáveis consideradas por PCA, os
valores de "score" calculados para cada componente principal foram
graficados. Através desses gráficos é possível agrupar as ligninas.
Para as ligninas Acetosolv pode-se observar na figura 31 que ao
graficar CP1 em função de CP2, a lignina Acetosolv original, grupo A
(amostras a, b e e), apresenta características espectroscópicas diferentes de
todas as ligninas Acetosolv oxidadas. As ligninas Acetosolv oxidadas podem
ser separadas em dois grupos (8 e C) que se diferenciam pela concentração
de estabilizante (tabela 11) utilizado na oxidação. O grupo B é formado pelas
72
ligninas oxidadas com uma variável 3 (concentração de estabilizante) no nível
(-) e as do grupo C pelas ligninas oxidadas com uma variável 3 no nível(+).
Na figura 32 apresenta-se o gráfico de CP 1 em função de CP3, e pode-
se observar também a possibilidade de se agrupar as amostras. O grupo A
(lignina Acetosolv original) apresenta características espectrais diferentes de
todas as ligninas oxidadas, e as ligninas oxidadas obtidas também apresentam
características diferentes entre si, separando-se em dois grupos B e C, agora
devido à variável 2 (tempo de reação). O grupo B é formado pelas ligninas
oxidadas com uma variável 2 nível(+) e o grupo C pelas ligninas oxidadas com
uma variável 2 nível (-). Esses resultados mostram que a concentração do
estabilizante e o tempo de reação são importantes na oxidação da lignina
Acetosolv e corroboram os resultados preliminares obtidos na análise de
variação de Mw . A quantidade de estabilizante determina a quantidade de
enzima ativa durante a reação de oxidação, e o tempo de oxidação determina
a extensão das reações de oxidação que ocorrem na lignina.
Na figura 33 (gráfico de CP1 e CP2 em função de CP3), observa-se a
separação conjunta das ligninas originais (a, b e e) das ligninas oxidadas, e a
separação entre as ligninas oxidadas devido à variável 3 utilizada na oxidação.
A variável 3 ( concentração de estabilizante) proporciona uma separação maior
que a variável 2 (tempo de reação). Isso é visto pela escala de CP2 o CP3 nas
. figuras 31 e 32, e de forma mais evidente na figura 33.
73
A
Figura 31: Gráfico de CP2 em função de CP1 para as ligninas Acetosolv
original (a, b e e) e oxidadas (ensaios 1 a 8).
-0,2
Figura 32: Gráfico de CP3 em função de CP1 para as ligninas Acetosolv
original (a, b e e) e oxidadas ( ensaios 1 a 8).
-0,6
CP3
A
-0,6 • b
-0,4
•e -0,2
74
Figura 33: Gráfico dos CP3 e CP2 em função de CP1 para as ligninas
Acetosolv original (a, b e c) e oxidadas ( ensaios 1 a 8).
A técnica de PCA também fornece como resposta os "loadings" (pesos)
dos componentes principais como uma função do comprimento de onda dos
espectros. Na figura 34 mostra-se o gráfico dos loadings de CP1 e CP2 em
função do comprimento de onda para as ligninas Acetosolv. Pode-se observar
que as maiores diferenças nos valores dos scores vem da região entre 1600 a
1700 cm", tanto para CP1 como para CP2. Essa região correspondente à
, absorbância das ligações C=O, corroborando a tendência observada no
estudo das absorções das bandas individuais (tabela 24 ).
75
0,20 CP2
0,15
0,10 e, .5 "C 0,05 a:s o ..J
0,00
-0,05
-0,10
número de onda (em")
Figura 34: Loadings de CP1 e CP2 dos espectros de FTIR em função do
comprimento de onda para as ligninas Acetosolv.
Para as ligninas de explosão a vapor pode-se observar na figura 35 que
ao se graficar CP3 em função de CP1 a lignina original, grupo A (amostras a, b
e e), apresenta características diferentes das ligninas oxidadas, e que essas
últimas são diferentes entre si, dependendo das condições de oxidação, mas
não podem ser agrupadas de forma definida. Na figura 36 (gráfico de PC 1 e
PC2 em função de PC3) é possível observar um resultado semelhante para
essas ligninas de explosão a vapor oxidadas.
76
CP3
0,15 1 A
6 •• 0,1 4 • 2
0,05 • CP1
-1,5 -0,5 -0,05 0,5
-0,1 • 7 -0,15 • 5
-0,2
-0,25 ·ª
Figura 35: Gráfico de CP3 em função de CP1 para as ligninas de explosão a
vapor original (a, b e c) e oxidadas ( ensaios 1 a 8).
o.t o
Figura 36: Gráfico de CP3 e CP2 em função de CP1 para as ligninas de
explosão a vapor original {a, b e c) e oxidadas (ensaios 1 a 8).
77
Para as ligninas de explosão a vapor, ao se graficar os loadings de CP1
e CP2 em função do comprimento de onda (figura 37), observa-se que o CP2
na região entre 1600 e 1700 cm" (C=O) apresenta maior contribuição na
diferenciação das ligninas. Observa-se também que o CP1 apresenta uma
maior contribuição na diferenciação das ligninas na região entre 1000 e 1200
cm", correspondente a ligações C-0.
0,20
0,15
Ili cn 0,10 .5 ,:, 1'11
.S? 0,05
-0,05
-0,10
número de onda (cm")
Figura 37: Loadings de CP1 e CP2 dos espectros de FTIR em função de
comprimento de onda para as ligninas de explosão a vapor.
IV.C.- Estudo das características químicas das ligninas Acetosolv e de
explosão a vapor
Realizou-se a caracterização química das ligninas Acetosolv e de
explosão a vapor originais e das ligninas do ensaio 5 do planejamento fatorial,
que apresentaram um maior poder de retenção de Cu2+. Os resultados obtidos
são mostrados na tabela 28.
78
Tabela 28: Análise dos grupos funcionais presentes na lignina Acetosolv
( ensaio 5) e lignina de explosão a vapor ( ensaio 5).
Grupos funcionais
Amostra % OHTatais % OHtenólicos % OHa1ifáticos % C=O % OCH3
Lig. Acetosolv 8,8 ± 0,2 1,75 ± 0,07 7,0 ± 0,3 4,3 ± 0,3 10,5 ± 0,6
original
Lig. Acetosolv 8,9 ± 0,8 1,53 ± 0,07 7,4 ± 0,8 5,7 ± 0,5 12,5 ± 0,2
ensaio 5
Lig. Expl. 12,2 ± 0,9
vapor original
Lig. Expl. 8, 1 ± 0,5
vapor ensaio 5
1,27 ± 0,04 10,9± 0,9 2,5 ± 0,7 12,8 ± 0,6
0,9 ± O, 1 7,2± 0,6 4,3 ± 0,5 9,26 ± 0,09
O conteúdo de hidroxilas fenólicas e hidroxilas totais encontrados em
lignina de gramíneas é de 1,7-1,9% e 11,9-12,8%, respectivamente (FAIX,
1992). A lignina de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor
apresenta para hidroxilas totais um valor igual a 12,2%, mas valores pouco
mais altos que a média foram obtidos para hidroxilas fenólicas (2,0%). O alto
teor de hidroxilas fenólicas encontrado na lignina de explosão a vapor foi
explicado pela clivagem das ligações éter ~-0-aril após o tratamento de
, explosão a vapor (SILVA, 1995). A lignina Acetosolv possui teores mais baixos
de OH em função, provavelmente, do método de obtenção (catálise com HCI)
que leva à condensação e formação de ligações etér entre as unidades
p-propilfenólicas. O valor de hidroxilas totais obtido para a lignina de explosão
a vapor do ensaio 5 foi de 8, 1 % e o valor de hidroxilas fenólicas foi de 0,9%,
sendo menor que o apresentado pela lignina original (1,27%). A diminuição
das hidroxilas totais e fenólicas nas ligninas oxidadas é devido à oxidação
enzimática da lignina no meio homogêneo composto de água:dioxano (3: 1 ).
Neste meio a enzima utilizada (fenolase) apresenta uma atividade cresolase e
catecolase levando à formação das respectivas quinonas, diminuindo o teor de
OH com aumento de carbonilas. Entretanto, é importante considerar que o teor
de hidroxilas fenólicas para compostos aromáticos, determinado pelo método
79
UV diferencial fornece valores inferiores àqueles obtidos por métodos
titulométricos. A título de exemplo, na figura 38 mostra-se o espectro de UV
diferencial para a lignina Acetosolv ensaio 5. Isso tem sido atribuído à
presença de hidroxilas fenólicas não ionizáveis em pH 13, as quais não são
detectadas pelo método UV diferencial (GOLDSCHIMID, 1977). Não foi
utilizado o método titulométrico pois há facilmente a formação de colóides da
lignina que se depositam na membrana do eletrodo. Cabe destacar-se que
esse erro torna-se pequeno à medida que passa o tempo, devido à
solubilização total dos colóides de lignina por aumento do pH. Mesmo assim,
esse erro é maior em comparação com o método UV diferencial. O método
titulométrico ainda é utilizado no laboratório a fim de se comparar os
resultados obtidos na determinação das hidroxilas aromáticas. Não foi possível
a determinação em função da quantidade insuficiente de amostras das ligninas
oxidadas, já que esse método consiste na titulação condutométrica da lignina
com hidróxido de lítio, sendo necessária uma quantidade total de lignina entre
200 e 300 mg.
1
0.8 (ti 0.6 ·c:s e: 0.4 <(ti .o ..... 0.2 o (/) .o <( o
-0.2 -0.4
225 275 325 375 Comprimento de onda (nm)
Figura 38: Espectro UV diferencial da lignina Acetosolv ensaio 5. Espectro
feito a partir de uma solução com 0,056 g L-1 em dioxano/água
50%.
80
Na análise dos grupos carbonilas das ligninas estudadas, observou-se
que para ambas ligninas oxidadas, lignina Acetosolv ensaio 5 e lignina de
explosão a vapor ensaio 5, tem-se um teor de carbonilas maior que as ligninas
originais. Para a lignina Acetosolv oxidada, o aumento foi de 36% em
comparação à original, e para a lignina oxidada de explosão a vapor foi de
72%, em comparação à original.
O aumento dos grupos carbonilas deve-se à ação de oxidação pela
fenolase sobre as ligninas, devido à atividade catalítica da enzima, cresolase e
catecolase, discutida anteriormente. O alto valor de grupos carbonilas é
refletido também no alto poder de retenção de íons Cu2+ apresentado por
essas ligninas oxidadas, confirmando os resultados obtidos. Como exemplo,
na figura 39 mostra-se a curva titulométrica da determinação do teor de
carbonila da lignina de explosão a vapor ensaio 5.
14 :-
::J' 12 E ~ 10 / N o ci , I 8 o <O 6
, z Q) -o Q) 4 E ::::, o 2 >
o o 5 10 15
Tempo (hrs)
Figura 39: Curva titulométrica da determinação do teor de carbonila da lignina
de explosão a vapor ensaio 5.
No estudo da porcentagem de grupos metoxilas nas ligninas Acetosolv,
obteve-se que a lignina oxidada do ensaio 5 apresenta 12,5% de metoxilas,
valor maior que o da lignina original (10,5%). Não há uma explicação clara
81
para esse fato, mas algumas hipóteses podem sem traçadas. Podem ocorrer
reações de hidrólise no momento de realizar-se a precipitação da lignina
Acetosolv em HCI O, 1 mol Lº1, após a reação de oxidação enzimática. Essas
reações de hidrólise aconteceriam nas unidades ésteres do ácido p-cumárico
das ligninas, formando-se macromoléculas de lignina de menor massa molar.
Desta forma, não existiria um aumento dos grupos metoxilas após a oxidação
enzimática, e sim que a lignina possui uma menor massa molar que leva a um
aumento da porcentagem desses grupos. Realmente, o valor de Mw para a
lignina do experimento 5 é menos de 30% do valor da lignina Acetosolv
original ( comparar tabelas 7 e 11 ). Outra evidência pode ser observada no
espectro de UV das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor original, onde
sob as mesmas concentrações tem-se uma absorbância a 310 nm de 0,748
para a lignina Acetosolv original, maior que a apresentada pela lignina de
explosão a vapor, que é de 0,572 para o mesmo comprimento de onda (Figura
40). Essa absorbância a 31 O nm deve-se à presença de a-carbonilas ou a-13
insaturações na estrutura dessas ligninas (FERNANDEZ et a/., 1990). Isso
indica que a lignina Acetosolv apresenta uma maior quantidade de unidades
ésteres do ácido p-cumárico que podem ser hidrolisados em comparação à
lignina de explosão a vapor.
82
--- Lig.Acet.orig. ---Lig.Stm.expl. orig. 0.8
Cll ·c3 0.6 e: <Cll .e .... o (/) 0.4 .e e:,::
0.2
o 250 275 300 325 375 350 400
Comprimento de onda (nm)
Figura 40: Espectro de UV da lignina Acetosolv e de explosão a vapor original.
Espectros feitos a partir de uma solução de 0,03 g L"1 em
dioxano/água 50%.
Para a lignina de explosão a vapor oxidada (ensaio 5) obteve-se uma
porcentagem de metoxilas de 9,26%. Esse valor é inferior ao valor obtido para
a lignina de explosão a vapor original (12,8%).
Dentre as enzimas oxidativas, além da fenolase, há outros tipos de
enzima que mostram a capacidade de catalisar a oxidação de compostos
fenólicos. Uma dessas é uma oxidorredutase denominada lacase que
necessita de oxigênio bimolecular para sua ativação (KARAM e NICELL,
1997). Essa enzima cria um radical na hidroxila fenólica, que é estabilizado por
deslocalização no anel aromático (ROY-ARCANO e ARCHIBALD, 1991). Essa
espécie, na presença de 02 ou H20, leva à formação de CH30H e da
correspondente quinona, o que pode levar a uma diminuição da quantidade de
metoxilas na lignina de explosão a vapor, após a oxidação enzimática. Esse
tipo de ação catalítica não tem sido relatado para a fenolase, não havendo
uma explicação plausível para a diminuição do porcentagem de metoxilas na
lignina de explosão a vapor ( ensaio 5). Pode-se postular que essa diminuição
83
poderia ser possível pela precipitação seletiva de macromoléculas de lignina
que contêm uma alta porcentagem de unidades guaiacil e p-hidroxicumaril,
após a oxidação enzimática.
84
V.- CONCLUSÕES
O desenvolvimento desse trabalho permitiu avaliar o poder de retenção
de íons Cu+2 apresentado por ligninas Acetosolv e de explosão a vapor
oxidadas pela fenolase. A oxidação com fenolase foi possível pela presença de
estruturas fenólicas na lignina, permitindo a ação da fenolase. Nas ligninas
oxidadas foram constatados aumentos na quantidade de grupos carbonilas e
hidroxilas, e estes produtos apresentaram uma alta interação com íons
metálicos Cu+2, formando complexos estáveis. Esse é um fato inovador, pois
tanto oxidantes inorgânicos como outras enzimas oxidativas não possuem
esse tipo de ação.
As conclusões pontuais geradas no trabalho são apresentadas a seguir:
- O método de cromatografia de permeação em gel, utilizado para a
quantificação de Cu+2 complexado à lignina, é adequado para os fins
propostos. Os resultados obtidos apresentam alta reprodutibilidade com desvio
padrão de 4%.
- A presença de poliol (glicerol ou polietilenoglicol) é fundamental para a
oxidação da lignina pela fenolase, nas condições experimentais estudadas. O
poliol tem um efeito estabilizante sobre a enzima, que permanece na forma
ativa por um período de tempo maior na presença da lignina. Em relação à
lignina Acetosolv original, as ligninas oxidadas em presença de
polietilenoglicol e glicerol apresentaram aumentos de 17% e 111 % na
capacidade de retenção de íons Cu2\ respectivamente.
- Os rendimentos obtidos nas reações de oxidação das ligninas Acetosolv e de
explosão a vapor foram altos, maiores que 65%, mostrando que uma fração
pequena de lignina é perdida como compostos de baixa massa molar, solúveis
na fase homogênea. No estudo estatístico do planejamento fatorial dos
experimentos de oxidação da lignina Acetosolv, observou-se que nenhuma das
85
variáveis estudadas apresentam um efeito significativo no rendimento das
reações de oxidação. Para a oxidação da lignina de explosão a vapor
observou-se que os efeitos da variável tempo de reação, além das interações
quantidade de enzima-tempo de reação e concentração de estabilizante -
concentração de oxidante, foram significativos ao nível de confiança de 95%
na região experimental estudada.
- No estudo da massa molar média das ligninas obtidas, mostra-se que, de
maneira geral, todas as ligninas obtidas apresentam um perfil bimodal de
distribuição de massas molares. O estudo estatístico do planejamento mostrou
que nenhuma das variáveis estudadas tem efeito significativo no valor da
massa molar média em massa, para ambas as ligninas, dentro da região
experimental analisada.
- No estudo do poder de retenção de íons Cu+2 apresentado por ligninas
Acetosolv e de explosão a vapor, tem-se que a capacidade quelante das
ligninas é dependente das condições de reação de oxidação. Para ambos os
sistemas obteve-se pelo menos uma das ligninas oxidadas com um poder de
retenção de íons Cu+2 comparável ao EDTA, um dos melhores agentes
quelantes utlizados industrialmente. Um modelo não linear foi proposto para
ambos sistemas a partir dos resultados do planejamento fatorial fracionário.
- O estudo dos espectros de infravermelho por análise dos componentes
principais, das ligninas Acetosolv e de explosão a vapor, permite classificar as
ligninas em diferentes grupos, de acordo com suas características
espectroscópicas.
- O teor de grupos hidroxilas totais e fenólicas, para as ligninas oxidadas
Acetosolv e de explosão a vapor, foi menor que o apresentado pelas ligninas
originais. O teor de carbonilas apresentado nas ligninas oxidadas foi maior em
ambos os sistemas comparados com as ligninas originais, devido à reação de
oxidação pela fenolase. O aumento das carbonilas nas ligninas leva a um
incremento do poder de retenção de íons Cu+2.
86
VI.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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