trabalho biologia molecular

7/21/2019 Trabalho Biologia Molecular

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1 INTRODUO

O estudo da biologia molecular hoje a principal fronteira com a evoluo da

Medicina. Diversas reas esto atualmente tendo seus conceitos modificados a partir

desta nova abordagem. Sendo o cncer uma doena resultante do acmulo de mutaes

genticas, adquiridas ou hereditrias, tem sido demonstrado que o comportamento

biolgico da neoplasia est relacionado expresso gnico tumoral, sendo, portanto um

tema de grande relevncia na avaliao prognstica desta doena. Tambm na rea da

infectologia, as ferramentas disponveis atravs da biologia molecular tm auxiliado

bastante no sentido de aumentar a acuidade diagnstica, alm de definir novas

interrelaes fisiopatolgicas. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007).

Desta forma, a pesquisa mdica encontra-se no momento comprometida de

forma intensa com a necessidade de estudar os aspectos da biologia molecular com o

objetivo de permitir o desenvolvimento de estratgias de preveno, diagnstico

precoce e tratamento de diversas doenas. Neste sentido, a repercusso dos trabalhos a

serem desenvolvidos por este grupo de pesquisa refere-se a uma contribuio ao esforo

atualmente realizado a nvel mundial, permitindo a definio dos aspectos de biologia

molecular dos observados em indivduos em Joinville e regio assim como sua

comparao com outras regies do Brasil e do mundo. (ANTONINI; MENEGHIN,

2004).

A biologia molecular est diretamente relacionada gentica e bioqumica e

consiste no estudo dos genes que transmitem as informaes de gerao em gerao.

Estas molculas so longos polmeros de cido desoxirribonuclico, ou simplesmente

DNA. Apenas quatro blocos qumicos de construo, guanina (G), adenina (A), timina

(T) e citosina (C), so colocados em uma ordem nica de cdigo para todos os genes em

todos os organismos vivos. (ROBERTIS; et al, 2006).

Os genes determinam os traos hereditrios, como a cor do cabelo ou dos nossos

olhos e at como ocorrem s reaes qumicas do nosso organismo. Eles fazem isso

fornecendo instrues sobre como cada atividade em cada clula do nosso corpo deve

ser realizada. (TORRES; AZEVEDO; FELIPE; ET AL, 2003).

Muitas doenas so causadas por mutaes ou alteraes na seqncia do DNA

de um gene (doenas monognicas) ou de vrios (doenas polignicas). Quando a


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informao codificada por uma alterao gentica, a protena resultante pode no

funcionar corretamente ou pode no ter sido formada. Em ambos os casos, as clulas

que contm alteraes genticas podem no funcionar conforme esperado.

Diagnstico pr-natal e pr-implantacional, predisposio gentica ao cncer,

investigao de doenas neurolgicas, diagnstico ou estagiamento de doenas e

pesquisa de agentes patognicos so algumas das muitas aplicabilidades da tcnica de

biologia molecular. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007).

O objetivo desse trabalho realizar uma breve reviso bibliogrfica sobre a

tcnica PCR, Captura Hbrida, Tecnica de Hibridao e tenologia do DNA

recombinante destacando os seus fundamentos e aplicao a sua utilizao ao

descobrimento de diversas doenas.


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2 DESENVOLVIMENTO

2.1 Reao da polimerase em cadeia (PCR)

PCR uma tcnica poderosa, que envolve a sntese enzimtica in vitro de

milhes de cpias de um segmento especfico de DNA na presena da enzima DNA

polimerase (figura 1). A reao de PCR se baseia no anelamento e extenso enzimtica

de um par de oligonucleotdeos (pequenas molculas de DNA de fita simples)

utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequncia de DNA de fita dupla

alvo da amplificao. (BOLLELA; SATO; FONSECA 1999).

FIGURA 1: Tcnica de PCR

Disponvel em: INSTITUTO SUPERIOR TCNICO, 2005.


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A replicao da molcula de DNA em grande escala e, de todas as tcnicas

moleculares, PCR considerada a mais desenvolvida. Diferentemente dos mtodos

imunolgicos, nos quais se identifica a doena por meio dos anticorpos dirigidos aos

microrganismos, os mtodos moleculares evidenciam a molcula do DNA na amostra

do paciente. Em muitos casos, porm, a deteco da molcula de DNA do

microrganismo na amostra clnica no indica, necessariamente, a confirmao da

enfermidade (TORRES; AZEVEDO; FELIPE; et al, 2003).

A reao em cadeia pela polimerase (PCR) rpida e eficaz, dependendo apenas

de mtodos de extrao do material gentico e para a retirada de substncias que possam

interferir na tcnica. (BOLLELA; SATO; FONSECA 1999).

2.1.1 Procedimento

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) um mtodo muito sensvel de

anlise e por isso realizado com muito cuidado para evitar contaminaes que possam

inviabilizar ou tornar errneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar

os mecanismos da replicao in vitro. Os cientistas ento simplificaram ao mximo o

processo de polimerizao das molculas. A maquinaria para separar as fitas sense e

anti-sense so muito complexas na clula, no lugar utiliza-se a mudana de temperatura.

Os ciclos so pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligao dos primers,

funcionamento da polimerase e iniciou de um novo ciclo. (MARANHO; AZEVEDO;

BRGIDO, ET AL, 2003).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura elevada de 94 a 96 C por pouco

tempo para que ocorra a separao da dupla cadeia de DNA (Desnaturao, quebra das

pontes de hidrognio). A amostra de DNA, a enzima que faz a replicao (DNA

polimerase), os nucleotdeos de DNA e os primers complementares a sequncia de

DNA so colocados em um tubo de ensaio. Na segunda etapa, a temperatura reduzida

entre 50 a 60 C dependendo da quantidade decitosina (C) eguanina (G) encontrada no

primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA

(anelamento). Coloca-se o tubo de ensaio em uma mquina de PCR (mquina que

aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Citosinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Guaninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Guaninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Citosina


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aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da mquina controlados pelo programa.

(SOUZA, 2003).

Posteriomente aquece-se o tubo a 94C para ocorrer a desnaturao, ou seja,

separar a dupla fita do DNA, a seguir cada fita do DNA que foi separado serve como

molde para a sntese de novas cadeias complementares Para que isso acontea, resfria-se

a 54C onde os primers se anelam ao incio das duas fitas simples, servindo de

iniciadores para a enzima polimerase. (ASSIS; LOPES; CARDOSO, et al, 2007).

Na ltima etapa do ciclo a temperatura elevada novamente a 72 C dentro do tubo

para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molcula (extenso), para a

duplicao da fita. A DNA polimerase inicia, aps o final do primer, a colocar osnucleotdeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim

uma nova fita dupla. em seguida um novo ciclo iniciado. Normalmente so realizados

de 25 a 40 ciclos para cada reao na qual a taxa de replicao exponencial. (

BOLLELA; SATO; FONSECA, 1999).

O resultado analisado atravs de umaeletroforese em gel deagarose ou

depoliacrilamida e depois interpretado com a ajuda de um profissional competente.

Geralmente um padro de peso molecular adicionado em uma das fileiras do gel,assim poder se avaliar o tamanho do fragmento amplificado. (SOUZA, 2003).

2.1.2 Eletroforese em gel

Consiste em uma tcnica analtica utilizada na anlise de macromolculas como

protenas ecidos nuclicos.Essa tcnica foi descoberta eempregadapela primeira vez

em 1937 por Arne Tislius um bioqumico russo. O efeito eletrofortico tem como base

a teoria de Debye-Hckel-Onsager, onde esta teoria dedissociao eletroltica aceita o

fato de as partculas carregadas moverem-se sob a influncia de foras eletrostticas

para um eletrodo de carga oposta quando aplicada umadiferena de potencial em uma

soluo contendo eletrlitos. (SOUZA, 2003).

A electroforese em gel uma das principais ferramentas de trabalho em Biologia

Molecular. Em geral, DNA, RNA e protenas podem ser separados segundo o seu

tamanho numa matriz usando um campo elctrico aplicado. Na electroforese em gel de

agarose, o DNA ou o RNA separado fazendo a amostra migrar atravs de um gel de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforesehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agarosehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamidahttp://www.infoescola.com/bioquimica/acidos-nucleicos/http://www.infoescola.com/bioquimica/eletroforese/http://www.infoescola.com/quimica/eletrolise/http://www.infoescola.com/eletricidade/diferenca-de-potencial/http://pt.wikipedia.org/wiki/Electroforese_em_gelhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Electroforese_em_gelhttp://www.infoescola.com/eletricidade/diferenca-de-potencial/http://www.infoescola.com/quimica/eletrolise/http://www.infoescola.com/bioquimica/eletroforese/http://www.infoescola.com/bioquimica/acidos-nucleicos/http://pt.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamidahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agarosehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese


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agarose. As protenas so normalmente separadas segundo o seu tamanho usando

electroforese em gel de acrilamida; tambm podem ser separadas segundo a sua carga

elctrica usando focagem isoelctrica, separa molculas com base em seu tamanho e carga

eltrica. Existem vrios tipos de eletroforese; mas para separar as molculas de DNA utilizada a

eletroforese em gel. Essa tcnica empregada para determinar o nmero, tamanho ou isolar os

fragmentos de DNA. (MARANHO; AZEVEDO; BRGIDO, et al, 2003).

O tipo de matriz que usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho

dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido diferena no

tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a

separao de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o

gel de poliacrilamida para separao de fragmentos pequenos, de at 1kb.

Alternativamente para a resoluo de fragmentos superiores a 1 kb pode-se utilizar a

agarose com baixo ponto de fuso (Low Melting) que um tipo de agarose derivada de

sntese orgnica. (MARANHO; AZEVEDO; BRGIDO, et al, 2003).

J o gel de agarose feito apenas atravs da mistura de um tampo e agarose,

no apresentando toxicidade. A polimerizao mais rpida e o gel pode ser reciclado

aps o uso, isto , pode ser reutilizado na elaborao de outros gis. Alm disso, a

eletroforese em gel de agarose pode ser usada como mtodo analtico ou preparativo,

isto , quando o fragmento de DNA recuperado e purificado a partir do gel. (DIAS,

FONSECA JUNIOR, RODRIGUES, et al, 2012)

A agarose, um polissacardeo extrado de uma alga marinha vermelha e formado

por resduos de D e L galactose unidos por ligaes glicosdicas (13) e (14),

um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. Por isso, para se preparar um gel

de agarose procede-se de modo similar a preparao de uma gelatina. (MARANHO;

AZEVEDO; BRGIDO, et al, 2003).

Dissolve-se uma quantidade em gramas do p de agarose, ajustando-se a

concentrao apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra, em

um dado volume de tampo de eltroforese. Os dois tipos de tampo mais utilizados so

TAE (Tris-acetato-EDTA) e TBE (Tris-borato-EDTA). Aquece-se a mistura em forno

microondas ou utilizando um bico de bunsen, at que a soluo fique homognea e

transparente. Aguarda-se a diminuio da temperatura at aproximadamente 50C e

verte-se em uma forma (um tipo de molde especfico para o preparo do gel). (SOUZA,

2003).


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Sobre a soluo ainda morna coloca-se um pente (uma tira de teflon denteada

que ficar a 1 mm acima do fundo da forma) que servir como molde para produzir

diversas cavidades (poos) no gel. Essas minsculas cavidades no chegam a atravessar

o gel e serviro como reservatrios onde as amostras de DNA sero aplicadas. Ao

esfriar e polimerizar, a agarose fica com o aspecto turvo e com resistncia diretamente

proporcional concentrao de agarose utilizada. (MARANHO; AZEVEDO;

BRGIDO, et al, 2003).

A seguir, a forma contendo o gel colocada no interior da cuba de eletroforese

horizontal (Figura 1). Na cuba o gel encontra-se entre fios de platina que atuam como

ctodo e nodo provocando a passagem de corrente eltrica gerada por uma fonte de

eletricidade. Adiciona-se o mesmo tampo usado para fundir a agarose em quantidade

suficiente para que o gel fique totalmente imerso tomando-se o cuidado para que o nvel

de tampo fique pelo menos 1 mm acima do gel. A seguir retira-se cuidadosamente o

pente. (SANTOS; et al, 2011).

FIGURA 2: Representao esquemtica dos equipamentos necessrios para a

realizao da eletroforese em sistema horizontal.

Fonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php

Antes da aplicao, as amostras de DNA devero ser misturadas a um tampo de

amostra. O tampo de amostra contm corantes e reagentes de alta densidade (sacarose,

glicerol ou ficol). Estes ltimos asseguram que a amostra de DNA entre no poo pela

fora da gravidade. J os corantes, azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a

aplicao da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento


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da corrida, j que apresentam velocidade conhecida durante a migrao na matriz em

direo ao plo positivo. (SOUZA, 2003).

Estes corantes podem ser adicionados simultaneamente no tampo de amostra,

ou utilizados individualmente, dependendo da disponibilidade e objetivo doexperimento. Mais rapidamente, como o Amarelo G, que acompanha para permitir uma

estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA de uma dada amostra

necessrio aplicar em um dos poos o marcador de massa molecular (ladder). Ele

permite inferir, por comparao, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra

analisada. (DIAS, FONSECA JUNIOR, RODRIGUES, et al, 2012)

Aps a aplicao das amostras, encaixa-se a tampa da cuba contendo os cabos

que permitiro a conexo entre a cuba e a fonte de corrente contnua. Os grupos de

molculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do

poo e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Aps a visualizao os

resultados geralmente so fotodocumentados. (SOUZA, 2003).

No caso de gis corados com brometo de etdio, as fotos devem ser adquiridas

sob luz ultravioleta. Para tal, utiliza-se filme Polaroid (branco e preto) ou um software

capaz de transformar em imagem a intensidade relativa de fluorescncia emitida pelas

bandas de DNA captadas por uma cmera fotogrfica digital. (MARANHO;

AZEVEDO; BRGIDO, et al, 2003).

Em alguns laboratrios, a fim de minimizar os potenciais efeitos danosos da luz

ultravioleta, o gel corado com brometo de etdio colocado dentro de uma cmara e a

luz U.V s ligada com a cmara fechada. Uma cmera acoplada registra a foto do gel.

(SOUZA, 2003).

Uma das anlises que pode ser feita por eletroforese em gel de agarose o

diagnstico da mutao que deu origem Anemia Falciforme. Esta mutao pontual no

gene da globina beta da hemoglobina. (SANTOS; et al, 2011).

2.1.3 Nested-PCR

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final, para

aumentar sensibilidade e eficincia da tcnica. Suas reaes requerem dois pares de

primers, um par mais externo para a 1a reao (round) e outro interno ao produto do


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1a reao. A 1a reao necessita de um maior tempo de extenso por causa do maior

tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alquota da

1areao, que servir como molde na mistura (mix) da 1areao. O produto da

1a reao normalmente no notado emcorrida em gel de agarose, por outro lado o

produto da 2a reao gerado em grande quantidade, por isso pode ser visualizado na

corrida eletrofortica ou utilizado parasequenciamento. (FERREIRA;

GRATTAPAGLIA, 1995).

2.1.4 RAPD( Random Amplified Polymorphic DNA)

Baseia-se na amplificao randmica do DNA, ou seja ao acaso, por um par deiniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, utilizando iniciadores

pequenos de seqncias arbitrrias, que detectam polimorfismos, mesmo na ausncia de

informaes da seqncia especfica de nucleotdeos do DNA alvo. (WELSH;

MCCLELAND, 1990).

Os marcadores de RAPD so extremamente apropriados para realizao de

mapas genticos, diferenciao de espcies animais e vegetais e para impresses de

DNA, com especial utilidade, tipagem do genoma de microrganismo, possibilitando sua

comparao entre isolados de amostras clinicas e nos estudos de gentica de

populaes. (WILLIAMS; KUBELIK; LIVAK; et al, 1990)

2.1.5 Real time PCR (PCR em tempo real)

PCR em tempo real compreende uma amplificao convencional de DNArepresentando um grande avano nos mtodos moleculares de auxilio diagnostico,

porm a deteco do resultado realizada dos ciclos atravs de marcadores, e reaalizar a

quantificao dos cidos nuclicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade,

porque determina valores durante a fase exponencial da reao. O ponto que detecta o

ciclo na qual a reao atinge o limiar da fase exponencial denominado de Cycle

Threshold (CT ). (WELSH; MCCLELAND, 1990).
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gelhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Sequenciamento_de_DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Sequenciamento_de_DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel


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Esse tipo de PCR requer utilizao de instrumentao que contm um

termociclador com sistema tico para a excitao da fluorescncia e na coleo da

emisso e um computador com um software para aquisio de dados e anlise final da

reao, A aplicao em diagnsticos, como a deteco de patgenos, ou doenas, torna-

se interessante uma vez que esta tcnica permite a quantificao e rapidez do resultado,

pois no mais requer a deteco em gel de eletroforese, necessrio na anlise da PCR.

(MAMONI; BLOTTA,2005).

2.2 Captura Hbrida

Conceitua-se como uma tcnica de diagnstico da presena do HPV atravs da

utilizao do DNA. Para realiz-la, o mdico deve obter material de colo ou vagina, no

caso da mulher, ou da uretra, no caso do homem, as infeces ocorrem em reas como

vulva, vagina, colo uterino, regio perianal e entre outras, Ambos devem ser obtidos

previamente no laboratrio que ir realizar o exame. (RODRIGUES; DALPICOLLI,

2009).

O diagnstico molecular da infeco pelo HPV importante para a triagem do

vrus e baseia-se, principalmente, em mtodos como: captura hbrida (CH),southernblot, hibridizao in situ, hibridizao em fase slida (microarrays) e reao em cadeia

da polimerase (PCR). Entre eles, a captura hbrida o mtodo molecular mais utilizado

em nosso meio para a deteco de HPV. Esta tcnica baseia-se na hibridizao de DNA,

fazendo uso de sondas especficas contra os tipos de HPV considerados de alto

risco.(TULIO; PEREIRA; NEVES, ET AL, 2007).

O teste molecular de captura hbrida para HPV capaz de detectar o DNA de 18

tipos virais que mais comumente infectam o trato anogenital (masculino e feminino), O

exame considerado como simples e no causa dor ao paciente, segue o mesmo padro

de outros exames ginecolgicos. (RODRIGUES; DALPICOLLI, 2009).

De acordo com o especialista, a eficcia deste mtodo consiste em detectar o

vrus antes mesmo dele significar a infeco propriamente dita, diferenciando a captura

hbrida em relao aos outros exames. O papanicolau ir diagnosticar a infeco por

HPV somente quando a clula manifestar alteraes, j na colposcopia preciso haver a


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infeco pelo vrus para que ele seja identificado, ou seja, o material para anlise,

colhido nestes exames, precisa estar doente e apresentar-se alterado, explica

Nicolau.(TULIO; PEREIRA; NEVES, ET AL, 2007).

2.3 Tcnica de Hibridao

A hibridao in situ por fluorescncia (FISH) foi descrita em 1988 por Pinkel

como adaptao do mtodo radioativo existente, tornando-o mais simples, rpido e

sensvel. Fundamentalmente assenta no mesmo princpio, ou seja, na hibridao de um

fragmento de DNA marcado com um fluorcromo, sua sequncia complementar

presente no DNA do tecido alvo. A visualizao deste sinal feita por microscopia de

fluorescncia. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003).

Os passos bsicos incluem o tratamento do tecido alvo, removendo restos

celulares e permeabilizando a amostra de forma a permitir a penetrao da sonda, por

exemplo, no ncleo da clula. Tanto a sonda como o DNA alvo so desnaturados

atravs de incubao a temperatura elevada em presena de formamida (agente

desnaturante). A sonda encontra-se em excesso, de forma a favorecer a cintica de

ligao ao DNA alvo. A hibridao conseguida pela incubao a 37C, e seguem-se

diversas lavagens para retirar a sonda em excesso, bem como a sonda que tenhahibridado de forma inespecfica em zonas no complementares. Nestas lavagens joga-se

a estabilidade dos hbridos formados face a diferentes condies de estringncia

(concentrao salina) e temperatura. (ROBERTIS; et al, 2006).

A deteco do sinal conseguida pela excitao do fluorcromo associado

sonda com luz ultravioleta e visualizao da preparao no microscpio de

fluorescncia. Entre os fluorocromos mais utilizados encontra-se o 5-tiocianato de

fluorescena (FITC), verde, ou a rodamina (TRITC) e o Texas Red, vermelho, enquanto

que o fundo azul obtido pela pintura cromossmica com diaminofenilindolo (DAPI).

(TORRES; AZEVEDO; FELIPE; ET AL, 2003).


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FIGURA 3: Esquema ilustrativo do processo de hibridao in situ por fluorescncia.

Fonte: BOTARI et al.(2006)

2.4 Tecnologia do DNA recombinante

A Tecnologia do DNA recombinante, e conceituado como um conjunto de

tcnicas, tem uma ampla aplicao. Essa tcnica pode ser usada para estudar

mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da sequencia de um

gene e consequentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de

culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina

humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes

quantidades. Sua aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial

inesgotvel. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003).

uma protena recombinante uma protena que derivada de DNA

recombinante. A tcnica do DNA recombinante foi proposta por Peter Lobban, um

estudante de graduao, com a. Dale Kaiser no departamento de Bioqumica da

Universidade de Stanford. A tcnica, em seguida, foi realizada por Lobban e Kaiser;

Jackson, Symons e Berg; e Stanley Norman Cohen, Chang, Herbert Boyer e Helling, em

19721974. (ROBERTIS; et al, 2006).

Como consequncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente

possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas

e infecciosas atravs da anlise de DNA. A tcnica central da metodologia do DNArecombinante a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao


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de molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo menos

dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de

inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se

chama de DNA recombinante. (ROBERTIS; et al, 2006).

Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula

hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A clula hospedeira

que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou

clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos

de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA

recombinante. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003).

2.4.1 Aplicaes Prticas em Geral

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia

nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de

restrio produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples.

Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e

homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se

a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os

fragmentos sero ligados permanentemente. Devemos introduzi-lo no material gentico

(no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrio do gene, em mRNA, e a

traduo em protena. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007).


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FIGURA 4: Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos

de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

Fonte:Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular Approach. 3d

ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA, p.110.

A figura acima demostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente

um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima

usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados

com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula

de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. (CARNEIRO;

JUQUEIRA, 2003).

Um plasmdeo uma pequena molcula circular que contm uma origem de

replicao (ori), gene que confere resistncia a um antibitico (no exemplo ampicilina,

Amp) e stio(s) de restrio (no exemplo, stio de restrio para a EcoRI), o qual pode

ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido ligado ao vector e os

plasmdeos recombinantes so transformados em bactrias, tais como aE. coli.As

bactrias so plaqueadas em meios contendo o antibitico para o qual o plasmdeo

confere resistncia, como forma de seleccionar as bactrias resistentes (ou seja,

transformadas). Desenvolvem-se ento colnias de bactrias com o plasmdeo

recombinante. (CANDEIAS, 1991).

Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria atravs de

transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo.

Geralmente, antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar

somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta

finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico). (GOEDDEL, 1979).

O desenvolvimento desta nova tecnologia s foi possvel pela descoberta, das

enzimas ou endonucleases de restrio. Este tipo de enzima atua como uma espcie de

"tesoura biolgica" que, aps reconhecer determinada seqncia nucleotdica, faz corte

bifilamentar na ligao acar-fosfato da molcula de DNA, produzindo fragmentos.

Elas so produzidas naturalmente por bactrias como forma de defesa contra infeco

viral, onde clivam em diversos fragmentos o material gentico dos vrus, impedindo sua


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reproduo na clula bacteriana. Portanto, a bactria protege seu prprio DNA dessa

degradao, modificando sua sequencia de reconhecimento. (CANDEIAS, 1991).

So em grande nmero os objetivos prticos da pesquisa biolgica, desde a

satisfao da curiosidade humana sobre a natureza da vida, at ao controle e eliminaode doenas humanas, de outros animais e de plantas, enfim, a melhoria da qualidade de

vida. Com as diversas tcnicas de DNAr vai-se tornando mais rpido e eficiente o

atendimento queles objetivos. Mesmo desconhecendo, ainda, os limites das

possibilidades da aplicao prtica da engenharia gentica, no resta dvida de que

passamos a dispor de tecnologia altamente promissora para a soluo de problemas de

natureza variada. (GOEDDEL, 1979).


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3 CONCLUSO

As tcnicas de biologia molecular possibilitam a identificao da expresso de

genes e/ou protenas. Cada uma das tcnicas de biologia molecular citadas

anteriormente, utilizadas isoladamente ou em associao, fornece uma srie de

resultados relevantes para a compreenso de varias patologias. De posse dessas

informaes acerca de quanto mais cedo uma doena for detectada, maior ser a

probabilidade de instituir o tratamento adequado. alguns casos, um diagnstico tardio

pode tornar completamente irreversvel o curso da doena.


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REFERNCIAS

ANTONINI, Sandra Regina Ceccato; MENEGHIN, Silvana Perissatto; Urashima,

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trabalho biologia molecular

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