BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR

Aula 7Aula 7

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIAVETERINÁRIA

DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVADEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA

REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA

O DNA é REPLICADO POR POLIMERASES,QUE SEGUEM INTRUÇÕES de UM MOLDE

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi

1. Os precursores ativados (dATP, dTTP, dGTP dCTP), devem estar presentes. Mg++ também.

2. DNA polimerase adiciona dNTPs à extremidade3'- OH da cadeia pré-existente.

3. DNA template (molde) é essencial (SS, DS DNA)

ATCGTCCGTAAGTTCGCGCTAAGGTTAGCAGGCAT

DNA polimerases:DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA enzimas que sintetizam DNA

- Replicação do genoma: - Replicação do genoma: REPLICASESREPLICASES

- Outras: - Outras: REPAROREPARO e funções auxiliares na replicação e funções auxiliares na replicação

- Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III)- Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III)

-Eucariotas: 5 polimerases (Eucariotas: 5 polimerases (, ß, , ß, , , , , ) )

- Mas, apenas Mas, apenas UMA é a replicaseUMA é a replicase

PROPRIEDADES das DNA polPROPRIEDADES das DNA pol

- - Sintetizam Sintetizam DNADNA a partir de moldes a partir de moldes DNADNA

- Necessitam de - Necessitam de PRIMERPRIMER

- Mecanismo de síntese é similar- Mecanismo de síntese é similar

- Síntese na direção Síntese na direção 5’ > 3’5’ > 3’

- Alta fidelidadeAlta fidelidade

- Atividade proofreadingAtividade proofreading

PolimerizaçãoPolimerização

Mecanismo de PolimerizaçãoMecanismo de Polimerização

A REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVAA REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVA

A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONALA REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL

A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUAA REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA

...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC

...5’- TACGATCGATCGATCG

ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC

ATCGATAG

TAGCTATC

5’-UACGAUCGATCGATCG

A Síntese de uma das cadeias é A Síntese de uma das cadeias é CONTÍNUACONTÍNUA

LEADING strandLEADING strand

E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????

...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC

...5’- TACGATCGATCGATCG

ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC

ATCGATAG

TAGCTATC

5’-UACGAUCGATCGATCG

A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’

...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC

...5’- TACGATCGATCGATCG

ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC

ATCGATAG

TAGCTATC

5’-UACGAUCGAUCGATCG

A Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUAA Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUA

LAGGING strandLAGGING strand

AUCGAUAC

...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC

...5’- TACGATCGATCGATCG

ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC

ATCGATAG

TAGCTATC

Síntese da LEADING strand Síntese da LEADING strand

UMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃOUMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃO

UACGAUCGAU

...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC

...5’- TACGATCGATCGATCG

ATCGATCGAT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTA

ATCGATAG

TAGCTATC

Síntese da LAGGING strandSíntese da LAGGING strand

UAGCUAGC

-Vários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃOVários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃO

- Remoção dos PRIMERsRemoção dos PRIMERs

- Ligação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKILigação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKI

ATCGTTTCGCGTCTATCTGCTGCTGCTCTTATATCGATAG

TAGCTATCTAGCTATC

ATCTAG

UAGCUAG

REPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUAREPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUA (O filme)(O filme)

REPLICAÇÃO EM PROCARIOTASREPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS

DNA POLIMERASES em DNA POLIMERASES em E.coliE.coli

- DNA pol I – DNA pol I – REPAROREPARO (tbém auxiliar na (tbém auxiliar na ReplicaçãoReplicação))

- DNA pol II - DNA pol II - REPAROREPARO

- DNA pol III – DNA pol III – É A REPLICASEÉ A REPLICASE!!!!!!!!

- Apenas a Apenas a I e III são ESSENCIAISI e III são ESSENCIAIS

PROPRIEDADES DAS DNA pol de PROPRIEDADES DAS DNA pol de E.coliE.coli

II IIII IIIIII

-Polimerização 5’>3’Polimerização 5’>3’ ++ ++ ++

-Atividade exonucleaseAtividade exonuclease-3’>5’3’>5’ ++ ++ ++

-5’>3’5’>3’ ++ -- --

-Taxa de síntese por segTaxa de síntese por seg 600600 ,, 30.00030.000

-Moléculas por célulaMoléculas por célula 400400 ,, 10-2010-20

“PROOFREADING”

(3’ > 5’ EXONUCLEASE)

DNA pol I (DNA pol I (E.coliE.coli))

Primeira DNA pol caracterizada

Polipeptídeo único: 104 kDa

Clivagem gera dois produtos: 68kDa e 35 kDa

Klenow fragment (68kDa): polimerase, exo 3’ > 5’

Fragmento de 35kDa: atividade 5’ > 3’ exonuclease

Capaz de iniciar a síntese em “NICKs”(única)

Funções – -Reparo (Nick translation)

-Termina a síntese da “lagging strand”

NICK TRANSLATIONNICK TRANSLATION

DNA pol III (Replicase de DNA pol III (Replicase de E.coliE.coli))

Complexo enzimático (várias subunidades)Complexo enzimático (várias subunidades)

Atividade polimerase e 3’ > 5’ exonucleaseAtividade polimerase e 3’ > 5’ exonuclease

Síntese da Síntese da leading e lagging strandsleading e lagging strands

Fidelidade: 10Fidelidade: 10-8-8 - 10 - 10-10 -10 (1 erro/genoma/1000 ciclos)(1 erro/genoma/1000 ciclos)

Proofreading-Proofreading- aumenta fidelidade 10 a 200 vezes aumenta fidelidade 10 a 200 vezes

Síntese: 800 a 1000 nt/sSíntese: 800 a 1000 nt/s

ETAPAS da REPLICAÇÃOETAPAS da REPLICAÇÃO

1. INICIAÇÃO 1. INICIAÇÃO

PrimossomaPrimossoma

2. ELONGAÇÃO 2. ELONGAÇÃO

ReplissomaReplissoma

3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO

REPLICON: A UNIDADE DE REPLICAÇÃO

Inicia na ORIGEM - termina no TERminador

BACTÉRIAS: um ÚNICO REPLICON (4.000 kb)

REPLICAÇÃO: 46’

ORI: 245 bp

Contém 3 (13bp repeats), 4 (9bp repeats)

Sítios p/ ligação da proteína DnaA

ORIgem em E.coli -245 bpORIgem em E.coli -245 bp

-Três 13mer repeatsTrês 13mer repeats

- Quatro 9mer repeatsQuatro 9mer repeats

Pré-INICIAÇÃO em E.coliPré-INICIAÇÃO em E.coli

-DnaA liga-se nos 9merDnaA liga-se nos 9mer

- Multimerização da DnaAMultimerização da DnaAForma agregados e flexionamForma agregados e flexionamO DNAO DNA

Separação das cadeiasSeparação das cadeiasInicia nos 13mersInicia nos 13mers

-DnaB+DnaC juntam-seDnaB+DnaC juntam-seAo complexo e formam oAo complexo e formam oComplexo de iniciaçãoComplexo de iniciação

-DnaB – helicaseDnaB – helicase-DnaC- liga-se na DnaBDnaC- liga-se na DnaB

FUNÇÕES NO REPLICATION FORKFUNÇÕES NO REPLICATION FORK

FunçãoFunção E.coliE.coli

HelicaseHelicase DnaBDnaB

PrimasePrimase DnaGDnaG

ClampClamp subunit subunit

CatáliseCatálise Pol IIIPol III

Remoção do PrimerRemoção do PrimerE substituição por DNAE substituição por DNA Pol IPol I

Ligação dos OkazakiLigação dos Okazaki LigaseLigase

Helicase

Primase

DNApol III

SSB

DNApol I

REPLICAÇÃO EM EUCARIOTASREPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS

EUCARIOTASEUCARIOTAS

Múltiplos REPLICONSMúltiplos REPLICONS

YEAST (40kb), mamíferos (100kb)YEAST (40kb), mamíferos (100kb)

ORI? Terminador?ORI? Terminador?

Iniciam na fase S Iniciam na fase S

Síntese (2000bp/min x 50.000/min em Síntese (2000bp/min x 50.000/min em E.coliE.coli))

Síntese não é simultâneaSíntese não é simultânea

Replicação completa em 6 horasReplicação completa em 6 horas

DNA pol de EUCARIOTASDNA pol de EUCARIOTAS

Pol Pol - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg

Pol Pol - Reparo - Reparo

Pol Pol - Replicase (Ld & Lg) - Replicase (Ld & Lg)

Pol Pol - Replicação do DNA mitocondrial - Replicação do DNA mitocondrial

Pol Pol - Reparo - Reparo

PROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTASPROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTAS

-Polimerização 5’>3’Polimerização 5’>3’ ++ ++ ++ ++ ++

-Atividade exo 3’>5’Atividade exo 3’>5’ -- -- ++ ++ ++

-Atividade PRIMASE -Atividade PRIMASE ++ -- -- -- --

- Localização- Localização NN NN MM NN NN

FUNÇÕES NO REPLICATION FORKFUNÇÕES NO REPLICATION FORK

FunçãoFunção E.coliE.coli Hela cellsHela cells

HelicaseHelicase DnaBDnaB ??

PrimasePrimase DnaGDnaG Pol alfa/primasePol alfa/primase

ClampClamp subunit subunit PCNAPCNA

CatáliseCatálise Pol IIIPol III Pol Pol

Remoção do PrimerRemoção do Primer Pol IPol I MF1MF1

Ligação dos OkazakiLigação dos Okazaki LigaseLigase Ligase ILigase I

As DNA pol PRECISAM de Primer!!!!As DNA pol PRECISAM de Primer!!!!

PRIMERS utilizados pelas DNA PolPRIMERS utilizados pelas DNA Pol

Primer de RNA (replicação procariotas/eucariotas)

O próprio DNA-OH (reparo, alguns vírus)

Proteína (alguns vírus)

Primer de RNAPrimer de RNA(replicação Euc + Proc)(replicação Euc + Proc)

Primer de DNAPrimer de DNANick + parvovírusNick + parvovírus

Proteína -0H - AdenovírusProteína -0H - Adenovírus

MUTAÇÕES (definição)MUTAÇÕES (definição)

Origem:Origem:

1.1. Erros da Polimerase durante a REPLICAÇÃOErros da Polimerase durante a REPLICAÇÃO

2.2. Erros da Polimerase durante o REPAROErros da Polimerase durante o REPARO

3. Lesões (cross-link) durante a interfase3. Lesões (cross-link) durante a interfase

Mutações em ponto, deleções e inserçõesMutações em ponto, deleções e inserções

Podem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do localPodem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do local

Em células somáticas: podem levar a neoplasias!Em células somáticas: podem levar a neoplasias!

MUTAÇÕES EM PONTO:MUTAÇÕES EM PONTO:

1.1. De acordo com a troca de base:De acordo com a troca de base:Transições ou TransversõesTransições ou Transversões

2. De acordo com o efeito:2. De acordo com o efeito:- Silenciosa (mesmo a.a) - Silenciosa (mesmo a.a) - “Missense” (a.a. diferente)- “Missense” (a.a. diferente)- “Nonsense” (stop codon)- “Nonsense” (stop codon)

Não altera a fase de leituraNão altera a fase de leitura2. Inserção2. Inserção

3. Deleção3. Deleção

Alteram a fase de leitura (frameshift)Alteram a fase de leitura (frameshift)

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