• Métodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos:

estudo das estruturas e processos celulares;

• Microscopias de luz (ML) e eletrônica (ME) – permitem o

reconhecimento da célula como um componente dinâmico e

participante do metabolismo corporal;

• Ferramentas utilizadas:

• lâminas com colorações histológicas e histoquímicas -

ML;

• Telas de cobre contrastadas por metais pesados - ME

(de transmissão, de varredura, etc.)

Técnicas de preparação e estudo de

lâminas citológicas

Técnicas de preparação e estudo de

lâminas citológicas

Microscópio de Luz e Microscópio Eletrônico de

Transmissão

Unidades de medida usadas:

O aumento total do objeto observado é calculado

multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular.

Portanto:

Preparo de lâminas ----- líquidos de montagem;

Geralmente contêm elementos ou substâncias que conferem

as propriedades de:

- Colorir esporos e outras estruturas do patógeno e/ou células

e estruturas do tecido do hospedeiro = melhor clareza na

visualização ao microscópio.

- Fixar a peça ou estrutura a ser observada.

- Impedir o dessecamento da preparação e preservar

integridade estrutural, por tempo mais ou menos longo.

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Preparação Tecidual

1. Coleta do tecido

do animal

2. Corte do tecido

em pedaços 3. Fixação

4. Desidratação

5. Inclusão

a.em parafina para

Microscopia Óptica (MO).

b. em resinas para

Microscopia Eletrônica de

Transmissão (MET). 6. Obtenção de cortes

a.com navalha metálica para MO.

b. com lâmina de vidro ou de

diamante para MET.

7. Montagem

a. em lâminas de vidro para MO.

b. em grades metálicas para MET.

Técnicas de Preparação de Lâminas Preparação do material que se deseja observar à microscopia =

etapas de confecção:

1º - Coleta do Material

-Partes dos órgãos ou tecidos são retiradas – bisturi, pinça ou

lâmina de barbear – extremamente finos (máx. 4 mm)

2º - Fixação

• objetivo: insolubilizar as proteínas dos tecidos;

• procedimentos físicos (congelamento) ou químicos (+

utilizados)

• agentes fixadores + comuns:

• formol 10%

• líquido de Bouin: formaldeído, ácido acético, ácido

pícrico)

• ambos fixam as proteínas evitando sua degradação

1. Coleta do espécime

2. Fixação:

• Evita a destruição das células por suas próprias enzimas, ou por bactérias.

• Insolubiliza as proteínas dos tecidos.

• Formaldeído 4-10% em solução tamponada (pH 7,4).

2. Fixação:

• Fragmentos com 5 mm

de espessura

• Tempo de fixação

variável dependendo do

tamanho do fragmento

e do fixador.

Técnicas de Preparação de Lâminas

3º - Processamento

• objetivo: preparar o material para ser analisado em microscópio

ótico.

• etapas rigorosamente seqüenciais e obrigatórias, na grande maioria

das técnicas, e uma etapa mal executada acarretará em material de

má qualidade para análise.

3.1 - Desidratação

• Objetivo: retirada de água da peça --- substâncias inclusoras são

insolúveis em água;

• Utilização de alcoóis etílicos graduados em tempos adequados: • (70 - 80 - 90 - 100%) - evitar a retração pronunciada do tecido

ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O

volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.

• 2 min em cada graduação.

3. Desidratação

• Tem como

finalidade retirar

água dos tecidos.

• Consiste em

banhos de

concentrações

crescentes de

etanol: 70%, 80%,

90%, 2x 100%.

4. Diafanização ou Clareamento • Objetivo: retirada do álcool da

peça (as substâncias

inclusoras dissolvem-se mal

no álcool) --- torná-la

transparente;

• O etanol é substituído por um

líquido miscível com o meio

de inclusão (xilol).

• Os tecidos embebidos em

xilol tornam-se translúcidos,

razão porque essa etapa é

denominada diafanização ou

clareamento.

• 3.3 - Inclusão (Impregnação)

• Objetivo: eliminar completamente o xilol contido no material e a total

penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes

existentes no tecido.

• preparar o material para os cortes, removendo o clarificante (xilol) e

endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada

para que possa ser cortado.

• Procedimento para Inclusão

– Tecido: passado em duas trocas de parafina para assegurar a

substituição de todo o agente clarificador pela parafina;

– Parafina: temperatura de 56 a 60º C (parafina fundida) --- bloco de

tecido: imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo

necessário para a completa impregnação.

– Blocos retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente ---

parafina endureça;

– Bloco de parafina com o tecido: retirado da fôrma e conduzido ao

corte.

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5. Inclusão ou Impregnação:

• Estufa a 60ºC:

parafina ocupa os

espaços antes

ocupados pelo xilol.

• Obtenção dos blocos

de parafina.

4º - Microtomia

• obtenção de cortes de material incluído em parafina o mais

delgado possível --- observação aos microscópios óticos;

• Utiliza-se o micrótomo: aparelho cuja regulagem medida em

micrômetros (MO) --- obtenção do corte na espessura desejada;

• duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a

cortar) e a navalha;

• espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6

micrômetros

• Após esta etapa = cortes coletados em lâminas de vidro.

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6. Microtomia:

• Cortes de 5 m de

espessura.

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Micrótomo

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Cortes Histológicos

5º - Colagem do Corte à Lâmina

• Na superfície de uma lâmina --- um ponto de aderência

(normalmente com albumina de ovo) --- corte parafinado se

adere;

• Antes --- corte colocado em banho-maria --- dobras provocadas

pelo corte no tecido desapareçam

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Cortes em Banho-Maria:

• Colocação dos

cortes em

lâminas de

vidro.

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Lâmina contendo cortes sem

coloração:

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7. Coloração:

• Coloração rotineira H-E.

• Hematoxilina (básica).

• Eosina (ácida).

• Núcleo é ácido e o citoplasma relativamente básico.

• Hidratação, Coloração, Desidratação e Clarificação.

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Colorações

• Corantes que diferenciam ácidos de bases.

- formam ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.

• Corantes que diferenciam componentes

fibrosos da matriz extracelular.

• Sais metálicos que precipitam nos tecidos

formando depósitos de metal (ex: tecido

nervoso).

As colorações foram desenvolvidas para visualizar componentes das células e dos tecidos que na maioria são incolores

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Colorações

• Baseadas no princípio ácido-base

– A hematoxilina é uma base, cora

componentes ácidos da célula em uma cor

azulada – núcleo (DNA e RNA)

– A eosina é um ácido que cora

componentes básicos (proteínas

citoplasmáticas) da célula em róseo.

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Reação e corantes histológicos comuns

REAGENTES

RESULTADOS

Hematoxilina (base) Azul: núcleo; regiões ácidas do citoplasma:

matriz da cartilagem.

Eosina (ácido) Rosa: regiões básicas do citoplasma; fibras de

colágeno.

Tricrômico de Masson Azul-escuro: núcleos.

Vermelho: músculo; queratina; citoplasma.

Azul-claro: mucinógeno, colágeno.

Orceína, corante para fibras elásticas Castanho: fibras elásticas.

Weigert, corante para fibras elásticas Azul: fibras elásticas.

Coloração com prata Preto: fibras reticulares.

Hematoxilina férrica Preto: estrias dos músculos, núcleos e hemácias.

Ácido periódico de Schiff Magenta: glicogênio e moléculas ricas em

carboidratos.

Corantes Wright e Giemsa Usados para a coloração diferencial das células

do sangue.

Rosa: hemácias, grânulos dos eosinófilos.

Púrpura: núcleos dos leucócitos, grânulos dos

basófilos.

Azul: citoplasma dos monócitos e linfócitos.

C O L O R A Ç Õ E S

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Hematoxilina-Eosina

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Tricrômico de Masson

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Resorcina-Fucsina de Weigert

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8. Montagem:

• Uso de lamínulas.

• Meio de montagem:

resinas (Entellan) ou

bálsamo do Canadá.

7º - Montagem

• Após corte corado ---- novamente desidratado (a retirada da água

objetiva aumentar a sobrevida do preparado);

• concentrações crescentes de álcool etílico.

• Corte é banhado em xilol;

• Montado em um meio solúvel em xilol = meio de montagem ((para

os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá)

• Coloca-se uma gota do meio de montagem em cima do corte já

fixado;

• coloca-se a lamínula sobre o corte imerso no meio de montagem ---

comprime-se com firmeza evitando formação de bolhas de ar;

• Lâmina Pronta para observação!!!!!