protocolo biologia molecular celular

LABORATRIO DE FARMACOLOGIA MOLECULAR

Protocolos de Tcnicas de Biologia Molecular

Braslia, Fevereiro de 2011

Laboratrio de Farmacologia Molecular

Faculdade de Cincias da Sade UnB Rilva Grigrio Pinho Soares

ii

Este trabalho foi elaborado para que fosse possvel um melhor acompanhamento nas

tcnicas de Farmacologia Molecular aplicadas a esse Laboratrio. Para que fosse possvel sua

realizao, contei com a colaborao de muitos colegas, alguns, verdadeiros amigos que

passaram pelo Laboratrio de Farmacologia Molecular. Assim como Karime Bicas,

Alessandra Menezes, Gustavo Barra, Anglica Amato, Rutnia Pessanha, Raniere e Cristina.

Agradeo tambm aos professores que fazem parte do Farmol.

A sua verso atual est sendo revisada pela Profa. Dra. Marie Togashi e est sujeita

alteraes.

A todos que ajudaram os meus agradecimentos, pois a elaborao desse trabalho foi

muito gratificante e com certeza contribuir a todos que ainda iro passar pelo Farmol.



iii

Dedico este trabalho aos meus filhos Murilo e Isabella.

Espero muito em Deus que eles cresam e se tornem adultos maduros e responsveis,

que tenham iniciativas, sejam idneos e tenham sempre Deus em primeiro lugar. Creio que

estas so as virtudes do alicerce da vida.



iv

ORAO DO BILOGO

Credo Molecular

Creio no DNA todo poderoso

Codificador de todos os seres vivos

E no RNA, seu nico filho

que foi concebido pelo poder da RNA polimerase

Nasceu como transcrito primrio

padeceu sob RNAses

Foi processado, modificado e transportado

Desceu ao citoplasma

Foi traduzido em protena

Subiu pelo Retculo Endoplasmtico ao complexo de Golgi

E est ancorado direita de uma protena G na

membrana plasmtica

De onde h de vir a controlar a transduo de sinais

em clulas normais e apoptticas

Creio na Biologia Molecular

Na terapia gnica e na biotecnologia

no sequenciamento do genoma humano

na correo de mutaes

na clonagem da Dolly

na vida eterna.

Amm



v

ndice

Preparo de Clulas Competentes _______________________________4

Introduo

Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes____________5

Teste de Esterilidade das Clulas Competentes ____________________6

Teste de Eficincia das Clulas Competentes______________________6

Preparo de Clulas Competentes - CaCl_________________________7

Preparo de Clulas Competentes TB___________________________8 Tampo TB 1x

Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2_________________9 Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo - RbCl_________10

Solues

Preparo de Clulas Eletrocompetentes____________________11

Preparo de Clulas de Baixa Competncia________________________12

Preparo do Tampo TSS1x.

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________13

Introduo

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________14

Procedimento

Estoque em Glicerol 30%

Teste para simples verificao do plasmdeo ______________________15

STE pH 8.0

Extrao e Purificao de DNA plasmidial________________________16

Introduo

Extrao e Purificao - kit Miniprep da Promega._________________18

Extrao e Purificao - Miniprep modificado por Marie/Joaquim______19

Extrao e Purificao - kit Midiprep da Promega.__________________20

Extrao e Purificao - Maxprep com PEG 30%__________________21

Purificao de DNA com Fenol Clorofrmio______________________23

Solues PEG 30%_________________________________________24 Extrao e Purificao - kit Maxprep da QIAGEN__________________26

Solues Maxpreps da QIAGEN________________________________28

Extrao e Purificao - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz__30

Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani)______________________31

Meio de cultura 2x YT Medium

Meio de cultura SOB Medium _________________________________32

Meio de cultura SOC Medium

Meio de cultura NZY Top Agarose______________________________33



vi

M9 Minimal Medium

Preparo do 10x M9 Salt_______________________________________34

Eletroforese de DNA em gel de agarose__________________________35

Quantificao do DNA _______________________________________36

Manuseio do espectrofotmetro.

Diluio do DNA - 1/100 ou 1/50

Clculo da leitura do DNA dupla fita

Frmula

Preparo do Gel de agarose 1% (100mL)__________________________37

Aplicando o gel de Agarose ___________________________________38

Preparo das amostras de DNA reciclagem de gel de Agarose__________39

Preparo de reagentes e solues_________________________________40

Manipulao da Sala de Cultura_________________________________41

Introduo

Origem das Clulas Hela______________________________________43

Origem das clulas U937______________________________________45

Reao da Transfeco _______________________________________47

Experimento programad

Check list Transfeco / UV por 30 minutos______________________48

Transfeco de Clulas Aderentes Hela ________________________49 Contagem das Clulas na Cmara de Newbauer___________________51

Leitura de Transfeco de Clulas Aderentes______________________52

Descongelamento___________________________________________53

Cultivo e Replicao de Clulas Aderentes

Congelamento de Clulas Aderentes____________________________54

Transfeco em Clulas em suspenso U937______________________55

Leitura da Transfeco de Clulas em suspenso - U937_____________57

Cultivo das Clulas em Suspenso______________________________58

Congelamento de Clulas em Suspenso_________________________59

Antibitico / Solues para cultura de Clulas_____________________60

Soluo de Congelamento I e II

Tampo de Lise _ modificado

PBS (1000 mL) Tampo de Fosfato e Salina) _____________________61

PBS com clcio e glicose

Tripsina____________________________________________________62

Meio de Cultura DMEM______________________________________63

Meio de Cultura RPMI_______________________________________64



4

Preparo de Clulas Competentes

Introduo

As linhagens de E.coli mais comumente empregadas para construo e propagao de

plasmdeos em biologia molecular so DH5 e XL1 Blue. O protocolo que permite a

preparao de bactrias aptas para serem transformadas com DNA plasmidial chamado

competncia. Basicamente as bactrias podem ser tornadas competentes por tratamentos

qumicos (quimiocompetncia) ou por descargas eltricas (eletrocompetncia). Ambos tm

em comum a necessidade de obteno de culturas bacterianas em crescimento exponencial e,

a partir desse ponto, os protocolos diferem de acordo com o mtodo de competncia.

O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente tem como a

hiptese de que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas

de adeso, que so locais onde as membranas interna e externa da clula bacteriana unem-se

formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento bacteriano (fase de

crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido

repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da

membrana bacteriana e dos grupos fosfato da molcula do DNA.

Um dos mtodos mais usados para transformao bacteriana o mtodo que utiliza

cloreto de clcio. Neste mtodo as clulas bacterianas so previamente tratadas com soluo

de cloreto de clcio para tornarem-se competentes, ou seja, mais aptas a receberem DNA

exgeno. Todo o tratamento feito sob banho de gelo. O papel do clcio explicado pela

hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana celular cristalizada, estabilizando a

distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca+2

formam um complexo com este

grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao eletrosttica com as

molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico da transformao complementa este

processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre o interior e o

exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da zona de adeso.

possvel aumentar a eficincia do processo por recurso a outros ons monovalentes (K+ ou

Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou Mn 2+).



5

Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes

Concentraes dos antibiticos somente para controle de qualidade das clulas competentes

estoque

100ug/mL Ampicilina - 100mg/mL

50ug/mL Kanamicina - 50mg/mL

15ug/mL Tetraciclina - 15mg/mL

20ug/mL Clorafenicol - 20mg/mL

100ug/mL Streptomicina - 100mg/mL

1 dia - estriar

Plaquei as clulas a serem testadas em meio de cultura sem antibitico e Ou no antibitico no

qual ela resistente.

2 dia - isolar

Escolha de algumas colnias para teste. (pode-se escolher umas 4 colnias)

Diluir 1 colnia em 1000uL de H2O estril e plaquei 10uL em meio sem antibitico e Ou no

antibitico no qual ela resistente.

3 dia selecionar

Estriar 1 colnia da placa isolada (fazer a mesma diluio do passo anterior) em placas com

antibiticos, testando os vrios antibiticos, concentraes acima.

Marque na placa a colnia testada.

4 dia - verificar se houve crescimento

A colnia que no tiver crescido em nenhum dos antibiticos, a colnia certa para proceder

com a o preparo de clulas competentes, ela esta livre de contaminaes.

No caso de clulas resistentes a algum antibitico, proceda com uma colnia crescida no

antibitico no qual ela resistente.



6

Teste de Esterilidade das Clulas Competentes

Controle negativo

Estrie as clulas preparadas em meio de cultura LB com todos os antibiticos, se possvel

veja tabela de antibiticos de Controle de Qualidade.

No deve crescer em nenhum dos antibiticos, exceto se a clula for resistente a algum

antibitico.

Libere a clula para uso s aps fazer este teste.

Teste de Eficincia das Clulas Competentes

1. Em um tubo no gelo coloque 50uL das clulas preparadas

2. Adicione 10 ng de DNA plasmidial (conhecido)

3. Incube 30 minutos no gelo

4. D um choque trmico de 42C por 45 segundos a 1 minuto e meio

5. Retorne para o gelo por 2 minutos

6. Adicione 950uL de meio de cultura ambiente estril

7. Incube 37C por 1 hora

8. Plaquei 100uL (1ng) em placa com antibitico de interesse.

9. Incube 37C overnight

10. No dia seguinte faa a contagem de colnias

11. Deve-se contar 1000 colnias para que a clulas estejam com uma boa eficincia



7

Preparo de Clulas Competentes - CaCl2

1. Plaquei as clulas de interesse XL1 Blue ou DH5 ou outra (estoque 80C) em meio LB

agar ou meio mnimo. (com antibitico de resistncia ou s/ antibitico)

2. Incube 37C por 16 horas ou overnight, no meio mnimo incube mais tempo.

3. Inocule uma colnia em 3 ou 5 mL de meio LB sem antibitico

4. Incube a 37C 16 horas ou overnight

5. Transfira 3 ml da cultura overnight para 100 mL de LB sem antibitico

6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 600nm

7. Transfira para tubos de 50 mL estries

8. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4C e descarte o sobrenadante

9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 mL de CaCl2 gelado (50mM)

10. Incube no gelo por 15 minutos

11. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante

12. Ressuspenda o pellet gentilmente em 2,85 mL de CaCl2 gelado (50mM)

13. Adicione 150 L de glicerol puro estril

14. Faa aliquotas de 100 e 300L

15. Freeze em nitrognio lquido (opcional)

16. Armazene imediatamente a 80C

Se for usar as clulas a fresco ressuspenda apenas em 3 mL de CaCl2 gelado (50mM) e use

em seguida. OBS.: use solues estreis e geladas.



8

Preparo de Clulas Competentes TB

1. Plaquei as clulas de interesse (estoque 80C) em meio LB agar ou meio mnimo. (com

antibitico de resistncia ou s/ antibitico)





6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 600nm. Incube no gelo por 10 minutos



9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 32 mL de TB gelado


11. Ressuspenda o pellet gentilmente em 8 mL de TB gelado

12. Adicione DMSO para concentrao final de 7% (560 L). Incube no gelo por 10 minutos


14. Freeze em nitrognio lquido (importante)


Tampo TB 1x. p/ 250mL

HEPES (10mM final) ...................651 mg

CaCL2 (15mM final) ....................551 mg

KCl (250mM final)....................... 4.66g

Ajuste pH 6.7

MnCl2 (55mM final) .....................2.8g

Esterelize filtrando 0,22um

Estoque a 4C



9

Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2

1. Plaquei as clulas de interesse (estoque 80C) em meio LB agar ou meio mnimo. (com

antibitico de resistncia ou s/ antibitico)

2. E.Coli TOP 10 Resistente a Streptomicina


4. Inocule uma colnia em 5 mL de meio LB - Streptomicina [ ] final 60g/mL


6. Transfira 2 ml da cultura para 300 mL de LB - Streptomicina [ ] final 60g/mL

7. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.4/0.5, 550nm



10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 mL de MgCl2 gelado (100mM)






16. Adicione 15% de Glicerol 900L de glicerol puro estril (novo)

17. Faa alquotas de 100 e 300L

18. Freezer em nitrognio lquido por 1 minuto




10

Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo RbCl

1. Transfira 400L da cultura ON /37C para 200mL de LB ou SOB

2. Incube a 30C 200rpm at OD 0.5 590nm

3. Centrifugue a 4000 rpm por 5 minutos de possvel a 4C. Despreze sobrenadante

4. Ressuspenda o pellet em 30mL RF1 gelado

5. Incube no gelo por 15 minutos.

6. Centrifugue novamente e descarte sobrenadante

7. Ressuspenda o pellet em 8mL RF2 gelado


9. Faa alquotas de 100 e 300L

10. Freeze no nitrogneo lquido (opcional)

11. Armazene a 80C.

Solues:

Acetato de Potssio - C2H3O2K 1M

9,8g para 100mL H2O. Ajuste pH 7.5 com cido actico

MOPS 0.5M

2,1g para 20mL H2O. Ajuste pH 6.8

RF1 g/100mL

RbCl 10mM 1,2g

MnCl22H2O 50 mM 1g

C2H3O2K 30mM 3mL 1M pH 7.5 ( acetato de potssio)

CaCl22H2O..10mM 1,5g

Glicerol 15% 15mL

Ajuste pH 5.8 com cido actico 0,2 N

Esterilize por filtrao 0,22m Armazene a 4C

RF2 g/100mL

MOPS 10mM 2mL 1M

RbCl 10 mM 0.12g

CaCl22H2O..75mM 1,1g

Glicerol 15% 15mL

Ajuste pH 6.8 com NaOH

Esterilize por filtrao 0,22m Armazene a 4C



11

Preparo de Clulas Clulas Eletrocompetentes

1. Plaquei as clulas de interesse BL21 DE3 (cloranfenicol) ou outra (estoque 80C) em

meio LB agar ou meio mnimo. (com ou s/ antibitico)





6. Incube a 30C 250 rpm at OD - 0.5 a 0.7, 600nm


8. Transfira para tubos de 50mL estries

9. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4C e descarte o sobrenadante completamente.

10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 200mL 10% de glicerol gelado


12. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante completamente.

13. Repita a lavagem com 10% de glicerol gelado com 100mL, 4mL e 1mL ressupenda

gentilmente e centrifugando a cada passo.


15. Freeze em nitrognio lquido (opcional)


* Trabalhe no gelo.



12

Preparo de Clulas de Baixa Competncia

Clulas BL21 DE 3 de Baixa Competncia.

1 Preparo da placa

Em uma placa com meio Mnimo + Cloranfenicol plaquei a clula BL21 DE3

Incube a 37C por 16 horas ou overnight

2 - Inoculo em 3ml.

Em um tubo estril p/ cultura de clulas coloque assepticamente

3mL de meio de cultura (ex: 2 YT) inocule uma colnia das clulas da placa

Incube 37C por 24horas ou overnight em um shaker.

3 - Inoculo em 25ml.

Da cultura obtida do inoculo de 3ml transfira 500L para:

25ml de meio (2 YT ou LB) sem antibitico em um Erlen meyer de 100ml.

Incube 37C em um shaker at OD 590nm (absorbncia de 0.3 ou 0,4)

4 - Centrifugue 4000rpm, por 5 minutos

5 - No Gelo ressuspenda o pellet em 2 ml do tampo TSS 1x, (equivalente a 1/10(um dcimo)

do volume original)

6 - Incube por 5 a 15 minutos no gelo

7 - Faa pequenas alquotas de 100L em eppendorfs de 0,5mL

8 - Freeze a 80C ou nitrogneo lquido

9 - Estoque a 80C

Preparo do Tampo TSS1x.

Para 100ml para 10ml

LB ou 2YT..........95mL........................... 9,5mL

PEG (10%)..........10g...........................1g (polietilene glicol)

2M MgCl2...........2mL...........................200L (20-50 mM final)

DMSO 5%........... 5mL...........................500 L

Esterilize filtrando 0,22m..

Armazene a 4C.



13

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

Introduo

A competncia natural das bactrias para receber o DNA plasmidial do meio

circundante um fenmeno raro (verificando-se apenas em determinadas espcies e em

condies fisiolgicas especficas). Assim, necessrio desenvolver essa capacidade, ou seja,

necessrio tornar as clulas competentes para viabilizar a introduo do DNA recombinante

no hospedeiro selecionado. Ao processo de entrada de DNA livre (isto , DNA em soluo,

fora do invlucro celular) na clula d-se o nome de transformao. A introduo de DNA em

clulas bacterianas (como por exemplo na linhagen da Escherichia coli DH5 ou XLI-Blue)

pode ser realizada recorrendo s tcnicas de transformao clssica ou eletroporao

Na transformao qumica (ou clssica) as clulas (principalmente de E. coli) so

tornadas competentes, por tratamento com uma soluo fria de cloreto de clcio ou outros

ons carregados positivamente. Os ons Ca+2

formam um complexo com este grupamento,

cobrindo as cargas negativas da membrana celular e assim facilitando a atrao eletrosttica

com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico da transformao

complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre

o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da

zona de adeso a que se segue um choque trmico de curta durao. Este DNA exgeno passa

a fazer parte do material gentico bacteriano que ser herdado pelas novas clulas medida

que a bactria se multiplica. As bactrias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma

ou mais caractersticas novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura

contendo antibitico permitindo o processo seletivo.



14

Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes

Procedimento:

1. Identifique os tubos a serem usados e coloque-os no gelo.

2. Coloque de 0,5uL a 1uL de DNA plasmidial (de 100ng a 1ug).

3. Retire as clulas competentes do freezer 80C e desconge-as no gelo.

4. Homogeneize bem e transfira 50uL de clulas competentes para os tubos com os

plasmdeos aliquotados.

5. Incube no gelo por 30 minutos. Ligue o banho maria.

6. Choque trmico: Coloque a 42C. por 1 minuto e 30 segundos.

7. Volte para o gelo por 2 minutos

8. Imediatamente, adicione com assepsia 500uL de meio de cultura LB sem antibitico. Use

o bico de busen.

9. Incube a 37C por 1 hora.

10. Plaquei 50uL em meio agar com antibitico no qual o plasmdeo confere resistncia.

11. Incube a 37C por 16 horas ou overnight com o meio de cultura voltado para cima

12. No dia seguinte passe um parafilme na placa e transfira 4C

Estoque em Glicerol 30%

O estoque de plasmdeo dentro da bactria e conservado em glicerol pode ser

armazenado por tempo indeterminado, desde que no descongele. Tambm pode ser feito

estoque em glicerol da prpria clula competente vazia.

A partir da cultura crescida 37C overnight contendo o plasmdeo de interesse dentro da

bactria prepare o estoque em 30% de glicerol.

1- 700 uL da cultura e 300 uL de glicerol.

2- Homogeneze bem at misturar completamente

3- Armazene imediatamente no freezer 80C

4- Evite que o estoque descongele quando for reutilizar.

5- Prepare tudo que for precisar antes de retirar o estoque do 80C

6- Trabalhe no gelo e seja rapidssimo.



15

Teste para simples verificao do plasmdeo

O teste de verificao do plasmdeo deve ser feito antes do processo de extrao e

analisado em gel de agarose m confirmar se o DNA em estudo esta presente na colnia

inoculada, evitando o processo de extrao e purificao de colnias vazias e

consequentemente o gasto de reagentes

Procedimento

1 Colete 500L da cultura

2 Centrifugue 13.000 rpm 2 minutos

3 - Ressuspenda o pellet em 40L de STE ( TE + 0,1 %de NaCl)

4 Adicione 20L de fenol pH 7.0

5 Adicione 20L de Clorofrmio/Acool isoamlico (24:1)

6 Centrifugue 13.000 rpm 5 minutos

7 Aplique 20L em gel de agarose 1% (pode ser reciclvel)

* Se aparecer uma banda ntida de acordo com o peso/tamanho de seu plasmdeo, proceda

com a purificao.

Soluo de STE pH 8.0 Maniatis 3 B20 10 mM Tris HCl (pH8.0)

1 mM EDTA (pH8.0)

0,1 %de NaCl



16

Extrao e Purificao de DNA plasmidial

Introduo

Entre as tcnicas de DNA recombinante normalmente utilizadas, a purificao

de plasmdeos consiste naquela mais bsica e fundamental, necessria para quase todos os

fins, seja para clonagem, sequenciamento, transfeco, introduo de modificaes em

sequncias, mutagnese stio-dirigida, entre outras. O princpio bsico de isolamento consiste

em primeiro passo na transformao bacteriana (inserir o plasmdeo de interesse dentro de

uma bactria a mais comumente empregadas em biologia molecular so as linhagens de

E.coli; DH5 e XL1 Blue.) e o crescimento de uma colnia contendo o plasmdeo de interesse

em condies que maximize o nmero de cpias do plasmdeo por clula bacteriana.

O mtodo mais utilizado para o isolamento e purificao de DNA de plasmdeo se

baseia na lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Esse mtodo

muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos Entretanto, o tamanho

do plasmdeo no deve ser muito grande (



17

DNA plasmidial em soluo. O DNA ressuspenso em TE, faz-se tratamento com RNase.

Para reduzir a contaminao do DNA purificado com protenas, pode-se empregar a extrao

com fenol:clorofrmio:lcool isoamlico e/ou clorofrmio:lcool isoamlico. O DNA ento

precipitado atravs da adio de alcool (0,8 1,0 X volume de isopropanol ou 2,5 x volumes

de etanol gelado) na presena de sais. Aps a lavagem com etanol 70% para remoo do

excesso de sais e RNAses.

Para algumas aplicaes, tais como o sequenciamento ou transfeco de clulas, existe

um requerimento alto para pureza do DNA plasmidial. Tradicionalmente, empregava-se a

purificao por gradiente com cloreto de csio. Esse mtodo requer uma ultracentrfuga, alm

de ser oneroso e usar grandes quantidades de brometo de etdeo. Por essas razes, houve uma

tendncia a usar cada vez menos esse mtodo, passando a utilizar outros mtodos que

empregam resinas de afinidade com DNA plasmidial e disponveis em kits comerciais. Outra

alternativa vivel consiste no emprego de precipitao em polietilenoglicol (PEG).

Os Kits comerciais prontos para extrao e purificao de plasmdeo, tais como o

Wizard Plus Minipreps da Promega; ou Qiagen so baseados no emprego de resinas de slica,

especficas para a purificao dos plasmdeos. De modo geral, esses Kits comerciais iniciam

a purificao do plasmdeo utilizando o mesmo protocolo de Lise Alcalina at a obteno do

lisado, seguido de ligao do plasmdeo com uma resina especfica que aps a lavagem da

coluna e remoo das impurezas e contaminantes, o plasmdeo pode ser eludo com gua Milli

Q ou TE de forma pura.

Aps a purificao de um plasmdeo, sempre recomendvel analisar a identidade e

caractersticas do plasmdeo atravs da digesto com enzimas de restrio, para confirmar o

tamanho dos fragmentos esperados, ou em simples eletroforese de gel de Agarose



18

Extrao e Purificao - kit Miniprep da Promega.

(5 a 10 mL de Cultura)

*Para purificao com cultura de 10 mL use 400ul das solues 1, 2 e 3.

1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB com

antibitico, incube 37C overnight.

2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga 14 mL ou tubos eppendorfs 1,5mL

3. Centrifugue a 4.000 rpm por 3minutos e descarte o sobrenadante.

4. Se usar tubos eppendorfs 1,5 mL repita o procedimento no mesmo tubo

5. Adicione 200uL da soluo I (cell resuspension solution)

6. Resuspenda por frico ou com uma pipeta, at ficar homogneo. Incube 5 minutos a

temperatura ambiente.

7. Transfira para tubo eppendorfs de 1,5mL (se for o caso)

8. Adicione 200uL da soluo II (cell lysis solution).

9. Homogeneize por inverso vrias vezes (lentamente) incube 5 minutos a temperatura

ambiente. (no ultrapasse de 5 minutos) nesta fase o aspecto ficar viscoso.

10. Adicione 200uL da soluo III (cell neutralization solution). Homogeneize por inverso vrias

vezes, incube 5 no gelo.

11. Agite bem a resina e coloque a 37C por 10 minutos para entrar em soluo.

12. Centrifugue os tubos 13.000 rpm por 5 minutos.

13. Identifique uma coluna para cada amostra.

14. Adicione 1 mL da soluo de resina (agite antes de usar).

15. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado.

16. Filtre a vcuo.

17. Adicione 2 mL da soluo de lavagem de coluna.

18. Continue filtrando (no deixe a coluna secar)

19. Retire a parte inferior da coluna introduza em tubo eppendorf 1.5mL

20. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto (para retirar o excesso)

21. Transfira a coluna para outro eppendorf.

22. Adicione 30uL de H2O Milli Q ou TE (se possvel aquecido a 65)

23. Espere de 1 a 3 minutos.

24. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto.

25. Faa leitura no espectrofotmetro. Armazene o DNA extrado a 20C.



19

Extrao e Purificao - Miniprep modificado por Marie/Joaquim

1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB

com antibitico, incube 37C overnight.

2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga 14 mL ou tubos eppendorfs 1,5mL

3. Centrifugue por 5 minutos 4000 rpm

4. Ressuspenda o pellet em 200L de soluo I, mais 2L de lisozima (50mg/mL)

incube 5 minutos 37C

5. Adicione 400L soluo II, incube 5 minutos temp. ambiente

6. Adicione 200L soluo III, incube 5 minutos no gelo.

7. Centrifugue por 5 minutos 13000 rpm.

8. Transfira o sobrenadante para outro tubo, acrescente 750L isopropanol. Incube por 5

minutos temperatura ambiente.

9. Centrifugue por 5 minutos 13000 rpm. Descarte sobrenadante. Retire bem todo o

lcool.

10. Ressuspenda em 200L de TE (incube 37C, se precisar).

11. Adicione mesmo volume de acetato de amnio 5M (200L) agite forte.

12. Centrifugue por 10 minutos 13000 rpm. Transfira o sobrenadante para outro tubo.

13. Adicione 750L de etanol 100%.Centrifugue por 10 minutos 13000 rpm. Descarte

sobrenadante.

14. Adicione 500L de etanol 70%. Centrifugue por 2 minutos 13000 rpm. Descarte

sobrenadante e espere o pellet secar.

15. Ressuspenda em e200L de TE. Adicione 1L de RNAse (10mg/mlL) para cada

100L de TE.

16. Incube a 37C por 30 minutos.

17. Proceda com fenol /clorofrmio



20

Extrao e Purificao - kit Midiprep da Promega.

(200mL de Cultura)

1. A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 ou 10 mL de Cultura LB com

antibitico, incube 37C overnight.

2. Transfira a cultura para tubos de centrfuga.

3. Centrifugue a 4.000 rpm por 10 minutos. Decante o sobrenadante.

4. Adicione 3ml da soluo (cell resuspension solution) em cada tubo.

5. Resuspenda com a pipeta, at que no haja mais glbulos e fique homogneo.

6. Incube 5 minutos a temperatura ambiente.

7. Adicione 3ml da soluo (cell lysis solution).

8. Homogenize por inverso (lentamente) at ficar viscoso. Incube 5 minutos a temperatura

ambiente. (no ultrapasse de 5 minutos).

9. Adicione 3ml da soluo (cell neutralization solution) Homogeneize por inverso

10. Incube 5 minutos no gelo

11. Centrifugue a 13.000 rpm por 15 minutos a 4C.

12. Transfira o sobrenadante para outro tubo

13. Identifique uma coluna para cada amostra. (identifique a parte inferior)

14. (Agite a resina antes de usar se preciso incube a 37C por 10 minutos).

15. Adicione 10 ml da soluo de resina.

16. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado.

17. Filtre a vcuo.

18. Adicione 25 ml da soluo de lavagem de coluna.

19. Filtre a vcuo novamente.

20. Corte a parte inferior da coluna e introduza em eppendorf identificado.

21. Centrifugue a 13.000 rpm por 30 segundos. (retirar o excesso).

22. Transfira a coluna para outro eppendorf.

23. Adicione 200 de H2O Milli Q ou TE (se possvel aquecido a 65C).

24. Espere de 1 a 3 minutos.

25. Centrifugue a 13.000 rpm por 1 minuto.

26. Faa quantificao no espectrofotmetro

27. Armazene o DNA extrado a 20C



21

Extrao e Purificao - Maxprep com PEG 30%

Procedimento:

1 A partir da placa transformada inocule uma colnia em 5 mL de meio LB com antibitico

- incube 37C overnight

2 - Transfira para um erlen de 1 litro com 500 mL de meio LB e antibitico

-incube 37C overnight

3 - Colete as clulas:

- transfira a cultura para tubos de centrfuga, centrifugue 4.000 rpm por 10 minutos.

* Obs.: retire 500 uL para teste fenol e 1000uL para estoque glicerol

- centrifugue 5700 rpm por 10 min

* se no for continuar frize o pellet a -20C

4 - Adicione 20 mL da soluo I

- ressuspenda at que no haja mais gumos,

- adicione 10mg de lisozina diluda em gua

- incube 5 min a temperatura ambiente

5 - Adicione 40 mL de soluo II (fresca)

- homogeneze por inverso delicadamente, cerca de 6 a 10 vezes

-incube a temperatura ambiente por 5 minutos

* no deve ultrapassar 5 minutos

6 - Adicione 20 mL da soluo III

- homogeneze por inverso de 6 a 10 vezes

- incube 20 min no gelo

* veja se os tubos estam com o mesmo volume/ peso

7 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos

- Filtre o sobrenadante em gaze em outro tubo identificado

8 - Adicione 60 mL de isopropanol a temperatura ambiente (espere de 2 a 40 minutos

opicional), balanceie os tubos

9 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos

- descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de gua

- transfira para tubos de 50 mL



22

Purificao

10 - Adicione um volume NH4Ac 5M (acetato de amnio) e agite bem

- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos

- transfira o sobrenadante para tubos de 50 mL

11 - Adicione 2 o volume de etanol absoluto

-incube a temperatura ambiente 5 minutos

- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos - descarte o sobrenadante

-ressuspenda o pellet em 4 mL de gua, - adicione (4 uL RNAse 10mg / mL)

Incube 37C por 1 hora

* se no for continuar pode frizar -20C aps RNAse

12 - Adicione 4 mL de PEG 30% + 1.5M NaCl , incube no gelo 40 minutos

* pode substituir a incubao no gelo por geladeira 4C overnight

- transfira para TUBOS TAMPA ROXA OU AMARELA

- centrifugue por 40 minutos 4 C a 13000 rpm

13 - Ressuspenda o pellet em 400 uL de gua Milli Q

- adicione 40 uL buffer 10 X e 4 uL PK 10 mg/ mL

- incube 37 C por 30 minutos

14 - Proceda com Fenol/Clorofrmio



23

Purificao de DNA com Fenol Clorofrmio

Ao trabalhar com fenol use luvas e culos protetores se possvel, evite contato com a pele

e roupa, evite respirar vapores. Se possvel use capela de exausto qumica.

Considerando que tenha 200uL de amostra

.Obs: Pipete a fase inferior do fenol.

1. Acrescente mesmo volume de fenol pH8 em cada eppendorf 200 L).

2. Agite bem ou vortex. Centrifugue a 13000rpm por 10 minutos.

3. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf. Tome cuidado para no pipetar as

impurezas, deve formal um anel entre as duas fazes. Se necessrio repita o tratamento

com fenol.

4. Acrescente o mesmo volume de fenol (clorofrmio e lcool isoamlico 24:1) 1:1, ou

seja 100L de um e 100 L do outro. Agite bem ou vortex.

5. Centrifugue a 13000 rpm por 10 minutos

6. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf.

7. Certifique que no haja mais impurezas para proceder com clorofrmio.

8. Acrescente igual volume de clorofrmio e lcool isoamlico (200 L).

9. Agite bem ou vortex. Centrifugue a 13000 rpm por 2 minutos.

10. Retire a 1 fase e passe para outro eppendorf. Acrescente 1/10 do volume de Acetato

de Sdio 3M pH 5.2 (20L) e o mesmo volume de isopropanol absoluto (200L) ou 2

vezes e meio o volume de Ethanol absoluto gelado (100%). 500uL

11. Deixe no freezer a 20C por 10 minutos, (so quando usar ethanol absoluto, esse passo

tambm opcional) Centrifugue a 13000 rpm por 15 minutos

12. .Aspire o sobrenadante e adicione 500 L de ethanol a 70% gelado.

13. Repita a lavagem com ethanol 70% mais uma vez ou at sair o cheiro do fenol.

14. No toque no pellet, coloque o tubo para centrifugar no mesmo sentido.

15. Centrifugue a 13000 rpm por 2 minutos.Aspire o sobrenadante.

16. Espere secar e ressuspenda o pellet com TE Buffer (pH 8.0). Ou H2O Milli Q .

17. A quantidade do solvente depende do tamanho do precipitado. Ou 100 L para cada

100uL da cultura inicial.

18. Identifique bem. Determine a concentrao no espectrofotmetro

19. Armazene no freezer a 20C.



24

Solues Protocolo Maxprep PEG 30%

Soluo I

500mL

50 mM Glucose______________________25mL 1M

25 mM Tris HCl( pH 8.0)_____________12,5 mL -1M

10mM EDTA (pH 8,0)_________________10mL 0,5M

H2O q. s. p. _________________________ 500mL

Autoclave 15 minutos a 121C

Armazene a 4C.

Soluo II

500mL 100mL

0,2 M NaOH_______________________20mL 5 M______________4mL

1% SDS ___________________________50mL 10%_____________10mL

H2O q. s. p. _______________________ 500mL_________________ 100mL

* aconselhvel o uso de soluo fresca

Soluo III

100mL 500L

5M acetato de potssio________________60mL ___________________300mL

cido actico glacial__________________11,5mL__________________57,5mL

H2O ______________________________28,5 mL__________________142,5mL

PEG 30%

......................................100mL

H2O destilada___________50mL

30% de PEG 8000________30g

1,5M de NaCl ___________8.7g

Agite aquecendo

Complete o volume com H2O p/ 100mL

Filtre 0,22m ou autoclave



25

Solues Protocolo Maxprep PEG 30%

Lisozima

Lisozima_________________10mg

H2O destilada_____________ 1mL

10X PK Buffer

100mL

H2O destilada____________ 40mL

0,2 M Tris (pH 8,0) _______ 20mL (1M)

25mM EDTA_____________ 5mL (0,5 M)

0,3 M NaCl ______________6mL (5M)

2% SDS ________________ 20mL (10%)

Complete o volume com H2O p/ 100mL

PK 10mg/ml

Ressuspenda 10mg de Proteinase K em gua destilada

TE pH 8.0 Maniatis 3 B20 10 mM Tris HCl (pH8.0)

1 mM EDTA (pH8.0)

RNase 10mg/mL

*Uso no protocolo Qiagem - prepare 25ug/ml na soluo 1

*Uso no protocolo fenol / clorofrmio prepare 10mg/ml

10mg de RNase A

0,1 M acetato de sdio pH 4.8

0,3mM EDTA pH 8.0

Complete volume para 1mL com gua destilada, homogeneze

Aquea a 80C por 10 minutos

Deixe esfriar a temperatura ambiente lentamente - overnight

Faa alquotas de 100uL e frize a -20C



26

Extrao e Purificao - kit Maxprep da QIAGEN

1. Colete as clulas centrifugando a cultura de 300 a 500mL a 5.000 rpm por 10 minutos.

Descarte sobrenadante. Remova todos os traos do sobrenadante atravs da inverso do

tubo sobre um papel toalha.

2. Adicione 10 mL de Buffer P1 com RNAse tampo de ressuspenso.

3. Homogeneze com vortex ou suco com pipetas at que no haja mais grumos

Certifique-se que a RNAase A foi adicionada ao Buffer P1. A bactria deve ser

ressuspendida completamente. Transfira para tubo de 50 mL.

4. Adicione 10 mL de Buffer P2 - tampo de lise. Homogeneize levemente por inverso 4 a

6x incube a temperatura ambiente por 5 minutos. No aplique o vortex, isso pode resultar

em rompimento do DNA genmico. O lisado deve parecer viscoso. No permita que a

reao de lise proceda por mais de 5 minutos.

5. Adicione 10 mL do Buffer P3 gelado - tampo neutralizador

6. Homogeneize por inverso + ou 6x, incube no gelo por 20 minutos.

7. A precipitao potencializada usando Buffer P3 resfriado e incubando no gelo. Aps

adio de Buffer P3 forma-se um material branco e precipitado e o lisado tornam-se

menos viscoso. O material precipitado contm DNA genmico, protenas celulares e SDS.

O lisado deve ser misturado suavemente para evitar precipitao do SDS.

8. Centrifugue 13.000 rpm por 15 minutos a 4C.

9. Aps a centrifugao o sobrenadante dever tornar-se translcido.

10. Filtre o sobrenadante em gaze ou papel toalha, para evitar entupimento da coluna.

11. Adicione 10 mL do Bufffer QBT - tampo equilibrador na coluna e espere filtrar. Coloque

a coluna em um tubo de centrfuga.

12. Transfira o sobrenadante para a coluna equilibrada e espere que a coluna esvazie

completamente por gravidade.

13. Adicione 2 x 25 mL de Buffer QC - soluo de lavagem

14. A primeira lavagem suficiente para remover todos os contaminantes da maioria das

preparaes de DNA. A segunda lavagem particularmente necessria quando grandes

volumes de cultura ou quando cepas de bactrias produzem grandes quantidades de

carboidratos.



27

15. Todas as solues devero estar em temperatura ambiente para minimizar a precipitao

de sais, embora as centrifugaes seja realizada a 4oC para prevenir um superaquecimento

da amostra.

16. Adicione na coluna 15 mL de Buffer Q.F tampo eluidor

17. Adicione 0,7 do volume de isopropanol temperatura ambiente ( p/ 15 mL de Q.F.

adiciione10,5mL de isopropanol

18. Centrifugue 13.000 rpm por 15 minutos e descarte o sobrenadante

19. Sem ressuspender o pellet, adicione 500L de etanol 70% em temperatura ambiente e

centrifugue a 13.000 rpm por 10 minutos. . O etanol a 70% remove sais precipitados, pois

mais voltil, tornando-se mais fcil a ressuspenso do DNA.

20. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. O pellet de isopropanol

pode parecer hialino e podem dificultar a visualizao

21. Deixe os tubos invertidos sobre um papel toalha e espere que o pellet seque a temperatura

ambiente. Certifique que todo etanol tenha evaporado.

22. Ressuspenda o pellet em 300 L de TE e transfira para um eppendorf. Ressuspenda o

pellet de DNA enxaguando as paredes do tubo. Pipetar o DNA vrias vezes pode causar

danos e deve ser evitado. Uma secagem exacerbada do DNA pode dificultar sua

ressuspenso. O DNA dissolve melhor em condies levemente alcalinas, no fcil

dissolv-lo em tampes cidos.

23. Quantifique em espectrofotmetro e depois analise uma alquota (500ng) em gel de

agarose 1%

24. Armazene a 20C



28

Solues para Maxpreps da QIAGEN

Buffer P1

(Resuspension Buffer)

50 mM Tris.Cl, pH 8.0;

10 mM EDTA;

100 g/ml RNAase A

2 a 8oC, aps adio

de RNAase A.

Buffer P2

(Lysis Buffer) 200 mM NaOH, 1% SDS(m/v);

Use fresco

Temp. ambiente

Buffer P3

(Neutralization Buffer) 3,0 M acetato de potssio pH 5.5 Temp. ambiente



29

Extrao e Purificao - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz

1. Procedimento para 200mL de Cultura

2. Transfira os 200 mL da cultura para tubos de centrfuga, balancei e centrifugue 4000

rpm por 15 minutos.

3. Descarte o sobrenadante. Deixe os tubos virados para baixo para escorrer todo o lquido.

4. Ressuspenda o pellet com TEG Buffer, utilizando 5 mL para cada tubo. Utilize pipeta de

vidro e homogeneize bastante aspirando e soltando o lquido at que todo o precipitado se

solte e se desfaam todos os grumos.

5. Transfira com a mesma pipeta para tubos de 50 mL. Incube a temperatura ambiente por 5

minutos

6. Acrescente 10 mL em cada tubo da Soluo Lyses Buffer. Homogeneize lentamente por

inverso (6x). Incube a temperatura ambiente por 5 minutos.

7. Acrescente 5 mL em cada tubo da Soluo Neutralizante. Homogeneize e deixe no gelo

por 5 minutos.

8. Centrifugue 4000 rpm por 20 minutos.

9. Filtre em guardanapo de papel branco transfira para tubo de centrfuga (tampa roxa ou

amarela).

10. Acrescente igual volume de isopropanol. Se necessrio divida em dois tubos. Balancei

com isopropanol.

11. Centrifugue 13000 rpm 40C por 20 minutos. Descarte o sobrenadante.

12. Ressuspenda o pellet em 500 L de H2O milli Q e homogeneize bem. Transfira para um

eppendorf, acrescente mais 500 L de H2O no tubo de centrfuga, lave bem e transfira

para o mesmo eppendorf. Homogeneize e divida o contedo para outro eppendorf.

13. Obs: a quantidade de H2O depende do tamanho do precipitado.

14. Prossiga com purificao Fenol/Clorofrmio.



30

Solues: Kit Maxprep /Qiagen Modificado por Prof:

Soluo TEG Buffer : Ressuspenso

Preparo de 250 mL de soluo, com as seguintes concentraes finais:

Tris base 25 mM (pH 8.0) ......................6,26mL (de uma soluo estoque 1M)

EDTA 10 mM (pH 8.0)...........................5mL (de uma soluo estoque 0.5M)

Glicose 50 mM .....................................12,5mL (de uma soluo estoque 1M)

- Complete o volume com H2O destilada para 250 mL.

- Homogeneze no agitador magntico.

- Transfira para um frasco com tampa.

- Armazene na geladeira.

Obs: Quando for utilizar, acrescente 5mg de lisozima por mL de soluo a ser utilizada.

Soluo 2: Lyses

Para cada 20 mL de soluo calcule as concentraes finais de:

0,2 M de NaOH........................0,8mL (de uma soluo estoque 5M)

1% de SDS...............................2mL (de uma soluo estoque 10%)

- Complete o volume com H2O destilada.

- Prepare apenas a quantidade a ser utilizada.

Soluo 3: Neutralizante:

Para volume de 100 mL:

-Acetato de Potssio (KAc) 5 M...................60 mL

- cido Actico Glacial ..............................11,5 mL

- Complete o volume com H2O destilada.

- Homogeneze no agitador magntico.

- Armazene 4C



31

Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani) (Maniatis 3 pg A.1)

P/ 1 litro p/ 100 mL

1. H2Obidestilada........800mL......................................80 mL

2. Bacto triptone ...........10g................................................1g

3. Bacto yeast extract......5g.............................................2,5g

4. NaCl...........................10g ..............................................5g

5. Homogeneize em agitador magntico at dissolver.

6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5M.

7. Ajuste o volume final (p/ quantidade que esta fazendo) com H2O destilada

8. Autoclave por 20 minutos a 121C.

Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o pH.

Adicione o antibitico na concentrao especificada pelo protocolo na temperatura entre

37 a 40C e plaquei.

Meio de cultura 2x YT Medium (Maniatis 3 pg A.3)

P/ 1 litro p/ 500mL p/ 200mL

1. H2Obidestilada........... 900mL..............400mL......................150mlL

2. Bacto triptone ..............16g....................8g............................3.2g

3. Bacto yeast extract.......10g....................5g..............................2g

4. NaCl...............................5g....................2,5g..........................1g


6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 1M (+ ou 1,3 ml /500ml)

7. . Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.


9. Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o pH.

10. Adicione o antibitico na concentrao especificada pelo protocolo na temperatura entre

37 a 40C



32

Meio de cultura SOB Medium (Maniatis 3 pg A.2)

P/ 1 litro p/ 100mL

1. H2Obidestilada...................900mL................................ 80mL

2. Bacto triptone ....................20g..................................... 2g

3. Bacto yeast extract..............5g....................................... 0,5g

4. NaCl....................................0,5g.................................... 0,05g


6. KCl. 250 mM ......................10mL................................ 1mL

7. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5N

8. Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.

9. Autoclave por15 20 minutos a 121C

10. Depois adicione 5mL/L de uma soluo estril de MgCl2 2M (500L/100ml)

Obs: KCl 250mM (1.86g de KCl em 100ml de H2O bidest) (MW 74.551)

Meio de cultura SOC Medium (Maniatis 3 pg A.2)

O SOC Medium similar ao SOB exceto por ele conter 20mM de glucose.

Aps autoclavar o meio SOB adicione a uma temperatura de 60C, 20mL/L de uma soluo

estril de Glucose 1M.



33

Meio de cultura NZY Top Agarose

P/ 1 litro p/ 200mL

1. H2O bidest.........................................900mL..............180mL

2. NaCl .................................................. 5g.....................1g

3. MgSO4 .............................................. 2g.....................0,4g

4. Yeast extratct......................................5g......................1g

5. NZ amine (casein hydrolysate)..........10g.....................2g

6. Agarose...........................................7%

7. Ajuste pH 7,0 com NaOH

8. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.


OBS: Temos NZY pronto. Veja rtulo em anexo

M9 Minimal Medium (Based on Maniatis and Notebook: Dec 1, 1993

and April 8, 1993 , also see Notebook III: p79).

P/ 500ml P/200ml

1. H2Obidestilada...............445mL...................................................175mL

2. Agar 1.5%........................7,5g......................................................3g

3. Autoclave por 20 minutos a 121C

4. Aps autoclavar a temperatura de 55C adicione:

5. CaCl2 1M........................50 L (autoclavado) (MW 110.99g/mol)....20L

6. M9 Salt 10x.................... 50mL (autoclavado)..................................20mL

7. MgSO4 1M......................1mL (autoclavado) (MW 246,5g/mol).......400 L

8. Glucose 20%.................10mL (autoclavado)...................................4mL

9. Vit. B1 1%.....................100 L. (filtre o,22m)...............................40 L

10. Arginine 100mg/ml......0,5mL (filtre o,22m)...................................100 L

11. Plaquei



34

Preparo do 10x M9 Salt

p/ 500mL p/250mL p/ 100mL

1. H2Obidest.........400mL.......... ..........200mL............................ 6g

2. Na2 HPO4..........30g..........................15g (corrigir H2O).... .... 3g

3. KH2PO4............15g..........................7,5g.................................. 1g

4. NH4CL..............5g...........................2,5g.................................. 0,5g

5. NaCl..................2,5g........................1.25g...............................0,5g

6. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.

7. Autoclave 121C por 20 minutos.

Nota 1: Correo da H2O do Na2HPO47 H2O

Peso molecular do Na2HPO4 142 PM 142..............15g ...250mL

Peso molecular do Na2HPO4 7 H2O 268 PM 268...........x=28,3g

Nota 2: In Maniatis Na2 HPO4 64g.

Este protocolo baseado em Current protocol Red Book

Nota 3: Antibitico/Clorofenicol (Maniatis 3 A6)

Prepare 34mg em 1ml de ethanol. - M9 (clula DE3) Conc. final = 68g/ml



35

Eletroforese de DNA em gel de agarose

A agarose um polissacardeo, e forma uma rede que prende as molculas durante a

migrao de agarose, a diferena no gradiente de separao depende da concentrao do gel.

A eletroforese em gel uma tcnica de separao de molculas de protenas, DNA e

RNA, que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de

uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois

as de menor massa iro migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o

formato da molculas tambm influi, pois algumas tero maior facilidade para migrar pelo

gel.

A eletroforese de gel de agarose usada como mtodo analtico e preparativo, aps

separar os fragmentos digeridos em tamanho especfico, possvel retir-lo do gel e purificar

para ser usado posteriormente em vrios procedimentos de tcnicas de manipulao gentica.

comumente usados gel de agarose para fragmentos entre 100pb a 12 mil pares de bases,

fragmento menor indicado gel de acrilamida 10% ou utilizao de agarose especial

A velocidade de migrao bem como o poder de resoluo de um gel depende de

vrios parmetros, como concentrao do gel, tamanho e forma da molcula, voltagem

aplicada e tampo de corrida.

Para visualizao e interpretao correta dos resultados obtidos, so necessrias a

incorporao de um agente intercalante de DNA (Brometo de Etdeo) (WHITE et al., 1998) e

a utilizao de marcadores de massa moleculares apropriados de maneira que migrem em

paralelo s amostras e um tampo de corrida com glicerol e corante azul, o glicerol consiste

que as amostras afundem no poinho e o azul em acompanhar a corrida.

Nota:

Para purificar bandas no use agarose reciclada. Use culos de proteo contra a luz Ultra

Violeta. O Brometo de Etdeo altamente txico e carcinognico, deve-se ter o mximo de

cuidado ao manuse-lo, use luvas, no aspire vapores.



36

Quantificao do DNA - Maniatis 3 E-5

Manuseio do espectrofotmetro.

Ligue o estabilizador e aparelho na lateral, levante o visor.

Espere que todas as estrelinhas se iluminem.

Escolha a opo Spectrum

Use o aparato menor cuveta de quartzo

Coloque 200ul de seu diluente ex. gua em cada cuveta.

Aperte F1 Base correct zerar o aparelho.

Retire a cuveta do compartimento inferior e coloque a amostra a ser lida.

Aperte Start espere a curva da leitura ser feita

Aperte F2 Data Process Digite 5, enter, 20 e enter. Anote a leitura.

Diluio do DNA - 1/100 ou 1/50 volume final de 200uL

A quantificao e feita em Espectrofotmetro com amostra diluda.

Exemplo: diluio de 1/100 (2L de DNA e 198L de H2O Milli Q)

Leitura da Protena: em 280 nm 0,162

Leitura do DNA: em 260 nm 0,306

Clculo da leitura do DNA dupla fita

Clculo do fator r razo (fator de pureza do DNA)

260nm / 280nm 0,306 : 0,162 =1.8%

OBS: 1,6 % DNA contaminado com protenas

de 1,7 % a 1.9% DNA puro

2.0 % DNA contaminado com RNA

Frmula

0,306 x 50 x 100 : 1000 = 1.5g/L (Concentrao em g/L)

Leitura da Abs.em 260nm x diluio x 50(=OD) : 1000 = g/L

g/uL



37

Preparo do Gel de agarose novo 1% ou 0,7%

Prepare apenas a quantidade suficiente para o uso no momento

Gel pequeno 0,7% - 0,42g agarose...............30 mL TAE 1x ou TBE 1x

Gel grande 0,7%- 0,21g agarose ...................60 mL TAE 1x ou TBE 1x

Faa os clculos para saber quanto precisa pesar de agarose, para a quantidade e concentrao

diferentes.

1. Em um erlem j destinado vidraria para uso com agarose e brometo de etdeo coloque a

agarose, e adicione a tampo TAE 1x (estoque 10x) ou TBE 1x (estoque 10x) leve ao

microondas por uns 3 minutos ou at que a agarose esteja completamente derretida, evite

ferver.

2. Espere a agarose derretida ficar a temperatura de pelo menos 50C adicione Brometo de

Etdeo 10mg/mL (estoque 10.000x) para que fique na concentrao final de 1x, ou 0,5x se

preferir manusear menos quantidade de brometo, (d certo), evite aspirar vapores.

Gel pequeno 1,5L de Brometo

Gel grande - 3L de Brometo

3. O aparato (caminha) j deve estar montada e nivelada, coloque 8 a 10mm de agarose,

coloque o pente espere polimerizar

4. Aps completa polimerizao retire o pente com cuidado, firmando a caminha para baixo

e puxando o pente reto para cima.

5. Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo usado

para fazer o gel.

Se for usar agarose reciclada, veja protocolo:

Guarde o restante da agarose no prprio bquer e cubra com papel alumnio ou filme

Identifique com fita crepe:

Concentrao, tampo usado, se tem brometo de etdeo ou no.

Quando precisar s aquecer.



38

Aplicando o gel de agarose

Preparo das amostras de DNA para aplicar no gel

Aplique 0.5g a 1.0g de DNA ou 10L da PCR ou sistema de digesto

Ex: 2L de da amostra ( 0.5g) - 8L de de H2O destilada - 2L de Tampo de Corrida 6x

1. Aps completa polimerizao do gel retire o pente com cuidado, firmando a caminha para

baixo e puxando o pente reto para cima.

2. Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo 1x.

3. Aplique 6L de marcador de peso molecular no primeiro poinho (1g/L)

4. Aplique todo o volume da amostra preparada - uma cada poo

5. Tampe a cuba de eletroforese e encaixe os eletrodos (+ positivo / - preto)

6. Ligue a fonte de eletroforese, selecione a corrente do negativo para positivo.

7. 100 Volts / mais ou menos uns 40 minutos.

8. A confirmao do fluxo de corrente dada pela observao da formao de bolhas a partir

dos eletrodos. OBS. DNA (-) migra para o anodo (+)

9. Monitore a migrao do DNA pela migrao dos corantes do tampo de corrida,

aconselhvel correr 1/3 do gel

Azul de bromofenol: migra ~ 300bpCianol de xileno: migra ~ 4.000bp

10. Desligue a fonte de energia, desconecte os eletrodos, retire o gel da cuba e visualize o

DNA no transluminador luz Utra Violeta.

11. Ou visualize no foto documentao, salve e fotografe (se for possvel)

12. A leitura deve ser rpida porque o DNA se difunde no gel com o tempo. Quando for cortar

a banda do gel, evite a luz ultravioleta sobre o DNA.

Foto



39

Reciclagem de gel de agarose

Em laboratrios de biologia molecular, a eletroforese em gel de agarose usada,

rotineiramente para separar molculas de cidos nuclicos. A agarose um polmero extrado

de algas marinhas que apresenta custo elevado e pode ser reciclada para uso em anlise

simples de DNA.

Procedimentos:

1. Estoque os gis em H2O destilada, quando houver um volume considervel inicie a

descontaminao.

2. Troque diariamente a H2O destilada durante 15 dias.

3. Derreta a agarose em forno de microondas.

4. Para maior pureza do gel filtre a vcuo(aquecido) em gaze.

5. Para cada 90 mL de agarose reciclvel; acrescente de10 mL a 20mL de H2O destilada.

6. Faa uma alquota em um pratinho de pesagem e compare a concentrao com um gel

novo. (opcional).

7. Faa alquotas de 90 mL, espere gelatinar

8. Transfira para recipiente maior cubra com H2O destilada, esse processo permite

hidratao do gel at o momento do preparo final.

Preparo final:

9. Transfira uma alquota de 90mL da agarose pr-reciclada para um bquer.

10. Acrescente 10 mL de tampo TBE 10x ou TAE 10x

11. Leve ao microondas at derreter espere esfriar a uma temperatura de 50C

12. Acrescente 5L de brometo de etdeo 10.000x 10mg/ml

13. Coloque na cuba com o pente. A quantidade que for usar no momento.

14. Guarde o restante no prprio bquer, identifique e cubra-o com papel alumnio.

15. Quando for reutilizar s aquecer.

16. Faa a seguinte identificao no recipiente de gel reciclado pronto e disponvel.

Gel agarose 1% reciclavel

Com Brometo de Etdeo

Tampo........................

Data..............................

Nome ..........................



40

Preparo de reagentes e solues

O preparo de solues com rigor passa pela avaliao do reagente qumico que ser

utilizado. O acondicionamento adequado dos reagentes (temperatura, condies higroscpica

e voltil e sensibilidade a luz) conservao e manuteno dos equipamentos bsicos como

balana e pHmetro so fatores importante no preparo correto de solues e devem ser

monitorados adequadamente.

Cuidados necessrios devem ser tomados no momento da dissoluo do soluto em H2O ou em

outro solvente, para que o volume final no ultrapasse aquele requerido, de forma a no

alterar a concentrao final da soluo. Aconselha-se dissolver o soluto em pequenos volumes

do solvente, em seguida completar um pouco mais, ajustar o pH e s depois ajustar o volume

final.

Tcnicas de Biologia Celular. Oliveira e tal

Solues para eletroforese em gel de agarose

TBE 5x

Soluo Estoque (Tris / cido brico / EDTA) Maniatis 3 B23

Para 1 litro

1. Tris base 54g

2. cido brico ..27.5g

3. EDTA0,5 M(pH8)..20mL

4. Coloque 400ml de H2O bidestilada.

5. Homogeneze em agitador magntico

6. Complete com H2O bidestilada at 1000mL

7. Filtre a vcuo, papel de filtro comum.

8. Armazene em frasco de vidro temperatura ambiente.



41

TAE 50x

Soluo Estoque - Maniatis 3 B23

100ml 50X 500mL 10x

1. Tris base 24,2g............................24,4g

2. cido actico 5.71ml..........................5,71g

3. EDTA 0,5M pH8,0 10ml ............................10mL

4. Filtrar a vcuo, papel de filtro comum.

5. Armazenar em frasco de vidro temperatura ambiente.

TAE 1x - Soluo de trabalho

Para 500ml

TAE 50x .........usar 10 ml

H2O Bid..........Completar p/ 500 ml

Tampo azul de corrida 6x Maniatis 3 pg B24 n III

1. 0,25% de bromophenol blue (azul escuro)

2. 0,25% de xylene cyanol (azul claro)

3. 30% de glicerol em gua

4. Armazene a 4C

Usamos apenas o bromophenol blue, mas isso no afeta seu efeito e visualizao.

Marcador de peso molecular

1 kb DNA Ladder - Estoque 1g/L

DNA1ug/uL ...........1L

Tp azul 6x .............1L

H2O ......................4L

Estoque a 4C ou 20C Aplique 6L no gel



42

Manipulao na Sala de Cultura de Clulas

Introduo

Trabalhar com cultura de clulas exige cuidado e ateno redobrada. Um simples

procedimento realizado de forma errada pode comprometer todo o experimento. Lave todo

material usado na cultura de clula com jato forte de gua vrias vezes e enxge com gua

destilada. No caso de contaminao use detergente especial para laboratrio no material que

ser autoclavado. Use a pia indicada para tratamento e lavagem do material microbiolgico no

caso de contaminao. Lave-os imediatamente aps o uso para evitar proliferao e

contaminao pr bactrias.

* A incubadora de clulas de responsabilidade de cada um mesmo tendo algum designado

para limpeza e manuteno do equipamento.

Na sala de cultura de clulas so realizados os seguintes experimentos:

Cultivo de clulas tumorais imortalizadas,

Preparo e cultivo de clulas primrias,

Ensaio de Transfeco,

Congelamento de clulas,

Filtragem de meio de cultura e reagentes entre outras atividades

OBS.: Mantenha a sala limpa e organizada.

No lave o material usado em cultura de clulas na pia destinada ao material microbiolgico.



43

Origem das Clulas Hela

Henrietta Lacks: Imortal

Henrietta morreu h mais de 55 anos, e apesar disto, existem mais clulas suas

atualmente do que quando ela era viva. Clulas tumorais extradas de seu tero so cultivadas

at hoje e so responsveis pela elucidao de muitos mecanismos celulares e outras questes

importantes como o desenvolvimento da vacina da plio.

Em fevereiro de 1951, Henrietta Lacks deu entrada no Hospital Johns Hopkins, em

Baltimore, EUA, e foi diagnosticada com um tumor cervical. Uma amostra tecido uterino foi

enviada ao pesquisador George Gey que estava na poca tentando cultivar tecidos humanos

em meio sinttico, porm sem sucesso. As clulas de Lacks no entanto cresciam muito bem,

num ambiente ideal se duplicam a cada 24hrs. E comearam a ser enviadas a pesquisadores de

todo o mundo, recebendo o nome de clulas HeLa. Se voc colher uma amostra de tecido

prpria, um pedao da sua pele por exemplo, mantendo num ambiente a 37C, com

oxigenao controlada e meio nutritivo, suas clulas vo continuar se dividindo como se ainda

estivessem no seu corpo. Porm, elas no passaro da 52 gerao, limite conhecido como

limite de Hayflick, devido ao encurtamento dos telmeros, uma espcie de controle celular

para impedir que clulas se dividam sem controle (como o tumor que originou as clulas

HeLa). Acontece que as clulas HeLa so clulas chamadas transformadas e so capazes de



44

manter-se em diviso constante, o que permite que essas clulas sejam cultivadas at hoje.

Henrietta morreu cerca de 8 meses aps seu diagnstico, em 4 de outubro de 1951,

aparentemente seu tumor foi diagnosticado como epitelial tpico e tratado com radiao, o que

no funcionou (no seu caso, o necessrio seria a remoo cirrgica do tecido). Sua famlia s

ficou sabendo do uso de suas clulas em 1975, e apesar das diferentes aplicaes e inclusive

da comercializao de alguns mtodos celulares que envolvem o uso de clulas HeLa, nunca

receberam um centavo. Atualmente se sabe que o que provavelmente causou o tumor de

Lacks foi uma infeco com HPV, o herpes papiloma vrus, conhecido por estar presente em

grande parte dos casos de cncer cervical, e que tem marcadores moleculares que podem ser

encontrados nas clulas HeLa. Hoje em dia existem vrias outras linhagens celulares, de

diferentes tecidos, transformadas ou no, mas nenhuma to estudada e utilizada como a

linhagem de Henrietta.

Alguns pesquisadores consideram suas clulas como um organismo parte, ou mesmo uma

outra espcie (devido ao nmero diferente de cromossomos que elas tm), batizada de

Helacyton gartleri.

Fontes:

SEXO E AS ORIGENS DA MORTE - WILLIAM R. CLARK - ISBN: 8501074004

AS DEZ MAIORES DESCOBERTAS DA MEDICINA - MEYER FRIEDMAN, GERALD

WIRILDLAND - ISBN: 8535908684



45

Origem Clulas U-937

Organismo: Homo sapiens (Homem)

Fonte: Linfoma histoctico

Morfologia: Moncito

Produtos celulares: Lisozima, beta-2-microglobulina,fator de necrose tumoral(TNF-)

Propriedades de Crescimento: Suspenso

Restries: A linhagem original de clulas U937 foi estabilizada pelo laboratrio do

Dr. K. Nilssons em 1974; e foram feitas algumas requisies:

1) Em todos os trabalhos que reportem o uso desta linhagem celular ou derivados,

deve ser citada referncia direta Sundstrom & Nilsson (Int. J. Cancer 17: 565-

577, 1976);

2) Qualquer uso com finalidade de comercializar deve ser nogociado com

Pharmacia Diagnostics AB, S-751 82 Uppsala, Sweden;

3) No devem ser feitas distribuio por terceiros;

4) Estas clulas devem ser usadas com propsitos: no-clnicos, no-comercial,

somente para pesquisa.



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Condies de Sobrevivncia

Meio de cultura:

90% de RPMI, 2mM de L-glutamina, 2 g/L de bicarbonato de sdio,

4,5g/L de glicose, 10mM de HEPES, 1mM de piruvato de sdio,

10% de Soro Fetal Bovino, 10 mL de penicilina (100U/mL) estreptomicina (100/mL).

RPMI a abreviao de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contm uma

grande quantidade de fosfato e formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5% de

CO2. O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos.

O meio de cultura deve ser trocado 2 a 3 vezes por semana.

Temperatura: 37C. Atmosfera: 95% de ar e 5% de CO2

Preservao das clulas:

Congeladas em nitrognio liquido ou freezer 80C

Meio para congelar: Meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO.

Temperatura de congelamento: fase de vapor do nitrognio lquido



47

Reao da Transfeco

No ncleo da clula, via plasmdeo de expresso, a transcrio do RNA feita e os

RNAm so transferidos para o citoplasma e codificados na protena (gene de interesse do

plasmdeo de expresso), que volta para o ncleo da clula e se senta no endereo do

elemento responsivo, plasmdeo reprter / gene da luciferase.

O ligante (droga) se liga protena sintetizada dando-lhe uma conformao diferente,

proporcionando a ao juntamente com protena RXR ou no, e ativar a maquinaria do gene

da luciferase.

A transcrio RNA feita no ncleo e os RNAm so transferidos para o citoplasma e

traduzido na protena luciferase que age com a luciferina adicionada e produz luz. A

intensidade da luz medida e correlacinonada ao controle positivo.

Experimento programado

Plasmdeos - Tratamento

1- CMV _LUC (1g) - DMSO/ETHO

2- CMV h TR1(1g) e F2 LUC(4g) - DMSO/ETHO

3- CMV h TR1(1g) e F2 LUC(4g) T3 10-4



48

Check list Transfeco

UV por 30 minutos:

Cuvetas (abertas: descartar ou aspirar o lcool)

Placas de 12 poos (abertas: descartar ou aspirar o lcool)

Pipetas descartveis de transferncia

Tubos falcon 50mL para coletar clulas e identificado para experimento

Pipetas estreis - Pasteur e sorolgica 10mL e 25mL

Pipetador automtico carregado

Pipetas P1000, P10 e P200

Ponteiras 1000L, 200 L e 10 L

Bquer vazio para descarte

Proveta 250mL com gua para descartar a pipetas usadas

lcool 70%

Luvas

Papel toalha

Obs.: Cuvetas e placas de 12 poos: mant-las abertas durante exposio por 30 min luz

UV. Utilizar placas novas ou esterilizadas com lcool.

CHECAR

Rascunho da transfeco

Plasmdeos aliquotados

Ligantes - concentrao

Meio de cultura aquecido

PBS 1x

PBS + Ca2+ + glicose (temperatura ambiente)

Tripsina para clulas aderentes

H2O autoclavada

Pipetadores carregados

Rotor da centrfuga

Calculadora, lpis e papel para rascunho

Cmara de Newbauer



49

Transfeco de Clulas Aderentes Hela

Objetivo:

Tem como objetivo testar a eficincia da transfeco com o plasmdeo CMV-

LUC que o promotor do gene da Luciferase.

E avaliar a resposta da expresso do receptor do hormnio tireoidiano pelo plasmdeo

TR1 com o ligante T3 o controle positivo. A fim de avaliar o controle e prosseguir

com os experimentos.

Procedimento:

1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas e se esto livre de

contaminaes. O meio deve ser trocado com no mximo 48 horas antes da

transfeco. Se ultrapassar s 48 horas, retire o excesso do meio de cultura.

2. . Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas.

3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfeco e aliquote os

plasmdeos (na bancada) na concentrao desejada para cada experimento. Deve-se

colocar uma gota em cada lateral do tubo.

4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de

vcuo. Adicione 10ml de soluo PBS na placa 150X15. Homogeneze

cuidadosamente em movimentos circulares e aspire soluo.

5. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.

6. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 1 minuto, at as clulas soltarem da placa.

Observe ao microscpio (s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)

7. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM com 10% de SFB na placa para bloquear a

Tripsina. (quem faz o bloqueio o soro)

8. Antes de aspirar s clulas, lave toda superfcie da placa (incline placa e pipeta para

que sua mo no fique por cima da placa, se possvel no abra toda a placa).

9. Transfira para 2 falcons de 50ml, retire 10uLe coloque na cmara de newbauer para a

contagem. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 2000 rpm.

10. Coloque o meio de cultura novo na placa. Use outra pipeta. Coloque a placa na

incubadora de CO2 a 37C.

11. Coloque em tubo falcon de 50mL, 12mL de meio de cultura DMEM para cada cuveta

eletroporada Reserve. Adicione um pouco mais para que no falte ao finalizar a



50

distribuio. Descarte o meio das clulas centrifugadas (vertendo sobre o bquer de

descarte ou aspirando com a pipeta pasteur.

12. Ressuspenda as clulas inicialmente com metade do volume desejado para a

transfeco. Faa a contagem das clulas usando a cmara de mewbauer.

13. Aps a contagem faa a diluio _ 5 milhes de clulas em 500L de PBS + Ca2+ +

glicose para cada cuveta.

14. EX.: Se for (para 4 cuvetas). Ressuspenda em 2,200mL final (coloque 200L a mais

para que no falte ao finalizar a distribuio) .

15. Transfira 500L do pool de clulas ressuspendidas ( Hela - 5 milhes de clulas por

cuveta,, no deve usar menos que 3 milhes), para os eppendorfs com os plasmdeos,

homogeneze com a prpria pipeta e transfira para a cuveta.

16. Condies de eletroporao clulas aderentes - Hela

17. Voltagem 0.240 Kv ( kilovolts) Capacitncia 0,950F (microfire) (para HeLa)

18. Pressione os 2 botes ao mesmo tempo at apitar.

19. Transfira as clulas eletroporadas com pipeta de transferncia ou P1000 para o tubo

contendo meio DMEM(item 10). Homogeneze bem, ao transferir. Junte as clulas

eletroporadas com os mesmos parmetros, para que tenha um pool de clulas

transfectadas mais homogneo.

20. Distribua 1mL em cada poinho da placa de 12 poos. Homogeneze bem a cada

retirada para ter o mesmo nmero de clulas em cada poo.

21. Pipete sempre na posio inclinada, no tubo e placa para evitar contaminaes

Tratamento: Usando uma p10 bem calibrada coloque 1L do veculo na lateral interna

dos trs primeiros poos. Puxe a pipeta com cuidado ainda pressionando o dedo, tenha

certeza de que no aspirou de volta o reagente pipetado.

22. Proceda com o tratamento nos demais poos de acordo com o experimento.

23. De leves tapinhas na lateral da placa e faa gentilmente alguns movimentos circulares

para homogeneizar bem. Cuidado para o meio de cultura no encostar-se tampa

proporcionando contaminaes.

24. Incube com 5% de CO2 a 37C por 20 a 24 horas

25. Faa a leitura veja protocolo de leitura de clulas aderentes.



51

Contagem das Clulas na Cmara de Newbauer

Colete as clulas, ressuspenda na metade do volume desejado e faa a diluio. Use 10L

de clulas ressuspendidas e 990L de PBS + ccio + glicose. Cubra a Cmara de

Newbauer com uma lamnula e coloque 10L da diluio 1:100 em cada retculo.

Ao microscpio focalize a cmara em uma objetiva menor, passe para uma objetiva maior

e centralize cada um dos 4 quadrantes externos e conte-os. Tire uma mdia dos 4

quadrantes contados. Se preferir pode contar o outro retculo para comparar.

Quadrante externo

Frmula

Nmero de clulas contadas x diluio x 104 (constante) = n de clulas /mL

25x100x10000 = 25.000.000 clulas/mL

Clculo para encontrar 5 milhes para cada cuveta 500uL (cl. Hela aderentes)

C1 V1 = C2 V2

25.000.000 V1 = 5.000.000 . 500L

V1 = 100L das clulas ressuspendidas e 400L de PBS + clcio + glicose por cuveta.

As clulas tambm podem ser contadas sem diluio, antes de centrifugar coloque

10L da cultura de clulas na cmara de Newbauer. Multiplique o nmero de clulas

contadas por 10 000 e por o volume centrifugado.

Frmula

38x10.000x 80mL = 30.000.000

Ressuspender:

Se quero 5000.000 em 0,5mL

Se tenho 30.000.000 quantos preciso resuspender ....x= 3mL de PBS

Que da para 6 cuvetas



52

Leitura de Transfeco de Clulas Aderentes

1. Observe as clulas transfectadas no microscpio poo por poo, verificando se elas

esto bem ou se esto contaminadas. Certificando que esto bem, proceda com os

procedimentos, na bancada.

2. Aspire o meio dos poos e lave com o mesmo volume de PBS e aspire.

3. Adicione 100uL de Tampo de Lise (modificado).

4. Incube a 4C por 10 minutos. Homogeneze a placa Verifique ao microscpio se as

clulas esto em suspenso. Se necessrio incube mais alguns minutos.

5. Transfira 20L para o tubo de leitura. Troque a ponteira a cada triplicata.

6. Ligue o luminmetro e espere estabilizar (voltar ao zero)

7. No momento da leitura, adicione 20L da luciferina. Coloque o tubo imediatamente

no aparelho e aperte o ENTER.

8. Anote a leitura. No necessrio trocar a ponteira, desde que no encoste a ponteira

usada no lquido do eppendorf.

CLCULO DA

MDIA E FATOR

DE ATIVAO

ATIVAO.

Triplicatas Mdia Fator de ativao

CMV +DMSO/ETOH 2

2

1

1 1,00

CMV +T3 4

4

4

4 2,50

TRb +DMSO/ETOH 1

1

1

0 1,00

TRb + T3 11

10

13

7 12,35

CMV LUC-DMSO/ETHO

2,101

1,316

1,383

CMV LUC + T3 10-4

4,295

3,753

3,948

Mdia:

Somam-se as leituras e

divide por trs.

Fator de ativao:

Diviso da Mdia / Mdia

basal.

CMV h TR1 - DMSO/ETHO

0,6810

1,451

0,377

CMV h TR1 - T3 10-4

10,54

13,25

7,199



53

Descongelamento

1. Prepare a capela/materiais.

2. Aquea o meio de cultura em banho maria a 37C.

3. Retire 2 frascos das clulas de interesse do freezer -80C.

4. Coloque a 37C. por alguns minutos

5. . Transfira imediatamente para uma placa pequena

6. Coloque 10ml de meio de cultura na placa

7. Incube com 5% de CO2 a 37C

8. Troque o meio de cultura no dia seguinte

*Quando as clulas so descongeladas h um acmulo de DMSO, morte celular e liberao de

toxinas, por isso necessria troca do meio no dia seguinte.

Cultivo e Replicao de Clulas Aderentes

1. .Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de vcuo

2. Adicione 10ml de soluo PBS na placa. Homogeneze cuidadosamente em

movimentos circulares e aspire a soluo.

3. .Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.

4. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 2 minutos, at as clulas soltarem da placa.

(s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)

5. Adicione 8ml de meio de cultura DMEN na placa para bloquear a Tripsina.

6. Distribua 2 a 3mL em cada placa

7. Complete a placa com meio de cultura at 20mL (se for a placa grande 100x25)

8. Cultive na incubadora com 5% de CO2 a 37C

9. Troque o meio a cada 48 horas, se necessrio.



54

Congelamento de Clulas Aderentes

1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas com meio de cultura DMEM e

10% de soro fetal bovino, e se esto livre de contaminaes. O meio deve ser trocado

com no mximo 48 horas antes do congelamento. A placa deve estar com uns 70% de

confluncia.

2. Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de vcuo

3. Adicione 10ml de soluo PBS na placa. Homogeneze cuidadosamente em

movimentos circulares e aspire soluo.

4. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.

5. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 1 minuto, at as clulas soltarem da placa.

(s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)

6. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM na placa para bloquear a Tripsina.

7. Deixe uns 2mL na placa e coloque 20ml de meio em placa para continuar o

crescimento. ( Se for mesangial basta 0,5mL)

8. Transfira as clulas para falcons de 50ml e centrifugue, 5 minutos a 2000 rpm.

9. Descarte o sobrenadante

10. Ressuspenda com a soluo de congelamento escolhida, quantidade suficiente para

que fique na concentrao de no mnimo 3 milhes / mL. Faa a contagem das clulas

para confirmar concentrao.

11. Transfira 1,5mL desse contedo para cada tubo de congelamento devidamente

identificado (clula, data e nome)

12. Coloque em recipiente prprio para congelamento cuba redonda com isopropanol

que deve estar temperatura ambiente

13. Transfira para o freezer -80C.

14. No dia seguinte comporte os tubos congelados para caixinhas prprias e identificados

no freezer -80C. e retire o recipiente de congelamento do freezer.

*As clulas s devem ser congeladas aps a replicao e quando estiverem em com

confluncia de u

protocolo biologia molecular celular

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