biologia celular e molecular 9ª ed junqueira & carneiro

Biologia Celular e Molecular

Roteiro

Para sua multiplicao, os vrus, estruturas que no so constitudas por clulas, usam amaquinaria sinttica das clulas que parasitam para produzir macromolculas virais

H apenas dois tipos celulares bsicos: as clulas procariontes e as eucariontes

As clulas procariontes no tm ncleo - o genoma separado do citoplasma por um envoltrio -e, geralmente, no apresentam membranas que dividem o citoplasma em compartimentos

As bactrias do grupo das riqutsias e clamdias so clulas procariontes incompletas, que semultiplicam somente dentro das clulas completas (clulas eucarionte)

As clulas eucariontes so maiores, estruturalmente mais complexas e contm muito mais DNA;seus cromosso-mos so complexos, contm numerosas protenas, inclusive histonas, e ficamseparados do citoplasma por uma membrana dupla, que contm poros, denominada envoltrionuclear

O citoplasma das clulas eucariontes dividido por membranas em compartimentos quecontm molculas dis-tintas e que executam funes especializadas em cada compartimento,aumentando muito a eficincia dessas clulas. O citoplasma das procariontes muito pobre emmembranas, que no formam compartimentos funcio-nais

As clulas eucariontes das plantas, geralmente, apresentam um grande vacolocitoplasmtico, tm plastos e parede de celulose, armazenam amido como reserva energtica ese comunicam por meio de plasmodesmos. Nas clulas eucariontes, a reserva energticaprincipal o glicognio

Cloroplastos e mitocndrias provavelmente se originaram de bactrias simbiontes que seestabeleceram de modo definitivo no citoplasma

Os seres vivos podem ser agrupados em cinco grandes grupos ou reinos: moneras, protistas,plantas, fungos e animais

Estudos filogenticos moleculares, fundamentados principalmente no RNA ribossmico,separam os seres vivos em apenas trs grandes grupos ou domnios: bactria, rquea e eucria.Os dois primeiros domnios so constitu-dos por clulas procariontes; apenas o domnio eucriaapresenta clulas eucariontes.

Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas -Neste captulo ser apresentada uma viso panormica da

estrutura, das funes e da evoluo das clulas, que servir de base para o estudo da matria que ser tratada mais minuciosamente nos captulos seguintes.

A clula a unidade que constitui os seres vivos, podendo existir isoladamente, nos seres unicelulares, ou formar arranjos ordenados, os tecidos, que constituem o corpo dos seres pluricelulares. Em geral, os tecidos apresentam quantidades variveis de material extracelular, produzido por suas clulas.

Vrus so parasitos

intracelulares obrigatriosEm razo de suas relaes com as clulas e seus efeitos

sobre elas, podendo causar doenas de gravidade varivel, os vrus sero estudados neste livro, embora de modo resumido (Captulo 16). Um vrus no capaz de se multiplicar, exceto quando parasita uma clula de cujas enzimas se utiliza para a sntese das macromolculas que iro formar novos vrus. Eles no contam com todas as enzimas nem as estruturas necessrias para a fabricao de outros vrus; so, portanto, parasitos intracelulares obrigatrios. Na verdade, os vrus so parasitos moleculares, uma vez que induzem a maquinaria sinttica das clulas a sintetizar as molculas que iro formar novos vrus em vez de produzirem molculas para a prpria clula.

Os vrus que atacam as clulas animais no atacam as vegetais, e vice-versa. Distinguem-se, pois, os vrus animais e os vrus \vegetais. H, porm, alguns vrus vegetais que, i n v a d i n d o - a s multiplicam-se nasclulas de insetos disseminadores desses vrus de uma planta para outra. Os vrus das bactrias so chamados bacterifagos, ou simplesmente fagos.

Cada vrus formado basicamente por duas partes: uma poro central, que leva a informao gentica, isto ,

um genoma constitudo, conforme o vrus, de um filamentosimples ou duplo de cido ribonucleico ou desoxirribonucleico, no qual esto contidas, em cdigo, todas as informaes necessrias para a produo de outros vrus iguais

uma poro perifrica, constituda de protenas, queprotege o genoma, possibilita ao vrus identificar as clulasque ele pode parasitar e, em determinados vrus, facilita apenetrao nas clulas.Alguns vrus maiores e mais complexos apresentam um

invlucro lipoproteico. A parte lipdica desse invlucro origina-se das membranas celulares; mas as protenas so de natureza viral, isto , so codificadas pelo cido nucleico do vrus. No exterior das clulas, os vrus se apresentam como partculas constitudas de um agregado de macromolculas e recebem a denominao de vrions.

Riqutsias e clamdias so clulasincompletas e, por essa razo, s proliferam

no interior de uma clula completaAs bactrias dos grupos das riqutsias e das clamdias so

muito pequenas e constitudas por clulas procariontes incom-

pletas, que no tm a capacidade de autoduplicao independente da colaborao de outras clulas. Como os vrus, as riqutsias e clamdias so parasitas intracelulares obrigatrios, pois s proliferam no interior das clulas completas; todavia, as clulas incompletas diferem dos vrus em dois aspectos fundamentais. Em primeiro lugar, os vrus carregam, codificada no seu cido nucleico, a informao gentica para a formao de novos vrus, mas no contm organelas e, por isso, utilizam-se da maquinaria das clulas para se multiplicar. As clulas incompletas, ao contrrio, tm parte da mquina de sntese para reproduzir-se, mas necessitam da suplementao fornecida pelas clulas parasitadas. Em segundo lugar, as clulas incompletas tm uma membrana semipermevel, atravs da qual ocorrem trocas com o meio, o que no acontece com os vrus. O invlucro que alguns vrus tm, e que constitudo principalmente por molculas celulares, perde-se quando esses vrus penetram nas clulas.

Provavelmente, as clulas incompletas so clulas "degeneradas", isto , que, no correr dos anos, perderam parte do seu DNA, de suas enzimas e, portanto, sua autonomia, tornando-se dependentes das clulas que se conservaram completas.

H apenas dois tipos bsicos de

clulas: procariontes e eucariontesA microscopia eletrnica demonstrou que existem fun

damentalmente duas classes de clulas: as procariontes (pro,primeiro, e cario, ncleo), cujos cromossomos no so separados do citoplasma por membrana, e as eucariontes (eu, verdadeiro, e cario, ncleo), com um ncleo bem individualizado e delimitado pelo envoltrio nuclear. Como ser visto a seguir, embora a complexidade nuclear seja utilizada para nomear as duas classes de clulas, h outras diferenas importantes entre procariontes e eucariontes.

Clulas procariontes so

"pobres" em membranasAs clulas procariontes caracterizam-se pela escassez de

membranas. Nelas, geralmente a nica membrana existente a membrana plasmtica. Ao contrrio das clulas eucariontes, as procariontes no contm membranas que separam os cromossomos do citoplasma. Os seres vivos que tm clulas procariontes so denominados procariotas; essas clulas constituem as bactrias (as cianofceas, ou algas azuis, tambm so bactrias).

A clula procarionte mais bem estudada a bactria Escherichia coli (Figura 1.1), que, por sua simplicidade estrutural e rapidez de multiplicao, revelou-se excelente para estudos de biologia molecular. A E. coli tem a forma de basto, com cerca de 2 m de comprimento, e separada do meio externo por uma membrana plasmtica semelhante que envolve as clulas eucariontes. Por fora dessa membrana existe uma parede rgida. Conforme a bactria, a espessura dessa parede muito varivel. Ela constituda por um complexo de protenas e glicosaminoglicanas. A parede bacteriana tem, sobretudo, funo protetora.

.... Membrana

--

-Ttica

Nucleoide

Figura 1.1 Clula procarionte (bactria Escherichia col,j. A clula envolvida por umaparede rgida presa membrana plasmtica. Na face interna da membrana, encontram-se enzimas relacionadas com a respirao e que esto representadas, no desenho, por pequenas raquetas. O citoplasma contm numerosos polirribossomos, mas no apresenta o sistema de membranas que existe nas clulas eucariontes. O desenho mostra dois cromossomos, que so idnticos, e, neste exemplo, prendem-se membrana plasmtica. A regio ocupada pelo cromossomo chama-se nucleoide.

No citoplasma das bactrias existem ribossomos ligados a molculas de RNA mensageiro (mRNA), constituindo polir

ribossomos. Encontram-se, em geral, dois ou mais cromossomos idnticos, circulares, ocupando regies denominadas nucleoides e, muitas vezes, presos a pontos diferentes da membrana plasmtica. Cada cromossomo, constitudo de DNA e protenas tem espessura de 2 nm e comprimento de 1,2 mm. As clulas procariontes no se dividem por mitose, e seus filamentos de DNA no sofrem o processo de condensao que leva formao de cromossomos visveis ao microscpio ptico, durante a diviso celular.

Retculo --+.-.1!.'ff endoplasmtico liso


O citoplasma das clulas procariontes em geral no apresenta outra membrana alm daquela que o separa do meio externo (membrana plasmtica). Em alguns casos podem existir invaginaes da membrana plasmtica que penetram no citoplasma, no qual se enrolam, originando estruturas denominadas mesossomos. Alm disso, no citoplasma das clulas procariontes que realizam a fotossntese, existem algumas membranas, paralelas entre si, e associadas clorofila ou a outros pigmentos responsveis pela captao da energia luminosa.

Outra diferena entre a clula procarionte e a eucarionte a falta de um citoesqueleto nas clulas procariontes. Nas eucariontes, o citoesqueleto responsvel pelos movimentos e pela forma das clulas, que, muitas vezes, complexa. A forma simples das clulas procariontes, em geral esfrica ou em bastonete, mantida pela parede extracelular, sintetizada no citoplasma e agregada superfcie externa da membrana celular. Essa parede rgida e representa tambm papel importante na proteo das clulas bacterianas. Na natureza so encontradas populaes de bactrias nos mais diversos habitats, e a parede essencial para proteger as clulas contra os fatores muitas vezes agressivos desses habitats.

Todavia, a diferena mais marcante entre as clulas procariontes e as eucariontes a pobreza de membranas nas procariontes. O citoplasma das clulas procariontes no se apresenta subdividido em compartimentos, ao contrrio do que ocorre nas clulas eucariontes, nas quais um extenso sistema de membrana cria, no citoplasma, microrregies (Figura 1.2) que contm molculas diferentes e executam funes especializadas.

Juno comunicante

Figura 1.2 Representao tridimensional de clula eucarionte animal (clula do fgado). O ncleo separado do citoplasma pelo envelope nuclear, de dupla membrana,com poros. O citoplasma das clulas eucariontes conta com um sistema de membranas muito desenvolvido e que, por motivos didticos, s est parcialmente representado nesta figura. Observar, acima do ncleo, um dos dois centrolos da clula, de onde irradiam microtbulos. Atrs dos centrolos est o aparelho de Golgi. No centro do ncleo aparece o nuclolo. (Reproduzida, com autorizao, de Carneiro, J.: Bases Celulares para a Fisiopatologia. ln: Marcondes, M. etal. Clnica Mdica, 3 ed. Guanabara Koogan, 1984.)

Poli rribossomo

Retculo _i((~~~ eadoplasmtiro~~~

Mitocndria Glicognio Ncleo

Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas - Clulas eucariontes so compartimentadas

Essas clulas apresentam duas partes morfologicamentebem distintas - o citoplasma e o ncleo -, entre as quais existe um trnsito constante de molculas diversas, nos dois sentidos. O citoplasma envolvido pela membrana plasmtica, e o ncleo, pelo envoltrio nuclear.

Caracterstica importante das clulas eucariontes sua riqueza em membranas (Figura 1.2), formando compartimentos que separam os diversos processos metablicos graas ao direcionamento das molculas absorvidas ou produzidas nas prprias clulas. Alm disso, h grandes diferenas enzimticas entre as membranas dos vrios compartimentos. A clula eucarionte como uma fbrica organizada em sees de montagem, pintura, embalagem etc. Alm de aumentar a eficincia, a separao das atividades permite que as clulas eucariontes atinjam maior tamanho, sem prejuzo de suas funes.

O citoplasma constitudo por matriz,

organelas e depsitos diversosO citoplasma das clulas eucariontes contm as organe

las, como mitocndrias, retculo endoplasmtico, aparelho de Golgi, lisossomos e peroxissomos. O conceito de organela no bem definido; varia um pouco de um autor para outro. Alguns consideram organelas apenas as estruturas envolvidas por membrana, como as mitocndrias e os lisossomos, por exemplo; outros admitem como organelas todas as estruturas intracelulares presentes em todas as clulas e que desempenham funes bem definidas, mesmo que no sejam delimitadas por membrana (p. ex.: centrossomos, corpsculos basais dos clios). Alm das organelas, o citoplasma pode apresentar depsitos de substncias diversas, como grnulos de glicognio e gotculas lipdicas. Preenchendo o espao entre as organelas e os depsitos, tambm chamados incluses, encontra-se a matriz citoplasmtica ou citosol. O citosol contm gua, ons diversos, aminocidos, precursores dos cidos nucleicos, numerosas enzimas, incluindo as que realizam a gliclise anaerbia (Captulo 4) e as que participam da degradao e sntese de hidratos de carbono, de cidos graxos, de aminocidos e de outras molculas importantes para as clulas. O citosol contm microfibrilas, constitudas de actina, e microtbulos, constitudos de tubulina, cujas unidades monomricas se podem despolimerizar e polimerizar novamente, de modo reversvel e dinmico, o que explica as modificaes de sol para gel, e vice-versa, observadas no citoplasma. Quando despolimerizadas (separadas umas das outras), as molculas das protenas actina e tubulina conferem maior fluidez ao citosol. Quando polimerizadas em microfibrilas e microtbulos, conferem a consistncia de gel regio citoplasmtica em que se encontram. Membrana plasmtica

: a parte mais externa do citoplasma, que separa a clula domeio extracelular, contribuindo para manter constante o meio

intracelular, que diferente do meio extracelular. Apresenta cerca de 7 a 10 nm de espessura e mostrada nas eletromicrografias como duas linhas escuras separadas por uma linha central clara. Essa estrutura trilaminar comum s outras membranas encontradas nas clulas, sendo, por isso, chamada unidade de membrana ou membrana unitria.

As unidades de membrana so bicamadas lipdicas formadas principalmente por fosfolipdios e que contm uma quantidade varivel de molculas proteicas, mais numerosas nas membranas com maior atividade funcional (as protenas so responsveis pela maioria das funes da membrana). O folheto externo da bicamada lipdica da membrana plasmtica apresenta muitas molculas de glicolipdios, com as pores glicdicas se projetando para o exterior da clula. s pores glicdicas dos glicolipdios se juntam pores glicdicas das protenas da prpria membrana, mais glicoprotenas e proteoglicanas secretadas, que so adsorvidas pela superfcie celular para formar um conjunto denominado glicoclice. Assim, o glicoclice uma projeo da parte mais externa da membrana, com apenas algumas molculas adsorvidas, e no uma camada inteiramente extracelular, como se pensou inicialmente.

Mitocndrias

As mitocndrias so organelas esfricas ou, mais frequen temente, alongadas (Figura 1.2). Nas micrografias eletrnicas aparecem constitudas por duas unidades de membrana, sendo a interna pregueada, originando dobras em forma de prateleiras ou de tbulos (Figura 1.3).

A principal funo das mitocndrias liberar energia gradualmente das molculas de cidos graxos e glicose, provenientes dos alimentos, produzindo calor e molculas de ATP (adenosina-trifosfato). A energia armazenada no ATP usada pelas clulas para realizar suas diversas atividades, como movimentao, secreo e diviso mittica. As mitocndrias participam tambm de outros processos do metabolismo celular (chama-se metabolismo o conjunto de processos qumicos de degradao e sntese de molculas), muito variveis conforme o tipo de clula, e que sero estudados em outros captulos deste livro.

Retculo endoplasmtico

No citoplasma das clulas eucariontes existe uma rede devesculas achatadas, vesculas esfricas e tbulos que se intercomunicam, formando um sistema contnuo, embora apaream separados nos cortes examinados no microscpio eletrnico. Esses elementos apresentam uma parede formada por uma unidade de membrana que delimita cavidades, as cisternas do retculo endoplasmtico (Figura 1.3). As cisternas constituem um sistema de tneis, de forma muito varivel, que percorre o citoplasma. Distinguem-se o retculo endoplasmtico rugoso, ou granular, e o liso (Figura 1.2).

A membrana do retculo endoplasmtico rugoso apresenta os ribossomos na sua superfcie voltada para o citosol. Os ribossomos so partculas densas aos eltrons e constitudas de cido ribonucleico (RNA ribossmico ou rRNA) e protenas. Os ribossomos das clulas eucariontes tm um dimetro de 15


Figura 1.3 Eletromicrografia de parte do citoplasma de uma clula do tecido conjuntivo (plasmcito). Os corpos mais escuros e alongados so mitocndrias. Essa clula, especializada na sntese de protenas, muito rica em retculo endoplasmtico rugoso ou granular (REG). As cisternas esto dilatadas por protenas sintetizadas pela clula e que sero secretadas no meio extracelular. As protenas aparecem como um precipitado fino e claro no interior das cisternas do retculo endoplasmtico rugoso. Aumento: 60.000x.

a 20 nm, sendo um pouco menores nas clulas procariontes (bactrias). Cada ribossomo formado por duas subunidades de tamanhos diferentes, que se associam somente quando se ligam aos filamentos de RNA mensageiro (mRNA).

Como diversos ribossomos se associam a um nico filamento de RNA mensageiro (mRNA), formam-se polirribossomos,que ficam dispersos no citoplasma ou presos superfcie externa do retculo endoplasmtico rugoso. Os polirribossomos tm papel fundamental na sntese de protenas.

O retculo endoplasmtico liso apresenta-se principalmente como tbulos que se anastomosam (Figura 1.2) e se continuam com o retculo rugoso. O retculo endoplasmtico liso muito desenvolvido em determinados tipos de clulas, como, por exemplo, nas que secretam hormnios esteroides, nas clulas hepticas e nas clulas da glndula adrenal.

Endossomos

Os endossomos formam um compartimento que recebeas molculas introduzidas no citoplasma das clulas pelas vesculas de pinocitose, que se originam da membrana plasmtica (Captulo 5). O compartimento endossomal constitudo de elementos separados; um sistema extenso, que se vai desde a periferia do citoplasma at as proximidades do ncleo celular. formado por vesculas e tbulos, cujo interior apresenta pH cido. Esse compartimento responsvel pela separao e pelo endereamento do material que penetra no citoplasma pelas vesculas de pinocitose. Grande parte desse material encaminhada para os lisossomos; porm, muitas molculas passam dos

endossomos para o citosol, e outras so devolvidas para a superfcie celular. Os endossomos podem ser considerados como uma parte da via lisossomal, porque muitas molculas que se dirigem para os lisossomos passam antes pelos endossomos.

Aparelho de Golgi

Essa organela tambm conhecida como zona ou com plexo de Golgi, estando constituda por um nmero varivel de vesculas circulares achatadas e por vesculas esfricas de diversos tamanhos, que parecem brotar das primeiras (Figuras 1.2 e 1.4).

Em muitas clulas, o aparelho de Golgi localiza-se em posio constante, quase sempre ao lado do ncleo (Figuras 1.2 e 1.5); em outras clulas, ele se encontra disperso pelo citoplasma.

Essa organela apresenta mltiplas funes; mas, dentre elas, cabe destacar que muito importante na separao e no endereamento das molculas sintetizadas nas clulas, encaminhando-as para as vesculas de secreo ( que sero expulsas da clula), os lisossomos, as vesculas que permanecem no citoplasma ou a membrana celular (Captulo 10).

Lisossomos

Os lisossomos so organelas de forma e tamanho muitovariveis (medem, frequentemente, 0,5 a 3,0 .m de dimetro [Figuras 1.2 e 1.5]), cujo interior cido e contm diversas enzimas hidrolticas (enzimas que rompem molculas, adi-

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1 Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas -

Figura 1.4 Eletromicrografia do aparelho de Golgi isolado de clula do intestino. Essa organela constituda de vesculas achatadas {VA) e vesculas esfricas {VE) que parecem brotar daquelas. Notar, tambm, alguns fragmentos do retculo endoplasmtico liso, um dos quais est assinalado {RE). Aumento: 25.000x.

cionando os tomos das molculas de gua). As hidrolases dos lisossomos tm atividade mxima em pH cido. Essas enzimas so sintetizadas pelos polirribossomos que se prendem ao retculo endoplasmtico rugoso. Os lisossomos so

.. .

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depsitos de enzimas utilizadas pelas clulas para digerir molculas introduzidas por pinocitose, por fagocitose, ou, ento, organelas da prpria clula. A destruio e renovao de organelas um processo fisiolgico que permite clula

Figura 1.5 Eletromicrografia de clula do tecido conjuntivo (macrfago). Em alguns pontos, a superfcie celular apresenta prolongamentos irregulares. Observar o ncleo {o nuclolo no aparece no corte), o aparelho de Golgi, os lisossomos {L), o retculo endoplasmtico liso {REL) e o centriolo. Aumento: 15.000x.

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manter seus componentes em bom estado funcional e em quantidade adequada s suas necessidades do momento. As organelas desgastadas pelo uso so eliminadas e substitudas por organelas novas. As que no so mais necessrias so simplesmente removidas.

Peroxissomos

Os peroxissomos so organelas caracterizadas pela presena de enzimas oxidativas que transferem tomos de hidrognio de diversos substratos para o oxignio, segundo a reao: RH2 + 02-. R + H202

Os peroxissomos contm a maior parte da catalase celular, enzima que converte perxido de hidrognio (H202) em guae oxignio:

2H202 2Hz + 02

A atividade da catalase importante porque o perxido de hidrognio (H202) que se forma nos peroxissomos um oxidante enrgico e prejudicaria a clula se no fosse eliminado rapidamente.

Os peroxissomos apresentam, ao microscpio eletrnico, uma matriz granular envolta por membrana, e tamanho varivel. Muitos peroxissomos exibem um cristaloide, eltrondenso e constitudo de catalase. Os peroxissomos so identificados ao microscpio eletrnico por conferirem reao positiva para a enzima catalase.

Essas organelas tm sido bem estudadas nas clulas do rim e do fgado de mamferos. Entre outras enzimas, contm catalase, enzimas da -oxidao dos cidos graxos, uratooxidase e D-aminocido-oxidase. Participam da metabolizao do cido rico, resultante das bases pricas. A presena da enzima D-aminocido-oxidase est provavelmente relacionada com a metabolizao dos D-aminocidos da parede das bactrias que penetram no organismo, pois as protenas dos mamferos so constitudas exclusivamente por L-aminocidos. Os peroxissomos tm tambm um papel na desintoxicao. Por exemplo, cerca da metade do lcool etlico (etanol) consumido por uma pessoa destrudo por oxidao nos peroxissomos, principalmente nos peroxissomos do fgado e dos rins. Os peroxissomos participam, como as mitocndrias, da -oxidao dos cidos graxos, assim chamada porque os cidos graxos so rompidos no carbono da posio dois ou beta. Os peroxissomos catalisam a degradao dos cidos graxos, produzindo acetil-CoA, que pode penetrar nas mitocndrias, na qual ir participar da sntese de ATP por meio do ciclo do cido ctrico (ciclo de Krebs). As molculas de acetil-CoA podem ser utilizadas em outros compartimentos citoplasmticos para a sntese de molculas diversas. Calcula-se que 30% dos cidos graxos sejam oxidados em acetil-CoA nos peroxissomos.

O contedo enzimtico dos peroxissomos varia muito de uma clula para a outra, notando-se ainda que, em uma mesma clula, nem todos os peroxissomos tm a mesma composio enzimtica. Essas enzimas so produzidas pelos polirribossomos do citosol, conforme as necessidades da clula e, muitas vezes, como uma adaptao para a destruio de mol-


culas estranhas que penetram na clula, como lcool etlico e diversos frmacos.

Receptores da membrana dos peroxissomos

captam protenas que apresentam sinal

especfico e so sintetizadas no citosolOs peroxissomos crescem pela incorporao de prote

nas sintetizadas nos polirribossomos livres no citosol, contendo uma sequncia especial de trs aminocidos prximos extremidade carboxila da molcula proteica. Essa sequncia reconhecida por receptores da membrana, e a protena transportada para o interior dos peroxissomos. Assim, os peroxissomos crescem e, aps atingirem determinado tamanho, dividem-se por fisso (Figura 1.6). O processo foi bem estudado, tomando-se como modelo a catalase. A molcula de catalase constituda por quatro polipeptdios idnticos, cada um deles ligado a um grupo heme. A catalase liberada pelos polirribossomos no citosol sob a forma de polipeptdios, sem o grupo heme, denominados apocatalase. As molculas de apocatalase, que contm o sinal para os peroxissomos, so reconhecidas pela membrana dos peroxissomos e penetram nessa organela, na qual se unem para formar os tetrmeros, que, em seguida, recebem quatro grupos heme.

As molculas receptoras, que ficam presas nas membranas dos peroxissomos, provocando salincia na face citoplasmtica, tambm so sintetizadas nos polirribossomos livres e captadas - porm no introduzidas - no peroxissomo, permanecendo presas na superfcie da membrana dessa organela.

Peroxissomo

Protenas no citosol "'- Receptor que auxilia

, 1 ""- a penetrao das

------ j protenas com sinal

1-1 ' .: para o peroxissomo ... 1

c,es,on,: 11

do peroxissomo / ',, 11'' ll

@}@ Duplicao do peroxissomo

Figura 1.6 Os peroxissomos se multiplicam por um processo ainda pouco conhecido de diviso binria. A ilustrao mostra que as protenas para essa organela so sintetizadas no citosol. Algumas ficam presas membrana do peroxissomo; porm, determinadas protenas tm sinais peptdicos (sequncias de aminocidos) que marcam sua destinao para o interior dos peroxissomos. Essas molculas proteicas atravessam a membrana e aumentam o tamanho da organela, a qual, enfim,divide-se em duas.

I Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas

Doenas humanas por defeitos nos peroxissomos

A sndrome crebro-hepatorrenal, ou sndrome de Zellweger, um distrbio hereditrio raro, no qual aparecem diversos defeitos neurolgicos, hepticos e renais, que levam morte muito cedo, geralmente na infncia. Foi observado que o fgado e os rins desses pacientes apresentam peroxissomos vazios, constitudos somente pelas membranas, sem as enzimas normalmente localizadas no interior dessas organelas. Essas enzimas aparecem livres no citosol, no qual no podem funcionar normalmente. Portanto, as clulas desses pacientes no perdem a capacidade de sintetizar as enzimas tpicas dos peroxissomos, mas, sim, a possibilidade de transferir para os peroxissomos as enzimas produzidas. O estudo gentico dos portadores da sndrome de Zellweger detectou mutaes em cerca de diversos genes, todos codificadores de protenas que participam do processo de importao de enzimas pelos peroxissomos. Esses genes j foram isolados, e foi demonstrado que as protenas que eles codificam so receptores para enzimas dos peroxissomos, ou ento, de algum outro modo, participam da maquinaria responsvel pela introduo das enzimas nos peroxissomos. O nmero de genes e protenas envolvido mostra a complexidade do processo de translocao de enzimas para o interior dessas organelas.

Outras doenas hereditrias dos peroxissomos so decorrentes da falta de apenas uma enzima, ao contrrio do que acontece na sndrome de Zellweger. A adrenoleucodistrofia um exemplo de deficincia em apenas uma enzima dos peroxissomos. Trata-se de uma mutao no cromossomo X que, geralmente, manifesta-se nos meninos antes da puberdade, quando aparecem sintomas de deficincia na secreo da glndula adrenal e disfunes neurolgicas. Os defeitos resultam do acmulo nos tecidos de numerosas molculas de cidos graxos saturados de cadeia muito longa, porque os peroxissomos desses doentes no oxidam os cidos graxos saturados de cadeia muito longa.

Citoesqueleto

Muitas clulas apresentam forma irregular, existindoalgumas, como os neurnios ou clulas nervosas, com prolongamentos muito longos. Alm disso, o ncleo, as organelas, vesculas de secreo e outros componentes celulares tm localizao definida, quase sempre constante, conforme o tipo celular. Essas observaes levaram os pesquisadoresa admitirem a existncia de um citoesqueleto que desempenharia apenas um papel mecnico, de suporte, mantendo aforma celular e a posio de seus componentes. Estudos posteriores, alm de confirmarem a existncia do citoesqueleto,mostraram que seu papel funcional muito mais amplo. Eleestabelece, modifica e mantm a forma das clulas. responsvel tambm pelos movimentos celulares como contrao,formao de pseudpodos e deslocamentos intracelulares deorganelas, cromossomos, vesculas e grnulos diversos. Osprincipais elementos do citoesqueleto so os microtbulos,filamentos de actina e filamentos intermedirios. Os microtbulos e os microfilamentos de actina, com a cooperaodas protenas motoras (Captulo 7), participam dos movimentos celulares e dos deslocamentos de partculas dentrodas clulas.

Depsitos citoplasmticos

O citoplasma pode conter, conforme o tipo celular estudadoe seu estado funcional, acmulos, geralmente temporrios, de substncias diversas, no envoltas por membrana.

So frequentes os depsitos do polissacardio glicognio, sob a forma de grnulos esfricos com 30 nm de dimetro, que podem existir isoladamente ou agrupados (Figura 1.7). O glicognio, um polmero da glicose, uma reserva energtica para as clulas animais. Muitas clulas contm gotculas lipdicas (Figura 1.8) de constituio qumica e tamanho muito variveis.

Depsitos de pigmentos tambm no so raros; um exemplo a melanina, encontrada nos cromatforos e nas clulas da epiderme (camada mais superficial da pele), e outro exemplo a lipofuscina, pigmento pardo que se acumula em algumas clulas de vida longa, como neurnios e clulas musculares cardacas, medida que elas envelhecem.

Os depsitos que contm pigmento so, em parte, responsveis pela cor dos seres vivos, com implicaes nos processos de mimetismo, na atrao para acasalamento e na proteo contra as radiaes ultravioleta da luz do sol.

O ncleo contm os cromossomos e

separado do citoplasma por membrana

dupla, o envoltrio nuclearUma das principais caractersticas da clula eucarionte a pre

sena de um ncleo de forma varivel, porm bem individualizado e separado do restante da clula por duas membranas. Todavia,

Figura 1.7 Micrografia eletrnica: grnulos de glicognio; a maioria deles forma aglomerados (setas). Clula do fgado. Aumento: 62.000x.

111111 li

Figura 1.8 Eletromicrografia: depsitos temporrios de lipdios no citoplasma de clula absortiva do intestino delgado. Essas clulas apresentam muitos prolongamentos em sua superfcie livre, os microvilos ou microvilosidades que aumentam a superfcie e facilitam a absoro de nutrientes. Notar mitocndrias (M) e lisossomos (L). Depois de absorvidos pelas clulas, os lipdios se acumulam temporariamente nas cisternas do retculo endoplasmtico liso, estando envolvidos por membranas deste retculo (setas). Aumento: 10.000x. (Cortesia de H. 1. Friedman.)

essa membrana dupla, chamada envoltrio nuclea1; contm poros que regulam o intenso trnsito de macromolculas do ncleo para o citoplasma e deste para o ncleo. Todas as molculas de RNAdo citoplasma so sintetizadas no ncleo, e todas as molculasproteicas do ncleo so sintetizadas no citoplasma. A membranaexterna do envoltrio nuclear contm polirribossomos, fazendoparte do retculo endoplasmtico rugoso (Figura 1.2). CromatinaA observao microscpica dos preparados fixados mos tra que o ncleo celular contm grnulos de tamanho varivel e forma irregular, que se coram intensamente por corantes bsicos. O material que constitui esses grnulos foi chamado de cromatina, em uma poca em que nada se conhecia sobre a sua constituio qumica. Atualmente, sabe-se que a cromatina constituda por cido desoxirribonucleico (DNA) associado a protenas. As clulas eucariontes, em comparao com as procariontes, contm uma quantidade muito maior de DNA, que apresenta grande complexidade, estando associado a diversas protenas como as histonas. As protenas tm importante papel nas funes e na organizao do DNA, tanto no ncleo interfsico, isto , que no est em mitose, como na condensao dos cromossomos na diviso celular. NucloloOs nuclolos so corpsculos em geral esfricos, geral mente visveis nas clulas vivas, examinadas ao microscpio sem qualquer colorao.


Os nuclolos contm grande quantidade de cido ribonucleico (RNA) e de protenas bsicas, ao lado de pequena quantidade de DNA. Geralmente, os nuclolos so basfilos em razo do RNA, que se cora por corantes bsicos; contudo, os que apresentam elevado teor de protenas bsicas, que tm afinidade pelos corantes cidos, so acidfilos ( o significado da basofilia e da acidofilia ser explicado no Captulo 2). Caractersticas que distinguem as clulas

eucariontes vegetais das animaisAs clulas dos vegetais superiores (plantas) so eucariontes e assemelham-se, em sua estrutura bsica, s clulas animais. As principais diferenas sero citadas a seguir, e, para mais detalhes, consulte o Captulo 13. "' Presena de paredes. Alm da membrana plasmtica, as clulas das plantas contm uma ou mais paredes rgidas que lhes conferem forma constante e protegem o citoplasma principalmente contra agresses mecnicas e a ao de parasitas. "' Presena de plastdios. Uma das principais caractersticas das clulas das plantas a presena dos plastdios, tambm chamados plastos, que so organelas maiores do que as mitocndrias e, como elas, delimitadas por duas unidades de membrana. Os plastdios que no contm pigmentos so chamados leucoplastos. Os que contm pigmentos so os cromoplastos, dos quais os mais frequentes so os cloroplastos, ricos em clorofila, principal pigmento fotossinttico. "' Vacolos citoplasmticos. As clulas das plantas contm, com frequncia, vacolos citoplasmticos muito maiores do que os que existem no citoplasma das clulas animais. Os vacolos das clulas vegetais podem ocupar a maior parte do volume celular, reduzindo-se o citoplasma funcional a uma delgada faixa na periferia da clula. "' Presena de amido. Ao contrrio das clulas eucariontes animais, que utilizam o polissacardio glicognio como reserva energtica, nas clulas das plantas o polissacardio de reserva o amido. "' Presena de plasmodesmos. As clulas vegetais tm tubos com 20 a 40 nm de dimetro ligando clulas adjacentes. Essas conexes so chamadas plasmodesmos e estabelecem canais para o trnsito de molculas. As clulas animais no apresentam plasmodesmos; porm, muitas se comunicam por meio das junes comunicantes (Captulo 5), que so morfologicamente muito diferentes, mas apresentam semelhanas funcionais com os plasmodesmos.

Origem e evoluo das clulasAdmite-se que o processo evolutivo que originou as pri meiras clulas comeou na Terra a aproximadamente 4 bilhes de anos. Naquela poca, a atmosfera provavelmente continha vapor d'gua, amnia, metano, hidrognio, sulfeto de hidrognio e gs carbnico. O oxignio livre s apareceu muito depois, graas atividade fotossinttica das clulas autotrficas. H 4 bilhes de anos, a superfcie da Terra estaria coberta por grande quantidade de gua, disposta em grandes "oceanos" e "lagoas". Essa massa lquida, chamada de caldo pri-

1 Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas 111111 mordia!, era rica em molculas inorgnicas e continha em soluo os gases que constituam a atmosfera daquela poca. Sob a ao do calor e da radiao ultravioleta, vindos do sol, e de descargas eltricas, oriundas das tempestades que eram muito frequentes, as molculas dissolvidas no caldo primordial combinaram-se quimicamente para constiturem os primeiros compostos contendo carbono. Substncias relativamente complexas como protenas e cidos nucleicos, que, nas condies terrestres atuais, s se formam pela ao das clulas ou por sntese nos laboratrios qumicos, teriam aparecido espontaneamente, ao acaso. Esse tipo de sntese, realizada sem a participao de seres vivos, denominada prebitica, e j foi demonstrado experimentalmente que ela possvel figura 1.9). O acmulo gradual dos compostos de carbono foi favorecido por trs circunstncias: ( 1) a enorme extenso da Terra, com grande variedade de nichos, onde provavelmente ocorreu a formao de molculas que foram mantidas prximas umas das outras e, certamente, diferentes das exis:entes em outros locais; (2) o longo tempo, cerca de 2 bilhes de anos, perodo em que ocorreu a sntese probitica no caldo primordial; e (3) a ausncia de oxignio na atmosfera, j mencionada, e importante porque assim as molculas neoformadas

-=igura 1.9 Aparelho criado por Stanley L. Miller para demonstrar a sntese de mplculas orgnicas, sem a participao de seres vivos (sntese prebitica), nas con- dices da atmosfera terrestre h cerca de 4 bilhes de anos. O aparelho continha vapor d'gua, proveniente do aquecimento do balo inferior. Pela torneira superior a3querda introduziam-se, na coluna, metano, amnia, hidrognio e gs carbnico. Ao passar pelo balo superior direito, a mistura era submetida a centelhas eltricas. A mistura tornava-se lquida no condensador e era recolhida pela torneira inferior. Jl)servou-se que esse lquido continha diversas molculas de compostos de carbono Ygnicas), inclusive aminocidos.

no foram logo destrudas por oxidao. Na atmosfera atual da Terra, a sntese do tipo probitico impossvel.

provvel que no caldo primordial tenham surgido polmeros de aminocidos e de nucleotdios, formando-se assim as primeiras molculas de protenas e de cidos nucleicos. Todavia, somente cidos nucleicos so capazes de autoduplicao, e a demonstrao experimental recente de que, em laboratrio, molculas de RNA simples so capazes de evoluir para molculas mais complexas, sem auxilio de protenas enzimticas, faz supor que a evoluo comeou com molculas de RNA. Como ser visto adiante, no Captulo 3, o RNA pode ter atividade enzimtica, propriedade que j se pensou ser exclusiva das protenas. Aparecidas as primeiras molculas de RNA com capacidade de se multiplicarem e de evoluir, estava iniciado o caminho para as primeiras clulas. Porm, era necessrio que

o sistema autocataltico ficasse isolado, para que as molculasno se dispersassem no lquido prebitico. Provavelmente aoacaso, formaram-se molculas de fosfolipdios que, espontaneamente, constituram as primeiras bicamadas fosfolipdicas,e estas podem ter englobado conjuntos de molculas de cidos ribonucleicos, nucleotdios, protenas e outras molculas.Estava, assim, constituda a primeira clula, com sua membrana fosfolipdica. Os fosfolipdios so molculas alongadas, com uma cabea hidroflica e duas cadeias hidrofbicas.Quando esto dissolvidas em gua, as molculas de fosfolipdios se prendem por interao hidrofbica de suas cadeias econstituem bicamadas espontaneamente, sem necessidade deenergia (Captulo 5).

Os dados hoje disponveis permitem supor que, em seguida ao cido ribonucleico (RNA), deve ter surgido o cido desoxirribonucleico (DNA), formado pela polimerizao de nucleotdios sobre um molde (template) de RNA, e os dois tipos de cidos nucleicos passaram a determinar os tipos de protenas a serem sintetizadas. Considerando a enorme variedade de protenas celulares, formadas por 20 monmeros diferentes (os 20 aminocidos), pouco provvel que todas as protenas se tenham formado por acaso. A sntese das protenas deve ter sido dirigida pelos cidos nucleicos, com eliminao das protenas inteis, pelo prprio processo evolutivo.

razovel supor que a primeira clula que surgiu era estruturalmente simples, certamente uma procarionte heterotrfica, e, tambm, que essa clula foi precedida por agregados de RNA, DNA e protenas, envoltos por bicamada de fosfolipdios. Esses agregados continuaram o processo evolutivo iniciado pelas molculas de RNA, e deram origem s primeiras clulas, que devem ter sido procariontes estruturalmente simples.

Como essas primeiras clulas procariontes eram heterotrficas e, portanto, incapazes de sintetizar compostos ricos em energia (alimentos), o processo evolutivo teria sido interrompido pelo esgotamento dos compostos de carbono formados pelo processo probitico, nos nichos em que surgiram as clulas primordiais. Essas primeiras clulas, alm de procariontes e heterotrficas, eram tambm anaerbias, pois no existia oxignio na atmosfera. Teria sido difcil sustentar o processo evolutivo das clulas primitivas, se elas tivessem permanecido dependentes, para sua nutrio, das molculas energticas formadas por sntese probitica no caldo primordial.

i

A manuteno da vida na Terra dependeu, ento, do aparecimento das primeiras clulas autotrficas, ou seja, capazes de sintetizar molculas complexas a partir de substncias muito simples e da energia solar. Admite-se que tenha surgido, em clulas procariontes, um sistema capaz de utilizar a energia do sol e armazen-la em ligaes qumicas, sintetizando assim alimentos e liberando oxignio. Esse novo tipo celular seria provavelmente muito semelhante s "algas azuis" ou cianofceas, que so bactrias ainda hoje existentes. Iniciou-se, assim, a fotossntese, que ocorreu em virtude do aparecimento, nas clulas, de determinados pigmentos, como a clorofila (pigmento de cor verde), que capta as radiaes azul e vermelha da luz do sol, utilizando sua energia para ativar processos sintticos.

O oxignio liberado pela fotossntese realizada pelas bactrias autotrficas foi-se acumulando na atmosfera. Isso produziu grandes alteraes na atmosfera, pois as molculas do gs oxignio ( 02) se difundiram para as alturas mais elevadas da atmosfera, onde se romperam sob ao da radiao ultravioleta, originando tomos de oxignio, muitos dos quais se recombinaram para formar oznio (03), que tem grande capacidade de absorver o ultravioleta. Desse modo, formou-se, pouco a pouco, uma camada de oznio que protege a superfcie da Terra contra a radiao ultravioleta, mas que transparente aos comprimentos de onda visveis.

O incio da fotossntese e as modificaes da atmosfera foram de grande importncia para a evoluo das clulas e das formas de vida hoje existentes na Terra. Graas fotossntese, surgiu o oxignio na atmosfera, e isso permitiu o aparecimento de clulas aerbias, ao mesmo tempo em que criou uma cobertura protetora de oznio nas camadas superiores da

Clula procarionte


atmosfera. As bactrias anaerbias ficaram restritas a nichos especiais, onde no existe oxignio.

Supe-se que o passo seguinte no processo evolutivo, depois das clulas procariontes autotrficas, foi o surgimento das clulas eucariontes. Tudo indica que as clulas eucariontes, caracterizadas por seu elaborado sistema de membranas, tenham se originado a partir de procariontes, por invaginaes da membrana plasmtica, que foi puxada por protenas contrteis previamente aparecidas no citoplasma (veja adiante, neste captulo). Essa hiptese apoiada pela observao de que as membranas intracelulares mantm, aproximadamente, a mesma assimetria que existe na membrana plasmtica. A face das membranas internas que est em contato com o citosol (matriz citoplasmtica) assemelha-se sua equivalente na membrana plasmtica, e o mesmo acontece com a face voltada para o interior dos compartimentos intracelulares, que tem semelhana com a face externa da membrana plasmtica (Figura 1.10). A interiorizao da membrana foi fundamental para a evoluo das clulas eucariontes, pois formou diversos compartimentos intracelulares, como o retculo endoplasmtico, endossomos, lisossomos e aparelho de Golgi, que so microrregies, cada uma com sua composio enzimtica tpica e atividades funcionais especficas. Esta separao molecular e funcional aumenta muito a eficincia dos processos celulares.

H evidncias sugestivas de que as organelas envolvidas nas transformaes energticas, cloroplastos e mitocndrias, originaram-se de bactrias que foram fagocitadas, escaparam dos mecanismos de digesto intracelular e se estabeleceram como simbiontes (endossimbiontes) nas clulas eucariontes hospedeiras, criando um relacionamento mutuamente benfico e que se tornou irreversvel com o passar dos anos (Figura 1.1 1),

Clula eucarionte Retculo c9 DNA

Po::

zt

j ern;mbossomo

Ncleo

Figura 1.10 A ilustrao mostra como, provavelmente, apareceram os compartimentos intracelulares, por invaginaes da membrana plasmtica. Essa hiptese apoiada pela observao de que as membranas intracelulares tm constituio molecular muito semelhante da membrana plasmtica.

lfJIII

1 1 Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas

Bactrias primitivas anaerbias com membrana e cpsula

O -----.(\

Baot,ia ama o \Jl (oxidao fosforilativa) Clula pnmitiva anaerbia fagocitando

)bactria aerbia ;--- Bactria aerbia

j sem cpsula

o'99

Mitocndria com membrana dupla: a interna, de origem bacteriana, e a externa, de origem celular. A membrana bacteriana passou a formar dobras: as cristas mitocondriais

Figura 1.1 1 Desenho esquemtico que mostra a teoria da origem bacteriana das mitocndrias, por endossimbiose. Clulas eucariontes anaerbias, primitivas, teriam fagocitado bactrias aerbias, as quais, de algum modo, escaparam digesto intracelular e estabeleceram inter-relaes mutuamente teis com as clulas hospedeiras, que assim se tornaram aerbias. Ao mesmo tempo, as bactrias, entre outras vantagens, receberam proteo e alimentao em sua nova localizao no citoplasma da clula hospedeira.

em razo de mutaes ocorridas no endossimbionte (chama-se endossimbionte um simbionte intracelular). As principais evidncias a favor dessa hiptese so: mitocndrias e cloroplastos contm um genoma de DNA circular, como o das bactrias essas organelas tm duas membranas, sendo a interna semelhante, em sua composio, s membranas bacterianas, enquanto a e}..1:ema, que seria a parede do vacolo fagocitrio, assemelha-se membrana das clulas eucariontes hospedeiras. Alm disso, simbiose entre bactrias e clulas eucariontescontinua acontecendo, sendo inmeros os casos atualmente existentes. Ao longo da evoluo, tanto as mitocndrias como os cloroplastos foram perdendo seu genoma para o ncleo da clula hospedeira, tomando-se dependentes do DNA dos cromossomos das clulas hospedeiras. A maior parte das protenas das mitocndrias e dos cloroplastos codificada por RNA mensageiro proveniente do ncleo celular, sintetizadas nos polirribossomos da matriz citoplasmtica e, depois, transferidas para dentro das mitocndrias e cloroplastos. Como surgiram as clulas eucariontes?O surgimento das clulas eucariontes, durante o lento pro cesso evolutivo, um aspecto de difcil elucidao, principal-

mente porque no existem hoje clulas intermedirias entre procariontes e eucariontes, o que facilitaria o esclarecimento dessa modificao evolutiva. Parece claro que, embora as mitocndrias e os cloroplastos sejam derivados de clulas procariontes, difcil imaginar a formao de uma clula eucarionte pela simples unio entre duas clulas procariontes tpicas. Uma delas deve ter sofrido modificaes evolutivas que no foram conservadas nas clulas procariontes atuais. possvel que as clulas eucariontes tenham evoludo gradualmente, na sequncia exposta a seguir (Figura 1.12). Uma clula procarionte heterotrfica e anaerbia, j com o sistema DNA-RNA-Protena funcionando, teria perdido a parede celular e, aos poucos, aumentado de tamanho e formado invaginaes na membrana plasmtica. Admite-se que, nessas reentrncias, acumularam-se enzimas digestivas que permitiram uma melhor digesto das partculas de alimentos. Ento, algumas invaginaes se desprenderam da membrana, formando vesculas membranosas que deram origem ao sistema lisossmico, s vesculas precursoras do retculo endoplasmtico, e levaram para a parte profunda da clula o DNA que estava preso membrana plasmtica. Com o aparecimento de oxignio na atmosfera, devido s bactrias fotossintticas, devem ter surgido os peroxissomos, defendendo as clulas contra a ao deletria de radicais livres contendo oxignio. Houve um aumento de DNA, paralelo crescente complexidade celular, e esse DNA, constitudo de longas fitas, foi concentrado em cromossomos, que foram segregados dentro do ncleo delimitado pelo envoltrio nuclear que se formou a partir do material membranoso vindo da superfcie celular. Houve tambm um desenvolvimento do citoesqueleto, com o aparecimento de microtbulos e aumento na quantidade de microfilamentos. medida que a concentrao de oxignio foi lentamente aumentando na atmosfera, as clulas que incorporaram procariontes aerbios predominaram por seleo natural, por duas razes: a respirao aerbia muito mais eficiente e, alm disso, gasta oxignio, diminuindo a formao intracelular de radicais livres (radicais de oxignio). Estes radicais oxidantes danificam muitas macromolculas, podendo prejudicar o funcionamento das clulas. A endossimbiose (simbiose intracelular) de procariontes aerbios deu origem s mitocndrias, organelas com duas membranas, sendo ainterna da bactria precursora e a externa da clula eucarionte que estava em formao. Provavelmente, os cloroplastos se originaram de maneira semelhante, tambm por endossimbiose, porm de bactrias fotossintticas. Ao longo da evoluo, houve transferncia da parte do genoma dos cloroplastos e mitocndrias, para os ncleos celulares; mas os cloroplastos transferiram menos DNA, em comparao com as mitocndrias. possvel que a endossirnbiose das mitocndrias tenha ocorrido antes da endossimbioseque originou os cloroplastos. Padres celulares e os grandes

grupos de seres vivosO sistema mais antigo de classificao, criado por Lineu, dividia os seres vivos em apenas dois reinos - o animal e o vegetal. No primeiro estavam includos os hetertrofos, que se alimentam por ingesto, exceto os parasitas, que se nutrem por osmose. No reino vegetal estavam includos os organis-

-- ~

o Clula eucarionte aerbia \

3


1 M

I Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas

Plantae Animal ia Fungi

Protista

Diatomceas

Dictyostelium

discodeum

Monera

Bacilo ciliado Cocos .. E,

Diplococos

Diplococos

" f Estafilococos Colnia de cianobactrias Figura 1.13 , Esquema dos cinco "reinos" a que pertencem os seres vivos. O "reino" monera, nico cujas clulas so procariontes, constitudo pelas bactrias (incluindo as cianofceas ou "algas azuis"). Nos demais"reinos todas as clulas so eucariontes. O"reino"protista composto de formas unicelulares ou unicelulares coloniais. O"reino" fungi compreende os fungos. O "reino plantae inclui os vegetais superiores. No "reino" animal ia esto todos os animais.

a elucidao da evoluo molecular das clulas parece ser a melhor maneira de esclarecer as origens das clulas atualmente existentes e de desvendar as caractersticas das clulas primordiais, que apareceram h cerca de 3,5 bilhes de anos e que so as precursoras das clulas atuais. Esses estudos podem ser feitos por meio de diversos tipos de molculas, como a sequncia de aminocidos nas protenas e de nucleotdios nos cidos nucleicos, ou a presena ou ausncia de enzimas importantes para o metabolismo dos organismos.

Todavia, os pesquisadores observaram que a anlise da sequncia de nucleotdios no RNA dos ribossomos, ou rRNA,

uma boa maneira de estudar a filognese. Todas as clulas tm ribossomos e seu RNA muito constante em suas funes, servindo como um "relgio molecular" adequado para estimar as modificaes evolutivas que ocorreram durante os bilhes de anos, desde que surgiram as primeiras clulas na Terra. At mesmo modificaes muito pequenas na estrutura de um RNA ribossmico fazem com que ele deixe de ser funcional. Assim, sua sequncia de nucleotdios foi bem conservada, ou seja, mantida constante, nas diversas linhas filogenticas, e a distncia evolutiva entre os organismos pode ser detectada pelas pequenas diferenas na sequncia de nucleo-

Clulas primordiais

rquea (procariontes)

Eucria (eucariontes)

Bactria (procariontes)

Figura 1.14 Esquema que mostra a diviso dos seres vivos em trs grupos ou domnios, com base na sequncia de nucleotdios no RNA ribossmco. Notar que o grupo eucria se separou do grupo rquea posteriormente, sendo o grupo bactria o mais antigo. Eucria e rquea so mais aproximados, em termos moleculares, e ogrupo bactria o mais afastado.

tdios no rRNA. Os ribossomos contm trs tipos de RNA, designados SS, 165 e 23S, nas clulas procariontes. Nas clulas eucariontes, o rRNA 16S substitudo por um rRNA 18S. A letra S, de Sved-berg, indica o tamanho da molcula, que se relaciona com seu coeficiente de sedimentao em uma ultracentrfuga (Captulo 3). Em razo do seu tamanho conveniente, o rRNA 16S (18S nas clulas eucariontes) o mais utilizado nos estudos filogenticos. O rRNA SS tem apenas 125 nucleotdios, o que limita muito as informaes que ele pode fornecer, enquanto o rRL'\TA 23S, com 2.900 nucleotdios, muito grande, e o estudo de sua molcula mais difcil e laborioso. 11-- Resumo

Os vrus so estruturas no celulares, mas s se multiplicam no interior das clulas, cuja maquinaria utilizam para a produo de novos vrus. Por serem parasitos intracelulares frequentes, sero estudados neste livro. Os vrus so formados de uma parte central com a informao gentica codificada seja em DNA ou em RNA. Esse genoma protegido por uma estrutura que o envolve, constituda por unidades proteicas denominadas capsmeros. Alguns vrus apresentam um invlucro lipoproteico, que contm lipdios da clula parasitada e glicoprotenas virais. Apesar da grande diversidade entre os seres vivos, todos constitudos por clulas, existem apenas dois tipos celulares bsicos: as clulas procariontes e as eucariontes. As clulas procariontes so menores e caracterizam-se pela falta de um sistema de membranas que divida a clula em compartimentos funcionais. Seu cromossomo consiste em filamentos duplos de DNA, de forma circular, localizados em um espao citoplasmtico onde a matriz menos eltrondensa: o nudeoide. Geralmente, cada bactria tem mais de uma cpia desse cromossomo simples e que alm do DNA contm apenas umas poucas protenas. Nessas clulas existe apenas a membrana plasmtica, que pode apresentar dobras dirigidas para dentro das clulas: os mesossomos. Nas clulas procariontes fotossintticas, como as bactrias cianofceas, existem algumas membranas citoplasmticas que, associadas clorofila, so responsveis pela fotossntese nessas clulas. As


Pelo estudo da sequncia de nucleotdios no rRNA 1 6S das clulas procariontes e 18S das eucariontes, foram construdas novas rvores evolutivas, que dividem os organismos em grupos diferentes dos que aparecem nas classificaes anteriores (Figura 1 . 14). Essa comparao entre os organismos est baseada no conceito de que organismos que se diversificaram mais cedo tiveram mais tempo para acumular modificaes no seu RNA ribossmico do que os organismos que se separaram mais recentemente. Os pesquisadores que realizaram esses estudos concluram que a clula procarionte ancestral universal se ramificou inicialmente em duas direes, dando origem aos grupos ou domnios rquea e bactria ( Figura 1 . 14). Posteriormente e a partir do domnio rquea, surgiram as primeiras clulas eucariontes que constituram o domnio eucria. O domnio rquea compreende os procariontes metangenos ( que produzem o gs metano como produto de seu metabolismo) e os que vivem em condies extremas de alta ou baixa temperatura e salinidade, acidez ou alcalinidade elevadas. Por suas caractersticas moleculares, como a composio do rRNA, essas clulas procariontes mostram algumas semelhanas com os seres do domnio eucria e muitas diferenas com o domnio bactria. Alm de diferenas no rRNA, as clulas do domnio rquea tm paredes celulares sem proteoglicanas, compostos encontrados nas paredes das bactrias. O domnio eucria engloba todos os seres constitudos por clulas eucariontes, e o domnio bactria engloba as bactrias atualmente mais conhecidas e denominadas tambm de eubactrias.

clulas procariontes no tm citoesqueleto e so de forma simples. A forma dessas clulas geralmente mantida pela presena de uma parede extracelular rgida que serve tambm de proteo mecnica, funo importante, pois as bactrias esto presentes em nichos ecolgicos muito variveis e, algumas vezes, pouco favorveis. As clulas eucariontes apresentam-se divididas em compartimentos funcionais graas presena de um sistema complexo de membranas que cria microrregies intracelulares especializadas, nas quais determinadas funes podem ser executadas com mais eficincia. Alm desse papel de compartimentalizao, o sistema de membranas cria uma enorme superfcie qual se prendem, em sequncia predeterminada, molculas enzimticas e transportadoras. Assim, os substratos so processados pelos diversos componentes das cadeias enzimticas sem que haja necessidade de grandes deslocamentos, que diminuiriam acentuadamente a rapidez e o rendimento dos processos metablicos. Dentre os principais compartimentos das clulas eucariontes esto o ncleo, o envoltrio nuclear, o retculo endoplasmtico (liso e rugoso), os endossomos, o aparelho de Golgi, os lisossomos, as mitocndrias e, nas clulas vegetais, os plastos ou plastdios, como os cloroplastos. Outra caracterstica das clulas eucariontes ter citoesqueleto fibrilar, responsvel pelos movimentos celulares e pela manuteno da forma

Introduo: Viso Panormica sobre a Estrutura, as Funes e a Evoluo das Clulas

;:mitas vezes, altamente complexa - dessas clulas. O citoesqueleto constitudo de microtbulos ( cerca de 24 nm de dimetro), filamentos intermedirios (cerca de 10 nm de dimetro) e :nicrofilamentos de actina (cerca de 6 nm de dimetro). Os

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IIIIDI

Confeco de cortes Rara estudo nos microscRios ptico e

microscpio de luz,22

Roteiro A biologia celular e molecular estuda objetos muito pequenos, por isso depende inteiramente do aperfeioamento

dos instrumentos e das tcnicas de pesquisa

Para estudo no microscpio ptico, os tecidos so fixados, cortados e corados; as imagens obtidas podem ser

armazenadas em discos de computador e, posteriormente, processadas

Os microscpios de contraste de fase facilitam o exame de clulas vivas

Com o microscpio confocal, possvel fazer cortes pticos da clula e a reconstituio tridimensional, por compu

tao, das imagens digitalizadas de organelas e outros constituintes celulares

O microscpio eletrnico de transmisso tem um poder de resoluo mais de 100 vezes superior ao do microscpio

ptico e revelou numerosas mincias da estrutura celular que no eram sequer percebidas anteriormente, revolu

cionando os estudos sobre as clulas

O microscpio eletrnico de varredura visa ao estudo das superfcies externas e internas das clulas e organelas

A imunocitoqumica empregada para a localizao de macromolculas celulares especficas

Nas culturas, as clulas podem ser mantidas vivas e proliferando por muito tempo, o que facilita o estudo de suas

funes

As organelas podem ser isoladas das clulas por centrifugao fracionada (centrifugao diferencial)

A cromatografia em coluna uma tcnica utilizada para separar macromolculas celulares

A tcnica de eletroforese pode ser utilizada para identificar macromolculas e para determinar o tamanho das

molculas proteicas.

2 1 Tecnologia da Biologia Celular e Molecular: Alguns Exemplos

Os conhecimentos sobre as clulas progridem paralemnente ao aperfeioamento dos mtodos de investigao. Jlicialmente, o microscpio ptico, tambm chamado microscpio de luz, possibilitou o descobrimento das clulas e a elaborao da teoria de que todos os seres vivos so constitudos por clulas.

Posteriormente, foram descobertas tcnicas citoqumicas para a identificao e localizao de diversas molculas constituintes das clulas. Com o advento dos microscpios eletrnicos, que tm grande poder de resoluo, foram observados pormenores da estrutura celular que no poderiam sequer ser imaginados pelos estudos realizados com os microscpios pticos.

Quase simultaneamente com o uso dos microscpios eletrnicos, foram aperfeioados mtodos para a separao de organelas celulares e para o estudo in vitro de suas molculas e respectivas funes. A anlise de organelas isoladas em grande quantidade, a cultura de clulas, a possibilidade de manipular o genoma por meio da adio ou supresso de genes e o aparecimento de numerosas tcnicas de uso comum aos diversos ramos da pesquisa biolgica levaram ao surgimento do que se costuma chamar de biologia celular e molecular, que o estudo integrado das clulas, por meio de todo o arsenal tcnico disponvel. impossvel descrever, mesmo de modo resumido, todas as tcnicas utilizadas nos variados estudos sobre as clulas. Cada pesquisador tem utilizado sua imaginao para criar abordagens das mais variadas, de acordo com o problema a ser resolvido. Neste captulo, apenas como exemplos, sero estudadas algumas tcnicas que tm contribudo de modo significativo para o progresso da biologia celular e molecular. Para manter a dimenso do livro razovel, muitas tcnicas no foram relatadas; porm, algumas esto descritas nos captulos que tratam dos assuntos esclarecidos por elas. Isso as torna mais facilmente compreensveis; um exemplo a importante tcnica denominada PCR Polimerase Chain Reaction), que est minuciosamente descrita no Captulo 8.

Confeco de cortes para estudo nos microscpios ptico e eletrnico

Embora seja possvel o estudo microscpico de clulas vivas, muitas vezes h vantagem em obter um preparado permanente (lmina) no qual as clu-2as ficam preservadas, isto , fixadas e coradas, para melhor demonstrao dos seus componentes.

1111611 preparados apresentam artefatos, que so alteraes produzidas nas clulas pelas tcnicas utilizadas.

... Fixao. A fixao a primeira etapa para a obteno de um preparado permanente, e apresenta as seguintes finalidades:

evitar a autlise, que a destruio da clula por suas prprias enzimas

impedir a atividade e a proliferao de bactrias endurecer as clulas para que elas resistam melhor s etapas

seguintes da tcnica aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos coran

tes utilizados na microscopia ptica e aumentar o contraste na microscopia eletrnica (veja adiante, neste captulo).

A qumica da fixao complexa e pouco conhecida. O formol e o aldedo glutrico (glutaraldedo) fixam as clulas por se combinarem com os grupamentos amnicos das protenas. O aldedo glutrico contm um grupamento aldedico em cada extremidade de sua molcula, sendo capaz de estabelecer pontes entre as unidades proteicas, estabilizando a estrutura quaternria da protena (Figura 2.1).

O tetrxido de smio e o glutaraldedo so os fixadores mais utilizados em microscopia eletrnica porque coagulam as protenas, causando modificaes mnimas na estrutura celular.

Cada um dos fixadores simples apresenta determinados inconvenientes, ao lado de algumas qualidades desejveis; por isso, foram elaboradas as misturas fixadoras, que contm pro-

Formo/. Grupo aldedico nico (representado esquerda por ponto preto) No fixa microtbulo

,,.;

H-Cv ' H

Glutaraldedo. Molcula em basto com dois grupos aldedicos. Fixa o microtbulo

Um preparado permanente ideal deveria mostrar as clulas com a mesma cStrutura microscpica e composio qumica que tinham quando vivas. Isso, entretanto, no possvel, e todos os

Figura 2.1 Comparao da atividade fixadora do formo! e do glutaraldedo (aldedo glutrico) sobre os microtbulos, que so constitudos por dmeros proteicos (representados por esferas). Contendo dois grupamentos aldedices, cada molcula do glutaraldedo pode ligar-se a dois dmeros proteicos, mantendo a estrutura do microtbulo. O formo! incapaz de manter essa estrutura, pois cada molcula de formei tem apenas um grupamento aldedo e se prende a um nico dmero.

(

o o ~ // / C-CH2-CH2-CH2-c,

H H

pores variveis dos fixadores simples com a finalidade de compensar-lhes as deficincias .

... Microtomia. Em sua maioria, as clulas fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas para exame no microscpio. Esses cortes so feitos em um aparelho denominado micrtomo (Figura 2.2). Para ser cortado no micrtomo, o fragmento de tecido fixado geralmente protegido por um material que o envolve e nele penetra, devendo contar com propriedades fsicas que facilitem o corte. Os tecidos destinados ao estudo no microscpio ptico so protegidos, isto , includos em parafina ou em resinas plsticas especiais, e cortados com uma espessura de l a 6 micrmetros, geralmente. Para estudo no microscpio eletrnico, os tecidos devem ser includos em resinas mais rgidas, como as do tipo epxi. Os cortes para o microscpio eletrnico so muito finos, medindo 0,02 a 0,1 mm. Os micrtomos que cortam tecidos includos em parafina utilizam navalhas de ao, e os que cortam tecidos includos em resinas usam navalhas de vidro ou de diamante.

.,. Colorao. Quase todas as organelas so transparentes e incolores, o que dificulta seu estudo microscpico. Para vencer essa dificuldade, foram criados numerosos processos de colorao que tornam visveis os diversos componentes celulares.

A maioria dos corantes comporta-se como base ou como cido. Nos corantes bsicos, o grupamento qumico responsvel pela cor ou grupamento cromforo (cromo, cor, e foro, conduzo) catinico. Os cromforos desses corantes combinam-se com os grupamentos cidos (aninicos) das molculas celulares. Portanto, as molculas cidas, como as do DNA e RNA, so basfilas, isto , tm afinidade pelos corantes bsicos. O azul de toluidina e o azul de metileno so exemplos de corantes bsicos. A hematoxilina, um corante muito utilizado, comporta-se como corante bsico, ligando-se s estruturas basfilas dos tecidos.

Figura 2.2 Micrtomo moderno, especialmente ergonmico, para cortes de tecidos includos em parafina ou em resina plstica. Modelo ErgoStar HM 200. (Ilustrao gentilmente cedida pela Microm, empresa do grupo Carl Zeiss.)


Nos corantes cidos, o cromforo aninico (portanto, com carga eltrica negativa) e tende a se combinar com os componentes celulares bsicos, que so eletricamente positivos. Estruturas ricas em grupamentos bsicos so acidfilas, por terem afinidade pelos corantes cidos. Os corantes cidos, como a eosina, orange G e fucsina cida, coram as molculas bsicas das protenas citoplasmticas.

Microscpio ptico ou microscpio de luz O microscpio ptico, tambm conhecido como micros

cpio de luz (Figura 2.3), compe-se de uma parte mecnica, que serve de suporte, e uma parte ptica, constituda por trs sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular.

A finalidade do condensador projetar um cone de luz sobre as clulas que esto sendo examinadas no microscpio. Aps atravessar as clulas, esse feixe luminoso, em formato de cone, penetra na objetiva, a qual projeta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que, novamente, a amplia. Por fim, a imagem fornecida pela ocular pode ser percebida pela retina (Figura 2.4) como uma imagem situada a 25 cm da lente ocular, ou ento pode ser projetada sobre uma tela ou uma chapa fotogrfica. A ampliao total oferecida por um microscpio igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.

Chama-se poder de resoluo de um sistema ptico a sua capacidade de separar detalhes. Na prtica, o poder de resoluo expresso pelo limite de resoluo, que a menor distncia que deve existir entre dois pontos para que eles apaream individualizados; por exemplo: duas partculas separadas por 0,3 m aparecem individualizadas quando examinadas em um sistema ptico com limite resolutivo de 0,2 m, porm,

Ocular

Objetivas

Platina

Condensador

Figura 2.3 Microscpio ptico moderno, binocular, com iluminao embt:'" (Fotografia cedida pelo fabricante, Carl Zeiss.)


D

Figura 2.4 O esquema do microscpio ptico mostra o trajeto dos raios luminosos. (1) base do microscpio, (2) condensador, (3) lente objetiva, (4) cristalino do globo ocular; (A) sistema de iluminao, (B) platina, (C) tubo binocular, (D) globo ocular do observador. (Ilustrao cedida pela empresa Carl Zeiss.)

aparecem como uma partcula nica quando o limite resolutivo de 0,5 m (Figuras 2.5 e 2.6). O que determina, pois, a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema ptico o seu limite de resoluo, e no o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos. A propriedade de aumentar apenas tem valor prtico se acompanhada de um aumento paralelo do poder resolutivo. O limite de resoluo depende essencialmente da objetiva. A ocular no pode acrescentar detalhes imagem; sua funo apenas aumentar de tamanho a imagem, que projetada em seu plano de foco pela objetiva. O limite de resoluo depende, sobretudo, da abertura numrica (AN) da objetiva e do comprimento de onda da luz utilizada. Limites de resoluo

Microscpio Microscpio Olho eletrnico ptico humano

l l l 10-

5 10 - 10-

3

10-2

1 0-1 mm

1 0,0001 0,001 0,01 0,1 10 100 1.000 m

0,1 10 100 1 .000 10.000 nm

10 100 1.000 1 0.000 10.000

Figura 2.5 As principais unidades de medida utilizadas em biologia celular so o -nicrmetro (mm) e o nanmetro (nm). A unidade ngstrim () deve ser substituda ::ielo nanmetro. A ilustrao mostra a equivalncia entre essas unidades, compa-ando-as tambm com o milmetro (mm). As setas indicam os limites {aproximados) je resoluo do olho humano, do microscpio ptico e do microscpio eletrnico.

1 / 1 / 1 / I I /

\ [!' ri I ,!, ...

-

Figura 2.6 , Este esquema do cone luminoso que penetra em uma objetiva mostra o semingulo de abertura, que entra no clculo da abertura numrica {AN).

O limite de resoluo (LR) da objetiva fornecido pela frmula: LR = k X . AN em que k uma constante estimada por alguns em 0,61 e, por outros, em 0,5, e . o comprimento de onda da luz empregada. Na prtica, o objeto iluminado por luz branca, constituda por diversos comprimentos de onda. Para o clculo do limite de resoluo, toma-se o comprimento de onda da faixa do verde-amarelo (0,55 m), por ser o olho humano mais sensvel a essas cores do que a quaisquer outras; portanto, na prtica: LR = 0,61 X 0,55 AN A anlise dessa frmula mostra que o limite de resoluo diretamente proporcional ao comprimento de onda da luz utilizada e inversamente proporcional abertura numrica da objetiva. ,,. Microscpio de polarizao. O emprego de um feixe luminoso polarizado permite estudar determinados aspectos da organizao molecular dos constituintes celulares. Ao atravessar a clula, o feixe de luz pode passar por estruturas cristalinas ou constitudas por molculas alongadas e paralelas, que dividem o feixe polarizado em dois, cujos planos so perpendiculares. Essas estruturas so chamadas anisotrpicas e so birrefringentes, pois apresentam dois ndices de refrao diferentes, conforme a incidncia da luz. As estruturas celulares que no apresentam tal organizao no modificam o plano de polarizao da luz, e so ditas isotrpicas. O microscpio de polarizao semelhante ao microscpio ptico comum, acrescido de dois prismas ou dois discos polaroides. Um desses elementos colocado no condensador e funciona como polarizador; o outro colocado na ocular e chamado analisador. A funo do polarizador iluminar a clula com um feixe de luz polarizada. O analisador verifica o efeito das estruturas celulares sobre o feixe polarizado. Quando o polarizador e o analisador esto com seus planos de polarizao perpendiculares (cruzados), somente as estru-

-1 1

turas birrefringentes ou anisotrpicas podem ser vistas. Isso ocorre porque elas dividem o feixe polarizado em dois; um deles absorvido pelo analisador, mas o outro, perpendicular ao primeiro, atravessa o analisador e forma a imagem. As estruturas isotrpicas no so observadas, pois no desviam o plano de polarizao da luz, e o feixe que passa pelo polarizador chega inalterado ao analisador, no qual retido.

.,.. Microscpio de contraste de fase. Esse microscpio dotado de um sistema ptico especial que transforma diferenas de fase dos raios luminosos em diferenas de intensidade. Assim, as diferenas de fase, para as quais o olho no sensvel, tornam-se visveis, pois so transformadas em diferenas de intensidade luminosa, facilmente perceptveis (Figura 2.7). O microscpio de contraste de fase pode ser utilizado de modo que as estruturas celulares apaream escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa) - comparar a Figura 2.7C e D.

A velocidade da luz ao atravessar um corpo e o ndice de refrao deste dependem da quantidade de matria presente, isto , da densidade do corpo. Quanto maior for a densidade, menor ser a velocidade da luz no interior desse corpo; menor ser tambm o ndice de refrao.

As diversas estruturas celulares apresentam quantidades diversas de matria e causam atrasos diferentes na luz que as atravessa. Isso provoca diferenas de fase na luz emergente, que, por interferncia, so transformadas em diferenas de amplitude, ocasionando diferenas de intensidade luminosa, s quais a retina sensvel.

O microscpio de contraste de fase empregado, em especial, para o estudo de clulas vivas. de grande utilidade para a observao de clulas cultivadas, cujos crescimento e diviso mittica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes.

O microscpio idealizado por Normaski um tipo de microscpio de contraste de fase que se utiliza da luz polarizada. Assim como no microscpio de fase comum, as estruturas celulares se tornam visveis em razo da interferncia dos raios luminosos emergentes (Figura 2.7B) .

... Microscpio confocal. Clulas isoladas e cortes de tecidos tm espessura maior do que o plano de foco do microscpio ptico. Na prtica, as lminas so examinadas usando-se o artifcio de variar o plano de focalizao por meio do boto micromtrico do microscpio, o que modifica a distncia entre as clulas e a lente objetiva. Com a movimentao do boto micromtrico, um plano da clula entra em foco, enquanto os outros planos saem de foco. Todavia, esse procedimento tem o inconveniente de oferecer uma imagem do plano focalizado que perde nitidez pela interferncia dos raios luminosos que passam pelos planos fora de foco. Na realidade, forma-se uma imagem ntida do plano focalizado e, simultaneamente, a ela est superposta a imagem "borrada" dos outros planos da clula. O microscpio confocal (Figura 2.8) soluciona esse inconveniente do microscpio ptico comum. No microscpio confocal, a iluminao feita por um delgado feixe de raios laser, que varre o corte iluminando apenas, ponto por ponto, um determinado plano da clula, realizando um verdadeiro "corte ptico". A imagem formada exclusivamente pelas estruturas que esto no plano da varredura, sem que os componentes celulares situados em outros planos contribuam para a formao da imagem. No somente a imagem muito


ntida, como tambm a clula pode ser "cortada" durante a microscopia, e as "fatias" obtidas podem ser utilizadas de vrias maneiras. Geralmente, as clulas so submetidas a um composto fluorescente e a luz emitida processada em um computador, que envia os sinais para formao da imagem na tela de um monitor de vdeo. As imagens dos "cortes pticos" assim obtidas podem ser armazenadas no disco do computador e utilizadas para construir uma imagem tridimensional, ou para clculos de comprimento, rea, volume e outras anlises, de acordo com a finalidade do estudo. Uma vez digitalizadas, as imagens podem ser arquivadas para estudos posteriores.

O microscpio eletrnico possibilitou a visualizao de estruturas celulares no visveis ao microscpio ptico por contar com poder resolutivo muito maior A capacidade resolutiva de qualquer microscpio limi

tada pelo comprimento de onda da radiao empregada. A radiao visvel permite distinguir detalhes de 0,2 mm; porm, a forma de objetos menores no visvel.

Recentemente, o microscpio eletrnico foi aperfeioado (Figura 2.9); ele emprega feixes de eltrons, que, acelerados por uma diferena de potencial de 60.000 volts, apresentam um comprimento de onda de 0,005 nm. No momento, no se consegue aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscpios eletrnicos em razo das dificuldades em preservar as clulas e, sobretudo, em obter cortes extremamente finos, imprescindveis para a resoluo mxima.

Os componentes do microscpio eletrnico, representados de modo esquemtico, lembram um microscpio ptico (Figura 2.10). Os eltrons so produzidos graas ao aquecimento, no vcuo, de um filamento de tungstnio - o ctodo - que emite eltrons. Essas partculas so aceleradas em razo de uma diferena de potencial de 60 a 100 k V existente entre o ctodo e o nodo. Este ltimo uma placa perfurada no centro e s permite a passagem de parte dos eltrons, formando um feixe. Os eltrons passam por uma bobina ou lente magntica, tambm chamada condensadora, que os dirige em feixe uniforme na direo do objeto. Aps atravessar o objeto, no qual muitos eltrons so desviados, o feixe passa por outra bobina, que corresponde objetiva do microscpio ptico. Por fim, uma terceira bobina projeta os eltrons sobre uma tela fluorescente - na qual eles formam uma imagem visvel - ou sobre um filme fotogrfico.

Os eltrons desviados por determinadas estruturas da clula em estudo no contribuiro para formar a imagem. Essas estruturas aparecem escuras e so chamadas eltron-densas. Os componentes celulares que desviam uma pequena porcentagem de eltrons aparecero em diversas tonalidades de cinza.

A tela fluorescente em que a imagem se forma uma placa revestida por ZnS (sulfeto de zinco), substncia que emite luz ao ser excitada pelos eltrons. Na prtica, as observaes mais cuidadosas so efetuadas nas micrografias obtidas pela retirada da tela do trajeto dos eltrons, os quais incidiro sobre um filme fotogrfico. Como as emulses fotogrficas so sensveis aos eltrons, elas registram a imagem fornecida pelo aparelho.


Figura 2.7 Comparao entre a microscopia comum e trs tipos de microscopia de interferncia (contraste de fase) na observao de uma clula epitelial sem colorao. A. Microscpio comum. B. Microscopia interferencial segundo Normasky. C. Microscpio de contraste de fase, com fase positiva. D. Microscopia de contraste de fase, com fase negativa. (As fotomicrografias foram gentilmente cedidas pelo Professor Raul Machado.)

t

Figura 2.8 Microscpio confocal Zeiss. (Reproduzido por cortesia do fabricante.)

Depois de revelados, os filmes so ampliados 2 a 4 vezes e as micrografias podem ser examinadas vontade. A tela fluorescente, constituda por partculas relativamente grosseiras, emite pouca luz em relao aos eltrons que recebe e fornece imagem menos contrastada do que a obtida nas ampliaes fotogrficas; por isso, os estudos de microscopia eletrnica so realizados principalmente nas ampliaes em papel fotogrfico, mais do que diretamente no microscpio eletrnico. No microscpio eletrnico, todo o trajeto dos eltrons feito no vcuo, condio necessria para a obteno de um

Figura 2.9 Microscpio eletrnico, modelo EM91 O da empresa Carl Zeiss. (Cortesia do fabricante.)


Condensadora

Tela fluorescente

Figura 2.1 O Trajeto dos eltrons no microscpio eletrnico. O corte de tecido colocado logo acima da bobina ou lente objetiva. A imagem, j aumentada pela objetiva, novamente ampliada por outra bobina, que a projeta em uma tela fluorescente.

feixe de eltrons, que seriam desviados ao colidirem com os tomos do ar; por isso, no se podem examinar clulas vivas, mas apenas clulas fixadas e completamente secas. Todavia, h aparelhos em que so usados baixo vcuo, os quais podem ser utilizados para exame de material que contm gua, embora sem que se possa obter a boa resoluo fornecida pelo microscpio eletrnico comum, que de alto vcuo. A preparao das clulas para a microscopia eletrnica requer cuidados muito especiais. A fixao, em geral, feita em soluo de aldedo glutrico (glutaraldedo) tamponado a pH 7,2. Utiliza-se tambm a fixao em soluo de tetrxido de smio. Na maioria das vezes, esses dois fixadores so empregados em sequncia: primeiro fixa-se o tecido em glutaraldedo e, depois, em smio. O smio, alm de fixador, atua como contraste, por ser um elemento de nmero de massa elevado, que desvia os eltrons. As estruturas que se combinam com o smio aparecero escuras. Alm do smio, outros tomos so empregados para fixar e aumentar o contraste entre os componentes celulares. Aps a fixao com aldedo glutrico, seguida da fixao com smio,

Filamento ~-,1

Objetiva

Projetora

2 J Tecnologia da Biologia Celular e Molecular: Alguns Exemplos

podem-se passar ainda as clulas por solues de sais de urnio ou chumbo. Como as diversas estruturas celulares tm :!.nidades diferentes por esses metais, o contraste melhora quando mais de um deles utilizado.

Em razo do fraco poder de penetrao dos feixes de eltrons utilizados nos microscpios eletrnicos, as clulas devem ser cortadas com uma espessura de 20 a 100 nm. Para isso, necessria a incluso em resina epxi. Os cortes so feitos em micrtomos especiais, que utilizam navalhas de vidro fraturado ou de diamante (Figura 2.11).

Alm do mtodo de contraste com metais que se ligam aos tecidos, chamados de contraste ou colorao positiva, usa-se tambm a chamada colorao negativa (Figura 2.12). Na colorao negativa, clulas, organelas isoladas ou vrus so mergulhados em solues contendo tomos que desviam os eltrons e, depois, examinados no microscpio eletrnico. O corante negativo fica entre as estruturas e penetra em suas depresses e orifcios, de modo que, ao microscpio, a estrutura aparece clara, contornada por um material eltron-denso, que o corante. Essa tcnica muito empregada no estudo de vrus e de organelas isoladas.

Suporte do micrtomo

Durante a microtomia, ao subir, o suporte avana de 50 a 1 00 nm e, ao baixar, deixa um corte flutuando na gua

Os cortes so retirados da gua com o auxlio de uma tela metlica e secos em seguida

Aspectos dos cortes presos tela e prontos para serem "corados" e observados no microscpio eletrnico

Aresta cortante

1 1 14

Tecido includo

1 3 mm :

gua

A

Figura 2.1 1 Algumas etapas da obteno dos cortes para a microscopia eletrnica. Os tecidos so includos em blocos de resina epxi. A. Observa-se o suporte do micrtomo com o bloco a ser cortado e a navalha de vidro. Preso navalha, h um pequeno recipiente contendo gua, sobre a qual os cortes sero recolhidos. B. Os cortes esto sendo coletados em uma tela de 3 mm de dimetro, manejada por meio de uma pina. C. Surge a tela com os cortes. Essa tela submetida soluo de sais de uranila e chumbo, que impregnam os componentes celulares, aumentando seu contraste. Em seguida, a tela levada ao microscpio eletrnico.

A2 m8 o rr 81 f?Mi MM en

-Uma gota da mistura de cido fosfotngstico e bacterifago colocada sobre um filme de celoidina

Ao secar, o cido fosfotngstico deposita-se em torno dos bacterifagos

Quando observado no microscpio eletrnico, o cido fosfotngstico aparece como um halo escuro ressaltando a forma dos bacterifagos

Figura 2.12 Esquema da tcnica de colorao negativa aplicada evidenciao de bacterifago (vrus de bactria), neste exemplo. Com o auxlio de uma pipeta, coloca-se sobre um suporte adequado uma soluo de cido fosfotngstico contendo bacterifagos em suspenso (A1 e A2). Aps a secagem (B1 e B2), o cido fosfotngstico, que desvia o trajeto dos eltrons, acumula-se em volta dos bacterifagos. No microscpio eletrnico, os bacterifagos aparecem claros contra um fundo escuro.

Em determinados casos, sobretudo no estudo dos vrus, utiliza-se tambm a tcnica de sombreamento, em que se faz vaporizao de um metal sobre uma estrutura, segundo certo ngulo (Figura 2.13). Como s um lado da estrutura recoberto pela camada metlica que se deposita durante o processo, sua forma aparece em relevo.

Microscpio eletrnico de varredura. Como o microscpio eletrnico comum ou de transmisso, o microscpio eletrnico de varredura tambm usa um feixe de eltrons. Mas, da em diante, eles pouco tm em comum e, na verdade, so apa-

B

Figura 2.13 A tcnica do sombreamento consiste na deposio de fina camada de metal (ouro, cromo, urnio) sobre a clula em estudo. A. O metal evaporado no vcuo e deve incidir obliquamente sobre o espcime. B. Aspecto observado no microscpio eletrnico.

em resina

relhos complementares. O microscpio eletrnico de transmisso tem poder de resoluo muito maior, enquanto o de varredura tem a vantagem de fornecer imagens tridimensionais, pelo exame da superfcie das estruturas.

Basicamente, o microscpio eletrnico de varredura (Figura 2.14) consiste em um sistema anlogo ao do microscpio de transmisso, que produz um feixe delgado de eltrons cujo dimetro pode ser modificado. O trajeto do feixe de eltrons , em seguida, modificado por um conjunto de bobinas defletoras que o fazem percorrer o espcime ponto por ponto e ao longo de linhas paralelas (varredura).

Ao atingirem o espcime, os eltrons causam diversos efeitos, entre os quais a emisso de eltrons secundrios pelo prprio espcime. Os eltrons secundrios so coletados por um coletor, passam por um sistema de amplificao e so transformados em pontos de maior ou menor luminosidade, em um monitor de vdeo. As micrografias so obtidas pela fotografia da imagem na tela do monitor, e no pela ao dos prprios eltrons sobre um filme fotogrfico, como acontece no microscpio eletrnico de transmisso.

biologia celular e molecular 9ª ed junqueira & carneiro

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