Unidade 4

Seção 2

iStock

Biologia Celular e MolecularBiologia Celular e Molecular

1

Webaula 2Técnicas de extração de DNA

A extração do DNA dos cromossomos ouplasmídeos é a etapa inicial do estudo dagenômica, e atualmente existem diversastécnicas disponíveis para realizar esseprocedimento.

iStock2

Inicialmente, a extração do DNA é feitapela lise das membranas e exteriorizaçãoda molécula.

Em seguida, é necessária uma etapa depurificação, em que ocorre a separação doDNA de outros componentes celulares,como enzimas (principalmente DNAses,que degradam DNA), proteínas, lipídeos,entre outras moléculas.

3

Etapa 1

As células são cultivadasin vitro ou amostradasdo indivíduo.

Etapa 2

As membranas dascélulas sofrem lise,liberando seu conteúdointerno.

Etapa 3

O conteúdo celular étratado, restandosomente o DNA.

Etapa 4

O DNA é precipitado porcomponentes químicose centrifugações, emantido em soluçãoaquosa.

De maneira geral, existem quatro etapas no isolamento do DNA. Clique em cada uma delaspara entendê-las.

4

Após esses procedimentos, pode-se realizarestudos de sequenciamento, melhoramentogenético, testes de paternidade, estudo demarcadores moleculares, entre outros.

iStock5

Extração de DNA de célulasvegetaisA extração a seguir é baseada no protocoloproposto por Doyle & Doyle (1987) paraisolamento de DNA de célula vegetal. Ométodo é fundamentado na utilização dodetergente brometo cetiltrimetilamônio(CTAB), sendo um dos mais utilizados paraextração de DNA vegetal. Adaptações nesseprotocolo são comumente utilizadas parasolucionar problemas intrínsecos do organismoanalisado.

iStock6

Explore a galeria e acompanhe o procedimento para extração de DNA de célula vegetal:

7

• Inicialmente, pese 100 a 300 mg do tecido vegetal desidratado e transfira aamostra para um almofariz. Adicione o nitrogênio líquido até cobrir a amostra emacere cuidadosamente com o pistilo. O nitrogênio irá sublimar, restando apenas aamostra do tecido vegetal macerada, formada por um pó fino e seco. Em caso detecido fresco, será necessária uma amostra maior. • Leve imediatamente o macerado para a capela onde serão acrescentados 2 mL dasolução tampão de extração, 4 µL de β-mercaptoetanol e 70 µL de proteinase K.

Extração de DNA de célulasanimaisO protocolo a seguir é utilizado pela EMBRAPApara análise de amostras de sangue compequeno volume, com base no protocoloproposto por Olerup & Zetterquist (1992), comalgumas adaptações. Em comparação com oprotocolo anterior, aqui é utilizado o detergentedodecilsulfato de sódio (SDS), ao invés de CTABpara lisar as membranas celulares.

iStock8

Agora explore a galeria e acompanhe o procedimento para extração de DNA de célula animal:

9

1. Colher sangue em tubos com anticoagulante EDTA, ajustar o volume comsolução salina (NaCl 0,9 M) e centrifugar por 5 minutos a 390 g, descartando oplasma cuidadosamente para não retirar os leucócitos. 2. Promover a lise de eritrócitos com 10 mL da solução A, misturando o tubo noagitador ou por inversão. Após a lise, centrifugar por 10 minutos a 700 g a 4 °C e,após, dispensar o sobrenadante em um Becker. Se o pellet obtido no precipitado formuito pequeno, realizar nova centrifugação.

A adaptação de protocolos é muito comum, e existem muitaspublicações detalhando a metodologia da extração de DNAde diversos organismos e tecidos. A existência de kitscomerciais também agiliza o processo, e estes possuem umótimo custo-benefício. A prática em laboratórios de biologiamolecular possibilita a adoção de novos métodos de extraçãoe uma maior compreensão dos procedimentos e reagentes eseus similares disponíveis. As técnicas de extração epurificação sofrem constantes mudanças e evoluções, porisso o profissional dessa área deve se manter atualizado emrelação a novas tecnologias e protocolos disponíveis.

10

Android:  https://goo.gl/yAL2Mv

iPhone e iPad - IOS: https://goo.gl/OFWqcq

Aqui você tem na palma da sua mão a biblioteca digital parasua formação profissional.

Estude no celular, tablet ou PC em qualquer hora e lugarsem pagar mais nada por isso.

Mais de 450 livros com interatividade, vídeos, animações ejogos para você.

Você já conhece o Saber?

0:00

11

Bons estudos!12