guia de prácticas - biologia celular y molecular

II CICLOLIMA - PERÚ

Biología Celular y MolecularEscuela Académica Profesional de Farmacia y Bioquímica

Elaborado y revisado por: Blga. MSc. Juana del Carmen Calderón Sánchez Blga. MSc. Ethel Vania Mallqui Brito

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RECOMENDACIONES GENERALES

Normas básicas de conducta en el laboratorio

Como todo ambiente de trabajo, el laboratorio tiene una serie de normas, que rige la conducta, deberes y obligaciones del personal que labora en él y que en una sola palabra lo resumimos como BIOSEGURIDAD; por tal razón, es responsabilidad del personal, respetar y hacer respetar éstas normas en todo momento, a fin de evitar errores en las investigaciones y/o accidentes. Las normas básicas que debemos practicar siempre son las siguientes:

1° La hora de entrada tendrá 5 minutos como máximo de tolerancia, después de este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio

2° Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste y deberá recogerse el cabello para así poder efectuar el trabajo de laboratorio.

3° Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán ser colocadas en los cajones debajo de las mesas de trabajo.

4° No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca. 5° Está PROHIBIDO el uso de teléfonos celulares en el laboratorio y de cualquier otro artefacto que distraiga la

atención del estudiante. 6° Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla. 7° No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse en su sitio sentado y en su equipo de

trabajo y hablar sólo lo necesario con los compañeros. NO se debe jugar o fomentar el desorden en el laboratorio 8° Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al

profesor. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo.

9° Está PROHIBIDO absorber o pipetear cualquier tipo de sustancia con la boca. Usar propipetas (bombillas) u otro dispensador.

10° El uso de guantes y mascarilla, estará restricto al tipo de práctica que se realice.11° El uso de agujas, jeringas y cualquier otro instrumento similar deberá ser restringido a su uso indispensable. Las

agujas y otros elementos punzantes deberán ser descartados en un recipiente resistente. Se deberán evitar los intentos de reintroducir las agujas descartadas en capuchones o de romperlas o doblarlas ya que esta conducta produce aumento de la posibilidad de accidentes por pinchazos o salpicaduras. No usar tijeras con puntas muy agudas. Por ningún concepto las agujas serán retapadas. El conjunto aguja-jeringa deberá ser descartado en el recipiente destinado a tal fin.

12° Asegurarse que los insumos, reactivos y soluciones estén debidamente ROTULADOS y que los frascos o envases no estén deteriorados.

13° Dejar DESCONECTADOS los equipos y CERRADAS las llaves de gas y grifos. 14° Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 15° Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio. 16° Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

Práctica Nº 1NORMAS DE BIOSEGURIDAD

INTRODUCCIÓN

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La bioseguridad se define como un conjunto de normas diseñadas para la protección del individuo, de la comunidad así como del medio ambiente contra el contacto accidental con patógenos biológicos, agentes físicos o químicos. El personal de laboratorio debe cumplir con las normas de bioseguridad y los directivos de la institución deben cumplir con brindar las facilidades para que éstas sean aplicadas.

OBJETIVO

Conocer las principales normas para proteger la salud de las personas que puedan estar expuestas a riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos, físicos y otros en los laboratorios de ensayos biomédicos y clínicos.

AGENTES DE RIESGO

Agentes biológicos; transmitidos por ingestión, inhalación, inoculación y por contacto directo a través de piel o mucosas.

Agentes físicos y mecánicos; como las temperaturas extremas, radiaciones ionizantes, contactos eléctricos o conexiones defectuosas y vidrios resquebrajados de recipientes dañados.

Agentes químicos; que pueden ser corrosivos, tóxicos, carcinógenos, inflamables o explosivos.

NIVELES DE CONTENCIÓN

Cuando las prácticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas medidas corresponden a los equipos de seguridad diseñados para la protección del personal y prácticas de manejo adecuado (barrera primaria), diseño de la instalación y características de la infraestructura de los locales (barrera secundaria).

1. Contención primaria:

Equipos de protección personal. Técnicas de laboratorio estándar y normas de higiene personal. Inmunización. Esterilización y desinfección de instrumentos y superficies.

2. Contención secundaria

Se refiere al diseño y construcción de un laboratorio, contribuye a la protección del personal de laboratorio. Los modos de transmisión en el laboratorio pueden ser insidiosos y algunas veces complicados, debido a que los vehículos y rutas de transmisión difieren de los modos clásicos.

TIPOS DE LABORATORIO CON RELACIÓN AL NIVEL DE BIOSEGURIDAD (NBS)

NBS 1: Microorganismos con muy pocas probabilidades de causar enfermedad humana o animal, agentes biológicos del grupo 1, ejemplo: virus de vegetales, Saccharomyces cerevisiae.

NBS 2: Riesgo individual moderado y riesgo limitado para la comunidad, agentes de riesgo tipo 2, ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella sp.

NBS 3: Riesgo individual alto y moderado para la comunidad, agentes de riesgo tipo 3, ejemplo: M. tuberculosis, Brucella sp, Influenza AN1H1.

NBS 4: Alto riesgo individual como comunitario, agentes peligrosos y exóticos. El laboratorio tiene características especiales de ingeniería y diseño para evitar la diseminación de los microorganismos en el medio ambiente. Agentes biológicos del grupo 4. Ejemplo: Arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa, Machupo, Ebola, Hantavirus y el VIH.

CONCEPTOS BÁSICOS EN BIOSEGURIDAD

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LIMPIEZA: Es la eliminación física de sangre, fluidos corporales o cualquier material extraño visible de la piel u objetos inanimados.

DESINFECCIÓN: Es la destrucción de la infectividad potencial de un material determinado. Es útil con la aplicación de desinfectantes sobre superficies, ejemplo: Hipoclorito de sodio 10%, glutaraldehido 2%, ácido paracético o fenol 10%. Para la desinfección de manos y piel, se utilizan productos menos tóxicos que los anteriores, ejemplo: alcohol yodado 2%, clorheximida 1% o etanol al 70%. Puede hacerse también por ebullición.

ESTERILIZACIÓN: Se define como la ausencia total de microorganismos viables, incluyendo las esporas fúngicas o bacterianas. Se puede lograr por métodos físicos como la temperatura: por calor seco (horno) ó calor húmedo (autoclave) y; en frío por filtración y centrifugación. Las radiaciones métodos físicos útiles para la esterilización de plásticos, sondas y alimentos. La esterilización por métodos químicos se puede hacer con óxido de etileno o peróxido de hidrógeno.

PARÁMETROS DE PROTECCIÓN RADIOLÓGICA

RADIACTIVIDAD: Fenómeno que consiste en la emisión de radiaciones que poseen ciertos elementos (ejemplo: radio, uranio, etc.) los cuales son capaces de atravesar capas metálicas delgadas e ionizar gases. RIESGO

RADIOLÓGICO: Es la probabilidad de sufrir daño por efecto de las radiaciones provenientes de un material radiactivo (cobalto 60) o un equipo generador de las mismas (rayos X). Los riesgos radiológicos, son para nuestros sentidos impalpables, invisibles, inodoros y no pueden ser detectados sino con la ayuda de aparatos especiales. Existen dos clases de riesgo radiológico:

IRRADIACIÓN: Cuando el cuerpo o parte del cuerpo de un individuo está sometido a las radiaciones emitidas. Puede ser interna o externa (más común).

Protección contra irradiación interna• Depende de las propiedades químicas de la sustancia incorporada y cuya eliminación dependerá del

período de semidesintegración del material. Otra consideración importante, es la utilización de vestimentas y equipos especiales.

Protección contra irradiación externa • Existen tres parámetros que permiten una mejor protección:

a. Tiempo: Útil si se limita el tiempo de exposición y si se considera la utilización del decaimiento radiactivo.

b. Distancia: Alejamiento de la fuente radiactiva y uso de telepinzas robots, etc.c. Blindaje: Protección física con materiales de plomo, hormigón, agua pesada, aluminio etc.

CONTAMINACIÓN: Consiste En el contacto físico directo con material radiactivo. Puede ser externa o interna (más común).

Reglas para evitar la contaminación por radiación• No manipular material radiactivo sin guantes.• No pipetear líquidos bajo ninguna circunstancia.• No fumar comer, beber o maquillarse dentro de la zona de riesgo.• No utilizar objetos personales.• Lavarse las manos con frecuencia.• Proveer recipientes reservados para los residuos radiactivos.• No dejar subsistir una contaminación que pueda ser fácilmente eliminada.

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CUESTIONARIO

1. Elaborar una relación de 20 microorganismos y ubicar el NBS al que pertenecen.

2. ¿Qué es radioterapia y cómo se administra?

3. ¿Qué alimentos actualmente son irradiados y son consumidos por el hombre?.

4. Investigue 5 equipos de protección para el personal y 5 equipos de seguridad para un laboratorio, mencione su uso y/o utilidad

5. ¿Cuál es el manejo y disposición de residuos contaminantes?

Escriba las referencias bibliográficas.

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Práctica N° 2 MICROSCOPÍA ÓPTICA

INTRODUCCIÓN

El perfeccionamiento del microscopio óptico ha contribuido a lograr avances significativos en los estudios citológicos, como mediciones celulares o cuantificación de células en las muestras.

Con el microscopio óptico podemos ver las células y algunas de sus estructuras en virtud de su capacidad para interaccionar con los colorantes, siendo el poder de resolución bajo. Sin embargo con el microscopio electrónico, podemos estudiar las diversas estructuras y su función, incluso elementos subcelulares debido a su alto poder de resolución.

El microscopio óptico consta de tres sistemas: el mecánico, el óptico y el de iluminación, cada uno de los cuales presentan una función y cuidados específicos. Al ser el microscopio un aparato de precisión, requiere que se maneje y cuide de manera muy especial y rigurosa.

OBJETIVOS

1. Valorar la importancia del microscopio como instrumento básico para el estudio e investigación en las Ciencias Biológicas y afines.

2. Familiarizar al alumno con el microscopio, reconocer sus partes y función de cada una de ellas. 3. Adiestrar al alumno con la interpretación de las microfotografías, calcular sus dimensiones reales.

CONCEPTOS BÁSICOS

Contraste: Relación entre la iluminación máxima y mínima de un objeto. Poder de resolución: Capacidad para poder distinguir dos objetos (puntos) como distintos y separados en vez

de “manchas borrosas” (permite distinguir detalles finos).

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Amplificación: Es la proporción entre el tamaño de la imagen que se ve al microscopio y el tamaño real del objeto.

MATERIALES

Microscopio óptico Papel impreso de periódico Letra “e” recortada de algún periódico Lamina con muestra clínica fijada 10 Lámina portaobjetos y cubreobjetos Algodón, alcohol, goteros, agua destilada.

CONSIDERACIONES

• Se ejercitará al alumno el uso y manejo del microscopio óptico.

1° Manejo del microscopio óptico 2° Conectar el microscopio a una toma de corriente. 3° Prender el microscopio. 4° Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. 5° Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 6° Comenzar la observación con objetivo de menor aumento. Si la preparación es de bacterias emplear el

objetivo de mayor aumento (objetivo de inmersión, ver punto 9). 7° Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

8° Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino.

9° El empleo del objetivo de inmersión es siempre utilizando aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO I

• Identificar en el microscopio compuesto, las partes que se mencionan a continuación y anotar las funciones de cada una de ellas: Sistema óptico: Lente ocular y Lente objetivo Sistema de iluminación: Fuente de luz o Espejos, Condensador, Diafragma Sistema mecánico: Tubo o Brazo, Pinzas o carro, Tornillo micrométrico, Tornillo Macrométrico, Revolver,

Platina, Base o pie

PROCEDIMIENTO II

A. Observación de la letra “e” • En un portaobjetos limpio y seco colocar una letra “e” recortada de alguna impresión, cubrir con una gota de

agua y colocar el cubreobjeto, retirar el exceso de agua con un poco de algodón. Enfocar la muestra • Observar al microscopio, primero con el objetivo de menor aumento (4X ó 10X) y por último con el objetivo de

(40X).

B. Observación de la muestra clínica fijada • Colocar en la platina la muestra clínica fijada. Enfocar la muestra • Observar al microscopio, primero con el objetivo de menor aumento (4X ó 10X) y por último con el objetivo de

(40X).

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OBSERVACIONES

Observación de la letra “e”

Observación de la muestra clínica fijada

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RESPONDA A LAS SIGUIENTES PREGUNTAS

1. ¿En qué posición se observa la letra “e” al microscopio? ______________________________________________2. Mueva la lámina hacia adelante. ¿Hacia dónde se mueve la letra? ______________________________________3. Mueva la lámina hacia la derecha. ¿Hacia dónde se mueve la letra? _____________________________________

PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los sistemas que conforman un microscopio?

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2. ¿A qué se llama Límite de Resolución?

3. ¿Qué función tiene el aceite de inmersión cuando se observa con el objetivo de 100 aumentos?

4. ¿Cuál es el fundamento del microscopio electrónico para observar imágenes de mayores aumentos?

Escriba la fuente de información.

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Práctica N° 3INTERPRETACIÓN DE MICROFOTOGRAFÍAS

Para estimar el tamaño de alguna estructura celular en la microfotografía, realice los siguientes pasos:

1° Localice la magnificación de la microfotografía : M 2° Utilice regla milimetrada y mida la estructura : Y 3° Realice la siguiente operación:

Magnificación de microfotografía (X) = 50 000 Medida de la estructura (Y) = 0,3 mm

DESARROLLO

1 micra es la milésima parte de un milímetro y 1 centímetro está formado por 10 milímetros; entonces si multiplicas 1000 x 10 = 10000 micras , que es lo que hay en 1 centímetro.

Por lo tanto la estructura en estudio mide:

• Aplicando conversiones:

PROCEDIMIENTO

Mida las siguientes microfotografías:

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1 magf. M

=X Y mm

1 mm 1 000 X mm 50 000 X mm =

(50 000 )(1 mm)1 000

= 50

mm

1 50 mm

= X 0,3 mm

=

0,006


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Práctica N° 4DIFERENCIA ENTRE CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

INTRODUCCIÓN

La célula constituye la unidad biológica de los seres vivos. Representa la mínima estructura necesaria para que se pueda observar la totalidad de las manifestaciones características de la vida incluyendo la reproducción. Por lo tanto la célula constituye el primer nivel en el que puede llevarse a cabo la unidad de un sistema vivo completo.

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Existen células procariotas como las bacterias donde el material genético no se encuentra limitado por una membrana, no presenta organelas membranosas, presenta una pared celular rígida. Están adaptadas a vivir en una gran variedad de ambientes. Para diferenciarlas es importante reconocer la forma y la técnica de coloración diferencial de Gram.

Las células eucariotas presentan una estructura más compleja, con núcleo y organelas membranosas.

OBJETIVOS

1. Adquirir la destreza en el uso del microscopio óptico. 2. Aprender las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas en el estudio microscópico de

cultivos bacterianos, raspados o hisopados. 3. Identificar las principales formas bacterianas. 4. Observar e identificar la morfología de las células.

MATERIALES

Microscopio óptico Láminas portaobjetos, cubreobjetos Azul de metileno Aceite de inmersión Recipiente para las tinciones Soporte para las preparaciones Láminas coloreadas Picetas Mecheros Hisopos, mondadientes Algodón Alcohol Goteros, pipetas Batería de coloración Gram (cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina)

MATERIAL BIOLÓGICO

Epitelio bucal Alba dental Biolactol (presentación farmacológica).

PROCEDIMIENTO

I. PREPARACIÓN DE FROTIS1. Los portaobjetos deben estar limpios y libres de grasa. 2. Marcar cada portaobjeto a ser utilizado. 3. Colocar una gota de agua en el centro de cada portaobjeto.

a. Frotis de mucosa bucal: Con el hisopo frotar suavemente la cavidad bucal y extenderlo en el centro del portaobjeto.

b. Frotis de sarro dentario: Con el mondadiente obtener sarro dentario y extenderlo en el centro del portaobjeto.

c. Frotis de cultivo bacteriano: Con la ayuda de un gotero colocar una gota en el centro del portaobjeto y cuidadosamente extenderlo.

II. FIJACIÓN DEL FROTIS1. Con la ayuda de un mechero fijar al calor.

III. COLORACIÓN 1. Los frotis con Biolactol y sarro dentario, proceder a realizar la coloración Gram:

Agregar cantidad suficiente de cristal violeta x 2’, trascurrido el tiempo enjuagar con agua y con ayuda de la pizeta.

Agregar lugol x 2’, transcurrido el tiempo eliminar el excedente (NO ENJUAGAR). Decolorar con alcohol-acetona, tantas veces sea necesario (hasta obtener una muestra libre de

colorante). Contracolorear con safranina x2’, transcurrido el tiempo enjuagar y secar al calor con ayuda del mechero.

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2. Frotis con hisopado bucal colorear con azul de metileno 5’, enjuagar con agua y secar al calor con ayuda del mechero.

IV. OBSERVACIÓN 1. Colocar los portaobjetos en la platina y ubicar las preparaciones con el objetivo de menor aumento 10X.2. Para la observación cambiar con el objetivo de 100X agregando una gota de aceite de inmersión. 3. Dibujar lo observado.

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CUESTIONARIO

1. Fundamente la coloración Gram.

2. Fundamente 5 métodos de coloración para la observación de célula eucariota.

3. Escriba diferencias entre célula procariota y eucariota.

4. ¿Qué estructuras ha podido identificar?. Precise sus respuestas en cada esquema.


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Práctica N° 5PERMEABILIDAD CELULAR FUNDAMENTO

INTRODUCCIÓN

La práctica se fundamenta que en células animales y células vegetales, se dan los procesos de intercambio de solutos y solventes con su medio ambiente a través de sus membranas asegurando así los procesos de ósmosis. Pero, además de membranas, las células vegetales presentan pared celular hacia el lado externo de la misma Esta pared porosa que brinda sostén y protección está formada por las secreciones celulares, básicamente carbohidratos, los cuales son los sillares del compuesto orgánico más abundante en la naturaleza, la celulosa.

OBJETIVOS

1. Identificar la presencia de pared celular de la célula vegetal y otros componentes con ayuda de ciertos colorantes.

2. Identificar los eritrocitos humanos. 3. Evidenciar el proceso de ósmosis con soluciones isotónicas, hipertónicas e hipotónicas en célula vegetal y

animal.

MATERIALES

Láminas portaobjetos Laminillas cubreobjetos Hoja de Gilette Solución de NaCl 0,2%, 0,9% y 5% (100 ml c/u) Azul de metileno Lugol

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Pizetas Goteros Lancetas Algodón, alcohol, guantes de látex.

MUESTRA BIOLÓGICA

Bulbo Allium cepa (cebolla). Glóbulos rojos

PROCEDIMIENTO

I. RECONOCIMIENTO CELULAR

1.1. Estructura vegetal1° Realizar cortes muy finos de la epidermis de cebolla.2° Colocar la muestra sobre lámina portaobjeto y adicionar una gota de agua.3° Colocar la laminilla y observar al microscopio 10x y 40x.4° Finalizada la observación levantar con cuidado la laminilla y añadir gotas de azul de metileno o

lugol5° Observar al microscopio 10x y 40x.6° Dibujar lo observado, especificando sus partes.

1.2. Eritrocitos

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1° Limpiar el pulpejo del dedo de la mano con algodón y alcohol. 2° Con la ayuda de una lanceta introducir en la zona desinfectada. 3° Colocar una gota de sangre en una lámina portaobjeto previamente desengrasada. 4° Observar a 40X. 5° Dibujar lo observado, especificando partes.

II. PROCESO DE ÓSMOSIS

2.1. Célula vegetal1° Colocar 3 muestras finas del catáfilo de Allium cepa sobre láminas portaobjetos.2° Agregar varias gotas de las diferentes soluciones de cloruro de sodio a cada muestra (0,2%,

09% y 5%), por separado. ROTULAR LAS MUESTRAS.3° Colocar laminilla cubreobjetos y observar al microscopio (10x y 40x).4° Levantar cuidadosamente la laminilla y adicionar 1 gota de azul de metileno. Observar a 10x y

40x.5° Dibujar lo observado, especificando partes y procesos.

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A. Célula vegetal en SOLUCIÓN ISOTÓNICA

B. Célula vegetal en SOLUCIÓN HIPERTÓNICA

C. Célula vegetal en SOLUCIÓN HIPOTÓNICA

2.2. Eritrocitos 1° Colocar 3 muestras con una gota de sangre sobre láminas portaobjetos. 2° Agregar varias gotas de las diferentes soluciones de cloruro de sodio a cada muestra, por

separado. ROTULAR LAS MUESTRAS. 3° Colocar laminilla cubreobjetos y observar al microscopio (10x y 40x) 4° Dibujar lo observado, especificando partes y procesos.

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A. Eritrocito en SOLUCIÓN ISOTÓNICA

B. Eritrocito en SOLUCIÓN HIPERTÓNICA

C. Eritrocito en SOLUCIÓN HIPOTÓNICA

CUESTIONARIO

1. ¿Qué función cumple el azul de metileno en ésta práctica?.

2. Describa las diferencias del proceso de permeabilidad en célula animal y vegetal.

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3. ¿Por qué los eritrocitos se lisan?.


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Práctica N° 6OBSERVACIÓN – CÉLULA ANIMAL TEJIDO ADIPOSO

FUNDAMENTO

El tejido adiposo es uno de los tejidos más abundante, representa alrededor del 15-20% del peso corporal del hombre y del 20 – 25% del peso corporal en mujeres. Los adipocitos almacenan energía en forma de triglicéridos. Debido a la baja densidad de estas moléculas y su alto valor calórico, el tejido adiposo es muy eficiente en la función de almacenaje de energía.

TEJIDO EPITELIAL

Fundamento El epitelio es un tejido compuesto por células muy próximas entre sí, sin sustancia intercelular y es avascular. Los epitelios recubren todas las superficies libres del organismo, tanto internas como externas. La superficie externa representa la epidermis, recubre todos los pasajes internos como el tubo digestivo, vías aéreas y vías urogenitales. Durante el desarrollo embrionario los epitelios pueden producir prolongaciones en el tejido conectivo subyacente y formar glándulas, pudiendo dividirse en epitelio de revestimiento y epitelio glandular.

MATERIALES

Microscopio óptico Centrífuga Tubos de ensayo Gradilla Bisturí Láminas portaobjetos y laminillas Formol, sudan III, Azul de metileno, Cristal violeta Pipetas Pizetas Mecheros Goteros, alcohol, algodón, guantes de látex Soporte para preparaciones Bandeja para coloraciones

PROCEDIMIENTO

I. TEJIDO ADIPOSO 1° Con ayuda de un bisturí, cortar una fina capa de tocino, colocarla sobre una lámina portaobjetos y

cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4’. 2° Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudán III. Dejar actuar unos 5’. 3° Volver a lavar la preparación con agua, cubrirla con cubreobjeto y observar al microscopio 10X y 40X. 4° Esquematice los resultados de su observación que justifique los objetivos específicos planteados.

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II. CÉLULAS EPITELIALES

2.1. Muestra de orina 1° En un tubo de ensayo colocar aproximadamente 5ml de orina. 2° Centrifugar a 3000 rpm x 3’ (contrapesar los tubos en la centrífuga). 3° Eliminar el sobrenadante. 4° Colocar en un portaobjeto una gota del sedimento con la ayuda de un gotero, cubrir con laminilla5° Observar 10X y 40X.6° En otro portaobjetos colocar una gota del sedimento y fijar al calor.7° Colorear con cristal violeta por 4’, enjuagar el exceso con la ayuda de la pizeta, secar al calor y

enfocar campo a 10X y observar a 100X.8° Esquematizar sus observaciones, especificar lo observado que justifique los objetivos

planteados.

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2.2. Muestra raspado epitelial 1° Con mucho cuidado realizar un raspado de piel con el bisturí y colocarlo sobre un portaobjeto. 2° Colorear con azul de metileno. 3° Cubrir con una laminilla. 4° Enfocar campo a 10X y observar a 100X. 5° Dibujar sus observaciones, especificando lo observado.

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CUESTIONARIO

1. Fundamente la aplicación del sudan III.

2. Describa el tejido adiposo.

3. ¿Qué función cumple el cristal violeta en esta práctica?.

4. Escriba la clasificación del tejido epitelial.


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Práctica N° 7OBSERVACIÓN MITOCONDRIAS – FERMENTACIÓN

FUNDAMENTO

Frecuentemente se ha definido la respiración como el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono entre un organismo vivo y el medio. Existen procesos en los que no se consumen oxígeno, aunque se libera dióxido de carbono. Estos son los llamados procesos anaeróbicos. La fermentación es uno de ellos. Aquellos procesos en que hay un consumo de oxigeno son procesos aeróbicos.

Sin embargo lo más característico de la respiración no es el intercambio de gases, sino la liberación de energía que ocurre durante el proceso, anaeróbico y aeróbico, y de la cual depende, en última instancia el funcionamiento orgánico. Para que esto ocurra el organismo vivo debe utilizar un combustible, un sistema enzimático y un sistema de transferencia energética. El combustible generalmente es el carbohidrato, pero puede ser también una grasa o una proteína, en ese orden. El sistema enzimático está dentro de la célula y el sistema de transferencia lo constituye los enlaces de alta energía de moléculas de tipo nucleótido, principalmente ATP.

OBJETIVOS

Establecer los procesos celulares implicados en la respiración y reconocer a las mitocondrias.

MATERIALES Y EQUIPOS

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Pasas Levadura de pan Papel filtro Láminas Laminillas Hisopos Frascos de vidrio con tapón Tubos de ensayo de 16 X 150 mm Vaso de precipitado de 100 cc Gradilla para tubos de ensayo Solución Azul de Bromotimol Verde de Janus Microscopio compuesto

PROCEDIMIENTO

A. Proceso de fermentación 1° 1 semana previa a la práctica obtenga un trozado de pasas en agua y macérelo en un frasco con

tapa hermética. Llévelo el día de la práctica al laboratorio. 2° Prepare el papel filtro con la solución de azul de Bromotimol, dejándolo secar. 3° Destape el frasco, reconozca el aroma y luego aplique firmemente el papel filtro. 4° Observe y registre el cambio de coloración del papel.

B. Observación de mitocondrias 1° Obtenga una muestra de epitelio de la cavidad bucal con un hisopo.

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2° Realice el frotis en la forma usual y deje secar al medio ambiente. 3° Cubra la muestra con verde Janus durante 5 minutos. 4° Elimine el exceso de colorante y deje secar al medio ambiente. 5° Observe al microscopio 10X y 40X, las mitocondrias y descríbalas. 6° Dibuje sus observaciones.

Cuestionario 1. Explique para que empleamos el indicador azul de Bromotimol, en la experiencia de fermentación

realizada.

2. Enumere los ejemplos de aplicación práctica del proceso de fermentación.

3. Explique el fundamento de emplear el colorante verde de Janus.

Escriba la fuente de información

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Práctica N° 8OBSERVACIÓN CÉLULA VEGETAL

FUNDAMENTO

Por lo general las células animales son translúcidas al microscopio óptico debido a su bajo contraste con su entorno, sin embargo dada su capacidad tintorial con determinados colorantes se pueden apreciar algunas de sus estructuras como algunas organelas, las cuales según sus propiedades químicas, reaccionarían con algunos colorantes bajo determinadas condiciones. Sin embargo las células vegetales si contrastan con su entorno, debido a la presencia de plastidios que contienen diferentes pigmentos. El plastidio más conocido es el CLOROPLASTO con su pigmento CLOROFILA, pero existen otros plastidios conocidos como cromoplastos los cuales presentan otro tipo de pigmentos.

Los plastidios son orgánulos exclusivos de vegetales, provistos de una doble membrana, y tienen como función el almacén y la síntesis de sustancias.

Pueden ser:

A. Indiferenciados: a) Proplastos : son el origen de los demás plastidios. b) Etioplasto : proplastos diferenciados en ausencia de luz.

B. Diferenciados: a) Cloroplastos : fotosintéticamente activos. b) Cromoplastos : fotosintéticamente inactivos o poco activos. c) Leucoplastos : • Amiloplastos: acumulan almidón. • Oleplastos: acumulan lípidos. • Proteinoplastos: acumulan proteínas.

La EPIDERMIS es un tejido formado por una única capa de células unidas entre sí, sin dejar espacios intercelulares. Se encuentra en las hojas, tallo y raíces de las plantas jóvenes. Sus células no poseen cloroplastos y pueden estar engrosadas exteriormente con materiales lipídicos, formando una capa impermeable llamada cutina. Cuando esto es así, la capa de cutina impide el necesario intercambio de agua y gases con la atmósfera, por lo que aparecen, especialmente en el envés de las hojas, unas estructuras

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denominadas estomas que hacen posible ese intercambio. Los estomas poseen mecanismos que regulan su apertura y cierre.

OBJETIVOS

1. Observar la morfología típica de las células vegetales. 2. Observar y distinguir las diversas organelas celulares en células vegetales. 3. Observar la presencia de estomas.

MATERIALES

Microscopio óptico Láminas portaobjetos Laminillas cubreobjetos Lugol Hoja de Gilette Pizeta Algodón, alcohol

MATERIAL BIOLÓGICO

Elodea sp. (Planta de acuario). Daucus carota (zanahoria). Licopersicum esculentum (tomate). Capsicum frutensis (ají). Solanum tuberosum (papa). Allium ampeloprasum var porrum (poro).

PROCEDIMIENTO

A. Observación de cloroplastos 1° Tomar una hoja de Elodea sp y colocarlo sobre una lámina portaobjeto con una gota de agua. 2° Cubrir con laminilla. 3° Observar a 10X y 40X. 4° Dibujar lo observado, especificando partes y organelas.

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B. Observación de cromoplastos

1° Realizar cortes muy finos de las muestras biológicas 2° Colocar cada corte sobre una gota de agua. 3° Cubrir con laminilla. 4° Observar a 10X y 40X. 5° Dibujar lo observado.

NOTA: La observación del tomate es con la pulpa, tomando una pequeña porción y presionarlo con ayuda de la yema de los dedos sobre una laminilla.

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C. Observación de leucoplastos 1° Realizar cortes muy finos de la papa. 2° Sobre una gota de agua colocar la muestra. 3° Cubrir con laminilla. 4° Observar 10X y 40X.5° Dibujar lo observado.

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6° Levantar cuidadosamente la laminilla y agregar una gota de lugol. 7° Observar 10X y 40X. 8° Dibujar lo observado.

D. Observación de estomas (poro) 1° Realizar cortes muy finos de la epidermis de la hoja de poro (parte blanca) y colocarla sobre una

lámina portaobjeto. 2° Colocar dos o tres gotas de agua. 3° Tener precaución que sea una capa incolora y que esté perfectamente extendida. 4° Examinar la preparación al microscopio 10x y 40x. 5° Al igual que el procedimiento anterior colocar una gota de azul de metileno 6° Observar al microscopio 10x y 40x. 7° Esquematizar sus observaciones, especificando partes que justifique los objetivos planteados.

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué pigmentos presentan las muestras biológicas en estudio?. Fundamente su respuesta.

2. Describa la composición de la clorofila.

3. ¿Qué importancia tienen los amiloplastos?. Fundamente su respuesta.

4. Describa importancia de los estomas. Fundamente su respuesta.


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Práctica Nº 9EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

FUNDAMENTO

La clorofila es el pigmento verde que está presente en las especies vegetales fotosintéticas. No se encuentra difundida en el citoplasma, sino en los cloroplastos. Estos que son de formas variadas, están constituidos por una trama de estructura proteica sobre la cual están fijados los pigmentos fotosintéticos, clorofila y pigmentos accesorios. Estos pigmentos presentan un grado diferente de solubilidad en los disolventes lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía o de filtro) dispuesta verticalmente sobre una película de disolventes orgánicos (por ejemplo etanol-bencina), ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende. Las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de filtro. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores que estarán más o menos alejados de la disolución alcohólica según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.

OBJETIVOS

Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante la técnica de cromatografía en papel.

MATERIALES Y EQUIPOS

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Mortero Embudo Matraz Papel de filtro (paso rápido y paso lento) Placa Petri Tubo de ensayo Gradillas Alcohol 96 Bencina Hojas de espinaca

PROCEDIMIENTO

1° Lavar las hojas de espinacas, retirar las nervaduras y ponerlas en un mortero, junto con el alcohol. 2° Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso. Filtrar

con un embudo y papel de filtro. 3° Colocar el filtrado en una placa Petri y sobre ella colocar un rectángulo de unos 15 centímetros de ancho

por 10 centímetros de alto doblado en V (papel filtro) para que se mantenga en pie sobre la placa de Petri. 4° Dejar así el montaje y esperar un tiempo breve. Los pigmentos se irán separando según su adsorción.

RESULTADOS

Observar en el papel donde se ha efectuado la cromatografía hasta cuatro bandas o zonas (ver figura) que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas. Según su grado de solubilidad con los solventes se reconocen estas bandas y en este orden:

1° Clorofila b 2° Clorofila a 3° Xantofila 4° Carotenos

Dibujar en cada caso la placa con los resultados obtenidos.

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CUESTIONARIO

1. Qué es el Rf y como se aplica para la cromatografía en capa fina?

2. ¿Qué otras variantes de esta técnica pueden emplearse para la separación de sustancias?

Escribir la fuente de información.

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}

Práctica N° 10OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA DEL NÚCLEO CELULAR

INTRODUCCIÓN

Uno de los rasgos distintivos del dominio Eucaria, es la presencia del núcleo, que siendo de diferente tamaño y forma se encuentra rodeado por una envoltura nuclear, encerrando toda LA INFORMACIÓN GENÉTICA contenida en el ADN y gracias a diversos eventos citológicos – moleculares, es capaz de duplicarse y transmitir una copia exacta a las células hijas. Uno de estos eventos moleculares es la mitosis, la cual es un tipo de reproducción asexual indirecta en la que se pueden observar las distintas fases conocidas y características de este tipo de reproducción que dura apenas dos horas del ciclo celular completo; también la producción de gametos es parte importante del desarrollo celular mediante la gametogénesis.

Para nuestro estudio hemos decidido tomar como muestra las células sanguíneas sometidas a una coloración especial permiten diferenciar las diferentes formas y tamaños de los leucocitos.

OBJETIVOS

1. Ensayar las técnicas de coloración para la observación microscópica de células sanguíneas. 2. Observar e identificar la morfología de las células sanguíneas. 3. Adiestrar al alumno en las técnicas hematológicas.

MATERIALES

Lancetas Algodón Etanol 96º Metanol Colorante Wright Pizetas Láminas portaobjetos Soporte para coloración Bandeja para coloración Microscopio óptico Aceite de inmersión Láminas fijadas

MATERIAL BIOLÓGICO

Muestra de sangre humana

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PROCEDIMIENTO

1° Limpiar la yema del dedo de un alumno con algodón y alcohol. 2° Aplicar un piquete con la punta de la lanceta en ángulo recto. 3° Descartar la lanceta. 4° Presionar la yema del dedo colocando una gota de sangre sobre el portaobjeto. 5° Realizar un frotis (película muy delgada) con ayuda de una lámina biselada, en ángulo de 45º y dejar

secar a temperatura ambiente 6° Fijar la muestra con metanol 5’ y dejar secar al medio ambiente 7° Colorear con la solución Wrigth 15’ – 30’. Enjuagar con agua corriente y dejar secar. 8° Observar al microscopio con el objetivo de inmersión. 9° Dibujar lo observado, especificando morfología nuclear y tamaño aproximado.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

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1° Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, teñidos de rojo (enucleados). 2° Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia del núcleo, teñido de morado.

Hay varias clases de leucocitos: Linfocitos, Monocitos, Neutrófilos, Basófilos y Eosinóflios. 3° En un frotis sanguíneo también se puede observar plaquetas (derivan de la fragmentación de los

megacariocitos precursores). 4° Dibujar lo observado

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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué los glóbulos rojos del humano no tienen núcleo? Fundamente su respuesta.

2. ¿En qué consiste un hemograma, qué parámetros se toma en cuenta y por qué es importante para el ser humano?

3. ¿Qué es hematopoyesis? Esquematice.

Escriba la fuente de información.

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Práctica Nº 11

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ESTUDIO DEL CARIOTIPO HUMANO

FundamentoSe denomina cariotipo al conjunto de cromosomas de una especie determinada. Su determinación se realiza observando durante la metafase la dotación cromosómica de una célula y la obtención de una fotografía de esta observación permite investigaciones genéticas sobre ese individuo o esa especie.

La dotación cromosómica normal de la especie humana es de 46,XX para las mujeres y de 46, XY para los varones. En el cariotipo humano los cromosomas se ordenan de mayor a menor. Hay cromosomas grandes, medianos y pequeños. Al ordenar los cromosomas se constituyen 7 grupos atendiendo no sólo al tamaño sino también a la forma de las parejas cromosómicas, dentro del cariotipo humano podemos encontrar cromosomas metacéntricos (tienen los dos brazos aproximadamente iguales en longitud), submetacéntricos (con un brazo más pequeño que otro) y acrocéntricos (con un brazo corto muy pequeño).

Concretamente en el cariotipo humano hay 7 grupos de cromosomas. Dentro de cada grupo vamos a ordenar y reconocer los cromosomas con la ayuda de un idiograma. Un idiograma es la representación esquemática del tamaño, forma y patrón de bandas de todo el complemento cromosómico, los cromosomas se sitúan alineados por el centrómero y con el brazo largo siempre hacia abajo.

Los grupos que comprende el cariotipo humano son los siguientes:

A. Cromosomas grandes• Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), meta y submetacéntricos • Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacéntricos

B. Cromosomas medianos • Grupo C, (cromosomas 7, 8, 9, 10, 11, 12 y además los cromosomas X), submetacéntricos • Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocéntricos

C. Cromosomas pequeños • Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacéntricos• Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacéntricos • Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocéntricos Por acuerdo los cromosomas sexuales X e Y se separan

de sus grupos correspondientes y se ponen juntos, al final del cariotipo.

OBJETIVOS

1. Reconocer los cromosomas humanos. 2. Elaborar un cariotipo a partir de una fotografía y saber determinar las anomalías cromosómicas más

frecuentes.

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CARIOTIPO HUMANO

PROCEDIMIENTO

1. Coloca en su respectivo par homólogo

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Los técnicos de los laboratorios compilan los cariotipos y después usan una notación específica para caracterizar su cariotipo. Esta notación incluye el número total de cromosomas, los cromosomas de sexo y algunas cromosomas extras o perdidos. Por ejemplo, 47, XY, +18 indica que el paciente tiene 47 cromosomas, es masculino y tiene un cromosoma 18 extra. 46, XX es una mujer con un número normal de cromosomas. 47, XXY es un paciente con un cromosoma de sexo extra.

En la siguiente tabla aparece información sobre alteraciones cromosómicas más frecuentes en la especie humana.

Cariotipo Paciente 1

60


Turner

CARIOTIPO 1

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Paciente 2

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Número de cromosomas: ____________________

Sexo : ____________________

Cariotipo del individuo : ____________________

Tipo de desorden :____________________


Tri 21

CARIOTIPO 1

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ANEXOS

COMPOSICIÓN DE COLORANTES Y SUSTANCIAS

1. Alcohol-ácido: decolorante para tinción Ziehl – Neelsen Ácido clorhídrico concentrado 3 mlEtanol 95% 97 ml

2. Lugol: solución de yodo para tinción Gram Yodo 1g Yoduro potásico 2 gsAgua destilada 100 ml

3. Azul de metileno: colorante de contraste Azul de metileno 1 gAgua destilada 100 ml

4. Safranina saturada Safranina 2,5gs. Alcohol etílico 100ml

5. Cristal violeta: para tinción Gram y tinción simple Cristal violeta 0,5 g Agua destilada 100 ml

6. Wright solución stock Clorhidrato de azul de metileno 9 gsCarbonato de sodio al 5% 100 ml Eosina 1g Agua destilada 150 ml

7. Sudan III Sudan III 3 g Alcohol etílico 100 ml

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Watson, J. (2008). Molecular Bilogy of the Gene. España: Médica Panamericana. (Quinta edición).

2. Casco V. et al. Compendio de Biología Celular y Molecular 2009. Hallado en:http://uader.edu.ar/fcvs/biblioteca/info_interes/compendio_2009.pdfAcceso enero 2012.

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Número de cromosomas: ____________________

Sexo : ____________________

Cariotipo del individuo : ____________________

Tipo de desorden :____________________

http://uader.edu.ar/fcvs/biblioteca/info_interes/compendio_2009.pdf


3. Alberts, B. (2006). Introducción a la Biología Celular. España: Médica Panamericana. (Segunda edición).

4. Karp, G (2005). Biología Celular y Molecular. México: Mc. Graw Hill. (Cuarta edición).

5. Luque, J. (2001). Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Harcourt.

6. De Robertis, E. (2000). Biología Celular y Molecular. Argentina: El Ateneo.

7. Berkaloff, A. (1983). Biología y Fisiología Celular. España: Omega.

8. Productos químicos. Hallado en:http://chemicalland21.com/specialtychem/finechem/sudan%20iii.htm.Acceso enero 2012.

9. Biología Celular y Molecular. Hallado en:http://biociencias.bq.uam.es/master_biologia_molecular_celular/.Acceso enero 2012.

10. Manual de Biología Celular y Molecular. Hallado en: http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/.Acceso enero 2012.

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http://chemicalland21.com/specialtychem/finechem/sudan%20iii.htm

guia de prácticas - biologia celular y molecular

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