resumos de biologia molecular

7/29/2019 Resumos de Biologia Molecular

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Apontamentos de Biologia Molecular, Licenciatura em Bioqumica

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Aula 1 Conceito de GeneIntroduo

Objectivos da Biologia Molecular

A Biologia Molecular o estudo da

Biologiaa nvel molecular, com especial foco no

estudo da estrutura e funo do material

gentico e seus produtos de expresso, as

protenas. Mais concretamente, investiga as

interaces entre os diversos sistemas celulares,incluindo a relao entre DNA, RNA e sntese

proteica.

Um dos objectivos da Biologia Molecular compreender como a

informao armazenada nos genes (aspectos estruturais) e como essa

informao usada pelas clulas (aspectos funcionais).

Evoluo do Conceito de Informao Hereditria

Os traos hereditrios so definidos pela sua capacidade de passar

duma gerao para a outra duma forma previsvel.

Cronologia do DNAGregor Mendel (1865) descreve as leis

bsicas da hereditariedade a partir de um estudo

sobre sucessivas geraes de ervilhas verdes e

amarelas. Concluiu que existiam elementos

autnomos que controlavam as caractersticas

hereditrias.
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Os factores hereditrios so transmitidos inalterados de gerao em

gerao experincias com ervilheiras-de-cheiro.

Johann Friedrich Miescher (1869) Extrai o que se tornar

conhecido como DNA do ncleo de glbulos brancos e esperma.

Francis Galton (1876) Prope a "lei da hereditariedade ancestral"

cada progenitor contribua com dos trao herdados e os avs contribuam

com o resto. Foi o pai da eugenia (Definio: estudo dos agentes sob o

controle social que podem melhorar ou empobrecer as qualidades raciais das

futuras geraes seja fsica ou mentalmente).

Walther Flemming (1878) Descobriu no ncleo

das clulas, a cromatina, e observou durante a mitose a

diviso desta substncia em filamentos mais tarde

denominados cromossomas.

Theodor Boveri (1888) Sugere pela primeira vez que os

cromossomas tenham um papel principal na hereditariedade. Verifica que o

esperma e o vulo contribuem com o mesmo nmero de cromossomas durante

a fertilizao.

DeVries, Correns, Tschermak (1900) Confirmam

independentemente as experincias de Mendel, sem terem conhecimentoprvio destas.

Sutton and Boveri (1903) Propem independentemente que os

factores hereditrios se localizam nos cromossomas.

Bateson (1905) Prope o termo "Gentica" para descrever o estudo

da hereditariedade.


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Garrod (1908) Confirma a hereditariedade recessiva na doena alfa-

fenilcetonuria.

Johannsen (1909) Prope que os factores hereditrios de Mendel

sejam designados genes.

Morgan (1910) Inicia os seus trabalhoscom a mosca da fruta

Drosophila melanogaster. Conclui que um gene est sempre num determinado

local dum dado cromossoma e introduz assim, o conceito de "mapeamento

gentico".

1920 Os cromossomas so constitudos por DNA e protenas.

Griffith (1928) Prope o conceito de princpio transformante, em

experincias com Streptococcus pneumoniae(S e R).

Experincia de Griffith:

Griffith usou duas estirpes que so distinguveis pela

aparncia das suas colnias quando crescidas em culturas laboratoriais. Numa

das estirpes, um tipo virulento normal, as clulas esto cobertas por uma

cpsula, dando s colnias uma aparncia lisa (smooth): da chamar-se S a

esta estirpe. Na outra estirpe, um tipo mutante, no virulento, que cresce nos

ratos mas no letal, a cpsula est ausente, dando a estas colnias um

aspecto rugoso (rough), sendo esta estirpe chamada de R.

Griffith matou algumas clulas virulentas, fervendo-as, e

injectou-as nos ratos. Os ratos sobreviveram, mostrando que as carcaas das

clulas no causam a morte. No entanto, ratos injectados com uma mistura declulas virulentas mortas pelo calor e clulas no virulentas vivas morreram.

Mais surpreendente ainda: clulas vivas podiam ser recuperadas dos ratos

mortos; estas clulas davam colnias lisas e eram virulentas aps injeco

subsequente. De alguma forma, os destroos das clulas S mortas,

converteram as clulas R vivas a clulas S vivas princpio transformante.


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Caspersson e Schultz (1938) Supunham que a informaohereditria (genes) estava contida nas protenas dos cromossomas.

Avery (1944) O princpio transformante ocido

desoxirribonucleicoou DNA.

Experincia de Avery, MacLeod e McCarty:


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Beadle e Ephrussi (1945) Propem que cada gene controla a

actividade dum nico enzima.

Chargaff (1949) Em todos os organismos, mantida a igualdade:

A/T = G/C, o que implica: (A+G) = (T+C), ou seja: [A]=[T] e [G]=[C].

Chase e Hershey (1952) Confirmam que o DNA o material

gentico, convencendo finalmente a comunidade cientfica.

Experincia de Chase e Hershey:

Levaram a cabo experincias com o fago T2:

consiste unicamente numa cpside que contm o material gentico, e infecta

uma bactria quando adere sua membrana externa, injectando o material

gentico. Como consequncia, o sistema gentico da bactria reproduz o vrus.

Numa primeira experincia, marcaram o DNA dos

fagos com oistopo radioactivofsforo-32 (P-32). Deixaram que os fagos da

cultura bacterianainfectassem as bactriasE.colie posteriormente retiraram

as coberturas proteicas das clulas infectadas mediante centrifugao.

Descobriram que o indicador radioactivo era visvel somente nas clulas

bacterianas e no nas coberturas proteicas.

Numa segunda experincia,

marcaram os fagos com o istopo

enxofre-35 (S-35). O aminocidos

cistena e metionina contm enxofre,diferentemente do DNA.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Bacteri%C3%B3fagohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bacteri%C3%B3fagohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3topo_radioactivohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3topo_radioactivohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3topo_radioactivohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cultura_bacterianahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cultura_bacterianahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Escherichia_colihttp://pt.wikipedia.org/wiki/Escherichia_colihttp://pt.wikipedia.org/wiki/Escherichia_colihttp://pt.wikipedia.org/wiki/Indicador_%28qu%C3%ADmica%29http://pt.wikipedia.org/wiki/Indicador_%28qu%C3%ADmica%29http://pt.wikipedia.org/wiki/Cisteinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cisteinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Metioninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Metioninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Enxofrehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Enxofrehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Enxofrehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Metioninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cisteinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Indicador_%28qu%C3%ADmica%29http://pt.wikipedia.org/wiki/Escherichia_colihttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cultura_bacterianahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3topo_radioactivohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bacteri%C3%B3fago


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Depois da separao, descobriu-se que

o indicador estava presente nas coberturas

proteicas, mas no nas bactrias infectadas.

Com isto confirmou-se que o material

gentico o que infecta as bactrias.

Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1950s) Uso da difraco de

raios X na anlise de fibras de DNA - as molculas so helicoidais com dois

tipos de periodicidade.

Watson e Crick (1953) Propem a estrutura do DNA em dupla hlice

e um mecanismo para a sua replicao.

1960Descoberta do RNA mensageiro (mRNA).

Jacob e Monod (1961) Teoria da regulao gnica.

Nirenberg (1961) Descobre o 1 tripleto originando a descoberta do

cdigo gentico.

Gilbert e Sanger (1977) Tcnica de sequenciao do DNA.

Hood ( 1986) Construiu o primeiro sequenciador automtico.

1986 - Incio do projecto de sequenciao Genoma Humano.


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O Gene

Gene

Unidade de informao biolgica (de hereditariedade). A informaogentica serve de base para processos bioqumicos.

O gene a sequncia de cidos nucleicos que transporta a informao

para uma dada protena ou molcula de RNA com actividade funcional.

H genes que codificam somente RNA.


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Actividade dos Genes

1. Genes Constitutivos(housekeeping) encontram-se sempre

em actividade, devido s suas protenas serem

permanentemente necessrias s clulas.

2. Genes Indutveis genes que permanecem silenciados at a

clula ser exposta a determinado estmulo que induz a sua

expresso.

3. Pseudogenes genes homlogos a outros genes, mas que no

so expressosno funcionam

Organizao Genmica

1. Genes Descontnuos (Split genes) a informao biolgica

contida em alguns genes (de Eucariotas) descontnua,

encontrando-se separada por sequncias intervenientes ou

intres de DNA.


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2. Opero cluster de genes codificantes para uma srie de

protenas (enzimas) que pertencem mesma via metablica.

Cluster: agrupamento de clulas da mesma famlia, mesmo

sendo codificados por genes diferentes (ex: famlia das globulinas, ,

-globulinas.

3. Famlias multignicas clusters de genes relacionados entre

si, sendo as respectivas sequncias semelhantes ou iguais.

Organizao Genmica em diferentes espcies


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Aula 2 Natureza do Material GeneticoMaterial Gentico

cidos Nucleicos

1. Contm informao acerca da estrutura das protenas (DNA);

2. Participam na seleco e ligao dos aminocidos necessrios

para formar as protenas (RNA);

3. Formam-se atravs de ligaes fosfodister entre nucletidos

sucessivos;

4. Para participar nessas ligaes, na posio 3 tem de haver

OH. A formao desta ligao d-se de 5 para 3.

Dogma central da Biologia Molecular:

foi descrito em 1958 por Francis Crick na tentativa de relacionar o DNA, o RNA

e as protenas. Diz que o DNA pode replicar-se e dar origem a novas molculas

de DNA, pode ainda ser transcrito em RNA, e este por sua vez traduz o cdigo

gentico em protenas. No entanto, algumas descobertas posteriores nocoincidiram com este Dogma:

O RNA pode sofrer replicao em alguns vrus e plantas

O RNA viral, atravs de uma enzima denominada transcriptase

reversa, pode ser transcrito em DNA

O DNA pode directamente traduzir protenas especficas sem

passar pelo processo de transcrio, porm o processo ainda

no est bem claro


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Cdigo Gentico:

Nucletido:

Diferentes pentoses:

Ribose Tem o grupoOH na extremidade 2

Desoxirribose em vez do grupoOH na extremidade 2, tem um H

Bases azotadas do especificidade s molculas


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Formao dadupla hlice

Esqueletohidrfilo

Desoxirriboses efosfatos viradospara o exterior

Interiorhidrfobo

Bases viradaspara o interior

O emparelhamentoorigina um minor groovee um major groove(esteideal para a ligao das

proteinas)

H emparelhamentoespecfico A-T e C-G

Estrutura das bases azotadas:

DNA

A estrutura tridimensional do DNA a dupla hlice surge a partir das

caractersticas qumicas e estruturais das suas duas cadeias polinucleotdicas.


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As duas cadeias polinucleotdicas so

complementares e anti-paralelas (d estabilidade).

A estrutura da dupla hlice estabilizada

por ligaes de hidrognio, foras de Van der Waals

e interaces dipolo-dipolo.

Propriedades do DNA:

Desnaturao e Annealing (Renaturao)

Desnaturao:

Separao reversvel das cadeias

Quebra das ligaes de hidrognio

Ligaes covalentes no so desfeitas

Renaturao:

Remoo das condies desnaturantes

DNA aquecido arrefecimento

Restabelecimento de pH ~7,0

Formao de novas ligaes de hidrognio


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Contedo em GC

O aumento do contedo em GC aumento o valor de Tm

(temperatura qual metade do DNA se encontra desnaturado).

Superenrolamentos (Supercoiling)

o Ocorre s em DNA fechado sem pontas livres/soltas

o O DNA fechado pode ser circular ou linear

o As pontas no tm liberdade rotacional

o Corresponde ao sobre enrolamento da dupla hlice de

DNA como resultado de uma tenso estrutural


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DNA torcido

na direco dahlice

superenrolamentopositivo

bases mais firmes

na direco oposta da hlice

superenrolamentonegativo

bases mais"frouxas"

O DNA pode ser torcido num processo denominado superenrolamento.

No estado relaxado do DNA, uma fita normalmente d uma volta completa ao

eixo da dupla hlice a cada 10,4 pares de base, mas se o DNA est torcido, as

cadeias ficam mais ou menos enroladas.


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Na natureza, o DNA apresenta um ligeiro superenrolamento negativo

que causado pela aco da enzima topoisomerase. Estes enzimas tambm

so necessrias para aliviar o stress de toro causado no DNA durante os

processos de transcrio e replicao.

Aula 3 Empacotamento do Material GeneticoEucariotas VS Procariotas

Eucariotas

Nos eucariotas as clulas tm compartimentos separados por

membranas, como o ncleo e o mitocndrio. O genoma fica restringido ao

ncleo.

Procariotas

Nos procariotas, no existem compartimentos internos. O genoma no

est num compartimento especfico.


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Empacotamento do Material Gentico

Empacotamento em Vrus


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Empacotamento em Procariotas

Nos procariotas, o genoma normalmente constitudo por um s

cromossoma circular.

Logo, o DNA enrolado aleatoriamente tem um volume 1000x superiorao volume da clula. Repulso entre cargas negativas dos fosfatos.

Nos Procariotas, o DNA acumula-se no nucleide.

Quando ocorre a lise bacteriana, as fibras de DNA so libertadas sob a

forma de loopsagarrados membrana da clula.

Empacotamento em Eucariotas

O empacotamento do material gentico denomina-se cromatina, nos

eucariotas.

D-se o nome de cromatina ao complexo de DNA e protenas (que

juntas denomina-secromossoma) que se encontra dentro do ncleo celular nas

clulas eucariotas. As principais protenas da cromatina so ashistonas.
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_celularhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Histonahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Histonahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Histonahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Histonahttp://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_celularhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNA


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Numa clula eucariota, quase todo o DNA est compactado na

cromatina. O DNA "empacotado" na cromatina para diminuir o seu tamanho e

para permitir maior controle por parte da clula de tais genes.

Grande parte da cromatina localizada na periferia do ncleo,

possivelmente pelo fato de uma das principais protenas associadas com a

heterocromatina ligar-se a uma protena da membrana nuclear interna.

Conhecem-se dois tipos de cromatina:

Eucromatina consiste em DNA activo, ou seja, que pode-se

expressar como protenas e enzimas. O DNA est menos empacotado.

Heterocromatina consiste em DNA

inactivo e que parece ter funes estruturais durante o

ciclo celular. O DNA est altamente empacotado, o que

no permite o acesso a enzimas como os RNA e DNA

polimerases, por isso diz-se que a heterocromatina

inactiva.

Estrutura da cromatina

A fibra de 10 nm

A fibra de 10 nm, num estado parcialmente

"desenrolado", consiste num "rosrio" em que as

"contas" so os nucleossomas (baixa concentrao

salina).

A fibra de 30 nm

A fibra de 30 nm apresenta uma

estrutura "enrolada" Condies fisiolgicas.

Ampliao a 10 nm.


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A descoberta do Nucleossoma

Nucleossoma

O nucleossoma o nome dado unidade fundamental da cromatinae consiste numa unidade de DNA, dividida em duas espirais, que se enrolam

em torno de um disco proteico, constitudo por quatro pares de protenas

chamadas histonas.

O nuclease de micrococcus hidrolisa, inicialmente

(digesto parcial), entre os nucleossomas: nos mono-

nucleossomas, os fragmentos de DNA tm ~200 pb.

Aumentando o tempo de digesto pelo nuclease de

micrococcuso tamanho das bandas de DNA vai diminuindo

sucessivamente, em passos discretos: 200, 165 e 146 pb.

Estrutura cristalina do nucleossoma


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Sequncias de DNA que ficam em voltas diferentes do nucleossoma

podem ficar prximas.

Propriedades das histonas

Robert Kornberg estabeleceu que os nucleossomas so constitudos

por partes equimolares de todas as histonas, excepo da H1.

Protenas no-histnicas (NHPs) todas e quaisquer protenas

associadas cromatina, incluindo as que possuem funes de expresso

gentica (topoisomerases, RNA polimerases, etc.) ou condensao

(condensinas, coesinas, etc.).

Protenas HMG (high mobility group) constituem um grupo bem

definido das NHPs, com elevado nmero de resduos polares (funo

estrutural).


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Funo das histonas

Histona H1 necessria para que os complexos histona-DNA (a H1

liga-se externamente ao centro do nucleossoma) formem uma fibra de 30nm de

espessura, enrolando assim o DNA de uma forma ainda mais eficaz.

Histonas H2A, H2B, H3 e H4 As histonas H3 e H4 apresentam

sequncias idnticas em organismos distintos, sugerindo que desempenham

funes idnticas em todos os eucariotas.

Os tipos H2A e H2B possuem

tambm sequncias idnticas, com

algumas variaes especficas nas

espcies. Duas histonas de cada

classe (H2A,H2B, H3 e H4) agregam-

se para formar um nucleossoma,

juntamente com DNA, o chamado

octmero.


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Nucleossomas e Condensao da Cromatina

http://www.youtube.com/watch?v=Pj9cdVeIntY

Aula 4 A ativaao da cromatinaNucleossoma: permite que o DNA se encontre esttico. No entanto, a

sua estrutura tem de ser flexvel para que possam ocorrer processos de

transcrio (de mRNA) e de replicao (por exemplo na diviso celular).

At que ponto mantida a estrutura nucleossmica da cromatina

durante a replicao e a transcrio?

So visveis nucleossomas em ambas as

fibras de cromatina recm-replicada.

A estrutura nucleossmica da cromatina

deve desfazer-se durante a duplicao do DNA,

mas rapidamente reformada em ambas as

hlices da cromatina recm-replicada. Como?


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Existem dois modelos para explicar o que acontece aos nucleossomas

pr-existentes:

Modelo dispersivo: cada molcula-filha formada por pores da

molcula inicial e por regies sintetizadas de novo, a partir dos nucletidos

presentes na clula.

Modelo conservativo: a molcula de DNA progenitora mantm-se

ntegra, servindo apenas de molde para a formao da molcula-filha, a qual

seria formada por duas novas cadeias de nucletidos.

Como se formam os novos nucleossomas?In vitroo DNA pode interatuar diretamente com

um octmero de histonas, ou pode interatuar com o

tetrmero H32-H42, ao que se segue a adio de dois

dmeros H2A E H2B.

In vivo a integridade dos nucleossomas durante

a replicao pode ser testada por experiencias de

cross-linkingdas histonas, isto faz-se atraves de:1. Crescer clulas na presena de

aminocidos pesados (por exemplo, marcados

radioativamente)

2. Posteriormente deixar a replicao do

DNA prosseguir em presena de aminocidos normais;

3. Adicionar agentes de cross-linkinge separar os nucleossomas

por gradientes de densidade (os octmeros iniciais tm aminocidos pesados e

por isso so mais densos do que os novos).


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Se ocorrer conservao dos nucleossomas o que se espera obter

uma banda numa zona de maior densidade, que corresponde aos octmeros

originais, e uma banda numa zona de menor densidade, que corresponde aos

nucleossomas novos, como visvel na figura correspondente hiptese A.

No entanto no o que se obtm, o que se obtm uma banda de

densidade intermdia entre a densidade dos nucleossomas novos e antigos.

Isto indica que as histonas se separam e voltam depois a ligar-se, sendo o

octmero formado tanto por histonas novas como pelas histonas originais, ou

seja, no h conservao do nucleossoma inteiro. Isto visvel na figura

correspondente hiptese B.


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Formao in vivo dos novos nucleossomas

Durante a replicao, o garfo replicativo

desloca os octmeros de histonas que se

dissociam em tetrmeros 2(H3+H4) e emdmeros H2A e H2B. Estes tetrmeros e dmeros

antigos misturam-se que outros tetrmeros e

dmeros novos. A ligao das histonas ao DNA

inicia-se por ligao dos tetrmeros 2(H3+H4)

ligao assistida por CAF-1, e depois que ocorre

a ligao dos dmeros H2A e H2B para formar o

octmero. A montagem dos octmeros aleatria quanto ao facto de ser uma

histona antiga ou nova. Quanto transcrio possvel que ocorra da mesma

forma.

Para ajudar assemblagem dos nucleossomas so necessrias

protenas acessrias:

CAF-1 e ASF1 so protenas de assemblagem de histonas

associadas maquinaria de replicao;

HIRA e a variante histnica H3.3 so usadas para assemblagem

independente da replicao.

Nucleossomas em fase

Os nucleossomas tm um posicionamento

(ou faseamento) pr-determinado?

O posicionamento dos nucleossomas

colocaria um local de restrio em posio nica,relativamente ao DNA linker, reconhecido pela

nuclease de micrococcus, que hidrolisa os

monmeros de DNA. O fragmento de restrio

tinha sempre o mesmo tamanho, pelo que se

obtm uma nica banda no gel de eletroforese.


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Na ausncia de posicionamento dos nucleossomas,

um dado local de restrio fica em todas as posies

possveis em diferentes cpias do genoma. So produzidos

fragmentos de todos os tamanhos quando um enzima de

restrio hidrolisa num local especifico (vermelho) e a

nuclease micrococcal hidrolisa junto das junes entre

nucleossomas (verde).

Transcrio

O que acontece aos nucleossomas?O RNA polimerase tem um tamanho maior do que o nucleossoma,

o que lhe dificulta seguir o DNA volta deste.

Quando o DNA est associado aos nucleossomas, o RNA

polimerase e os fatores de transcrio no tm acesso ao DNA.

Quando o RNA polimerase e os fatores de transcrio esto

ligados ao DNA, os octmeros de histonas (nucleossomas) no tm acesso ao

DNA.

Logo os nucleossomas tm de se dissociar para que os fatores de

transcrio e o RNA polimerase se possam ligar. Depois da transcrio, os

nucleossomas formam-se rapidamente.

A transcrio vai envolver o relaxamento e o desenrolamento do DNA

em certas regies da cromatina vai ocorrer portanto, uma alterao

conformacional do DNA.


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Histonas e ativao da cromatina

Experincia 1

Quando o DNA exposto em simultneo ahistonas e fatores basais de transcrio, as

histonas formam nucleossomas na TATA box

e bloqueiam o acesso aos fatores basais de

transcrio.

Experincia 2

Quando o DNA exposto aos fatores basaisantes das histonas (passo 1), os fatores basais

associam-se TATA box, deixando as

histonas de fora, quando posteriormente

adicionadas.

Experincia 3

Quando o DNA exposto em

simultneo a histonas, fatores basais e

ativadores, estes permitem a ligao

dos fatores TATA box, bloqueando o

acesso das histonas.

Concluses a retirar destas experincias

o Histonas e fatores basais de transcrio competem para o acesso

TATA box. Em simultneo, ganham as histonas.

o As histonas podem, portanto, ajudar represso de genes.

o Para haver ativao dos genes, as histonas tm de ser removidas

da TATA box.

o As protenas ativadoras podem desempenhar uma funo de

disrupo do nucleossoma e ativao de transcrio dos genes.

o No interior da regio codificante, o nucleossoma no inibe a

transcrio, embora possa abrandar a passagem do RNA polimerase.


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o Genes constitutivos (de housekeeping: ou seja, genes sempre

ligados) so normalmente desprovidos de nucleossomas na TATA box, ao

contrrio dos genes indutveis (ie, genes que so tem funo em determinadas

alturas). Estas zonas sem nucleossomas s ocorrem quando o gene ativo.

o Locais de hipersensibilidade ao DNase I

Os locais de hipersensibilidade so criados pela estrutura da cromatina

e variam de tecido para tecido (j que depende se o gene se encontra ativo ou

no). Pensa-se que estes locais resultam da ligao de protenas de regulao

que excluem os nucleossomas. Existem de locais de hipersensibilidade ao

DNase I nas regies que regulam a transcrio, nas origens de replicao degenes ativos e nos centrmeros, ou seja, so desprovidos de nucleossomas

todos os locais onde a dupla hlice inicia uma funo

Estes locais permitem a associao de protenas no histnicas. So

zonas muito sensveis a enzimas de restrio.

As localizaes dos locais de hipersensibilidade podem ser

determinados utilizando o enzima DNase I:

1. O DNase I vai hidrolisar num local de

hipersensibilidade, j que o local mais

exposto;

2. A molcula de DNA encontra-se

agora hidrolisada.

3. Hidrolisando com outro enzima de

restrio (local de hidrlise conhecido)

obtm-se um fragmento que numa ponta foi

hidrolisado pelo DNase I e noutra ponta foi

hidrolisado com o enzima de restrio.

4. Como se sabe onde o enzima de

restrio hidrolisa, atravs de uma

eletroforese sabe-se o tamanho do

fragmento em causa e, desta forma, onde

se encontrava o local de hipersensibilidade.


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o Os nucleossomas so deslocados e reassemblados durante a

transcrio

A maioria dos genes transcritos retm uma

estrutura nucleossmica, apesar das alteraes naorganizao da cromatina durante a transcrio.

Alguns genes altamente transcritos parecem

ser casos excecionais, sendo desprovidos de

nucleossomas.

Experincias mostram que o nucleossoma

continua ligado ao DNA, mas numa posio

diferente. O nucleossoma deve voltar suaposio inicial apos o processo de transcrio

estar concludo.

Os promotores ativos esto marcados por locais

de hipersensibilidade ao DNase porque os octmeros

de histonas foram deslocados do DNA.

Quando o RNA polimerase comea a sntese de

RNA, este encontra-se ligado aos locais onde o DNA

est livre de histonas. Para prosseguir durante a

elongao, as histonas e os octmeros que se

encontram frente tm de ser deslocados. No entanto,

para evitar que o DNA fique exposto (a enzimas de

restrio, por exemplo) necessrio que estas

protenas se voltem a ligar rapidamente.

In vitro, para que ocorra transcrio

necessrio adicionar a protena FACT (facilitates

chromatin transcription) que funciona como um factor

de elongao na transcrio. Esta protena vai causar

a dissociao da subunidade H2A-H2B do octmero,

ou seja, vai produzir hexassomas. Esta protena pode

tambm estar envolvida na montagem dos octmeros


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no final do processo de transcrio. Outros fatores so responsveis pela

libertao dos dmero H3 e H4.

Acetilao de HistonasA ativao da transcrio est associada com a

acetilao das histonas (adio de um grupo acetil

COCH3) na regio promotora.

As histonas possuem "caudas flexveis" que podem

sair do nucleossoma e sofrer acetilaes nos resduos de

lisina.

Os enzimas que catalisam a acetilao dashistonas podem ser de dois tipos:

Histona acetiltransferases ou HATs enzimas que promovem a

acetilao das histonas; que se dividem em:

o Grupo A envolvidos na transcrio;

o Grupo B atuam em histonas sintetizadas de novo no

citosol, esto tambm envolvidos na formao dos

nucleossomas;

Histona diacetilase ou HDACs enzimas que promovem a

desacetilao das histonas, provocam a condensao da cromatina

e a inibio da transcrio. A tricostatina e o cido butrico so

inibidores dos HDACs, e no laboratrio podem ser utilizados como

ativadores de genes normalmente inativos ou pouco expressos.

Os ativadores e os repressores dos genes

atuam via acetilao e desacetilao das caudas das

histonas

Demonstrou-se que fatores coativadores da

transcrio conhecidos possuam atividade de histona

acetilases (HAT) atuando nas "caudas" das histonas.


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A alterao do promotor envolve alteraes na cromatina

A remodelao de complexos pode facilitar a

ligao de complexos de acetiltransferases e vice

versa.

A metilao de histonas tambm pode

recrutar complexos que modificam cromatina.

Diferentes modificaes e complexos

facilitam a elongao da transcrio.

A metilao do DNA e das histonas est

associada cromatina inativada a longo prazo (e.g.,

genes silenciados)

A formao de heterocromatina iniciada quando a

protena RAP1 se liga ao DNA. SIR3/SIR4 ligam-se a

RAP1 e tambm s histonas H3/H4. O complexo vai

polimerizando ao longo da cromatina e pode ligar os

telmeros matriz nuclear.


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Aula 5 Auto perpetuaao do DNA

Replicao Semi-Conservativa

Experincia de Meselson & Stahl

Meselson e Stahl, em 1958, realizaram experincias que tinham como

objectivo comprovar a hiptese semi-conservativa, trabalhando com a

marcao do DNA por incorporao de 15N.

Os cientistas imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotdicas de

uma molcula de DNA fossem marcadas, seria possvel fazer uma previso

sobre o destino dessas cadeias no decorrer das geraes seguintes.

Clulas de E.coli crescem em meio contendo apenas15

N (azotopesado istopo estvel com 8 neutres e 7 protes) durante vrias geraes.

O DNA extrado e centrifugado em gradiente de densidade.

As clulas so lavadas e passam a crescer em meio com 14N (azoto

normal 7 neutres e 7 protes).


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A replicao

O DNA replicado visualizado sob a forma dum "olho" flanqueado pelo

DNA ainda no replicado.

O "olho replicativo" forma uma estrutura em (theta) na replicaoduma molcula de DNA circular.

O replico

a unidade de replicao, ou seja, a poro de DNA que replicadopela mesma origem de replicao (Ori) e "entra em aco" apenas uma vez por

ciclo celular. Uma vez iniciada a replicao, esta s pra quando todo o

genoma da clula tiver sido replicado.

Nos procariotas existe apenas um replico, enquanto nos eucariotas

existe grande nmero de replices que tm de entrar em aco quase em

simultneo para todo o genoma ter sido replicado antes da diviso celular.

As regies Oriso ricas em timina e adenina a natureza destasligaes mais fraca que as de guanina e citosina, o que facilita a abertura da

cadeia dupla, e so reconhecidas por um par de enzimas, os helicases.


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Garfos Replicativos

Os garfos replicativos esto organizados em focino ncleo. A

replicao do DNA a partir dos garfos de replicao bidireccional.

Em E. colih um replico: os trminos

da replicao encontram-se no local de

encontro dos dois garfos replicativos.

Em Eucariotas h vrios replices por

cromossoma h fuso de replices.

Ncleo onde se v todo o DNA

corado com iodeto de propdeo.Ncleo marcado com um anticorpo anti-brometo

de desoxiuridina (BrdU) que identifica o DNA em

replicao


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Replicao em Crculos Rolantes

A origem inicia a replicao apenas numa das cadeias, produzindo

multmeros da sequncia original em cadeia simples (replicao unidireccional).

Como exemplo pode ser a replicao do genoma de certos fagos(como o fago M13).


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Replicao em D-loops

H uma origem de replicao diferente em cada uma das duas cadeias

(L e H):

1. Replicao da cadeia H inicia-se num "D loop" (com primer deRNA).

2. Replicao da cadeia L inicia-se quando origem L fica exposta

pela passagem do garfo replicativo do D-loop.

Exemplo: a replicao do DNA mitocondrial e no DNA dos

cloroplastos.


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O problema dos replices lineares

PROBLEMAS:

Tem de ser usada uma estratgia especial para poder replicar a cadeia

de DNA com uma extremidade 5 num replico linear. O DNA polimerase s funciona na direco 5'-3' e precisa de uma

extremidade 3'-OH como "primer.

SOLUES:

Converso da molcula linear em circular (fagos T4 e )

Formao duma estrutura especial, e.g., hairpin(Paramecia)

Extremidades de comprimento varivel (eucariotas)

Presena duma protena que permite a iniciao da sntese na prpria

extremidade (adenovrus, vrus de RNA da poliomielite)

Deslocao da cadeia: Um modo

de replicao do DNA de alguns

vrus que iniciada separadamente

nas duas extremidades da molcula

e em que a nova cadeia de DNA

cresce por deslocao da cadeia

me (homloga).


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Telmeros e Telomerase

Os extremos dos

cromossomasnormais so constitudos

por estruturas denominadas telmeros

que impedem a unio de cromossomas.

So estruturas constitudas por fileiras

repetitivas de protenas e DNA no

codificante.

Os telmeros esto presentes principalmente em clulas eucariticas,

visto que o DNA das clulas procariticas forma cadeias circulares, logo no

tem locais de terminao, embora existam excepes como: bactrias com

DNA linear e que possuem telmeros.

Telomerase: enzima que tem como funo adicionar sequncias

especficas e repetitivas de DNA extremidade 3' dos cromossomas, onde se

encontra o telmero. Este enzima um transcriptase reversa, tendo na sua

estrutura um modelo em RNA que utiliza para sintetizar o DNA telomrico, em

eucariotas.

A protena terminal de adenovrus liga-se

extremidade 5 do DNA, proporcionando umgrupo C-OH (citidina com 3-OH) que o

polimerase usa para iniciar a sntese da

nova cadeia de DNA.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Tel%C3%B4merohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Transcriptase_reversahttp://pt.wikipedia.org/wiki/RNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eukaryotahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eukaryotahttp://pt.wikipedia.org/wiki/RNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Transcriptase_reversahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Tel%C3%B4merohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima


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Replicao e Ciclo Celular

O telomerase posiciona-se na cadeia

de DNA protuberante por emparelhamento de

bases com a sua molcula de RNA

ribozima. Vai adicionando as bases de acordocom o "molde". O ciclo recomea de novo

aps a adio duma unidade completa

(GGGTTG). O telomerase est activo nas

clulas germinais e estaminais onde muito

importante manter as sequncias

cromossmicas intactas.

Nas clulas somticas, oencurtamento do telmero d um limite ao

nmero de divises celulares possveis e

conduz senescncia.

A senescncia celular importante na

supresso do cancro.


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Em E. coli, a replicao do cromossoma bacteriano demora 40

minutoa, seguido de diviso celular 20 minutos depois.

Quando a bactria esta a crescer rapidamente, a replicao pode

decorrer mais rapidamente do que a diviso celular. O resultado podem ser

cromossomas bacterianos com mltiplos garfos replicativos.

Replicao em Eucariotas

Em bactrias, a segregao

cromossmica pode necessitar de

recombinao em locais especficos.

Um cromossoma circular replica-se

produzindo duas molculas-filhas

monomricas que segregam com as

clulas-filhas


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Aula 6 Mecanismos de Replicaao do DNA

DNA polimerase enzima que catalisa a

sntese da nova cadeia polinucleotdica de DNA

O DNA sintetizado pela adio de

nucletidos extremidade 3-OH da cadeia

nascente, de forma que a nova cadeia cresce na

direo 53. Os DNA polimerase necessitam de:

Uma cadeia molde;

Uma extremidade 3-OH livre;

Nucletidos

A separao das duas cadeias na extremidade livre (ou seja, no garfo

replicativo) cria foras de torso crescentes e faz com que o DNA ainda no

separado fique mais enrolado. Para corrigir estas foras de toro existe um

famlia de enzimas, os topoisomerases:

Topoisomerase tipo I: enzimas que hidrolisam uma cadeia de DNA(dando origem aos nicks)

Topoisomerase tipo II: enzimas que hidrolisam duas cadeias de DNA.

Mecanismo de ao do DNA topoisomerase I

A topoisomerase I introduz

um nick no DNA, permitindo a

rotao duma cadeia em torno daoutra, aliviando a fora de torso

que se acumula frente do garfo

replicativo. O nick transitrio,

sendo religado imediatamente aps

o topoisomerase I ter libertado a

outra cadeia.


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Algumas topoisomerases s reconhecem

superenrolamentos negativos e outras s reconhecem

superenrolamentos positivos. As topoisomerases dos

eucariotas so semelhantes, mas reconhecem

enrolamentos positivos ou negativos e ligam-se

covalentemente cadeia de DNA que hidrolisam.

As topoisomerases so

responsveis por separar os

cromossomas no final da replicao

em E. coli, atravs do processo de

decatenao (processo em que se

desligam duas molculas de DNA que

se encontram interligadas, o oposto

de catenao)

Replicao do DNA

1. Ab ert ur a da du pla h lice

A replicao requer uma helicase para separar as cadeias da dupla

hlice de DNA usando energia custa da hidrlise de ATP.

As SSBPs ("single-stranded binding proteins") so necessrias

para manter separadas as duas cadeias simples

2. O Priming necessrio para o incio da sntese de DNA

Todos os DNA polimerases requerem uma extremidade 3-OH livre

para iniciar a sntese de DNA.


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3. Elongao e Topoisomerases

A estrutura antiparalela das duas cadeias de DNA constitui um

problema para a replicao. Enquanto o garfo de replicao avana, ambas as

cadeias filhas devem ser sintetizadas enquanto as cadeias me se encontram

expostas. No entanto o garfo replicativo avana no sentido 5-3 numa cadeia e

no sentido 3-5 noutra, e os cidos nucleicos so sintetizados apenas na

direo 5-3. Este problema resolvido sintetizando a cadeia 3-5 numa srie

de pequenos fragmentos que so formados no sentido 5-3.

Na cadeia lder, a sntese de DNA procede de forma continua na

direo 5-3, enquanto molcula de DNA desenrolada. Na cadeia atrasada,

(uma parte do DNA original tem de estar exposto) formam-se segmentos na

direo oposta do garfo replicativo. Estes fragmentos, denominados,

fragmentos de Okazaki vo se juntando, formando uma cadeia atrasada

completa.

Sntese das cadeias lder e atrasada em E. coli:

a) Interveno de DNA helicases (que separam as duas cadeias),

SSBPs ("single stranded binding proteins") que impedem o re-emparelhamento

do DNA e de topoisomerases

b) Sntese de primer de RNA (10-60 nt) pela primase

c) A sntese das duas cadeias catalisada por um dmero assimtrico

da DNA polimerase III.

Replicao da cadeia atrasada

a) O primer de RNA (10-60 bases)

sintetizado pela primase, baseado na cadeia-me de

DNA

b) A DNA polimerase sintetiza a nova cadeia

DNA a partir do 3-OH do primerde RNA


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c) A polimerase remove o RNA a 5 no final do fragmento de Okazaki

seguinte e preenche o espao com DNA

d) A DNA ligase une dois fragmentos de Okazaki adjacentes e

terminados

4. Terminao

Em E.coli, a replicao termina numa zona de repeties de 20 bp

(zonas de terminao de replicao = "ter")

As duas molculas de DNA resultantes esto interligadas catenanos

A separao (decatenao) feita pela topoisomerase IV.

Enzimas includos no modelo de sntese de DNA (E. coli)

Helicase: abre as cadeias da dupla hlice original

Single stranded BPs (SSB): impedem o reemparelhamento das

cadeias

Topoisomerase II: reduz a tenso na dupla hlice frente do RF

Primase (RNA polimerase): inicia as novas cadeias de DNA

DNA polimerase III: o principal enzima replicativo

DNA polimerase I: remove os primers de RNA

DNA ligase: liga os fragmentos de Okazaki na cadeia atrasada

Topoisomerase IV: faz a descatenao dos dois novos

cromossomas (circulares)

Assemblagem in vivo do DNA Polimerase IIIO DNA polimerase constitudo por 10 protenas:

Existem 2 copias do centro ativo. Cada centro ativo contm uma

subunidade (que confere atividade ao DNA polimerase), uma subunidade

(que confere atividade de proofreading3-5).

Existem 2 cpias da subunidade de dimerizao, , que ligam os

dois centros catalticos

Existem 2 cpias de subunidade de processividade, , que soresponsveis por ligar os centros catalticos s respetivas cadeias;


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O complexo um grupo de 5 protenas, clamp loader, que

posiciona as subunidades de processividade no DNA, formando um clamp

sua volta. responsvel por adicionar um par de dmeros a cada cadeia de

DNA.

Mecanismo de assemblagem:

1. O dmero e o complexo

reconhecem o primer e formam um complexo

inicial. Nesta reao, o complexo hidrolisa o ATP

e transfere as subunidades para o primer. O par

de subunidades forma um clamp que se liga

volta do DNA e assegura a processividade. A

hidrolise do ATP permite a ligao da subunidade

ao DNA.

2. A ligao ao DNA altera a

conformao da subunidade na ligao ao

complexo , aumentando a afinidade da subunidade

para o centro ativo do polimerase. Esta alterao conformacional o que vai

permitir que o centro ativo se ligue ao DNA.

3. O dmero liga-se ao centro ativo do polimerase promovendo a

dimerizao atravs da ligao de dois centros ativos. O holoenzima

assimtrico porque apenas tem um complexo .

Modelo dimrico do DNA polimerase

Enquanto uma subunidade

sintetiza a cadeia lder de forma contnua,

a outra subunidade vai sintetizando de

forma descontnua a cadeia atrasada,

iniciando e terminando os fragmentos de

Okazaki. O clamp associado cadeia

atrasada dissocia-se e reassocia-se para

cada fragmento de Okazaki.


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Enzimas e fatores de replicao

DNA polimerases

DNA polimerase I: reparao de DNA; remove os primers de

RNA nos fragmentos de Okazaki e substitui-os por DNA

DNA polimerase II: reparao de DNA; funo no muito bem

esclarecida

DNA polimerase III: sintetiza cadeias de DNA. Faz parte dum

grande complexo, o holoenzima do DNA polimerase III. Uma das

subunidades deste holoenzima a subunidade , que mantm

a polimerase III associada ao DNA.


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Aula 7 A Transcriao em Procariotas

O cido Ribonucleico (RNA)

O RNA desempenha as suas funes em cadeia simplese a sua diversidade estrutural muito superior do DNA. As

principais funes do RNA so o armazenamento e

transmisso da informao genticae a catlise enzimtica

(ribozimas).

O processo de sntese de RNA a partir da informao

armazenada de forma permanente no DNA chama-se

transcrio.Na transcrio, um sistema enzimtico complexo

converte a informao contida num segmento de DNA em

cadeia dupla numa cadeia de RNA cuja sequncia de bases

complementar a uma das cadeias de DNA.

O processo semelhante para os trs tipos de RNA: mRNA, tRNA e

rRNA.

Transcrio e Replicao

Semelhanas:

O mecanismo fundamental da reaco semelhante;

A transcrio d-se de 5 3;

Ambas necessitam dum molde para a sntese do DNA/RNA;

Os processos dividem-se em trs fases: iniciao, elongao eterminao.

Diferenas:

A transcrio selectiva apenas um gene ou um grupo

especfico de genes transcrito de cada vez;

Na transcrio, apenas uma das cadeias transcrita;

A transcrio no necessita de um iniciador (primer);


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A iniciao da transcrio complexa, dividindo-se em ligao

dos factores ao DNA e iniciao da sntese de RNA.

Unidade TranscricionalUma unidade transcricional uma poro de DNA transcrita numa

nica molcula de RNA (transcrito primrio), comeando no promotor e

acabando no terminador.

A transcrio pelo RNA polimerase

A funo do RNA polimerase copiar uma das cadeias de DNA em

RNA.


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Cadeia Codificante e Cadeia Molde

As duas cadeias de DNA tm funes distintas na transcrio, s uma

serve de molde sntese do RNA: cadeia molde.

A cadeia de DNA complementar cadeia molde designa-se por cadeia

no molde ou cadeia codificante (m designao que traduz o facto de ser

idntica molcula de RNA sintetizada, excepto devido presena de ribose e

uracilo).

A cadeia codificante de um dado gene pode estarem qualquer uma das

cadeias de DNA num cromossoma.

As sequncias que regulam a transcrio so por conveno descritas

pela sequncia na cadeia no-molde (por isso chamada "codificante").

A bolha Transcricional

Durante a transcrio, a

"bolha" transcricional

mantida no interior do

RNA polimerase.


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As fases da transcrio:

1. Pr-iniciao reconhecimento do DNA molde.

2. Iniciaoincioda sntese da cadeia de RNA pela adio dos

primeiros 2-9 ribonucletidos.

A sntese de RNA ocorre

na "Bolha" Transcricional.

O RNA polimerase no

necessita de primer. O primeiro

nucletido fica intacto (semperda de pirofosfato).


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3. Elongao aumento da cadeia de RNA na direco 5 3

pela adio de ribonucletido.

4. Terminao libertao do polimerase e da cadeia de RNA

completa.

A transcrio em Procariotas

O alinhamento de mltiplos promotores evidencia a conservao de

nucletidos em determinadas posies a montante do local de incio da

transcrio.

O promotor uma sequncia especfica no DNA qual os RNA

polimerases se ligam.

O Promotor


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Mutaes no promotor do opero Lac podem resultar quer no

aumento ou na diminuio da actividade de transcrio, consoante a

mutao se aproxima ou afasta da sequncia cannica de consensus.

Promotores em Procariotas

Um promotor tpico possui 3 componentes:

1. a sequncia a35;

2. a sequncia a10;

3. o incio da transcrio (startpoint).

Uma das cadeias de DNA no promotor possui os pontos de contacto

para o RNA polimerase.


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O RNA polimerase de E.coli

Os RNA polimerases de bactrias, especialmente de Escherichia coli,

so os melhores caracterizados gentica e bioquimicamente.

Em todas as bactrias, um nico tipo de RNA polimerase responsvelpela sntese de rRNA, mRNA e tRNA ao contrrio dos eucariotas, onde o

rRNA, mRNA e tRNA so descritos, tipicamente, por diferentes RNA

polimerases: Pol I, II e III.

Holoenzima (Enzima completo) forma do RNA polimerase que

competente para iniciar a transcrio. Consiste nas cinco subunidades do

enzima core e no factor . A composio das suas subunidades est na figura

seguinte.

O "core" dos RNA polimerases bacterianas so complexos de ~400

kDa com mltiplas subunidades e com a estrutura geral 2.

As subunidades e so as principais subunidades catalticas.

O domnio CTD ("C-terminal domain") o domnio do RNA

polimerase que est envolvido na estimulao da transcrio por contacto com

as protenas reguladoras.


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O Papel da Subunidade

A subunidade primeiramente responsvel pelo

reconhecimento do promotor.

Subunidades sigma distintas reconhecem diferentessequncias de consensus.

Factor anti-sigma Uma protena que se liga a um factor

sigma inibindo a sua capacidade de se ligar a promotores especficos.

Aminocidos da subunidade contactam bases especficas na

cadeia no transcrita da sequncia10 do promotor.

A hlice da subunidade sigma determina a sua especificidade.

A subunidade tambm contribui para o reconhecimento do

promotor.

A subunidade mais comum a 70.

A subunidade no possui centro activo para proofreading.

Os erros na transcrio so de 1 em 104-105 nucletidos

incorporados. A correco de um erro faz-se por reverso da actividade de

polimerase.

A subunidade dissocia-se do enzima logo aps o

reconhecimento, ficando apenas o enzima core durante o resto da transcrio.


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O modelo para o movimento do enzima sugerido pela sua estrutura

cristalogrfica:

O DNA move-se atravs dum

canal no RNA polimerase e faz uma

curva acentuada no centro activo.

Alteraes de conformao em

certos mdulos flexveis do enzima

controlam a entrada nucletidos no

centro activo.

Complexos de Iniciao do RNA polimerase

O RNA polimerase liga-se aopromotor, formando um complexo fechado(o DNA est intacto).

O DNA desemparelha parcialmentejunto regio -10, formando um complexoaberto.

A transcrio inicia-se levando auma alterao conformacional nocomplexo.

Na presena do complexo ternrio, a

iniciao abortiva.Passa-se fase da elongao, com

a libertao da subunidade .

O reconhecimento de diferentespromotores feito mediante o uso dediferentes subunidades .


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Posicionamento do RNA polimerase

Inicialmente, o RNApolimerase contacta com

a regio entre -55 e +20.

Quando a subunidade sigma se

dissocia, o enzima core contrai-se

at -30.

Quando o enzima se move alguns

pares de bases, torna-se mais

compactamente organizado no

complexo de elongao.


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Reconhecimento do Alvo pelo RNA polimerase


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Reciclagem da subunidade e do Enzima core


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Aco dos Enhancers

So sequncias estimuladoras da

transcrio que podem acelerar aconverso do complexo binrio fechado

em complexo aberto.

Elongao da Transcrio


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Reincio da Transcrio

Um RNA polimerase parada pode reiniciar a transcrio por uma

reaco de hidrlise na extremidade 3.

Terminao por Palindromas

Palindroma tem a propriedade de poder ser lida tanto da direita para

a esquerda como da esquerda para a direita.Exemplo:

5'-GAATTC-3'

3'-CTTAAG-5'

Este tipo de segmento um palndroma de DNA, que significa que

ambos os segmentos tm a mesma sequncia de nucletidos, mas com ordem

inversa.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Guaninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Citosinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Citosinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Citosinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Timinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Adeninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Guaninahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Guanina


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Os terminadores intrnsecos incluem

regies palindromas de 7 a 20 pb.

A estrutura em "stem-and-loop" inclui

uma regio rica em GCs ("stem") e

outra com uma srie de Us.

Terminao Independente de Rho ()

Os sinais independentes de formam uma pequena regio em "hairpin" e

possuem uma sequncia de 3 As na cadeia molde junto da extremidade 3 do

"hairpin".


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Terminao Dependente de Rho

()

1. O factor Rho, liga-se a um local rut ("rho utilization site");

2. O factor Rho persegue o RNA polimerase, ligado a este;

3. Quando o polimerase abranda (ou pra) num stem-and-loop, o factor

Rho, consegue "apanh-lo;

4. Rho induz a terminao desfazendo o hbrido DNA-RNA e todos os

componentes so libertados.

Transcrio e Traduo


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Anti-Terminao

Pode ser usado um mecanismo de anti-terminao para controlar a

transcrio. Os factores de anti-terminao atuam como subunidades do RNA

polimerase que ignoram (fazem o readthrough) os sinais de terminao.


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Aula 8 A transcriao em Eucariotas

Principais diferenas em relao transcrio de procariotas

O processo mais complexo, devido estrutura nucleossmica do

DNA.

Existem 3 RNA polimerases diferentes no ncleo das clulas

eucariticas: RNA polimerases I, II e III (para alm da RNA polimerase

mitocondrial e, nas plantas, da RNA polimerase dos cloroplastos); nos

procariotas apenas existe um RNA polimerase com capacidade de

reconhecimento do promotor (subunidade ).

Cada um dos RNA polimerases nucleares no se liga diretamente ao

seu promotor respetivo mas sim a protenas designadas fatores de transcrio

que, por sua vez, se ligam a sequncias de DNA especficas que constituem

cada promotor.

Os mRNAs so mais estveis e os processos de transcrio e

traduo so espacialmente e temporalmente separados (ou seja, a transcrio

ocorre no ncleo e a traduo ocorre no citoplasma).

Fatores auxiliares

Fatores Basais - so necessrios ao incio da transcrio em todos os

promotores. Formam um complexo com a RNA polimerase em torno do incio

da transcrio (IT).

Fatores a Montante (Upstream Factors) so protenas que se ligam

ao DNA a montante do IT. So ubiquitrios e a sua atividade no regulada.

Fatores Indutveis - atuam como os fatores a montante, mas possuem

atividade reguladora. Ligam-se a elementos de resposta.

Fator de Transcrio Qualquer protena necessria para o incio da

transcrio, mas que no seja parte integrante da RNA polimerase.

Enhancers Sequncias que estimulam a transcrio, mas que se

situam a uma distncia considervel do IT (a montante ou a jusante) e em

qualquer orientao.


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RNA polimerases

Transcrio pelo RNA polimerase I

A RNA Polimerase I usa um promotor bipartido:

Spacer no-transcrito Uma regio entre a unidade transcricional

num "cluster" de genes em tandem.

O promotor da RNA polimerase I consiste num promotor core e num

elemento a montante do promotor (UPE, "upstream promoter element").

O fator UBF1 enrola o DNA em torno duma estrutura proteica para

trazer o core e o UPE em proximidade.

Transcrio pelo RNA polimerase III

A RNA Polimerase III usa trs tipos de promotores:

Promotores internos (tipo I e II) que tm curtas sequncias de

consensus localizadas dentro da unidade transcricional e que induzem a

iniciao a ocorrer a uma distncia fixa "upstream".


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Promotores upstream Contm trs curtas sequncias de

consensos "upstream" do incio da transcrio e s quais se ligam fatores de

transcrio.

Transcrio pelo tRNAs em levedura

A eficincia da transcrio depende do correto posicionamento de dois

nucleossomas a montante do gene do tRNA e da maquinaria de transcrio nogene.

Transcrio pelo RNA polimerase II: complexo de iniciao

A RNA pol II requere sete fatores gerais de transcrio, ou GTFs

("general transcription factors") e ATP para iniciar a transcrio.

A ligao do TFIID TATA box (ou Inr) o primeiro passo da iniciao:

a TBP posiciona a RNA Pol II na TATA box.


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Iniciao de transcrio

Elementos "upstream" e os fatores que a eles se ligam aumentam a

frequncia da iniciao

Papel do TFIIH

O TFIIH funciona como local de ancoragem de um complexo de

enzimas envolvidos na reparao do DNA

Mutaes no "domnio XPD" do TFIIH so causadoras de

doenas

Fatores de iniciao do RNA polimerase II


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A TBP um Fator Universal de Posicionamento

A TBP a componente do fator de posicionamento

que requerida para os trs tipos de RNA polimerases se

ligarem ao seu promotor.Para o RNA polimerase II o fator TFIID, que

consiste na TBP mais aproximadamente 14 TAFs.

As trs polimerases ligam-se via fatores de

compromisso.

Promotor do RNA polimerase IIUm promotor tpico do RNA polimerase II consiste em dois tipos de

regies:

1. Promotor core que inclui a

TATA box, onde se ligam os fatores basais, e

situado perto do incio da transcrio (IT).

2. Sequncias a Montante onde

se ligam os fatores a montante. Estas podemincluir os elementos de resposta, onde se ligam os fatores indutveis

(elementos reguladores), no caso dos genes indutveis.

Funo de Diferentes Regies no Promotor

TATA box (TATAAAA) situa-se a cerca de -30 nucletidos do

incio da transcrio. Quando mutada, altera-se o local de incio da

transcrio.

CAAT box (GGCCAATCT) - a cerca de -75/-80 do IT; mutaes

sugerem um papel na determinao da eficincia da transcrio, e no

na especificidade do promotor. Funciona em qualquer orientao.

GC box (GGGCGG) - a cerca de -90 do IT ocorre frequentemente

em mltiplas cpias e em qualquer orientao. Atua sobre os fatores

basais, determinando a frequncia da transcrio.

Octmero (ATTTTGCAT) - responsvel por interaes protena-

protena que determinam a eficincia da transcrio.


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Promotores vs. Enhancers

Enhancers

So sequncias de DNA que atuam:

A distncias geralmente grandes do incio da transcrio. Estadistncia ao promotor varivel.

Em qualquer orientao.

Podem-se localizar a jusante do incio da transcrio.

Promotores

Sequncias de DNA que se encontram a uma distncia (relativamente)

fixa e curta do incio da transcrio.

O Aparelho Transcricional em Eucariotas


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Aula 9 Regulaao da Transcriao em Procariotas

Porqu regular a Expresso dos Genes?

Procariotas

O gene 1 um gene constitutivo (ou de housekeeping).

Os genes 2 e 3 so genes indutveis, sendo activados consoante o tipo

de glcido presente no meio.


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Eucariotas

1. Genes de plantas que respondem luz;

2. Hormonas que regulam a expresso gnica;

3. Clulas especializadas expressam genes diferentes.


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Regulao Transcricional

Regulao Negativa

Na regulao negativa, um repressor liga-se ao operador evitando queum gene seja expresso.

Exemplo: operes repressveis que so controlados negativamente

pelo produto final da via biossinttica a que pertencem.

Regulao Positiva

Na regulao positiva, necessrio um factor de transcrio ligar-se ao

promotor a fim de permitir que o RNA polimerase inicie a transcrio.

Exemplo: operes indutveis que so controlados positivamente pelo

substrato da respectiva via metablica.


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Um repressor pode evitar a iniciao pelo

RNA polimerase.

Factores de transcrio permitem que o

RNA polimerase se ligue ao promotor.


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Opero da Lactose

Opero indutvel em procariotas, requerido para o transporte e o

metabolismo da lactose em Escherichia colie outras bactrias.

O opero lac regulado por diversos factores, em particular a

disponibilidade de glicose e lactose no meio extracelular.

A regulao gentica do opero lac foi o primeiro mecanismo complexo

de regulao gnica a ser elucidado e um dos principais exemplos de

regulao gentica em procariotas.


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Organizao do Opero Lac

Regulao Alostrea do Opero Lac


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Regulao do opero Lac


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Represso do Opero Lacpela Glucose

Quando existe glicose, que preferencialmente usada, os genes

que codificam os enzimas envolvidos no catabolismo de outros glcidos no

so expressos, ou seja, a glicose reprime o opero lac na presena do seu

indutor lactose.

A represso pela glicose mediada por um sistema positivo de

controlo, que est dependente dos nveis de cAMP. O enzima que converte em

ATP em cAMP activado quando os nveis de glicose esto baixos, o cAMP

liga-se a uma protena reguladora da transcrio, a CAP, que por sua vez se

liga sua sequencia alvo (localizado antes do inicio do opero) e faz com que

a subunidade do RNA polimerase se ligue mais facilmente ao promotor.


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CAP e RNA polimerase

CAP catabolite activator protein um activador

transcricional.

Duas molculas de cAMP (AMP cclico) ligam-se CAP

com cooperatividade negativa e funcionam como efectores alostrios

aumentando a afinidade da protena para o DNA.

CAP tem uma estrutura em hlice que lhe permite ligar-se

a sucessivas major grooves de DNA. Isto abre a molcula de DNA,

permitindo que o RNA polimerase se ligue e transcreva os genes

envolvidos no catabolismo da lactose. Assim, CAP aumenta a

expresso do opero lac, quando a lactose est presente, mas a

glicose no.

Represso do Opero Lac

O repressor Lac controlado

por uma pequena molcula indutora. Um

indutor pode funcionar convertendo umaprotena repressora numa forma com baixa

afinidade para o operador.

O repressor tem 2 locais de

ligao: um para o operador do DNA e

outro para o indutor.


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Indutor gratuito indutores que se assemelham a autnticos

indutores da transcrio, mas no so substratos para os enzimas induzidos.

Opero do TriptofanoA regulao da transcrio do opero do triptofano pode ser

generalizada para os restantes aminocidos e uma regulao por

represso do produto final pois, ao contrrio do opero da lactose que est

sempre silenciado na ausncia do substrato, o opero do triptofano est

sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminocido abunda na

clula.


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Mecanismo de Atenuao

A regulao por atenuao exclusiva dos procariotaspois implica

que a transcrio e a traduo ocorram em simultneo, o que no se verifica

em organismos eucariotas.A atenuao da transcrio age impedindo o alongamento a partir de

determinados stios, que no so mais do que sequncias especficas.


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Aula 10 Regulaao da transcriao em Eucariotas

A expresso dos genes em eucariotas ,

principalmente, controlada no incio da

transcrio. Este controlo envolve mudanas

estruturais da cromatina na regio do promotor,

acompanhado com a ligao do aparelho

transcricional basal ao promotor.

Os intres so depois removidos do

mRNA transcrito. O RNA maduro migra depois do

ncleo para o citoplasma. Esta transio pode ser

especificamente controlada em clulas

embrionrias. A regulao dos fatores de

transcrio permite controlar um elevado nmero

de genes alvo.

Um gene regulado por uma sequncia promotora (e, por vezes um

ou mais enhancers) que compreende vrios elementos em cis.

Cada um destes elementos reconhecido por uma protenaespecfica: elementos em trans(ou fatores de transcrio). O conjunto destes

elementos indispensvel para a RNA polimerase iniciar a sua atividade, em

conjunto com os fatores basais.

Os fatores de transcrio s se encontram presentes na sua forma

ativa sob condies em que o gene deve ser expresso. Na sua ausncia, o

gene no ativado por via desse fator.

Gene Humano da Metalotionena

Um elemento que causa que um gene responda a um dado fator

denominado elemento de resposta. Exemplos de elementos de resposta:

GRE Glucocorticoid response element

MRE Metal response element

TRE TPA (tumour promoting agent) response element


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A regio qual os fatores se ligam no fica muito longe da regio que

vo ativar. Podem localizar-se tanto nos promotores como nos enhancers. A

ligao do ativador ao elemento de resposta necessria para que o RNA

polimerase inicie a transcrio. Um ativador pode apenas estar ativo em

determinadas condies e so essas condies que vo determinar quando o

gene vai ser expresso.

O gene da metalotionena um exemplo de como um gene pode ser

regulado por vrios fatores. Este gene est ativo, mas induzido por elevadas

concentraes de metais pesados (como o cdmio) ou por glucocorticoides.

A TATA e a GC box esto localizadas perto da regio de

iniciao. Para a expresso basal so tambm necessrios dois elementos

basais, BLE basal level elements, que se encaixam na categoria de

enhancers. Estes elementos, embora perto do local de iniciao, podem ser

movidos para outro sitio sem perder a sua atividade.

Ativao da transcrio

Ativadores: determinam a frequncia da transcrio.

Repressores: protenas que inibem a expresso dum gene.

o Podem atuar evitando que ocorra a transcrio ligando-se

a um operador no DNA ou prevenindo a traduo ligando-

se ao RNA.

Epigentica: inclui alteraes que influenciam o fentipo semalterao do gentipo.

o Estas consistem em alteraes nas propriedades da

clula que so herdadas, mas que no representam uma

alterao da informao gentica.


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Vrios Elementos Um Gene

Cada acontecimento

regulador depende apenas da ligao

de um fator em transno elemento emciscorrespondente.

Cada elemento regulador

(promotor ou enhancer) pode por si s

ativar o gene, independentemente dos

restantes.

Para um dado fator de

transcrio, o respetivo elemento em cise a regio ativada (promotor) situam-se em locais diferentes, o que explica como diferentes regies reguladoras, a

distncias variveis do promotor, possam funcionar independentemente.

Domnios Zinc Finger

Alguns aminocidos ligam o io zinco e formam um domnio

independente na protena.

O io zinco ligado por aminocidosconservados de histidina e cistena.

Os zinc fingerso domnios comuns no DNA

que liga protenas; os zinc fingers organizam-se

numa srie de repeties tandem.

O C-terminal de cada finger forma hlices enquanto o N-terminal

forma folhas .

O Finger pode estar envolvido na ligao do

RNA e no do DNA ou pode no estar relacionado

com a ligao de nenhum cido nucleico.

Os aminocidos antes do primeiro zinc

finger determinam a sequncia do DNA alvo; os que

se encontram antes do segundo controlam o

espaamento entre os locais em que so reconhecidos por cada subunidade

de um dmero.


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A evidncia de que o primeiro zinc

finger que ligava o DNA veio da

experincia de trocar a especificidade da

sequncia antes desse finger. O finger do

recetor de estrognio (localizado antes do

primeiro finger) foi eliminado e substitudo

pela sequencia do recetor de

glucocorticoide. A nova protena passou a

apresentar especificidade para o GRE (o alvo do recetor do glucocorticoide) em

vez de apresentar para o ERE (o alvo do recetor de estrognio).

Ativao da transcrio por hormonas esterides

Uma hormona esteroide pode atravessar a membrana celular por

difuso simples. Dentro da clula, o

glucocorticoide liga-se ao seu recetor (a

localizao destes recetores ainda no est

esclarecida, pensa-se que existem em equilbrio

entre o ncleo e o citoplasma), o que converte a

protena para a sua forma ativa que tem uma

elevada afinidade para o DNA, pelo que o

complexo hormona-recetor se encontra sempre

localizado no ncleo.

O recetor ativado reconhece uma sequncia especfica que identifica o

GRE. O GRE, normalmente, encontra-se localizado no enhancer, que se

encontra a alguns pares de bases do promotor. Quando o complexo hormona-

recetor se liga ao enhancer, o promotor mais perto ativado e dando incio

transcrio.

A ativao do enhancercorresponde ao mecanismo geral pelo qual os

esteroides regulam alguns genes.


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Aula 11 Processamento de RNAs: mRNAs de Eucariotas

Processamento do mRNA em Eucariotas

Nos procariotas, o mRNA est pronto a ser traduzido logo aps a

transcrio. J nos organismos eucariotas, o transcrito de pr-mRNA

sintetizado no ncleo ainda vai sofrer extensas modificaes at poder ser

utilizado no processo de traduo.

O processamento de mRNA de eucariotas ocorre no ncleo e inclui:

Capping em 5 adio ao terminal 5 de um nucletido com

uma base modificada, 7-metil guanilato. neste terminal que se vo ligar os

ribossomas para que se d a traduo completa do mRNA;

Poliadenilaoadio de nucletidos de adenina ao terminal 3

e formao de uma cauda poli-A de comprimento varivel (pode atingir 200-300

bases). Para alm de regular mecanismos de traduo e estabilidade, esta

cauda tem ainda um papel protectorna medida em que atrasa a digesto do

RNA pelo RNase, permitindo assim que a sua sequncia codificante se

mantenha ntegra durante um perodo de tempo maior.

A poliadenilao no um processo exclusivo dos

eucariotas, tendo-se vindo a verificar que tambm ocorre em

alguns mRNAs de procariotas;

Splicingremoo de intres e colagem de exes intres so

sequncias que no codificam para o mRNA final, em oposio ao exes, que

codificam informao para o mRNA maduro. Ocorre em grandes complexos, os

spliceossomas, formados por protenas e pequenos RNAs nucleares

(snRNA). Os snRNAs reconhecem sequncias nos locais de splicing do pr-

mRNA e catalisam a reaco de splicing. A maioria dos genes de eucariotas

contm mltiplos intres pelo que possvel juntar exes em diferentes

combinaes atravs de mecanismos de splicing alternativo.


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Estes mecanismos, muito importantes na regulao da expresso

gentica, permitem ainda que intres passem a ser considerados exes, no

sendo removidos e permitindo novas combinaes.

Capping

O cap bloqueia a extremidade 5 do mRNA e pode ser metilado em

vrias posies.

1. Presente em todos os "caps" (posio 7 da guanina terminal).

Enzima: guanina 7-metiltransferase

2. Posio 2-O da base primeiro (da cadeia original). Enzima: 2-O-

metiltransferase.

3. Em 10% dos casos, tambm h metilao na posio 2-O da

segunda base original: "CAP 2".

CAP 1


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O cap tem influncia na eficincia da traduo.

Cap0 uma s metilao na posio 7da guanina (pelo guanina-

7-metil-transferase).

Cap1 a 1 base transcrita (geralmente A ou G) pode tambmestar metilada (pelo 2-O-metil-transferase) no oxignio 2. Esta metilao

predomina nos mRNAs de eucariotas, excepo dos unicelulares.

A adio dum grupo metilo no azoto N6do cap1pode ocorrer nos

Eucariotas superiores, se a base deste 2 nucletido fr a adenina.

Cap2 a 2 base transcritapode tambm apresentar metilao

no oxignio 2 (10-15% dos mensageiros).

Podem ainda ocorrermetilaes internasno mRNA (nas adeninas)

Poliadenilao

A sequncia AAUAAA

necessria para a clivagem e

poliadenilao da extremidade 3.


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1. A poliadenilao inicia-se quando o complexo da RNA polimerase II

sintetiza o sinal AAUAAA na extremidade 3 da molcula do mRNA precursor.

2. O CPSF liga-se ao sinal de consensos (AAUAAA) e forma um complexo

contendo os endonucleases CFI e CFII que clivam o transcrito a juzante do

sinal de poliadenilao, formando nova extremidade 3. A PAP liga-se agora a

esta extremidade.

3. Os endonucleases dissociam-se e a nova extremidade 3 poliadenilada

pela actividade da PAP.


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A poliadenilao do mRNA:

Ocorre em 2/3 dos mRNAs de Eucariotas ausente nas histonas);

um acontecimento precoce na biossntese do mRNA: ~1 min

aps a polimerase passar AAUAAA;

O tamanho da cauda ~200 A;

A adio da cauda catalisada pelo enzima poli(A) polimerase

(PAP). A sua actividade distributiva (liga-se e dissocia-se para cada base

ligada), para a sntese dos primeiros ~20 A;

A actividade da PAP torna-se processiva (uma cadeia

polimerizada durante uma associao), para a sntese dos restantes ~200 A,

quando mediada pelo CPSF (cleavage poliadenylation specificity factor) e do

seu cofactor CstF, e em presena da PABP (poly(A) binding protein);

Para cada espcie de mRNA, apenas 70% possui cauda;

A presena da cauda poli(A) est relacionada com estabilidade e

com o transporte ncleo-citoplasma;

Principal consequncia prtica: isolamento de mRNA.

Alguns mensageiros (de Eucariotas) no possuem cauda poli(A).

Exemplo: mensageiros das histonas: a formao da sua extremidade

3depende da estrutura secundria e do snRNA U7.

A formao da extremidade 3 nos mRNAs das histonas depende dum

hairpin conservado e duma sequncia que emparelha com o RNA U7.


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Os mRNAs eucariotas so modificados, processados e transportados

Splicing

O splicing depende apenas do reconhecimento de pares de junes de

splicing as junes de splicing so lidas aos pares.

Todos os locais de splicing 5 so funcionalmente equivalentes, assim

como todos os locais de splicing 3.

Outras sequncias adicionais conservadas, quer a 5 quer a 3 dos

locais de splicing, definem estes ltimos como funcionais entre os numerosos

potenciais locais presentes no pr-mRNA.

Na figura seguinte mostra-se a remoo de 3 intres por splicing

correto atravs do reconhecimento de pares de junes de splicing.


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O splicing nuclear decorre por duas reaces de esterificao.

O intro libertado como um "lariat" quando clivado no seu local de

splice 3 e os exes esquerda e d

resumos de biologia molecular

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