manual de biologia molecular

TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR

Lívia Ferreira S. Verzola

2018

Biologista Me. Lívia Ferreira. S. Verzola - Laboratório de Patologia Molecular – SERPAT e-mail: [email protected]

2


3

TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR

Mais do que um complexo conjunto de técnicas que geram conflitos intelectuais, sociais e religiosos, a manipulação genética cria condições para que nós possamos conhecer melhor não só o mundo e os seres que nele vivem. Antes disso, ela nos permite viver mais próximos à nossa vaidade e nos remete ao questionamento

de nossas limitações.

A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial foco no estudo

da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a

Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre

DNA, RNA e Síntese Protéica. É um campo de estudo amplo, que abrange outras áreas da Biologia e da

Química, em especial, Genética e Bioquímica. Muito do trabalho feito no âmbito da Biologia Molecular

relaciona-se com a obtenção, identificação e caracterização de genes. No estudo da Microbiologia, diversas

técnicas de biologia molecular são utilizadas para o isolamento e caracterização de organismos patogênicos

(ou de seus genes), como vírus e bactérias.

Desde o início da década de 1970 foram desenvolvidas e/ou aperfeiçoadas diversas técnicas de

detecção ou diferenciação de ácidos nucléicos. A maioria dessas técnicas é realizada em função da variação da

temperatura e/ou do pH do meio onde os ácidos nucléicos se encontram. Considerando que a temperatura e o

pH estão relacionados com a capacidade do DNA em desfazer e refazer as pontes de hidrogênio, deve-se

então ter em mente que a hibridização dos ácidos nucléicos é a base fundamental da maioria das técnicas

moleculares como Western blot, Southern blot, Northen blot, ISH, FISH, PCR Convencional, PCR em Tempo

Real, Seqüenciamento, etc.


4

OBTENÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS – EXTRAÇÃO

Princípio:

A obtenção de DNA e ou RNA para qualquer finalidade é sem dúvida uma etapa fundamental em

qualquer protocolo, pois a pureza e a integridade das moléculas de ácidos nucléicos certamente influenciarão

nos resultados finais dos experimentos para as quais se destinam.

Existem métodos clássicos, com pequenas variações, para a obtenção dos ácidos nucléicos a partir de

amostras biológicas em geral, e são aplicáveis em qualquer laboratório que disponha dos equipamentos e

reagentes necessários, como a técnica SALTING OUT. Outros métodos mais modernos são baseados no uso

de KITS INDUSTRIALIZADOS preparados com variados tipos de soluções salinas de diferentes

concentrações, tampões e colunas de troca iônica para a purificação de DNA ou RNA, são de modo geral mais

práticos e rápidos, porém todos seguem as mesmas etapas básicas:

Ruptura (físico e químico) das membranas celulares para liberação do material genético.

Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas.

Separação do DNA dos demais componentes celulares.

OBS.: Cada Kit de Extração Comercial possui seu próprio procedimento, mas com o mesmo

princípio. Sempre verificar o procedimento do Kit que você está utilizando para não errar na

técnica.


5

PROTOCOLOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE PATOLOGIA MOLECULAR

EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

Centrifuga de tubos 1,5-2,0 mL

Kit Comercial para extração.

Banho-Maria

Vortex

Timer

EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE MATERIAL PARAFINADO: KIT DNA ISOLATION FROM FFPE

SAMPLES – MACHEREY-NAGEL – MN

1. Desparafinizar amostra: Adicionar 400ul de Paraffin Dissolver na amostra.

2. Incubar 3 minutos à 60°C (esta temperatura é de acordo com a temperatura de fusão da parafina).

3. Vortexar a amostra ainda quente imediatamente depois dos 3 minutos.

4. Lizar amostra: Adicionar 100ul do Buffer FL.

5. Vortexar vigorosamente e Centrifugar a 11.000 rpm por 1 minuto.

Depois da centrifugação irá formar 2 fases no tubo da amostra. Retirar com a pipeta todo o

sobrenadante, manter somente a fase do fundo no tubo.

6. Pipetar 10ul de Proteinase K diretamente no fundo do tubo e homogeneizar.

7. Incubar o tubo em temperatura ambiente por 3 horas ou overnight.

8. Depois da incubação vortexar o tubo e ligar o banho-maria na temperatura 90°C.

9. Adicionar 100ul do Decrosslink Buffer D-Link no tubo e vortexar. Centrifugar a 11.000 rpm por 30

segundos.

10. Adicionar 200ul de etanol (96-100%) no tubo e vortexar. Depois dar um Spin no tubo.

11. Pipetar todo o conteúdo do tubo na coluna com o tubo coletor e Centrifugar a 11.000 rpm por 30

segundos. Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar.


6

12. Adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. Retirar todo o

filtrado no tubo coletor e descartar.

13. Novamente adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos.

Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar.

14. Centrifugar somente a coluna com o tubo coletar por 1 minuto para retirar todo o etanol da amostra.

15. Eluir o DNA: Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um tubo tipo eppendorf. Adicionar 20ul

do Buffer BE diretamente na coluna de sílica e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos.

EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE MATERIAL PARAFINADO: KIT QiAamp FFPE TISSUE –

QIAGEN

1. Cortar a parafina com a amostra no tamanho de 5-10 um. Colocar em um eppendorf.

2. Adicionar 1 ml de xilol na amostra e vortexar por 10 seg. centrifugar na velocidade máxima por 2 min.

3. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de álcool (96-100%) e vortexar. Centrifugar na velocidade

máxima por 2 min.

4. Remover o sobrenadante, abrir o tubo e deixar à temperatura ambiente ou à 37°C por 10 min para

evaporar o álcool.

5. Ressuspender o pellet em 180ul de tampão ATL, adicionar 20ul de proteinase K e vortexar.

6. Incubar à 56°C por 1 hora e depois incubar à 90°C por mais 1 hora.

7. Dar um spin e adicionar 2ul de RNAse e incubar por 2 min. na temperatura ambiente. Adicionar 200ul

do tampão AL, vortexar, adicionar 200ul de álcool (96-100%) vortexar.

8. Transferir tudo para a coluna. Centrifugar a 8.000 rpm por 1 min.

9. Desprezar a solução do tubo coletor e adicionar na coluna 500ul do AW1.

10. Centrifugar a 8.000 rpm por 1 min. desprezar e adicionar 500ul do AW2 e centrifugar.

11. Desprezar e centrifugar a coluna sem nada a 14.000 rpm por 3 min. para retirar totalmente o álcool.

12. Adicionar de 20-100ul do tampão ATE, eluição, deixar 1 min. na temperatura ambiente e centrifugar a

14.000 rpm por 1 min.


7

EXTRAÇÃO DE RNA A PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL SIGMA – RTN70

1. Antes de iniciar o experimento preparar a solução de lise. Manipular tudo no gelo (amostras/lisado).

Adicionar 2-mercaptoetanol ao volume de solução de lise que será utilizada no dia, usualmente 250 ou

500ul por preparação de RNA. Usar 10ul para cada 1ml de solução de lise.

TECIDO

2. 40 mg de tecido adicionar 500ul sol. lise

25 mg de tecido adicionar 300ul sol. lise

100 mg de tecido adicionar 1250ul sol. lise

Obs.: O lisado acima de 500ul deve ser divido em 2 colunas e processar separadamente.

3. Separar o tecido e colocar em um tubo próprio para homogenização. O volume do tampão de lise deve

ser suficiente para a amostra. Não deixar o tecido congelado, descongelar antes da ruptura na solução

de lise/2-ME e homogenizar sempre no gelo.

4. Pipetar o homogenato em uma coluna Gen Elute Filtration (azul inserido em um tubo de 2ml).

Centrifugar a velocidade de 12.000 – 16.000 g por 2 min. (a centrifuga já tem que estar refrigerada a

4°C). descartar a coluna de filtração.

5. Adicionar ao filtrado 500ul de Etanol 70%. Vortexar

6. Pipetar 700ul da mistura lisado/etanol na coluna Gen Elute Binding Column. Se o volume for maior

fazer em 2 etapas. Centrifugar na velocidade máxima por 15 seg.

7. Primeira lavagem: adicionar 500ul de Wash Solution 1 na coluna e centrifugar a velocidade máxima

por 15 seg.

8. Segunda lavagem: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 500ul do wash solution 2 na coluna

e centrifugar a velocidade máxima por 15 seg.

9. Terceira lavagem: pipetar 500ul do wash solution 2 na velocidade máxima por 2 min.

10. Dar um Spin para secar a coluna


8

11. Eluição do RNA: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 50ul da solução de eluição e

centrifugar na velocidade máxima por 1 min. Se é esperado uma concentração maior que 50ug de

RNA, repetir a eluição com 50ul extra da solução de eluição.

12. Manter no gele até estocar no -70°C

EXTRAÇÃO DE RNA PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL RNeasy MICRO KIT) –

QIAGEN

Procedimento:

1. Adicionar B-Mercaptoetanol ao tampão RLT. Adicionar 10ul de B-ME em 1ml de Buffer RLT.

2. Adicionar ETOH 4V no Buffer RPE

3. Adicionar 350ul Buffer RLT no tecido e homogeneizar por 30 seg.

4. Centrifugar a 14.000 rpm por 3 min. Transferir o sobrenadante para outro tubo, adicionar 350ul de

etanol 70% e transferir para uma coluna. Centrifugar a 8.000-10.000 rpm por 15 seg.

5. Adicionar 350ul de buffer RW1 a 10.000 rpm por 15 seg.

6. Adicionar 10ul de DNAse I a 70ul Buffer RDD e adicionar sobre a coluna e incube em banho maria a

20-30°C por 15 min.

7. Adicionar 350ul RW1 a 10.000 rpm por 15 seg.

8. Troque o tubo que sustenta a coluninha e adicione 500ul de Buffer RPE a coluna e centrifugue a

10.000 rpm por 15 seg.

9. Adicione 500ul de etanol 80% e centrifugue a 10.000 rpm por 2 min.

10. Centrifugue a 10.000 rpm por 2 min. para retirar o excesso de etanol.

11. Colocar a coluninha em um outro tubo coletor e adicionar 14ul de RNAse Free Water, centrifugar a

10.000 rpm por 2 min.


9

EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE TOTAL: KIT COMERCIAL GEN ELUTE – SIGMA

1. Coletar o sangue total em um tubo anticoagulante

2. Adicionar 500ul de sangue total a 1 ml de solução de lise (160 mM amonium chloride e 20 mM

sodium bicarbonate pH 7.2 com HCl). Misturar gentilmente por 5 minutos a 700 g em uma

microcentrífuga.

3. Descartar o sobrenadante. Gentilmente ressuspender o pellet em 1 ml de solução de lise cloreto de

amonium (a mesma anteriormente), misturar gentilmente e dar um spin.

4. Descartar o sobrenadante manter o pellet no gelo.

CÉLULAS BRANCAS – PELLET

5. Ressuspender o pellet com 200ul de solução ressuspensão. Adicionar 20ul de proteinase K a amostra e

vortexar. Adicionar 20ul RNAse e incubar por 2 min. em temperatura ambiente.

LISE CELULAR

6. Adicionar 200 ul da solução de lise C na amostra vortexar. Uma mistura homogênea é essencial para

uma lise eficiente. Incubar a 55° C por 10 min.

PREPARO DA COLUNA

7. Adicionar 500ul da solução preparação da coluna para cada coluna e centrifugar 12.000 g por 1 min.

descartar o líquido.

8. Adicionar 200ul ETOH ao lisado, misturar vortexando 5-10 seg. uma solução homogênea é essencial.

9. Carregar o lisado – transferir o conteúdo do tubo para coluna tratada e centrifugar a 6.500 g por 1 min.

descartar o tubo coletor contendo o fluido e colocar a coluna em um outro tubo.

LAVAGENS

10. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 6.500 g por 1 min. Descartar o liquido que

está no fundo do tubo coletor

11. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 12.000 g por 3 min. Descartar o líquido que

está no fundo do tubo coletor. Colocar a coluna em um outro tubo coletor.

12. Adicionar 200ul de solução de eluição e centrifugar a 6.500 g por 1 min. para eluir o DNA.


10

REAÇÃO EM CADEIA PELA AÇÃO DA POLIMERASE (PCR)

Princípio:

A reação em cadeia pela ação da polimerase, ou simplesmente PCR (do inglês polimerase chain

reaction), desenvolvida por Kary B. Mullis, é o ensaio mais sensível para a detecção de DNA. A técnica de

PCR é um método baseado na amplificação enzimática de um determinado segmento de DNA pela extensão

de oligonucleotídios (primers ou seqüências iniciadoras) que hibridizam com as fitas complementares de uma

seqüência – molde também conhecida como seqüência – alvo. Repetidos ciclos com sucessivas variações de

temperatura permitem a desnaturação do DNA molde, hibridização e extensão dos primers pela ação da DNA

polimerase. Ao decorrer de vários ciclos o segmento de DNA limitado pelos primers vai sendo amplificado,

de modo que passa a existir um acúmulo exponencial dessa região. Então se partirmos de uma única molécula

de DNA molde, após 30 ciclos de desnaturação, hibridização e extensão, será obtido cerca de 1,4 bilhão de

cópias da região limitada pelos primers.

EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

Termociclador

Vórtex

Obs.: A quantidade a ser adicionada de cada reagente depende da concentração dos mesmos e da

marca dos reagentes que estão sendo utilizados. Observar o protocolo que acompanha os reagentes

para não errar a técnica.

Procedimento:

A PCR consiste em uma reação em que são misturados em um tubo:

DNA: que se deseja amplificar

Primers: que atuam como iniciadores e que limitarão a região a ser amplificada

Bases nitrogenadas (dNTPs): serão incorporadas às novas cadeias de DNA

Tampão: fornece o pH ótimo para a atividade da polimerase

Taq Polimerase: atividade enzimática.


11

(Protocolo para 1 paciente)

1. Definir o volume final da reação de PCR (por ex: 25ul).

2. Adicionar em um tubo tipo eppendorf ou poço de uma placa de 0,2ul os reagentes fazendo um “mix”:

3. Adicionar primeiramente 9,0 ul de H2O ultrapura

4. Adicionar 12,0 ul Taq DNA Polimerase JumpStart (já com MgCl e dNTPs)

5. Adicionar 1,0 ul de Primer Foward

6. Adicionar 1,0 ul de Primer Reverse

7. Adicionar 2,0 ul do DNA a ser amplificado (paciente)

8. Depois que adicionou tudo, vortexar o tubo e colocá-lo no termociclador no programa (ciclo)

adequado.

PCR em Tempo Real

Princípio:

Trata-se de uma inovação que permite o acompanhamento do número de cópias feitas numa PCR.

Neste sistema, além dos primers, você utiliza uma sonda interna ao segmento a ser amplificado também é

hibridizado ao DNA molde. Essa sonda possui um marcador fluorescente que permanece protegido, sendo

liberado quando a sonda é destruída pela ação da enzima polimerase. Assim quando ocorre a extensão dos

primers, a polimerase passa pelo local onde a sonda está ligada, promovendo a sua desintegração. Esse evento

pode ser acompanhado pela liberação da fluorescência, que é captada pelo equipamento e processada no

computador. Esse é um teste que está sendo bastante utilizado para verificação de carga viral.

RT-PCR

Princípio:

Consiste em um método de amplificação de ácidos nucléicos a partir de moléculas de RNA convertidas

em DNA complementar (cDNAs). Neste sistema, o RNA, após ser isolado, é convertido em cDNA devido à

atividade da transcriptase reversa (RT). O cDNA é então utilizado como molde da reação de PCR que fornece

dados quantitativos e/ou qualitativos.


12

DILUIÇÃO DOS PRIMERS

Observar como chegaram os primers, geralmente eles estão liofilizados e temos que reconstituí-los. Ler o

protocolo que acompanha os primers.

PARA RECONSTITUIR OS PRIMERS:

Primeiramente:

Recomenda-se que a diluição dos primers seja realizada em uma concentração > 10 uM. Geralmente o

mais utilizado é deixar os primers para estoque na concentração de 100 uM.

CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DOS PRIMERS:

[ ] nmoles x 1.000 / 100 uM = V. final

Procedimento:

1. Centrifugar o tubo por poucos segundos - SPIN

2. Abrir com cuidado

3. Adicionar H2O Ultrapura ou TE deixar 2 minutos em temperatura ambiente reidratando

4. Vortexar 15 segundos

5. Aliquotar os primers e armazená-los

OBS.: Verificar muito bem a H2O ultrapura ou TE se estão estéreis (sem contaminação), fazer uma

assepsia adequada na bancada, nas mãos (luvas) e de preferência diluir em uma Workstation ou Capela

(UV) para que não haja contaminação.

OBS.: Geralmente no protocolo que acompanha os primers já vem o volume que você tem que adicionar de H2O ou TE. Se não tiver, fazer o cálculo ao lado.

Concentração do Primer (ler na

bula do primer)

Concentração Desejada

Fator de Conversão


13

ARMAZENAMENTO DOS PRIMERS

- 20°C = Material liofilizado (estabilidade > 1 ano)

- 20°C = Material reidratado/diluído (estabilidade > 6 meses)

4°C = Material reidratado/diluído (estabilidade até uma semana)

ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Eletroforese, do grego elektronphorese (conduzida pela eletricidade), refere-se ao deslocamento de

biomoléculas numa matriz sólida (agarose ou poliacrilamida) pela ação de um campo elétrico. A velocidade

do deslocamento dessas moléculas é determinada pelos fatores: carga elétrica (positiva, negativa ou neutra),

estrutura tridimensional e tamanho da molécula. Por ser uma técnica simples e relativamente rápida, a

eletroforese é a metodologia mais utilizada para separação de biomoléculas.

Princípio:

A técnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por exemplo), uma cuba com

eletrodos, um tampão no qual está imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba. Você adiciona a

amostra em um dos poços do gel. A amostra deve estar corada ou o gel deve ter o corante como por exemplo o

brometo de etídio. Sob influência de um campo elétrico, moléculas carregadas e partículas migram em direção

ao pólo oposto. A carga e a massa das moléculas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e,

portanto, propiciam a separação destas. Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuem carga elétrica

negativa eles sempre migrarão em direção ao pólo positivo.

Equipamentos Utilizados:

Microodas

Fonte e Cuba de Eletroforese

Formas e Pentes para montagem do gel

Balança Analítica


14

Procedimento:

PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE

1- Pesar 1,5 g de Agarose.

2- Colocar 100ml de TAE ou TBE 10x em uma proveta de 1000 mL e adicionar Água MiliQ ou Destilada

até completar 1000 mL, para que eu tenho um tampão TAE ou TBE 1x.

3- Colocar a agarose em um erlenmeyer, adicionar 100mL do tampão TAE ou TBE 1x já diluído

anteriormente, cobrir com um papel filme, fazer furos no papel filme, colocar no microondas por no

máximo 1minuto ou até dissolver a agarose. O restante do tampão TAE ou TBE 1x que sobrou colocar

na cuba de eletroforese. Se sobrar mais tampão, guardar em um frasco.

4- Depois colocar o gel já dissolvido no suporte com o pente para que ele endureça.

PREPARAR A AMOSTRA PARA SER APLICADA NO GEL

5- Retirar o gel do suporte, colocar na cuba de eletroforese.

6- Para aplicar o DNA amplificado ou genômico, colocar em um papel

1 ul de Azul de Bromofenol

3 ul de água MilliQ ou Destilada

2 ul do DNA genômico ou amplificado (PCR)

7- Fazer Up and Down com a pipeta para misturar e pegar todo volume e aplicar no pocinho do gel que já

está dentro da cuba de eletroforese com o tampão.

8- Ligar a fonte de eletroforese para que ocorra a corrida.

9- Depois da corrida, pegar o gel e colocá-lo no aparelho foto documentador ligando a UV e ver o

resultado.

A quantidade dos reagentes e do DNA genômico ou amplificado vai depender do tamanho do poço do gel.


15

TÉCNICA HIGH RESOLUTION MELTING - HRM

Princípio:

É um método poderoso em biologia molecular para a detecção de mutações e polimorfismos, foi

descoberto e desenvolvido na Universidade de Utah, é uma técnica utilizada para identificar as variações nas

seqüências de ácidos nucléicos que é baseado na detecção de pequenas diferenças na PCR de fusão

(dissociação). Possui várias vantagens sobre os outros métodos como o: baixo custo em relação a outras

tecnologias; baixo consumo de reagentes requerendo apenas o volume da reação de PCR (20ul) para análise

de cada amostra.


Equipamento de PCR em tempo real Centrífuga para placa

Procedimento:

Vamos utilizar um equipamento de PCR em Tempo Real ( Marca: Life Technologie (modelo: 7500

FAST ou StepOnePlus) e um reagente – fluoróforo – chamado MeltDoctor (Life Technologie).

Para 1 amostra:

10uL – MeltDoctor

1,2 uL Primer Fowarde a 5uM

1,2 uL Primer Reverse a 5uM

4uL do DNA estudado a 5ng/uL

3,6uL de Água MiliQ

1- Colocar todos os reagentes em um tubo tipo eppendorf, menos o DNA , formando um MIX.

2- Colocar 16 ul do MIX em cada poço de uma placa (de acordo com a quantidade de amostra que

você possui) e por ultimo pipetar o DNA (amostra).

3- Dar um SPIN na placa.

4- Colocar a placa no aparelho e programar a corrida no software do computador.


16

TÉCNICA FISH (do inglês Fluorescence in situ hibridization)

Princípio:

Essa técnica é usada para estudar os cromossomos de células em metáfase, mas seu principal

uso é nas células em interfase, quando anormalidades numéricas e algumas estruturais podem ser detectadas.

Essa propriedade é de grande valor em estudos sobre câncer, já que um grande número de células pode ser

verificado quanto a anormalidades clonais específicas que podem estar presentes somente em poucas células.

A citogenética em interfase também possui enorme potencial para diagnóstico pré-natal, sendo também um

instrumento valioso para o mapeamento gênico .

A técnica FISH envolve a preparação de sondas específicas de DNA, marcadas pela incorporação de

nucleotídeos quimicamente modificados que são diretamente fluorescentes (método direto) ou podem ser

detectados pela ligação a uma molécula fluorescente (método indireto), visualizados sob luz ultra-violeta. Tais

sondas de cadeias simples de DNA são hibridizadas com os cromossomos metafásicos como nas técnicas

habituais de citogenética, mas também diretamente com os cromossomos de células interfásicas. Após a

hibridização in situ, as lâminas formadas podem ser vizualizadas em microscópio de fluorescência, e as

alterações cromossômicas, se presentes, identificadas. (ver etapas do processo adiante). Atualmente há

sondas viáveis para todos os cromossomos, DNAs satélites e muitos locos específicos envolvidos em doenças,

que podem ser obtidas em Kits pelos laboratórios de citogenética.


Banho-Maria

Centrifuga

Vortex

Jarras de Coplin

Estufa

Termobrite e Timer


17

Procedimento:

1 – Colocar as lâminas na estufa à 60°C overnight.

2- Desparafinização em Xilol – 3 lavagens de 10 minutos cada

3- Passagem em álcool – 3 banhos de 5 minutos cada

4 – Passagem em água destilada – 3 banhos de 2 minutos cada 5- Banho em solução 0,2N HCl – por 20 minutos à temperatura ambiente

6- Pré-tratamento com Citrato pH 6,0 à 80°C em banho-maria por 1 hora 7- Digestão Enzimática com Pepsina (pronta para uso) por 8 minutos à temperatura ambiente ( este

tempo é variável em decorrência do tipo e tamanho do tecido) 8- Lavagem em Solução de 2x SSC por 2 minutos cada 9- Desidratação em álcool: 75%, 80% e 100% por 2 minutos cada 10- Secagem das lâminas ao ar 11- Aplicação da sonda: Colocar 10ul da sonda e incubar no Hibridizador para Denaturação e

Hibridização (tempo e temperatura é variável dependendo da indicação do fornecedor da sonda. Seguir a Bula da sonda).

OBS.: Aplicar a sonda sempre ao abrigo da luz

12- Cobrir os cortes com lamínula e aplicar selante (Cola Fixogum) em volta e colocar as lâminas no

Termobrite e deixar 20 horas à 37°C (lembrando para verificar na Bula da Sonda) 13- No outro dia “tudo no escuro”: Pré aquecer a solução de 1,5M Ureia/0,1x SSC em banho-maria à

45°C

14- Mergulhar as lâminas em solução de Ureia/0,1x SSC – 45°C por 30 minutos 15- Lavar em solução 2x SSC por 2 minutos à temperatura ambiente 16- Desidratação em álcool 75%, 80% e 100% por 2 minutos cada 17- Secagem das lâminas ao ar e no escuro.

18- Aplicar 15 ul de DAPI I ou 25 ul de DAPI II, colocar a lamínula e analisar a lâmina.

manual de biologia molecular

Documents