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Universidade de São Paulo Instituto de Química

Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno

2009

Professora: Nadja Cristhina de Souza Pinto Monitores: Carolina Domeniche Romagna Débora da Silva Freitas

QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008

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QBQ-3401 Biologia Molecular

Química-Noturno - 2009 DOCENTE RESPONSÁVEL: Prof. Nadja Cristhina de Souza Pinto (sala 1065 − Bloco 10 superior) MONITORES: Carolina D. Romagna (sala 1065 – Bloco 10 superior) Débora da Silva Freitas (sala – Bloco HORÁRIO E SALAS: Aulas Expositivas e Exercícios (Discussão): 6as feiras das 19 às 22:40h - Sala 10 - Bloco 6 inferior Aulas Práticas: 6as feiras das 19 às 22:40h - Laboratório Didático - Bloco 7 superior ORGANIZAÇÃO DO CURSO: O Curso envolve aulas expositivas, períodos para resolução e discussão de exercícios e aulas práticas. Utilizando as informações das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos deverão resolver os exercícios e entregar as resoluções à professora. Os exercícios serão discutidos em sala de aula com acompanhamento da professora e das monitoras. Nas aulas práticas serão realizadas experiências que envolvem algumas técnicas básicas utilizadas em Biologia Molecular. Os alunos serão divididos em grupos e cada grupo deverá apresentar um RELATÓRIO contendo os resultados obtidos e a resolução das questões correspondentes. Só serão aceitos relatórios de alunos que realizaram as aulas práticas. POR RAZÕES DE SEGURANÇA, O USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO. AVALIAÇÃO: A avaliação será feita através da média ponderada das notas obtidas nas duas provas (P1, P2), nos quatro relatórios (R) e nos exercícios (E), de acordo com a fórmula abaixo:

Nota final= (P1 x 2) + (P2 x 2) + (média dos 4 relatórios)+ (média dos exercícios) 6

A matéria das provas será CUMULATIVA. No final do curso, será oferecida uma prova substitutiva para alunos que tenham sido impossibilitados de fazer uma das provas por motivo de doença, que incluirá toda a matéria do curso. Um atestado médico deverá ser entregue neste caso. O peso da prova substitutiva será igual ao da prova perdida. Os alunos que não atingirem Nota Final ≥ 5,0, porém atingirem ≥ 3,0 e 75% de frequência poderão realizar a prova de recuperação, que será administrada em fevereiro 2010.

A FREQUÊNCIA OBRIGATÓRIA MINÍMA ÀS AULAS É DE 75%.


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CRONOGRAMA QBQ-3401

21/8 Aula1 - Introdução à Biologia Molecular. Estrutura e Função dos Ácidos Nucléicos. Exercício 1

28/8 Aula 2 - Replicação do DNA. Exercício 2

04/9 Experiência 1: Extração de DNA de E. coli

11/9 Aula 3 - Mutação e Reparo de DNA. Exercício 3

18/09 Aula 4 - Estrutura gênica e Transcrição. Exercício 4

25/09 Experiência 2: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção

de genes 02/10 Aula 5 - Código Genético. Exercício 5

09/10 Prova 1

16/10 Aula 6 - Processamento do RNA e Tradução/Síntese de Proteínas. Exercício 6

23/10 Aula 7 - Regulação da Expressão Gênica. Exercício 7

30/10 Experiência 3: Transformação de bactérias com plasmídeos

06/11 Aula 8 - Transdução de Sinal e Câncer. Exercício 8

13/11 Aula 9 - Tecnologia do DNA recombinante. Exercício 9

20/11 CONSCIÊNCIA NEGRA– Não haverá aula

27/11 Experiência 4: Indução de Beta-galactosidase com IPTG

04/12 Prova 2

11/12 Prova substitutiva BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA:

Inglês:

• Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons – 3rd edition. 2004. • Biochemistry – J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer. W.H.Freeman – 6th edition - 2006. • Genes IX – Lewis, B. Jones & Bartlett Publishers; 9th edition. 2007 • Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox. Worth Publishers 4th edition – 2004. • Molecular Biology of the Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. 5th Edition - 2003 Português: • Bases Moleculares da Biotecnologia. A.H.Ulrich, W. Coli; P.L.Ho;M. Faria;C.A. Trujillo. Editora Roca.1° Edição. 2008 • Biologia Molecular Básica – A. Zaha. Editora Mercado Aberto. - 3a edição. 2003 • Biologia Molecular do Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. Editora Artmed. 5a edição. 2006 • Bioquímica - L. Stryer - Editora Guanabara Koogan - 5a edição. - 2004. • Fundamentos de Bioquímica – D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt – Editora Artmed. 3a edição. 2006. • Princípios de Bioquímica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox. Editora Sarvier -4a edição. 2007.


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Exercícios


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Exercício 1. Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos 1.Quais as diferenças de composição e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre uracila e timina, e entre ribose e desoxirribose? 2. RNA é facilmente hidrolizado por álcali, enquanto DNA não o é. Por que? 3.Escreva a seqüência de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a seqüência:

(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') Exprima, em porcentagem, a composição de bases do DNA de fita dupla. 4. Uma molécula de ácido nucleico tem a composição de bases abaixo. O que você pode afirmar sobre esta molécula?

C = 24,1% G = 18,5% T = 24,6% A = 32,8% 5. Explique por que ácidos nucleicos são desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs extremos? Uma molécula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como? 6. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a fórmula:

Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina

a) DNA de E. coli contém 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactéria. b) As curvas de fusão da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm é normalmente maior do que 65oC. Por que isto é importante para a maioria dos organismos? c) Como varia o Tm com a força iônica da solução? d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol à solução de DNA? 7. Quais das seguintes afirmações sobre o DNA isolado de um cromossomo eucariótico são corretas? - É resistente à quebra durante a extração por seu grande tamanho. - É linear e não ramificado - É uma molécula única - Pode ter tamanho superior a 100 Mb 8. O núcleo de uma célula humana tem 6µm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1,8m. Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas?


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Exercício 2. Replicação do DNA 1. Combine as características da coluna da direita com o tipo de hélice do DNA da coluna da esquerda (a) A-DNA (1) As pirimidinas estão na configuração anti (b) B DNA (2) Os fosfatos na cadeia estão em ziguezague (c) Z-DNA (3) A sua formação é favorecida por superenovelamento negativo (4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo (5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrógiro (6) Tem 10,4 pares de bases por volta (7) Tem a estrutura similar àquela do RNA de fita dupla (8) As fitas na hélice são anti-paralelas

2. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicação do DNA fosse conservativa? 3. Combine as propriedades ou funções na coluna à direita com a DNA polimerase na coluna da esquerda: (a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicação (b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde (c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA (4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicação (5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicação 4. O fragmento de DNA no esquema abaixo é de fita dupla em ambas as extremidades, porém de fita simples no meio. As extremidades da fita superior estão indicadas. 5'____________________________3' __________P HO_________ a) O fosfato (P) indicado na fita inferior está na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence ? (Indique no esquema). b) Como você esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ? c) Quantos fragmentos você esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in

vitro", na presença de todos os desoxirribonucleotídeos-trifosfato e DNA polimerase, mas na ausência de DNA ligase? 5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5' → 3' praticamente normal. 6. Qual a atividade da DNA polimerase III que é responsável pela editoração durante a replicação? Por que essa atividade é importante? 7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas não podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a célula supera o problema? Esquematize a formação da ligação fosfodiester durante a replicação a partir do nucleotídeo trifosfato livre, mostrando o grupo fosfato que é incorporado.


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8. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) é utilizada para obter grandes quantidades de DNA a partir de amostras contendo quantidades ínfimas de DNA. a) Descreva os passos envolvidos nesta técnica. b) Quais as características da DNA polimerase utilizada? Porque essas características são fundamentais ao desenvolvimento dessa técnica? c) Exemplifique aplicações desta técnica.


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Exercício 3. Mutação e Reparo do DNA 1. Quais os principais tipos de reparo de excisão e qual a especificidade de lesões de cada via? 2. Descreva brevemente as etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas. 3. Como os dímeros de timina podem ser diretamente removidos do DNA? 4. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotídeo não complementar incorporado durante a replicação? 5. Bromouracila é um mutagênico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adições ou deleções de uma base no DNA. Mutações causadas por acridina frequentemente podem ser compensadas por mutações secundárias, distantes vários nucleotídeos da primeira mutação, enquanto aquelas causadas por bromouracila geralmente requerem mudanças dentro do mesmo codon. Explique. 6. Explique como algumas cepas da bactéria Salmonella são usadas para detectar substâncias carcinogênicas. Por que extrato de fígado de mamífero está envolvido no teste? 7. Que propriedade da DNA polimerase I é responsável pela observação de que bactérias mutantes polA1 são mais sensíveis à luz ultravioleta ? Explique. 8. Por que a taxa de mutacao observada em E.coli é de 10-8 a 10-10 / par de bases replicado, apesar das taxas de erro da Pol I e Pol III serem de 10-6 a 10-7 /par de bases replicado?


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Exercício 4. Estrutura gênica e Transcrição 1. Genes de eucariotos são geralmente constituídos de introns e exons. Estas seqüências são tanto transcritas como traduzidas? A remoção dos íntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente preciso. Por que? Dê um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em humanos. 2. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotídeo para o crescimento da cadeia polinucleotídica. É necessário um iniciador para a ação da RNA polimerase? 3. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana são necessárias para a iniciação da transcrição a partir de um promotor? E para a terminação da transcrição? Explique como uma mutação poderia dar origem a uma E. coli resistente ao antibiótico rifamicina. 4. A seguinte fita simples de DNA vai se transcrita in vitro: 5'- ATGTACCGAAGTGGTTT - 3' Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que serão radiativos quando a transcrição for feita na presença de [γ

32P]-ATP

(a?) b) Faça o mesmo para [α

32P]-UTP

5. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados através da técnica de "footprinting". 6. Combine as descrições na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucariótica apropriada: a) RNA pol I (1) localizada no nucléolo (2) localizada no nucleoplasma (3) sintetiza hnRNA b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA (5) sintetiza rRNA

(6) sintetiza precursores do rRNA c) RNA pol III (7) inibida por α-amanitina (8) sintetiza RNA na direção 5'-3' (9) composta de várias subunidades 7. Você usaria num paciente, como agente terapêutico anti-bacteriano, qual destes antibióticos: a) rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha. 8. Quais as principais características das seqüências de promotores de genes eucarióticos transcritos em mRNAs? Qual a função dos fatores de transcrição e “enhancers”?


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Exercício 5: O Código Genético 1. No desenho abaixo, da esquerda para a direita, indique as pontas 5' e 3' em cada uma das fitas. Selecione uma das opções abaixo e explique o porquê de suas escolhas: fita codificadora de DNA ___________________________________________________ fita complementar ou fita molde de DNA ___________________________________________________ fita de mRNA ___________________________________________________ fita de tRNA (anticódon para Metionina) 2. Faça um x no ácido nucleico (pode ser mais de um) que corresponde aos conceitos abaixo: código genético ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA anti-códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA moldura de leitura ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 3. Baseando-se na lista de códons e amino ácidos abaixo, quais das seguintes afirmações são corretas? AGU = serina AGC = serina AAG = lisina AAA = lisina AUG = metionina AUA = isoleucina a) O código genético é degenerado b) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons poderia levar à substituição de uma isoleucina por uma lisina no polipeptídeo. c) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons necessariamente levaria à substituição de um aminoácido no polipeptídeo codificado. 4. Um tRNA com o anticódon ACU se ligaria a um ribossomo na presença de um dos códons da questão 3. Qual? Olhando a tabela ao final deste exercício faça a previsão do anti-códon para terminação da tradução e a seqüência das bases correspondentes no DNA codificador . 5. Uma globina de 146 aminoácidos sofreu uma mutação no códon correspondente ao sexto aminoácido da cadeia (ver tabela ao final do exercício). A análise do DNA indicou uma mudança de TTC para TAC na fita molde. Pergunta- se:


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a) A mutação provocou a troca de um aminoácido por outro? Em caso afirmativo, quais são estes aminoácidos? b) Quais as implicações para a estrutura da proteína? 6. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequência 5'...AGGTTACCTAGTTGC...3' Qual é a sequência do polipeptídeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questão 3 (não intendi!). Assuma que o quadro de leitura começa com o primeiro nucleotídeo. 7. Abaixo está anotado o gene completo da insulina como se encontra no Banco de dados NCBI. Para facilitar a leitura e a contagem, há um número que denota a primeira base da fila e as bases estão separadas por um espaço colocado a cada 10 bases. O códon de iniciação e o códon de terminação estão sublinhados e em negrito. Qual o número de aminoácidos na proteína resultante da transcrição desta seqüência? Explique porque. 1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgc 61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttg 121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac 181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg 241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc 301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg 361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccg 421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagc 8. O gene de uma proteína, cuja seqüência parcial está indicada abaixo, sofreu uma série de mutações pontuais independentes, o que levará à produção de diferentes RNAs mensageiros, Indique a seqüência de aminoácidos do peptídeo correspondente (a tabela se encontra no fim dos exercícios) e explique a conseqüência do tipo de mutação que ocorreu em cada um dos RNAs resultantes. 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUGGCUUGUAACU....3' (a) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGGGGCUUGUAACU....3' (b) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCAUGGCUUGUAACU.....3' (c) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUCGCUGUAUACU......3' (d) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUUGGCUUGUAACU....3'


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Exercícios 6. Síntese de proteínas 1. Considere a seguinte sequência de um fragmento de DNA isolado de bactéria: 5'CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3' a) Assumindo que esta seqüência corresponde à seqüência da fita codificadora, qual seria a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que características na seqüência do mRNA determinam qual é o códon iniciador? Considere a primeira base como o início da transcrição. b) De acordo com o princípio de oscilação no pareamento de bases ("wobble"), qual o número mínimo de tRNAs necessário para decodificar os seis códons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e CUG ? Explique. 2. Num sistema de síntese de proteínas in vitro, que permita o início e término da síntese em qualquer seqüência de RNA, que peptídeo seria produzido pelo poli-ribonucleotídeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3'? Indique qual o aminoácido N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo obtido. 3. O códon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptídica quanto para dirigir a incorporação de uma metionina em posições internas de uma proteína. Quais os mecanismos de seleção do códon AUG para a iniciação da tradução em procariotos? 4. No que consiste a sequência de Shine Dalgarno? Ela é universal? Explique. 5. Escreva os produtos finais das seguintes reações: a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase 6. Explique quais são os mecanismos de ação dos antibióticos que agem na célula procariótica. Se muitos antibióticos exercem sua ação por inibição da síntese protéica, como alguns destes antibióticos podem ser usados em humanos para combater infecções microbianas sem causar efeitos tóxicos devido à inibição da síntese protéica eucariótica? 7. O que se entende por chaperona? 8. Quais eventos podem acontecer com uma proteína depois de terminada sua síntese?


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Exercício 7. Regulação da Expressão Gênica 1. Compare a expressão gênica em procariotos e eucariotos quanto a: a) grau de acoplamento da transcrição e da tradução. b) número de produtos gênicos em um transcrito primário. c) número de proteínas resultantes da tradução de um transcrito primário. d) proporção de seqüências codificadoras no DNA. e) organização de genes em operons. 2. Defina expressão gênica constitutiva. Compare expressão gênica induzida com repressão gênica. Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon, gene estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-repressor. 3. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos açúcares é metabolizado preferencialmente? Qual é o mecanismo que permite esta seletividade? O que acontece quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactéria? 4. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo além dos sais necessários, os componentes: a) lactose d) glicose + cAMP b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP c) glicose Analise a produção de β- galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o modelo de Jacob e Monod. 5. Qual o efeito da deleção do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutação resultando no mesmo efeito? 6. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, além de diversas outras fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de mutação pode ter produzido estes resultados? 7. Demonstrou-se que o operon para a biossíntese do aminoácido fenilalanina de certa bactéria é regulado por um mecanismo de atenuação. O que pode ser afirmado sobre a seqüência de aminoácidos do peptídeo líder para este operon? Explique. 8. A cromatina que é ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto a cromatina que é inativa (heterocromatina) é compacta. Quando núcleos de células de galinha produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancreática, os genes de globina de adultos foram seletivamente destruídos, mas os genes para globina embriônica e ovalbumina permaneceram intactos. Quando os núcleos de células de oviduto foram tratadas com DNase, os genes de ovalbumina foram destruídos. Explique estes resultados.


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Exercício 8. Transdução de Sinal e Câncer 1. Descreva o mecanismo de ativação: a. das Proteínas G pelos receptores serpentina b. da Proteína Quinase A por cAMP 2. O que são protooncogenes e oncogenes? Que tipos de proteínas estes genes podem codificar? 3. A proteína c-src é homóloga à proteína viral oncogênica conhecida com v-src e atua como tirosina quinase citossólica, cuja atividade é regulada por fosforilação. Qual a característica de v-src que a torna uma proteína oncogênica. 4. Qual o tipo de modificação covalente reversível em proteínas mais frequente nas cascatas de sinalização intracelular? Quais são as enzimas que catalisam esta modificação? 5. O cAMP (AMP cíclico) é um importante mensageiro secundário para muitos hormônios. Como pode ocorrer a ativação da enzima adenilato ciclase após ativação de um receptor hormonal? 6. Como a transcrição de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular? 7 A predisposição ao câncer pode ser hereditária. Explique este fato lembrando-se que existem proteínas que agem como supressores do crescimento celular. 8. Retinoblastoma, um câncer de retina que aflige crianças, está asssociado a uma deleção no cromossomo 13. Proponha uma possível função para o gene selvagem (Rb) e que codifica uma proteína de 105 kD localizada no núcleo e capaz de se ligar ao DNA.


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Exercício 9. Tecnologia do DNA recombinante 1. A figura na página seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo método de Sanger. Escreva a seqüência deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima. Traduza a seqüência obtida, considerando as três fases de leitura. O que aconteceria se durante a leitura do gel você tivesse omitido uma base? Como você faria para ter segurança absoluta da seqüência deste fragmento de DNA? 2. O que a diferencia a técnica de Southern blot da técnica de Northern blot? 3. Você gostaria de analisar os níveis de expressão do gene que codifica a proteína A de um fungo em resposta ao estresse hipertérmico. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado, se você quiser analisar simultaneamente os níveis de expressão de milhares de genes deste fungo na mesma condição, qual seria a metodologia mais adequada? 4. Qual a diferença entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a presença de íntrons em genes eucarióticos complica a geração de produtos protéicos que eles codificam quando a expressão é feita em bactéria. Como se pode resolver este problema? 5. A partir de uma biblioteca de cDNA você isolou um cDNA completo que codifica para uma proteína que é um potente estimulador do sistema imunológico. Agora você deseja clonar este cDNA em um vetor de expressão para produzir grande quantidade desta proteína em E. coli. O cDNA possui nas suas extremidades sítios para enzima BamHI e você planeja cloná-lo no sítio de BamHI do vetor de expressão. Esta é sua primeira vez com experimentos de clonagem e você decide seguir cuidadosamente as instruções do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5’. a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina? b) Como você analisaria se a clonagem foi bem sucedida? c) A proteína de seu interesse afeta o crescimento das bactérias. Como você faria para obter grande quantidade desta proteína recombinante?


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G A T C


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6. O gene completo (contendo todos os exons e íntrons) do hormônio de crescimento de ratos pode ser expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutível por Cd2+. Como podem ser obtidos tais camundongos transgênicos? Quais as suas características? Como você explica o fato da expressão do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos? 7. Planeje a obtenção de cabras transgênicas que possam produzir o hormônio de crescimento humano em seu leite. 8. Há poucos anos, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a partir de células de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experiência com a obtenção de um animal transgênico.


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ROTEIRO PARA AS AULAS PRÁTICAS


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ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS

RECOMENDAÇÕES: 1. Por razões de segurança não será permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. É PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATÓRIO. 2. Leia com detalhe o protocolo e preste atenção às instruções fornecidas antes de iniciar a experiência. 3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponíveis com cuidado, para evitar desperdício e quebra. 4. Mantenha sua área de trabalho organizada. Ao terminar a experiência passe água na vidraria utilizada e coloque-a no local indicado. 5. O relatório individual deverá ser entregue no final de cada uma das aulas práticas. O relatório deverá ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Após preenchidas, as respectivas folhas devem ser destacadas e entregues. 6. Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio às técnicas, às monitoras ou à professora.

USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO.


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EXPERIÊNCIA No.1: EXTRAÇÃO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli. Fundamento Freqüentemente é necessária a purificação de DNA de alto peso molecular para sua manipulação e análise subsequentes. Procedimentos mais comuns para preparação de DNA genômico bacteriano consistem na lise das bactérias com a utilização de lisozima e/ou detergente, seguida de extrações com solventes orgânicos (fenol/clorofórmio) para remoção de proteínas. Os ácidos nucléicos são então precipitados com etanol na presença de concentrações relativamente altas de sal (0,1M – 0,5M). Na obtenção de DNA de alto peso molecular (molécula longa e fibrosa) devem ser tomados cuidados para se evitar sua fragmentação. Material - 2 Tubos de ensaio médio

- 1 Proveta de 50 mL

- 1 cálice graduado

- 1 bastão de vidro

- 1 tubo de centrifuga

- 1 recipiente de descarte c/ lisoforme

- 10 mL de SDS 10%

- 10 mL de NaCl 1%

- 1 frasco de Clorofórmio c/ Álcool Isoamílico na Capela

- 1 frasco de Etanol no freezer -20 °C

Procedimento Experimental Será utilizada uma cultura de bactérias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37°C até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para a geladeira. 1. Coletar as bactérias pela centrifugação de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel absorvente. Balancear os tubos! 2. Adicionar 6mL da solução I (citrato de sódio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactérias por inversão. 3. Remover a tampa e adicionar 0,7mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (m/V)]. Fechar o tubo e incubá-lo em banho-maria a 60°C por 10 min, com agitação manual suave. 4. Retirar o tubo do banho, abrir e deixá-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume (6,7mL) da solução III (Clorofórmio:alcool isoamílico 24:1 V/V). Não pipetar com a boca! Fechar muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min à temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada na capela de exaustão.


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5. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm. 6. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma proveta. Estimar o volume e transferir para um cálice graduado. 7. Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20°C e adicioná-lo lentamente com pipeta Pasteur, pela parede do cálice. 8. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transferí-lo para um tubo de ensaio contendo 10mL de Solução IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20 minutos, até completa dissolução. 9. Identificar o tubo com o número do grupo. Tomar uma alíquota e diluir em 1 mL de água. Medir a D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relação D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida assumindo que D.O.260nm (Densidade Óptica a 260nm) = 1 equivale a 50µg DNA/mL.


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RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.1

Grupo No. Data Nomes dos Integrantes do Grupo:

OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:_________________________________________

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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________

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QUESTÕES: 1. Qual a função do SDS, Clorofórmio: Álcool Isoamílico e Etanol nas etapas da purificação? Consultar tabela (no fim da apostila). 2. Por que é possível "enrolar" o DNA no bastão de vidro? 3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experiência realizada. 4. Se compararmos as medidas de absorção a 260nm e a 280nm da amostra de DNA obtida e de uma solução de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactérias, o que observaríamos? Por que?


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5. Qual o espectro de absorção do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro de absorção de albumina? 6. Como você faria para obter DNA puro a partir dessa preparação que contém DNA e RNA? 7. Por que ocorre o efeito hipercrômico na desnaturação do DNA?


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EXPERIÊNCIA No. 2: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM PLASMÍDEOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. Fundamento A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. Este plasmídeo pode conferir à bactéria hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no meio. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. Na aula prática usaremos o método do CaCl2. Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA plasmidial. Usaremos o plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo). O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de genes. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. coli) o pBR322 apresenta duas marcas genéticas, ou seja, genes que codificam para proteínas que conferem resistência a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. coli que normalmente é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos. Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da resistência à ampicilina, uma vez que este sítio está localizado na região ampr. Da mesma forma, clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina. Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico, em resistentes, será revelada através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de ágar contendo meio LB (meio rico de Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina).

Procedimento Experimental


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O ideal seria fazermos a experiência em condições estéreis, para evitar contaminação. Como isto não será possível, manipule convenientemente o material estéril fornecido. NÃO ABRA AS PLACAS DE ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO. As bactérias competentes para transformação foram preparadas a partir de uma cultura em fase exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de bactérias com uma solução de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC. 1. Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E. coli) e incubar à 37°C até o dia seguinte sob forte agitação (200-250 rpm). 2. Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar à 37°C sob agitação até OD600nm =0,3 (fase logarítmica de crescimento). 3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm, 5min). Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20 mM pH 6,5 contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos. 4. Coletar as bactérias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão (frio). 5. Após pelo menos 30 min no gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser transformadas. 6. Para transformar, distribuir 0,1 mL/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada um de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 µg DNA de pBR322 em 10 µl de tampão 10 mM Tris pH 7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo será usado como controle (bactéria apenas). 7. Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90 segundos). Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min. 8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação, em banho-maria, por uma hora. 9. Transferir 25µl ou 250µl da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactérias com o auxílio de uma alça de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na própria tampa da placa de Petri. 10. Incubar as placas por __ h e contar as colônias formadas. Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A

#1 Bactérias controle 25µL #2 Bactérias controle 250µL #3 Bactérias transformadas 25µL #4 Bactérias transformadas 250µL


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Nome: Grupo No. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________

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RESULTADOS OBTIDOS: 1. Preencher a tabela com o número de colônias obtido em cada caso.

Número de colônias/ placa

Placa LB Placa LB-A

#1 Bactérias controle 25µL #2 Bactérias controle 250µL #3 Bactérias transformadas 25µL #4 Bactérias transformadas 250µL

2. Qual a eficiência de transformação obtida, em termos de n° de colônias/ug de DNA?

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Nome: QUESTÕES:

1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactérias competentes? 2. Qual o papel do choque térmico? 3. Por que as bactérias devem ser incubadas por 60 min a 37°C antes de espalhá-las em placas de ágar?

4. Que utilidade teria esta técnica do ponto de vista biotecnológico? Dê um exemplo.


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EXPERIÊNCIA No.3: INDUÇÃO DA ββββ-GALAGTOSIDASE POR IPTG. Fundamento A β-galactosidase de E.coli é uma enzima indutível que hidrolisa β-D-galactosídeos. A atividade desta enzima pode ser medida com substratos cromogênicos que quando hidrolisados dão origem a produtos coloridos. Um exemplo é o orto-nitrofenil-β-D-galactosídeo (ONPG) que é incolor, mas na presença de β-galactosidase é convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-nitrofenol é amarelo e sua absorção pode ser medida a 420nm. Altos níveis de β-galactosidase só são medidos em culturas crescendo na presença de lactose ou de um indutor não metabolizável, o IPTG (isopropil-tiogalactosídeo).

Procedimento Experimental Será utilizada uma pré-cultura de bactérias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esteril e mantida até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para geladeira. 1. Tomar uma alíquota da pré-cultura de bactérias e diluir em meio líquido na presença e ausência de IPTG (1mM) sob agitação vigorosa a 37°C até a cultura atingir D.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm) = 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min. 2. Retirar 0µL, 50µL e 100µL de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf previamente identificados. Complete com água para um volume final de 100µL. Adicione 0,7mL de tampão de ensaio (tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 contendo KCl 10mM, MgSO4 1mM e β-mercaptoetanol 50mM).

Não descarte o restante das culturas, mantendo-as no gelo. 3. Adicionar 50 µL de cloroformio. Agitar bem. Incubar os tubos em banho de água a 30oC por 5 min.

-IPTG +IPTG

Cultura - 50µµµµl 100µµµµl 50µµµµl 100µµµµl

H2O 100µµµµl 50µµµµl - 50µµµµl -

T.E. 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl

Clorofórmio 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl


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4. Iniciar a reação pela adição de 200 µL de ONPG (4mg/mL) e incubar a mistura de reação em banho de água a 30oC por 10 min. 5. Interromper a reação adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M. 6. Centrifuguar os tubos por 5 minutos na minicentrífuga. 7. Remover delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofórmio, e faça a leitura da D.O.420nm (Densidade Óptica a 420nm). Enxaguar as cubetas com água entre a cada leitura. 8. Fazer uma diluição 1:10 das culturas de E.coli e faça a leitura da D.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm). 9. Calcular a atividade de β-galactosidase das duas culturas:

Atividade de β-galactosidase = culturadaODmLvolumetempo

OD

nm

nm

600

420

..)((min)

..1000

××

× UNIDADES



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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. O que você pode concluir sobre o genótipo da cepa CSH23?

2. O que você esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo genótipo é

I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas.


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EXPERIÊNCIA No. 4: DIGESTÃO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE Fundamento Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digestão com enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA. A escolha das enzimas de restrição deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterização do DNA em questão, ou seja, obter seu mapa físico. As enzimas de restrição classificam-se em 3 gupos quanto a força iônica para a atividade (alta, média e baixa). As enzimas de restrição comercialmente disponíveis costumam vir acompanhadas do tampão correspondente e instruções para realizar a reação. Procedimento experimental A - Digestão do DNA com enzimas de restrição

Na experiência a ser realizada o DNA do plasmídeo será digerido com 4 enzimas de restrição diferentes.

Cada grupo (ver tabela abaixo) receberá um tubo Eppendorf contendo os componentes da reação com exceção do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo. - Cada aluno deverá providenciar uma folha de papel monolog para construção do gráfico (Questão 3). 1. Acrescentar 10µL da solução de plasmídeo (DBQ1, 150ng/10µL) no tubo.

GRUPOS 1,7,13,19 2,8,14,20 3,9,15,21 4,10,16,22 5,11,17,23 6,12,18,24

EcoRI BglII EcoRI e

BglII EcoRI e

XbaI BglII e

XbaI sem enzima

H2O 7 µL 7 µL 6 µL 6 µL 6 µL 10µL Tampão da enzima (10X)

2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL -

Enzima (1 U) 1µL 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL -

Plasmídeo 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL

Volume total 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 2. Misturar o conteúdo dos tubos por agitação e centrifugação rápida. 3. Incubar a reação em banho maria a 37°C durante 60min. 4. Interromper a reação pela adição de 1µL EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um banho a 65°C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente colocá-lo em gelo. 5. Adicionar a cada um dos tubos 5µL de tampão da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra está pronta para ser analisada em eletroforese em gel de agarose.


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Tampão de digestão 10X Tampão da amostra Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8, NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8, MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v *(depende da enzima) sacarose 40% p/v

B. Fracionamento do DNA em gel de agarose.

Preparo do gel de agarose 1,0% OBS: Serão montados dois géis com espaço para aplicação de até 14 amostras 1. Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH 8). 2. Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose. Enquanto espera-se a dissolução da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar até 40°C (até conseguir segurar com as mãos) e acrescentar 5µL de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE ETÍDIO É CARCINOGÊNICO! Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente. Deixar solidificar por pelo menos 30min. 3. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possível. 4. Aplicar as amostras preparadas na experiência anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar aproximadamente 100V. Cuidado para não tocar o tampão. 5. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel. 6. Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando óculos protetores. Fotografar o padrão de bandas observado com uma régua posicionada na lateral do gel. OBS: Ordem de aplicação das amostras nos géis GEL 1: 1 - 2 - 3 - 4 -5 – 6 - Padrão de tamanho - 7 - 8 - 9 – 10 – 11- 12 GEL 2: 13 - 14 -15 – 16 – 17 – 18 - Padrão de tamanho - 19 – 20 – 21 – 22 – 23 –24


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RESULTADOS OBTIDOS: :____________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. Por que se observam duas bandas no plasmídeo que não foi incubado com a enzima? 2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etídio) no gel e no tampão da eletroforese? 3. Géis de agarose podem ser usados para análise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 e 800.000 pares de base. Assim, é possível estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relação à de outros de tamanho conhecido. Se o gel foi fotografado com uma régua ao lado, a mobilidade relativa pode ser lida diretamente da foto. O gráfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dará uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relação a uma determinada mobilidade. Entretanto, a interpolação é muito mais precisa se a função puder ser encontrada em uma linha reta: gráfico de log L versus M. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em pb). Usando-se a mistura de padrões de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digestão do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faça um desenho do pQBQ indicando a posição dos sítios de clivagem para estas enzimas.


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PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

DNA RNA Força iônica baixa ("Salting in") alta ("salting out)

Solubiliza Precipita

Solubiliza Precipita

Meio ácido 0,5N (brando) à frio

Precipita Despurina

Precipita Despurina

Meio alcalino brando

(0,3N KOH; 37°C; 18h)

ss: estável ds: desnatura

Hidrolisa 2' e 3'nucleosídeos

Solvente orgânico (cte dieletr. < que da H2O) ex.: etanol, isopropanol

Precipita

Precipita

Agentes desnaturantes que quebram pontes de H ex.: formamida, uréia

ss: estável ds: desnatura

1ária: estável

2ária: destruída

Luz UV (260 nm)

ss: absorve mais ds: absorve menos

Absorve

Calor

ss: estável ds: desnatura (Tm)

1ária: estável

2ária: destruída Nucleases

Exonucleases + +

Endonucleases + +


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INIBIDORES DE TRANSCRIÇÃO OU DE TRADUÇÃO

ANTIBIÓTICOS Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sintética) Inibe iniciação da transcrição (impede a formação da la. ligação fosfódieser) mas não inibe elongação da cadeia de mRNA. Liga-se à subunidade β de RNAP. Actinomicina D: Estrutura: 2 peptídeos + 3 anéis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). Extraída de Streptomyces. Inibe transcrição. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. Anéis fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de câncer. α-Amanitina (octapeptídeo cíclico) de um cogumelo (Amanita) Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentração). Liga-se a RNAPII bloqueando a formação de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe elongação. Puromicina: Inibe tradução. Análogo de aminoacil-tRNA. Liga-se ao sítio A do ribossomo, impedindo a entrada de aminoacil-tRNAS. Foma ligação peptídica com a cadeia polipeptídica nascente (peptidil transferase). Peptidil-puromicina: peptídeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao C-terminal. Tetraciclina: Liga-se ao sítio A do ribossomo, impede ligação de aminoacil-tRNA neste sítio. Cloranfenicol: Só inibe a síntese de proteínas de procariotos e mitocôndira (não inibe a síntese protéica extramitocondrial de eucariotos). Cicloheximida: Inibe a formação dos ribossomos de eucariotos (80S), mas não de procariotos (70S). Estreptomicina: Causa leitura incorreta do código genético. TOXINAS Diftérica: Inibe síntese protéica. Alvo é EF2 que cataliza a translocação do peptídeo. O fragmento A da toxina cataliza a transferência de ADP para EF2 (ADP-ribosilação) inativando este fator de elongação da cadeia polipeptídica. Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos.


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CÓDIGO GENÉTICO UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

AUG é parte do sinal de iniciação e também é o códon para as metioninas internas à

cadeia.

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