TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

RÉKA M. CANE

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS: REACÇAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Repetiçao de 3 processos/ etapas:

1º Desnaturalizaçao térmica do DNA.

2º Hibridaçao dos cebadores especificos (oligonucleótidos)

com o DNA de cadeia simples.

3º Extensao enzimática do DNA.

PASSO 1: DESNATURALIZAÇAO

PASSO 2: HIBRIDAÇAO

PASSO 3: EXTENSAO

MATERIAIS NECESSARIOS PARA A PCR

Oligonucleótidos

Tampao de reacçao

Termociclador com sistema de detecçao

É necessario separar as zonas de preparacao das amostras, dos reactivos,amplificaçao e detecçao.

Devem-se fazer os controis positivo e negativo em cada ronda das reacçoes.

LEITURA E INTERPRETAÇAO DA PCR CONVENCIONAL

Separaçao electroforética dos fragmentos amplificados – Gel de Agarosa

1ºTinçao com bromuro de etidio

2ºTransiluminaçao com luz ultravioleta

3º

PCR EM TEMPO REAL

Termociclador associado a um fluorímetro.

A medida que os amplicones vao sendo produzidos, emitemfluorescencia.

Permite quantificar, detectar mutaçoes (por discriminaçaoalélica) e caracterizar os productos da PCR.

Métodos de deteçao:

Sondas Fret Hibridaçao de sondas especificas marcadascom 2 fluorocromos (Annealing).

Sondas Taqman Sondas específicas com um fluorocromoem cada extremo (Elongaçao).

CEPA SELVAGEM

HETEROZIGOTO

VANTAGEMS DA PCR EM TEMPO REAL

Diminui o tempo de análisis; Reaçao monitorizada a tempo real;Menor risco de contaminaçao (ausencia da etapa de processamento post-PCR); Ciclos de amplificaçao más rápidos; Alta especificidade e reproduzibilidade.

HOMOZIGOTO

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS NAO BASEADAS NA REACÇAO EM CADEIA DA POLIMERASE

AMPLIFICAÇAO BASEADA NA SEQUENCIA DOS ÁCIDOS NÚCLEICOS (NASBA)

* Coordenaçao de 3 enzimas con 2 cebadores especificos para a sequencia diana.

Ex: NucliSens (HIV,CMV).

AMPLIFICAÇAO MEDIADA POR TRANSCRIPÇAO (TMA)

* Transcriptase inversa, RNA polymerase, 2 cebadores complementarios do ácido núcleicodiana;

* Extensao exponencial do RNA.

Ex: GenProbe (HIV, Mycobacterium, C. trachomatis, N. gonorrhoeae).

AMPLIFICAÇAO POR MOVIMIENTO ESTÁNDAR

* 1º Formaçao do ácido núcleico diana de cadeia simples + 2º Ampificaçao exponencial do ácido núcleico diana.

Ex: BD Probe Tec System ( C. trachomatis, N. gonorrhoeae).

GENPROBER APTIMA COMBO2 assay

Combina a técnica de amplificaçao mediada por transcripçao(TMA) com a tecnologia de ensaio dual cinético (DKA).

Captura selectiva - as sondas de captura hibridam com umcontrol interno e com as moléculas rRNA diana. O materialnao unido e os possiveis inhibidores da reaçao eliminam-semediante lavagem.

Transcriptasa inversa – cria uma copia do DNA (cDNA) doácido núcleico selecionado.

RNA polimerase – inicia a transcripçao, sintetiza RNA. Osnuevos RNA servem de molde para nuevos ciclos deamplificaçao.

Sondas marcadas com éster de acridinio – hibridam com osproductos da amplificaçao.

DKA – permite a deteçao simultanea do control interno y doRNA mediante a produçao de um flash de luz e de umaincandescencia de longa duraçao (quimioluminiscencia).

1º Preparaçao do equipamento.

-Ajuste da temperatura: *62oC; *42oC; 62oC.

-Limpeza de superficie e pipetas (lejía + agua 1:1).

-Preparar o sistema de captura diana: verificar asgarrafas de lavagem e a conexao do aspirador abomba de vazio.

2ºPreparaçao do reagente de constituiçao.

- Seguir instruçoes do fabricante.

- Preparar o reagente de captura diana (TCR) e o reagente de captura diana B (TCR-B):

V(TCR) = (nº reaçoes + 5 reaçoes extra) x0,1mL

V(TCR-B) = V(TCR) mL/100

3º Captura diana.

4º Amplificaçao.

5º DKA.

6ºInterpretaçao dos resultados

- Para todas etapas: seguir instruçoes do

fabricante (varia em funçao do tipo de

amostra).