Hibridação de ácidos nucleicos

Hibridação de ácidos nucleicos

DNA de vírus da Peste suína africana

Tópicos• Origem e características das sondas de hibridação

• Métodos de marcação de DNA

• Sondas de RNA

• Sondas homólogas, heterólogas e degeneradas

• Marcação não isotópica de DNA

• Sistema de detecção de hibridação baseado na afinidade biotina-estreptavidina

• Temperatura de desnaturação/temperatura de hibridação

• Tipos de sondas e condições de hibridação

• Hibridação ASO

Origem e características das sondas de hibridação

Marcação de DNA por nick-translation

α-32P dCTP

Mg++

Digestão parcial

Marcação de DNA por primers aleatórios

α-32P dCTP

Marcação de extremidades 5’ do DNA

A marcação é fornecida na forma de 32P na posição γ-fosfato do ATP( [γ-32P]ATP).

A cinase de polinucleótido catalisa uma reacção de troca com os fosfatos 5’terminais.

Marcação de extremidades 3’ do DNA

Preenchimento de extremidades 3’ recuadas

α-32P dATP

Sondas de RNA (ribossondas)

As sondas de RNA são produzidas por transcrição run-off de insertos clonados em vectores apropriados e terão de ter o sentido inverso ao da transcrição do transcrito em estudo.

Sondas degeneradas

Sondas homólogas; sondas heterólogas

Estrutura de fluoróforos utilizados na marcação directa não isotópica

O grupo de fluoresceína do dUTP-fuoresceína está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina por um grupo espaçador, de modo que quando o nucleótido modificado é incorporado no DNA o grupo fluoresceína fica acessível, facilitando a sua detecção.

Um fluoróforo é um grupo químico que fluoresce quando exposto a luz de um determinado comprimento de onda.

A fluoresceína é um corante fluorescente verde claro.

A rodamina é um corante fluorescente vermelho.

A coumarina amino metil éum corante fluorescente azul.

Princípios gerais da marcação indirecta não isotópica

Estrutura de um nucleótido modificado com digoxigenina

O grupo digoxigenina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do dUTP por um grupo espaçador de 11 átomos de carbono.

No sistema digoxigenina, a molécula de afinidade é um anticorpo anti-digoxigenina.

Os grupos digoxigenina e biotina são grupos repórter: após incorporação no ácido nucleico são ligados por ligandos específicos acoplados a um marcador. Os marcadores podem ser fluoróforos ou enzimas, tais como a fosfatase alcalina e a peroxidase.

A digoxidenina é um esteróide natural obtido a partir de Digitalis.

Estrutura de um nucleótido modificado com biotina

O grupo biotina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do dUTP por um grupo espaçador de 16 átomos de carbono.

No sistema biotina-estreptavidina, a molécula de afinidade é a estreptavidina.

A biotina é uma vitamina natural e a estreptavidina é uma proteína bacteriana.

Sistema de detecção de hibridação baseado na afinidade biotina-estreptavidina

Temperatura de desnaturação (Tm)

As condições de hibridação são escolhidas de modo a promover a formação de heterodúplices, sendo a temperatura de hibridação (65 a 680 C), em geral 250 C abaixo da Tm.

A Tm é uma medida útil da estabilidade de um ácido nucleico de cadeia dupla.

Corresponde ao ponto médio na transição de densidade óptica da forma de cadeia dupla para a forma de cadeia simples.

ODSS e ODDS indicam a densidade óptica de DNA de cadeia simples e de cadeia dupla, respectivamente.

As bases dos ácidos nucleicos absorvem fortemente luz ultravioleta a 260 nm.A absorção pelo DNA de cadeia dupla é consideravelmente menor do que pelos nucleótidos livres.

15-20 nts.> 100 nts.

Tipos de sondas e condições de hibridação

Hibridação ASO

ASO - Oligonucleótido alelo-específico