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Isabel Cristina Ribau Fernandes Coutinho
Mestre em Tecnologias do Medicamento
A peroxidase do citocromo c de Marinobacter
hydrocarbonoclasticus 617: aplicao de tcnicas
espectroscpicas e electroqumicas ao estudo do
mecanismo de activao e catlise.
Dissertao para obteno do Grau de Doutor em Qumica Sustentvel
Orientador: Doutora Sofia Rocha Pauleta, Cientista Convidada do
Laboratrio Associado REQUIMTE
Doutora Patricia Mira Paes de Sousa Videira, Gestora de
Cincia e Tecnologia da FCT
Co-orientador: Doutor Jos Joo Galhardas de Moura, Professor
Catedrtico Aposentado da FCT-UNL
Jri:
Presidente: Prof. Doutor Antnio Rendas
Arguente(s): Prof. Doutora Isabel Maria Andrade Martins Galhardas de Moura
Vogais: Prof. Doutora Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romo
Prof. Doutor Francisco Jorge Fernandes Caldeira
Prof. Doutor Stephane Pierre Besson
Prof. Doutor Francisco Manuel Ferreira Grio
Maro 2013
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2013
Isabel Cristina Ribau Fernandes Coutinho
Mestre em Tecnologias do Medicamento
A peroxidase do citocromo c de Marinobacter
hydrocarbonoclasticus 617: aplicao de tcnicas
espectroscpicas e electroqumicas ao estudo do
mecanismo de activao e catlise.
Dissertao para obteno do Grau de Doutor em
Qumica Sustentvel
Orientador: Sofia Pauleta, Cientista Convidade do
Laboratrio Associadao REQUIMTE, FCT-UNL e Patricia
Sousa, Gestora de Cincia e Tecnologia da FCT
Co-orientador: Jos Moura, Professor Catedrtico, FCT-
UNL
II
A peroxidase do citocromo c de Marinobacter hydrocarbonoclasticus 617: aplicao de
tcnicas espectroscpicas e electroqumicas ao estudo do mecanismo de activao e catlise.
Copyright
Isabel Cristina Ribau Fernandes Coutinho
FCT/UNL
UNL
A Faculdade de Cincias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tm o direito,
perptuo e sem limites geogrficos, de arquivar e publicar esta dissertao atravs de
exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer meio
conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar atravs de repositrios cientficos e de
admitir a sua cpia e distribuio com objectivos educacionais ou de investigao, no
comerciais, desde que seja dado crdito ao autor e editor.
III
Alice, Catarina e Beatriz
IV
AGRADECIMENTOS
Se vi mais longe, foi por estar de p sobre ombros de gigantes.
Isaac Newton
(Cartas a R. Hooke)
Gostaria de comear por agradecer Professora Isabel Moura e ao Professor Joo Moura a
oportunidade de realizar um trabalho de investigao na rea da Bioqumica e de usufruir de
boas condies a nvel laboratorial.
s minhas orientadoras Sofia Pauleta e Patrcia Sousa agradeo os conhecimentos adquiridos e
o tempo que disponibilizaram para a discusso de resultados.
A todos os que de algum modo me ajudaram a concretizar este trabalho, agradeo o empenho e
a amizade.
Agradeo a todos os colegas de laboratrio que durante estes anos me acompanharam e
encorajaram a continuar a trabalhar.
Por ltimo um agradecimento especial s minhas trs filhas, Alice, Catarina e Beatriz, que me
apoiaram durante estes anos e a quem dedico este trabalho.
Resumo
V
RESUMO
As peroxidases do citocromo c bacterianas catalisam a reduo do perxido de
hidrognio a gua. A sua estrutura, activao e os mecanismos de desintoxicao de perxido de
hidrognio tem sido alvo de estudos desde os anos noventa do sculo XX. Estas enzimas
existem numa grande variedade de organismos, tanto aerbios como anaerbios e protegem-os
do stress oxidativo.
Este trabalho teve como principal objectivo o aprofundamento do conhecimento do
mecanismo de activao e catlise da peroxidase do citocromo c (PCc) da bactria marinha
Ma. hydrocarbonoclasticus. Pretendeu-se compreender melhor os factores de que depende a
activao da enzima, e que alteraes estruturais provocam. Tambm se pretendeu conhecer
melhor os mecanismos que regem a transferncia de electres no meio biolgico, tendo-se
centrado este estudo na transferncia de electres entre a PCc e o seu parceiro fisiolgico o
citocromo c552. Analisou-se o comportamento electroqumico da PCc com elctrodos com filme
de protena e de membrana e utilizaram-se tcnicas espectroscpicas.
Iniciou-se o trabalho investigando as condies que permitem bactria Ma.
hydrocarbonoclasticus, sobreexpressar a peroxidase do citocromo c. Esta optimizao permitiu
confirmar que o FNR regula a expresso do gene ccp que codifica para esta enzima.
Caracterizou-se a PCc e investigou-se o seu mecanismo de activao, o qual exibe
caractersticas de efeito redox-Bohr. Estudou-se tambm a cintica da transferncia electrnica
intermolecular durante a catlise da peroxidase do citocromo c mediada pelo citocromo c552,
obtendo-se uma constante intermolecular, k, de (8,00,4) 106 M-1s-1. Investigou-se ainda a
influncia de condies experimentais como o pH ou a fora inica na catlise mediada. Os
resultados obtidos nas diferentes condies foram analisados com base em parmetros
termodinmicos e cinticos, tais como potenciais formais e constantes de velocidades de
transferncia intermolecular. Usando tcnicas electroqumicas obteve-se um pKa1 de 5,80,1 e
um pKa2 de 7,50,1, usando tcnicas espectroscpicas pKa1 de 5,50,1 e um pKa2 de 8,50,1.
Esta diferena de resultados foi atribuda s diferentes condies experimentais iniciais usadas
em cada tcnica. A anlise dos resultados do estudo da actividade cataltica com a fora inica
mostrou que o complexo entre a PCc e o citocromo c552 tem natureza hidrofbica. Com base nas
estruturas da PCc e do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus, usando o algoritmo
computacional BiGGER e o programa Chemera, bem como dados de espectroscopia de
Ressonncia Magntica Nuclear, props-se uma estrutura para o complexo de transferncia
electrnica entre as duas protenas.
PALAVRAS-CHAVE: Peroxidase do citocromo c, Mecansimo de activao, Citocromo
c552, Catlise mediada, Complexo de transferncia electrnica.
VI
Abstract
VII
ABSTRACT
Since the nineties of the twenty century, the structure, activation and hydrogen peroxide
detoxification mechanism of bacterial cytochrome c peroxidase have been studied. These
cytochrome c peroxidase are important in cellular detoxification in bacteria by catalyzing the
reduction of hydrogen peroxide to water, they protect the bacterium from oxidative stress and its
ubiquity reflects its importance.
The main aim of this work was to investigate the activation mechanism and catalysis of
cytochrome c peroxidase from Marinobacter hydrocarbonoclasticus, a marine bacterium, to
improve the knowledge on dihemic cytochrome c peroxidase. With the objective of better
understanding the mechanisms governing the electron transfers in biological system, we have
investigated the electron transfer between the cytochrome c peroxidase and its physiological
partner cytochrome c552.
The growth conditions of Ma. hydrocanonoclasticus were optimized in order to obtain
large amounts of cytochrome c peroxidase (CCP). This optimization led to the confirmation that
FNR regulates the ccp gene expression which codifies for CCP in this bacteria. The
spectroscopic characterization was described and activation mechanism was investigated. This
mechanism involves a redox-Bohr effect. The electrochemical behaviour of CCP was analyzed
with the proteins adsorbed in the electrode surface (protein film) or entrapped in a membrane
electrode. The kinetics of intermolecular electron transfer during the catalysis of cytochrome c
peroxidase mediated by cytochrome c522 was also investigated and a intermolecular constant, k,
was obtained (8,00,4) 106 M-1s-1. The influences of experimental conditions such as the pH
or ionic strength was studied by electrochemical and spectroscopic techniques. The results
obtained in the different conditions were evaluated on the basics of thermodynamic and kinetic
parameters. Using electrochemical tecniques a pKa1 of 5,80,1 and a pKa2 of 7,50,1 was
obtained and using spectroscopic tecniques the values were pKa1 of 5,50,1 and a pKa2 of
8,50,1. These differences were attributed to the inicial experimental conditions of these
tecniques. The analyses of the results revealed that cytochrome c552 binds to CCP mainly by
hydrofobic interactions.
Based on CCP and cytochrome c552 PDB structures, using the computer algorithm
BiGGER and program Chemera, putative structures for the complex electron transfer between
the two proteins were obtained.
KEYWORDS: Cytochrome c Peroxidase, Activation mechanism, Cytochrome c552,
Mediated catalysis, Electron transfere complex .
VIII
IX
NDICE GERAL
DEDICATRIA III
AGRADECIMENTOS IV
RESUMO V
PALAVRAS - CHAVE V
ABSTRACT VII
KEY-WORDS VII
NDICE GERAL IX
NDICE DE FIGURAS XV
NDICE DE TABELAS XXV
LISTA DE ABREVIATURAS XXIX
LISTA DE SMBOLOS XXXI
CAPTULO 1| INTRODUO 1
1.1 As espcies reactivas de oxignio e o stress oxidativo in vivo 2
1.2 As peroxidases do citocromo c bacterianas 5
1.2.1 Regulao da expresso gnica das peroxidases do citocromo c bacterianas 5
i) O regulador da activao transcripcional FNR 6
ii) O regulador da activao transcripcional OxyR 6
1.2.2 Regulao gentica de peroxidases do citocromo c nas bactrias gram-
negativas 7
1.2.3 Alinhamento da sequncia primria de peroxidases do citocromo c
dihmicas 9
1.2.4 Estrutura das peroxidases do citocromo c dihmicas 10
1.2.5 Caracterizao bioqumica 15
1.2.6 Espectroscopia de UV-visvel 17
1.2.7 Espectroscopia de ressonncia paramagntica electrnica (RPE) 18
1.2.8 Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (1 H-RMN) 19
1.2.9 O mecanismo de activao 21
1.2.10 A catlise enzimtica 23
1.2.11 Inactivao de peroxidases pelo perxido de hidrognio 25
1.3 Complexos de transferncia electrnica - peroxidases do citocromo c e
citocromos c
27
1.3.1 O citocromo c552 de Marinobacter hydrocarbonoclasticus 28
ndice
X
1.3.2 O citocromo c de cavalo 29
1.3.3 Complexos formados entre peroxidases do citocromo c e parceiros redox 30
1.4 mbito do trabalho 33
CAPTULO 2| MATERIAIS E MTODOS 35
2.1 Crescimento da bactria Marinobacter hydrocarbonoclasticus 617 36
2.1.1 O microrganismo 36
2.1.2 Preparao do meio de cultura lquido e slido 36
2.1.3 Condies de crescimento 37
2.2 Purificao das protenas de Ma. hydrocarbonoclasticus 40
2.2.1 Preparao de esferoplastos 40
2.2.2 Purificao da peroxidase do citocromo c 41
2.2.3 Purificao do citocromo c552 de Marinobacter hydrocarbonoclasticus 42
2.3 Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante 42
2.4 Determinao da concentrao das protenas 43
2.5 Determinao da massa molecular aparente por cromatografia de
excluso molecular
43
2.5.1 Estudo da influncia da concentrao de PCc na sua massa molecular aparente
44
2.5.2 Estudo da influncia dos ies clcio na massa molecular aparente de PCc 44
2.5.3 Estudo do efeito da fora inica na massa molecular aparente de PCc 44
2.6 Caracterizao espectroscpica 44
2.6.1 Espectroscopia de UV-visvel 44
2.6.1.1 Estudo da activao da PCc 44
2.6.1.2 Catlise em estado estacionrio mediada pelo citocromo c552 - ensaio
espectrofotomtrico 45
i) Preparao das protenas 45
ii) Ensaio de actividade 45
2.6.2 Espectroscopia de ressonncia paramagntica electrnica (RPE) 47
2.6.3 Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (1 H-RMN) 48
ndice
XI
i) Preparao da amostra de PCc e aquisio de dados 48
ii) Estudo da interaco entre a PCc e o citocromo c552 48
iii) Determinao da constante de dissociao do complexo PCc-citocromo c552 por espectroscopia de 1H-RMN
48
2.7 Titulaes potenciomtricas: determinao do potencial formal de
oxidao-reduo
49
2.7.1 Calibrao do elctrodo combinado (platina, Ag/AgCl) 49
2.7.2 Titulao potenciomtrica 50
2.7.2.1 Determinao dos potenciais formais por potenciometria 51
2.8 Mtodos electroqumicos 52
2.8.1 Voltametria cclica 53
2.8.2 Voltametria de impulso diferencial 53
2.8.3 Preparao do elctrodo 54
2.8.4 Electrlito de suporte e solues de trabalho 55
i) Peroxidase do citocromo c de Ma. hydrocarbonoclasticus 55
ii) Citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus 55
iii) Determinao do coeficiente de difuso do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus
55
iv) Variao do pH 56
v) Variao da fora inica 56
vi) Ensaios em presena de PCc 57
2.8.5 Estudo cintico da catlise medida 57
i) Variao da concentrao do perxido de hidrognio 57
ii) Variao da concentrao de PCc 57
2.8.6 Influncia do pH na catlise mediada 58
2.8.7 Influncia da fora inica na catlise mediada 58
i) Adio de NaCl soluo de trabalho e ao electrlito 58
ii) Adio de NaCl ao electrlito 58
2.9 Simulaes de atracamento molecular 58
ndice
XII
CAPTULO 3| CARACTERIZAO DA PEROXIDASE DO CITOCROMO C DE
MARINOBACTER HYDROCARBONOCLASTICUS
61
3.1 Optimizao das condies de crescimento da bactria Ma.
hydrocarbonoclasticus para a produo de PCc
62
3.2 Purificao da peroxidase do citocromo c e do citocromo c552 64
3.3 Determinao da massa molecular aparente da peroxidase do citocromo c
e do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus
66
3.4 Caracterizao espectroscpica da peroxidase do citocromo c 68
3.4.1 Espectroscopia de UV-visvel 68
3.4.2 Espectroscopia de Ressonncia Paramagntica Electrnica (RPE) 74
3.4.3 Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (1H-RMN) 77
3.5 Determinao dos potenciais formais por potenciometria 80
3.6 Estudos por voltametria utilizando elctrodos de grafite piroltica com
filme de protena
85
3.6.1 Voltametria cclica 85
3.6.2 Voltametria de impulso diferencial 89
3.6.3 Catlise directa 93
i) Voltametria de impulso diferencial 93
ii) Voltametria cclica 94
3.7 Estudos por voltametria de impulso diferencial utilizando elctrodos de
membrana de grafite piroltica
96
3.8 Concluso 97
CAPTULO 4| CATLISE DA PEROXIDASE DO CITOCROMO C MEDIADA PELO
CITOCROMO C552 DE MARINOBACTER HYDROCARBONOCLASTICUS
103
4.1 Caracterizao da cintica de transferncia electrnica, por
electroqumica
104
4.2 Caracterizao da interaco entre a peroxidase do citocromo c e o citocromo c552 de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
111
4.2.1 Efeito da presena de peroxidase do citocromo c no sinal do citocromo c552 111
4.2.2 Catlise da peroxidase do citocromo c mediada pelo citocromo c552 113
4.2.3 Efeito do pH na catlise mediada 121
4.2.4 Efeito da fora inica na catlise mediada 123
ndice
XIII
4.2.4.1 Diferente metodologia para a preparao da soluo de trabalho 123
4.2.4.2 Efeito da fora inica na catlise a diferentes valores de pH 126
4.3 Caracterizao da cintica de estado estacionrio seguida por ensaios espectrofotomtricos
129
4.3.1 Efeito da concentrao de peroxidase do citocromo c 129
4.3.2 Efeito do pH na actividade do centro cataltico 130
4.3.3 Efeito da fora inica na catlise mediada 132
4.4 Concluso 135
CAPTULO 5| CARACTERIZAO DO COMPLEXO DE TRANSFERNCIA
ELECTRNICA ENTRE A PEROXIDASE DO CITOCROMO C E O CITOCROMO C552 DE MARINOBACTER HYDROCARBONOCLASTICUS
139
5.1 Interaco peroxidase do citocromo c: citocromo c552 140
5.2 Modelo estrutural do complexo PCc: Cit c552 144
5.2.1 As estruturas da PCc (protena alvo) e dos citocromos c (sondas) 144
5.2.2 Simulaes de atracamento molecular 147
i) Complexo citocromo c552 e PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus 148
ii) Complexo citocromo c de cavalo e PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus 153
5.3 Concluso 156
CAPTULO 6| CONCLUSO 159
6.1 Concluso final 160
6.2 Perspectivas futuras 164
BIBLIOGRAFIA 167
XIV
ndice
XV
NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Sequncia de ADN (NCBI Sequence Referncia: NC_017067.1) do gene ccp
(VIMSS3521861: Maqu-0372 citocromo c peroxidase 349 a.a.) da PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus (140 bases a montante, 1050 pares de base (gene ccp a negrito), 50 bases
ajusante do gene ccp-Maug) onde se destaca a sequncia de bases nuclecas reconhecida pelo
FNR. A montante do gene ccp, encontra-se a seaquncia de resduos reconhecidos pelo
regulador FNR, que est assinalada por uma caixa (dados retirados de www.microbesonline.org,
acedido a 1 de Fevereiro 2013).
Figura 1.2 Esquema da organizao do sistema de maturao de citocromos tipo c (Ccm) na
membrana citoplasmtica e da translocao do hemos em bactrias Gram-negativas [112, 113].
O pr-apo-citocromo transferido do citoplasma para o periplasma translocador SecYEG
(sistema de transporte secretor) e o grupo hemo pelo sistema de transporte complexo CcmABC,
CcmD e CcmE. A incorporao do hemo no apo-citocromo ocorre em CcmF, usando electres
transferidos pela protena transmembranar DsbD (oxidoreductase dissulfureto). Os sistemas
CcmG e CcmH libertam o citocromo para o periplasma [112, 113]. O sistema de maturao de
citocromo tipo c, Ccm, constitudo por protenas membranares ou que esto ligadas
membrana (CcmABCDEFGH e DsbD). As setas so caminhos do sistema de maturao. Figura
adaptada da referncia 113, 114 e 119.
Figura 1.3 Sequncia de aminocidos da PCc de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC
49840, onde se destaca o pptideo-sinal (caixa cinzenta). Previso obtida em
http//www.signalP.4.1 [120].
Figura 1.4 Alinhamento da sequncia primria das peroxidases do citocromo c bacterianas mais
estudadas: Pa, Ps. aeruginosa, Pp, Pa. pantotrophus, Mh, Ma. hydrocabonoclasticus, Ps, Ps.
stutzeri, Rc, Rb. capsulatus, Gs, Gb. sulfurreducens, So, Sw. oneidensis e Ne, Ni. europeae. Os
aminocidos ligados aos hemos (CXXCH) esto indicados como hemo E (C-terminal) e hemo P
(N-terminal). A cor cinzenta esto assinalados os aminocidos conservados e a vermelho os
semi-conservados. () Ligandos H (histidina) e M (metionina) ao ferro hmico, () resduos
de cistena covalentemente ligados ao hemo, () ligandos do io clcio. Figura adaptada das
referncias [65, 71, 75, 77 e 97].
Figura 1.5 Estruturas da peroxidase do citocromo c de Ps. aeruginosa na forma oxidada (A)
[PDB ID: 1EB7] e no estado de valncia mista (B) [PDB ID: 2VHD] e de Ni. Europaea (C)
oxidada [PDB ID: 1IQC]. HE-hemo de transferncia electrnica, HP-hemo peroxidctico, esfera
verde- io clcio. As PCc contm dois domnios helicoidais, com um hemo tipo c
covalentemente ligado via ligaes tioeter a um motivo conservado CisXXCisHis. O hemo P
est no domnio N-terminal e tem a coordenao bis-histidina, enquanto o grupo hmico ligado
ao C-terminal tem a coordenao metionina-histidina. Figuras preparadas com o software
Accelerys Viewerlite.
Figura 1.6 Posio do hemo E, do hemo P e do triptofano 97, bem como do io clcio na
estrutura cristalina de Rb. capsulatus. A distncia entre os ferros hmicos aproximadamente
20 e a distncia entre os grupos propionatos de 10 . Os grupos propionatos encontram-se circundados e o triptofano 97 identificado. Figura retirada da referncia 65.
Figura 1.7 Sobreposio de estruturas de PCc bacterianas. A cor verde apresenta-se a estrutura
da PCc na forma oxidada de Rb. capsulatus (1ZZH) a cor vermelha a estrutura da PCc de Ps.
aeruginosa na forma oxidada (1EB7) e a azul a PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus na forma
oxidada (1RZ6). Circundado a preto encontra-se o loop 3. Figura retirada de referncia 65.
http://www.microbesonline.org/
ndice
XVI
Figura 1.8 Estrutura da PCc de Ma. hydrocabonoclasticus na (A) forma fechada e sem clcio a
pH 4,0 [PDB: IRZ6] e (B) forma aberta com clcio a pH 5,3 [PDB: IRZ5], onde se mostra a
ampliao da cavidade entre os domnios da PCc. Cada hemo est localizado num domnio (C
ou N-terminal); o triptofano e o clcio (esfera verde na estrutura e a rosa na ampliao) esto
localizados na interface hidrofbica entre os dois domnios. Na forma fechada (A) o hemo P
apresenta uma coordenao bis-His, estando a cavidade entre os domnios ocupada por uma
molcula de gua (a vermelho) coordenada com quatro molculas de gua e trs resduos
(treonina, aspergina e prolina); o hemo E apresenta uma coordenao Met-His. Na forma aberta
(B) o hemo P apresenta-se penta coordenado e o hemo E apresenta-se hexacoordenado com uma
coordenao Met-His e o io clcio encontra-se coordenado com quatro molculas de gua e
trs resduos (treonina, aspergina e prolina). Em (B) indicam-se os loops 1 (aminocidos 80-92,
circundado a azul), 2 (aminocidos 105-132, circundado a amarelo) e 3 (aminocidos 225-257,
circundado a verde) que encontram-se circundados, bem como o hemos (HE- hemo de
transferncia de electres; HP- hemo peroxidctico) e o io clcio (esfera verde). Asp-cido
asprtico, Asn-aspargina, Thr-treonina, Pro-prolina. As figuras da estrutura tridimensional da
PCc foram preparadas com Accelerys Viewerlite e as ampliaes (imagens do lado esquerdo)
foram retiradas da referncia 71.
Figura 1.9 (A) Espectro de absoro da PCc de Pa. pantotrophus oxidada (Ox.) e
completamente reduzida (Red). (B) Espectro de absoro da enzima (i) oxidada, (ii) aps a
adio de ascorbato de sdio (PCc em valncia mista) e (iii) aps a adio de CaCl2. Espectros
retirados da referncia [46].
Figura 1.10 Espectro de RPE da PCc de Pa. pantotrophus (337 M) oxidada e a vrios tempos
aps a incubao com ascorbato de sdio em tampo fosfato 1 mM (pH 7) com NaCl 10mM,
temperatura de 8 K. Espectros retirados da referncia [46].
Figura 1.11 Espectro de 1H-RMN da PCc de Pa. pantotrophus nas forma oxidada (a) e em
valncia mista (b), na ausncia de clcio. Espectros retirados da referncia [46].
Figura 1.12 Comparao das estruturas de PCc no estado inactivo (verde) e das estruturas no
estado activo (azul), focando os resduos que envolvem o hemo E e que envolvem o hemo P. A
PCc de Ps. aeruginosa est representada a verde tal como isolada (forma inactiva)
(cdigo do PDB: 1EB7) e a azul representa-se a PCc de Ni. europaea como isolada (forma
activa) (cdigo do PDB: 1IQC). O loop 3 encontra-se circundado a preto. Figura retirada da
referncia 59.
Figura 1.13 Estrutura da PCc de Ni. europaea como isolada (forma activa) (cdigo do PDB:
1IQC), onde se identificam os loops 1 (aminocidos 80-92, circundado a vermelho), 2
(aminocidos 105-132, circundado a amarelo) e 3 (aminocidos 225-257, circundado a verde)
que encontram-se circundados, bem como o hemos (HE-hemo de transferncia de electres;
HP-hemo peroxidctico) e o io clcio (esfera verde). Figura preparada com Accelerys
Viewerlite.
Figura 1.14 Esquema da activao e do mecanismo do ciclo cataltico de PCc bacterianas, onde
se apresenta a regenerao do citocromo c durante a catlise do perxido de hidrognio.
(Esquema adaptado das seguintes referncias [41, 42, 49, 58, 65, 71 e 76]). E-hemo de
transferncia electrnica, P- hemo cataltico, SA- spin alto, SB- spin baixo e SA/SB- equilbrio
de spins.
Figura 1.15 Mecanismos de inactivao de PCc, proposto a partir do composto IV. Reaco
(1): converso do composto IV no composto VI, na presena de excesso de perxido de
hidrognio. So possveis trs caminhos de decomposio do composto VI: (2) reaco com o
tetrapirrol, oxidando a porfirina e libertando o io ferro; (3) regresso ao estado inicial (composto
V, Figura 1.14); (4) o perxido de hidrognio o doador de electres, originando um radical
ndice
XVII
perxido e a regenerao do hemo ao estado inicial (composto V, Figura 1.14). Retirado da
referncia 157.
Figura 1.16 Esquema do mecanismo de inactivao de peroxidases, onde se apresenta a
regenerao do mediador c e a formao de espcies intermedirias durante a catlise do
perxido de hidrognio mediada por peroxidases. O hemo cataltico, circundado, no final do
processo de inactivao novamente regenerado. Esquema adaptado da referncia 158.
Figura 1.17 Estrutura do dmero do citocromo c552 obtida a pH 5,6 (cdigo PDB: CNO) tendo
em conta a (A) estrutura secundria, (B) os pKa resduos e (C) a os resduos carregados da
superficie. Em (C) a colorao azul representa as partes bsicas carregadas positivamente na
superfice da protena e a vermelha representa as partes acdicas negativamente carregadas da
superfcie da protena. Os hemos esto coloridos a cinzento e azul os ligando hmicos (His 18 e
Met 60). Na estrutura circunda-se a zona do hemo exposta ao solvente. Figura preparada com Accelerys Viewerlite.
Figura 1.18 Estrutura do dmero do citocromo c de cavalo (cdigo PDB: 1HRC) tendo em conta
a (A) estrutura secundria, (B) os pKa resduos e (C) a os resduos carregados da superficie. Em
(C) a colorao azul representa as partes bsicas carregadas positivamente na superfice da
protena e a vermelha representa as partes acdicas negativamente carregadas da superfcie da
protena. Os hemos esto coloridos a cinzento e azul os ligando hmicos (His 18 e Met 80). Na
estrutura circunda-se a zona do hemo exposta ao solvente. Figura preparada com Accelerys Viewerlite.
Figura 2.1 Cultura da bactria Gram-negativa Ma. hydrocarbonoclasticus em meio de cultura
lquido, recolhido de um microfermentador de 10 L, aps 3 horas de incubao. A morfologia
tpica desta bactria (bastonetes) pode ser observada nesta imagem obtida com um microscpio
ptico (ampliao de 1000 x/1.3 oil Ph3).
Figura 2.2 Esquema do microfermentador de 10 litros onde se efectuaram os crescimentos da
bactria Ma. hydrocarbonoclasticus.
Figura 2.3 Curva de crescimento da bactria Ma. hydrocarbonoclasticus, obtida num
fermentador de 10 L em que () representa a percentagem de oxignio dissolvido registada ao
longo do crescimento e () representa logaritmo da densidade ptica a 600 nm ao longo do tempo. Condies de crescimento: lactato 0,8 % (m/V), NaNO3 120 M, pH 7,5, velocidade de
arejamento 0,2 vvm. A velocidade de agitao foi de 150 rpm durante as primeiras 3 horas,
sendo depois reduzida para 50 rpm, o crescimento foi realizado a 30 C durante 42 horas.
Figura 2.4 Esquema geral da purificao da peroxidase do citocromo c e do citocromo c552 de
Ma. hydrocarbonoclasticus. Os tampes indicados referem-se aos tampes de eluio dos
diversos passos cromatogrficos.
Figura 2.5 (A) Perfil de eluo das protenas padro a 280 nm eludas com Tris-HCl 50 mM
(pH 7,5), NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM, numa coluna de excluso molecular Superdex-200. Os
padres usados foram: ferritina (Fe), aldolase (Al), conalbumina (CA), anidrase carbnica (AC),
ribonuclease (R) e aprotinina (AP). (B) Curva de calibrao obtida a partir do perfil de eluio
de (A); linearizao do volume de eluio (Ve) em funo da massa molecular aparente (MM),
Ve = - 4,0 LogMM + 21,4 (r = 0,99).
Figura 2.6 Absorvncia a 552 nm em funo do tempo, obtida durante ensaios de actividade da
PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus. As setas indicam o momento da adio de PCc, perxido de
hidrognio e K3Fe(CN)6 mistura reaccional. Insero: linearizao do logaritmo neperiano (ln)
da diferena entre a absorvncia a 552 nm (A) e a absorvncia da mistura reaccional totalmente
oxidada (Aox), em funo do tempo. A actividade do centro cataltico (k) determinada pelo
ndice
XVIII
produto do declive da recta (k) pela concentrao do citocromo c e da PCc. Equao da recta
(ln (A-Aox) = -0,280 t -2,44, r = 0,99). Condies experimentais: citocromo c552 7 M,
peroxidase do citocromo c 24 nM, CaCl2 1 mM, em tampo HEPES 10 mM (pH 7,5), e
perxido de hidrognio (100 M).
Figura 2.7 Esquema do modelo usado para simular as curvas de absorvncia em funo do
potencial.
Figura 2.8 Esquema da clula electroqumica usada neste trabalho.
Figura 2.9 (A) e (B) Preparao do elctrodo de membrana (EMGP), onde sobre a membrana
de dilise (c), depositada em cima do anel de borracha (b) colocada uma gota de soluo de
trabalho (d) com ajuda de uma micropipeta (f). (C) Esquema do elctrodo de membrana: (a)
elctrodo de trabalho de grafite piroltica; (b) anel de borracha; (c) membrana; (d) soluo de
protena aprisionada, (e) grafite piroltica. Junto da superfcie do elctrodo a protena oxidada
recebe electres ficando reduzida.
Figura 3.1 Electroforese em condies desnaturantes do periplasma de Ma.
hydrocarbonoclasticus, obtido em diferentes condies de crescimentos, realizados para a
optimizao da produo de peroxidase do citocromo c em que foram adicionadas diferentes
concentraes de nitrato de sdio ao meio de cultura. Gel de poliacrilamaida (12,5%) com
colorao para hemos tipo c. Nos gis foram aplicadas amostras em que a relao volume de
periplasma bruto / volume da amostra aplicada no gel igual. cd1 - nitrito reductase, PCc -
peroxidase do citocromo c.
Figura 3.2 (A) Espectros de UV-visvel de PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus 3,1 M em
tampo Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), no final da purificao (___) e na forma reduzida (---) aps a
adio de ditionito de sdio. (B) Electroforese em condies desnaturantes em gel de
poliacrilamaida (12,5%) corado com Azul de Coomassie; P- periplasma, 1- fraco de PCc que
eluu da coluna Source Q, 2- fraco de PCc que eluu da coluna superdex 200, 3- fraco pura
de PCc que eluu da coluna HTP.
Figura 3.3 (A) Espectro de UVvisvel do citocromo c552 4,7 M em tampoTris-HCl 10 mM
(pH 7,6). (____) Espectro do citocromo c552 puro e oxidado e (---) espectro do citocromo c
reduzido.(B) Electroforese em condies desnaturantes em gel de poliacrilamaida (12,5%)
corado com azul de comassie, MM - padres de massas moleculares. 1 - fraco de citocromo
c552 que eluu da Source Q, 2- fraco de citocromo c552 que eluiu da Superdex 75, 3 fraco
pura de citocromo c552 que eluu da HTP.
Figura 3.4 Espectros de UV-visvel da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, a pH 4,5 (A), 5,0
(B), 5,5 (C), 6,0 (D), 6,5 (E), 7,0 (F), 7,5 (G), 8,0 (H) e 8,5 (I). PCc oxidada (____);PCc de
valncia mista aps 1 minuto (-.-.-) e 20 min (..) de incubao com ascorbato de sdio (1 mM )
e DAD (5 M), PCc de valncia mista aps 1 minuto (_____) e 40 minutos (____) de incubao na
presena de excesso de cloreto de clcio (1 mM). Foi utilizado o tampo acetato/cido actico
para pH 4,5 e 5,0, tampo MES para pH entre 5,5 e 6,5, HEPES para pH 7,0, 7,5 e 8,0 e Tris-
HCl para pH 8,5.
Figura 3.5 Espectros de UV-visvel da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, a pH 4,5 (A), 5,0
(B), 5,5 (C), 6,0 (D) e 6,5 (F). Espectros entre 360 nm e 480 nm e espectros entre 590 nm e 690
nm. PCc oxidada (____); PCc de valncia mista aps 1 minuto (-.-.-) e 20 min (..) de incubao
com ascorbato de sdio (1 mM ) e DAD (5 M), PCc de valncia mista aps 1 minuto (____) e
40 minutos (____) de incubao na presena de excesso de cloreto de clcio (1 mM). Foi utilizado
o tampo acetato/cido actico para pH 4,5 e 5,0 e tampo MES para pH entre 5,5 e 6,5.
ndice
XIX
Figura 3.6 Espectro de UV-visvel da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus a pH 6,5 (A), 7,0 (B),
7,5 (C), 8,0 (D) e 8,5 (F). Espectro entre 360 nm a 480 nm e espectro de 590 nm e 690 nm. PCc
oxidada (____);PCc de valncia mista aps 1 minuto (-.-.-) e 20 min (..) de incubao com
ascorbato de sdio (1 mM ) e DAD (5 M), PCc de valncia mista aps 1 minuto (_____) e 40
minutos (____) de incubao na presena de excesso de cloreto de clcio (1 mM). Foi utilizado o
tampo MES para pH 6,5, HEPES para pH 7,0, 7,5 e 8,0 e Tris- HCl para pH 8,5.
Figura 3.7 Espectros de RPE da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus em Tris- HCl 10 mM (pH
7,5). No estado oxidado (A), no estado de valncia mista (B) e no estado de valncia mista
incubada com excesso de io clcio (1 mM) (C). Simulao do espectro de RPE da PCc oxidada
(A), da forma de valncia mista (B) e da forma de valncia mista incubada com excesso de
ies clcio (C). Condies experimentais: Frequncia de micro-ondas 9,65 GHz; temperatura 8
K; nmero de varrimentos 3; ganho 2x105; modulao de amplitude 5 Gpp; potncia de micro-
ondas, 0,635 mW, atenuao 25 dB. Os parmetros usados na simulao (A) do hemo P foram:
gz = 2,96, gy = 2,29, gx = 1,34 (spin-baixo, S = 1/2) e do hemo E foram gz= 3,39, gy= 2,02,
gx= 0,60 (spin-baixo, S= 1/2). Como existe s contribuio do hemo P em (B), os parmetros
usados na simulao (B) foram: gz = 2,96, gy = 2,29, gx = 1,34 (spin-baixo, S= 1/2). Para a
simulao (C) foram usados os seguintes parmetros: hemo HP2 (spin-baixo): gz = 2,94, gy =
2,29, gx = 1,34 e para HP1(spin-baixo, S=1/2) e gz = 2,80, gy = 2,25, gx = 1,54. Na figura esto
identificados os valores de g e a sua atribuio em relao aos hemos.
Figura 3.8 Espectros de 1H-RMN de uma soluo de PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus
(827 M), adquiridos num espectrmetro de RMN Avance a 400 Hz. (A) PCc oxidada, (B) PCc
oxidada aps a adio de cloreto de clcio 2 mM e (C) PCc na forma de valncia mista na
presena de ies clcio e de ascorbato de sdio 2 mM aps 60 minutos de incubao. Condies
experimentais: Tampo Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), temperatura de 303 K, 10% de D2O.
Figura 3.9 O anel da protoporfirina IX de um hemo tipo c, onde se vem quatro grupos metilo
do anel e os quatro protes meso (,, e ). M1-Grupo metilo rodeado a azul, M2- Grupo
metilo rodeado de vermelho, M3- Grupo metilo rodeado de laranja e M4- Grupo metilo rodeado
de verde (Nomenclatura da IUPAC-IUB).
Figura 3.10 Espectros de visvel da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus durante a sua reduo, a
pH 7,5, (A) na presena e (B) na ausncia de excesso de ies clcio. Em (A) (___) E = +361 mV, (..)E = +237 mV,(- - -) E = +38 mV, (_ _ _) E = -124 mV, (___) E = -327 mV. Em (B) (___)
E = +210 mV, (..) E = +148 mV,(- - -) E = +52 mV, (_ _ _) E = -128 mV, (___) E = -295 mV.
Condies experimentais:PCc 5,4 M, tampo HEPES 10 mM (pH 7,5) (no incio da titulao)
na presena de mediadores e de CaCl2 1 mM.
Figura 3.11 Curvas de titulao de oxidao-reduo, seguida por espectroscopia de UV-visvel
( = 545 nm), da peroxidase do citocromo c de Ma. hydrocarbonoclasticus, (A) aps a adio
de ies clcio e (B) sem adio de ies clcio, em tampo HEPES 10 mM (pH 7,5) na
presena de mediadores. Titulao potenciomtrica no sentido da reduo () e no sentido da
oxidao ().
Figura 3.12 Voltamogramas cclicos a diferentes velocidades de varrimento (10 v
300 mVs-1) da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus 100 M, num EGPF. Condies
experimentais: tampo HEPES 10 mM (pH 7,5) e cloreto de clcio 1 mM.
Figura 3.13 Variao das correntes do pico (A) andico e (B) catdico com a velocidade de
varrimento. Condies experimentais: tampo HEPES 10 mM (pH 7,5) e CaCl2 1 mM.
Figura 3.14 Variao do potencial formal, E0, da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus com o
pH, determinada por voltametria cclica usando um EGPF (E0 = - 54 pH + 266, r= 0,9).
ndice
XX
Figura 3.15 Voltamogramas de impulso diferencial de PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, (100
M), obtidos com um EGPF em presena de Ascorbasto de sdio (1mM), DAD (2 M). (___)
Primeiro, (_ _ _) segundo e (.) terceiro voltamograma consecutivos.. (___) Voltamograma de
impulso diferencial obtido com um elctrodo de grafite piroltica onde secou, durante 30
minutos, uma soluo com Ascorbasto de sdio (1mM), DAD (2 M) e clcio 1 mM.
Electrlito HEPES 10 mM (pH 7,5) em presena de cloreto de clcio 1 mM
Figura 3.16 Voltamogramas de impulso diferencial consecutivos de PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus, (100 M), obtidos com um EGPF, a diferentes valores de pH. Primeiro
(___), segundo (_ _ _) e terceiro (.) voltamograma consecutivos. Condies experimentais:
tampo MES 10 mM (pH 5,5 e pH 6,0), tampo bis-tris-propano 10 mM (pH 6,5), tampo
HEPES 10 mM (pH 7,0 e pH 7,5) em presena de cloreto de clcio 1 mM.
Figura 3.17 Voltamogramas de impulso diferencial de PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus
100 M na ausncia de perxido (primeiro (____), segundo (----), terceiro (__ __ __), quarto () e
o que antecedeu a adio de perxido de hidrognio(---)) e (- - -) os quatro primeiros
voltamogramas consecutivos (1, 2, 3 e 4) aps a adio de perxido de hidrognio 750 M,
obtidos usando um EGPF. Insero: ampliao dos primeiros quatro voltamogramas
consecutivos (primeiro (____), segundo (---), terceiro (__ __ __), quarto () na ausncia de
perxido de hidrognio e do que antecedeu a adio de perxido de hidrognio (---).
Condies experimentais: electrlito de referncia bis-tris-propano 10 mM (pH 7,5) com CaCl2
1 mM.
Figura 3.18 Voltamogramas cclicos (Ei= + 0,400 V, E inv= - 0,450 V, Ef = + 0,400 V) a
v= 20 mVs-1 de Ma. hydrocarbonoclasticus 100 M na (I) ausncia e (II) na presena de
perxido de hidrognio 750 M, obtidos usando um EGPF. Condies experimentais:
electrlito de referncia bis-tris-propano 10 mM (pH 7,5) com CaCl2 1 mM.
Figura 3.19 Variao do potencial cataltico da catlise da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus
com o pH, determinada por voltametria cclica usando EGPF (Ecat = -0,033 pH + 0,152, r = 0,9).
Figura 3.20 Voltamogramas de impulso diferencial consecutivos de PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus (100 M), obtidos com um EMGP em HEPES 10 mM (pH 7,5).
Primeiro (_), segundo (_ _) e terceiro (.) Condies experimentais: HEPES 10 mM (pH 7,5) em
presena de CaCl2 1 mM.
Figura 3.21 Modelo do mecanismo de reduo/oxidao da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus.
Figura 4.1 (A) Voltamogramas cclicos a diferentes velocidades de varrimento (10 v
200 mVs-1) do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus a 35 M, num EMGP.
(B) Variao das correntes catdicas com a raiz quadrada da velocidade de varrimento.
(C) Variao das correntes andicas com a raiz quadrada da velocidade de varrimento.
Electrlito: bis-tris-propano 10 mM (pH 7,6) em presena de CaCl2 1 mM. Equaes das rectas:
ipc = - 1,69 v1/2, r = 0,99, ipa = 1,49 v1/2, r = 0,99.
Figura 4.2 Voltamogramas cclicos (v = 20 mVs-1) de diferentes concentraes de citocromo
c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus num EMGP. Condies experimentais: bis-tris-propano
10 mM (pH 7,5) em presena de CaCl2 1 mM.
Figura 4.3 Variao do potencial formal, E0, do citocromo c552 com o pH, a fora inica
constante. Condies experimentais: determinao por voltametria cclica (20 mVs-1) usando
um EMGP com citocromo c552 35 M. O ajuste efectuou-se utilizando a equao 4.2 e um
algoritmo do programa Excel (Solver), obtendo-se um valor de pKa de 10,7 0,1.
ndice
XXI
Figura 4.4 (A) Variao do potencial formal e (B) das correntes do pico andico e catdico
com a fora inica, dos voltamogramas cclicos do citocromo c552 de Ma.
hydrocarbonoclasticus 35 M, num EMGP. Electrlito: bis-tris-propano 10 mM a pH 6,5 ()
e a pH 7,5 () na presena de CaCl2 1 mM.
Figura 4.5 (A) Variao do Variao do potencial formal com o pH e (B) e com a fora inica
a a pH 6,5 () e a pH 7,5 () dos voltamogramas cclicos do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus 35 M, num EMGP. Electrlito: bis-tris-propano 10 mM em presena
de CaCl21 mM. O perfil va variao do potencial com o pH foi simulado usando a equao 4.3
e um pKa de 10,8 0,1.
Figura 4.6 Esquema da catlise peroxidase do citocromo c mediada pelo citocromo c552 de
Ma. hydrocarbonoclasticus: O elctrodo reduz o citocromo c552 que rapidamente reoxidado
pela enzima a qual regenerada pela converso do perxido de hidrognio a gua. Adaptado da
referncia 169.
Figura 4.7 Variao das correntes catalticas ao longo do tempo aps adio de 0,5 mM () ou
1,0 mM () de perxido de hidrognio utilizando EMGP. Correntes catalticas obtidas nas
seguintes condies: voltamogramas cclicos a 20 mV s-1 de citocromo c552 35 M, peroxidase
do citocromo c 4,6 M, em bis-tris-propano 10 mM (pH =7,5) e CaCl2 1 mM.
Figura 4.8 Voltamogramas cclicos (v = 20 mVs-1) da catlise da peroxidase do citocromo c 4,6
M mediada pelo citocromo c552 35 M de Ma. hydrocarbonoclasticus, usando um EMGP, em
bis-tris-propano 10 mM (pH 7,5) e CaCl2 1 mM, na ausncia (----) e na presena de diferentes
concentraes de perxido de hidrognio ().
Figura 4.9 Variao da corrente cataltica com a concentrao de perxido de hidrognio, a
partir dos voltamogramas cclicos (v = 20 mVs-1) obtidos com EMGP. Os pontos foram
ajustados a uma cintica de Michaelis-Menten. A soluo de trabalho continha citocromo c552
35 M, PCc 4,6 M e CaCl2 1 mM, em tampo bis-tris-propano 10 mM (pH 7,5). Insero:
linearizao de Eadie-Hofstee dos valores da corrente cataltica em funo da razo entre a
corrente cataltica e a concentrao de perxido de hidrognio. Cintica de Michaelis Menten,
ajustada com KM = (65 2) M, Vmax = icat Max = (302 2) nA (valores obtidos pela linearizao
de Eadie-Hofstee (Captulo 2| Materiais e mtodos (2.10.5)).
Figura 4.10 (A) Voltamogramas cclicos (v = 20 mVs-1) em tampo bis-tris-propano, 10 mM
(pH 7,5), obtidos com EMGP. Condies experimentais: citocromo c552 35 M, CaCl2 1 mM,
perxido de hidrognio 1 mM e peroxidase do citocromo c em diferentes concentraes. (B)
icat/ip em funo de (1/v) e (C) variao da constante de velocidade de pseudo-primeira ordem
(k) com a concentrao de PCc. Equao da recta: k= 0,43 [PCc] + 1,77 com r = 0,99. A
constante de pseudo-primeira ordem, (k) foi obtida a partir do declive das rectas de (icat/ip) em
funo de (1/v)1/2 (equao 4.5).
Figura 4.11 Variao da corrente cataltica, icat, com o pH. Ensaios com EMGP, com uma
soluo de trabalho de citocromo c552 35M e peroxidase do citocromo c 4,6 M, em presena
de CaCl2 1 mM, perxido de hidrognio 1 mM. Solues tampo utilizadas 10 mM: acetato (pH
5,0), MES (5,5 < pH < 6,5), HEPES (7,0 < pH < 7,5), bis- tris-propano (8,0 < pH< 8,5) e CAPS
(pH 8,9). O ajuste da curva efectuou-se utilizando a equao (2.18) e um algoritmo do programa
Excel (Solver) permitiu estimar os pKa1 = 5,8 0,1 e pKa2 = 7,5 0,1.
Figura 4.12 Variao das correntes catalticas com a fora inica. () Condio 1 (a soluo de
trabalho e o electrlito tm a mesma fora inica) e () Condio 2 (a soluo de trabalho e o electrlito tem diferente fora inica). Condies experimentais: voltametria cclica
ndice
XXII
(v = 20 mVs-1) em soluo de bis-tris-propano, 10 mM (pH 6,5) com peroxidase do citocromo c
4,6 M, citocromo c552 35M, CaCl2 1mM e perxido de hidrognio 1 mM.
Figura 4.13 Variao da corrente cataltica, icat, com a fora inica a pH 6,5 () e a pH 7,5 ()
e dependncia das correntes de pico, ipc para a reduo do citocromo c552 a pH 6,5 () e a
pH 7,5 (), determinadas por voltametria cclica (v = 20 mVs-1) com EMGP. Condies
experimentais para a catlise mediada: citocromo c552 35 M e peroxidase do citocromo c
4,6 M, CaCl2 1 mM em tampo bis-tris-propano 10 mM e perxido de hidrognio 1 mM. A
variao da fora inica efectuou-se pela adio de pequenos volumes de soluo de NaCl 6 M
ao electrlito. Condies experimentais para a reduo do citocromo c552 35 M: bis-tris-
propano 10 mM, na presena de CaCl2 1 mM.
Figura 4.14 A variao da actividade por centro cataltico da PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus com a concentrao de PCc. Condies experimentais: tampo HEPES
10 mM (pH 7,5), citocromo c552 7 M, CaCl2 1 mM e perxido de hidrognio 100 M
Equao da recta: k = 8,03 [PCc] + 0,07, r = 0,989. A PCc foi activada como descrito no
Captulo 2| 2.7.1.
Figura 4.15 Variao da actividade da PCc com o pH. Condies experimentais: citocromo c552
7 M, peroxidase do citocromo c 24 nM, CaCl2 1 mM e perxido de hidrognio 100 M.
Solues tampo utilizadas 10mM: acetato (pH 5,0), MES (5,5 < pH < 6,5), HEPES (7,0 < pH <
7,5), bis-tris-propano (8,0 < pH< 8,5) e CAPS (pH 8,9). O ajuste da curva foi feito utilizando
a equao (4.13) com pKa1 = 5,5 0,1 e pKa2 = 8,5 0,1, ocorrendo a actividade mxima
para pH 7,0.
Figura 4.16 Actividade por centro cataltico da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus em funo
da concentrao de NaCl a pH 7.5, usando () o citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus
ou () o citocromo c de cavalo como doador de electres. Condies experimentais: tampo
HEPES 10 mM (pH 7,5), citocromo c552 7 M, citocromo c de cavalo 7 M, peroxidase do
citocromo c 24 nM, CaCl2 1 mM e perxido de hidrognio 100 M.
Figura 5.1 Espectro 1H-RMN da forma oxidada de 234 M de citocromo c552 de Ma.
hydrocarbonoclasticus (Tris-HCl 1 mM (pH 7,5), CaCl2 2mM, 303 K). O espectro foi adquirido
num espectrmetro de RMN AVANCE III (600Hz) equipado com uma crio-sonda TCI. As
ressonncias identificadas como M1, M2, M3 e M4, so respectivamente a 34,95 ppm, 27,85
ppm, 14,67 ppm e a 13,83 ppm. A ressonncia identificada como C6-CH3 est localizada a -15,1
ppm e atribuda ao grupo - CH3 da metionina axial [165].
Figura 5.2 Titulao do citocromo c552 com peroxidase do citocromo c. Condies
experimentais: espectros foram adquiridos num espectrmetro de RMN AVANCE III (600Hz)
equipado com uma crio-sonda TCI. A titulao efectuou-se em tampo Tris-HCl 10 mM (pH
7,5), CaCl2 2 mM, a 303 K.
Figura 5.3 Variao do desvio qumico dos grupos metilo M4 (1-CH3) do citocromo c552, em
funo da razo entre peroxidase do citocromo c e o citocromo c552. A curva foi simulada tendo
em conta a formao de um complexo 1:2 sendo estimada uma constante de dissociao de
KD = 47 M.
Figura 5.4 (A) Estrutura (imagem da esquerda) e superfcie de potencial electrosttico (imagem
da direita) da peroxidase do citocromo c de Ma. hydrocarbonoclasticus na forma oxidada
(cdigo do PDB 1IRZ6). (B) Estrutura (imagem da esquerda) e distribuio de resduos
carregados na superfcie (imagem da direita) da peroxidase do citocromo c de Ma.
hydrocarbonoclasticus na forma de valncia mista (cdigo do PDB 1IRZ5). As cadeias de
aminocidos esto coloridas de acordo com a estrutura secundria, os hemos esto coloridos a
ndice
XXIII
preto e o io clcio a verde. Na representao da superfcie a colorao azul representa as partes
bsicas carregadas positivamente na superfcie da protena e a vermelha representa os resduos
acdicos negativamente carregados da superfcie da protena. As imagens da PCc (I) esto
rodadas 90 (II) sobre o eixo dos xx. A vizinhana do hemo E da PCc exposto ao solvente
(provvel local de interaco com o citocromo c) est circundada a preto na representao da
superfcie da enzima ou assinalado com uma seta na estrutura da protena.
Figura 5.5 Estrutura e superfcie de potencial electrosttico de (A) do citocromo c552 de Ma.
hydrocarbonoclasticus e (B) do citocromo c de cavalo. Na frmula estrutural a cor cinzenta
apresenta-se a estrutura secundria dos citocromos e os hemos esto coloridos a preto. Na
representao de potencial electrosttico os resduos carregados positivamente na superfcie da
protena tem a colorao azul e os resduos acdicos negativamente carregados da superfcie da
protena a cor vermelha. As imagens de cima e de baixo encontram-se na mesma disposio, a
representao I est rodada 90o (representao II) sobre o eixo dos YY. Circundada a preto est
a vizinhana do metilo exposto ao solvente.
Figura 5.6 A Distncia entre os hemos do citocromo c552 e o hemo de transferncia de electres
da peroxidase do citocromo c para as 50 melhores solues da simulao de atracamento entre o
dmero do citocromo c552 e o dmero da peroxidase do citocromo c de Ma.
hydrocarbonoclasticus na forma oxidada com (A) 300 contactos e com (B) 500 contactos. As
solues dentro das caixas, so as que apresentam simultaneamente uma posio de
classificao global e uma distncia reduzida entre os ferros hmicos (citoctomo c552 - hemo E).
Figura 5.7 Complexo de transferncia electrnica entre o dmero da PCc em valncia mista (A,
C e E) (ID-2827), ou oxidada (B, D e F) (ID- 3498 e ID- 1080) e dmero do citocromo c552.
Representao das quinhentas melhores solues para o atracamento molecular, encontradas
com 300 contactos, pelo critrio de classificao global (A, B), de hidrofobicidade (C, D) e
interaces electrostticas (E, F). As figuras foram preparadas usando o programa Chemera. As
hipotticas posies do centro molecular do dimero do citocromo c 552 esto representadas como
esferas, volta de estrutura da PCc. As esferas a vermelho so as que apresentam melhor
indexao na caracterstica referida, sendo as verdes as que apresentam pior indexao. As
posies que podero proporcionar a transferncia de electres esto circundadas a vermelho.
Os ies clcio esto coloridos a cor azul claro e os hemos da PCc a preto.
Figura 5.8 As estruturas das duas melhores solues de atracamento molecular entre o dmero
de PCc (A) na forma oxidada (ID 3498) e (B) na foram de valncia mista (ID-2827) e o dmero
do citocromo c552. A distncia entre o ferro hmico do hemo E (HE) da PCc em valncia mista e
o centro com ferro hmico do citocromo c552 na estrutura ID-2827 19 , sendo a distncia entre o hemo E da PCc na forma oxidada e o centro com ferro hmico do citocromo c552 na
estrutura ID-3498 de 19 . A estrutura da PCc apresenta-se com cor preta tal como os hemos, o citocromo apresenta-se com a cor vermelha tal como o hemo e o io clcio apresenta-se a azul.
As figuras foram preparadas utilizando o programa Chemera.
Figura 5.9 Complexo de transferncia electrnica entre o dmero da PCc na forma oxidada e o
citocromo c de cavalo, tendo em conta a classificao global (A), a hidrofobocidade (C) e as
interaces electrostticas (E) respectivamente e o dmero da PCc na forma de valncia mista e
o citocromo c de cavalo, tendo em conta a classificao global, a hidrofobocidade e as
interaces electrostticas (B), (D) e (F), respectivamente. Representao das quinhentas
melhores solues para o atracamento molecular encontradas com 300 contactos. Figuras
preparadas usando o programa Chemera. As hipotticas posies do centro molecular do
citocromo c de cavalo esto representadas como esferas. As esferas a vermelho so as que
apresentam melhor indexao na caracterstica referida, sendo as verdes as que apresentam pior
indexao.
ndice
XXIV
Figura 5.10 Representao melhor soluo para o complexo de transferncia electrnica entre
(A) o dmero da PCc na forma inactiva e o citocromo c de cavalo, tendo em conta a
classificao global, a hidrofobocidade e as interaces electrostticas (ID-1861) e (B) entre o
dmero da PCc na forma activa e o citocromo c de cavalo, tendo em conta a classificao global,
a hidrofobocidade e as interaces electrostticas (ID- 4318). Solues de atracamento
molecular obtidas com 300 contactos. Figuras preparadas usando o programa Chemera. O
citocromo c de cavalo est representado a vermelho e a PCc a preto. Os ies clcio esto
coloridos a azul claro.
ndice
XXV
NDICE DE TABELAS
Tabela 1.1 Potenciais formais de espcies reactivas de oxignio produzidas in vivo.
Tabela 1.2 Percentagem de sequncia de alinhamento idnticas1 das estruturas primrias
apresentadas na Figura 1.4
Tabela 1.3 Propriedades bioqumicas de peroxidase do citocromo c bacterianas periplsmicas.
Tabela 1.4 Propriedades espectroscpicas de peroxidase do citocromo c bacterianas.
Tabela 1.5 Condies de activao das peroxidases do citocromo c bacterianas.
Tabela 2.1 Composio do meio de cultura lquido, para o crescimento da bactria Ma.
hydrocarbonoclasticus 617. O pH do meio foi ajustado a 7,5 e o meio foi esterilizado numa
autoclave [70].
Tabela 2.2 Solues adicionadas ao meio de cultura lquido para o crescimento da bactria Ma.
hydrocarbonoclasticus. Estas solues foram preparadas e autoclavadas separadamente [70].
Tabela 2.3 Composio da soluo de oligoelementos de Starkey [216]. Esta soluo foi
esterilizada numa autoclave.
Tabela 2.4 Quantidade de nitrato de sdio e velocidade de agitao utilizadas em cada um dos
crescimentos realizados no microfermentador.
Tabela 2.5 Mediadores redox usados e o respectivo potencial de reduo a pH 7,0.
Tabela 3.1 Massa de clulas hmidas obtida de 10 L de cultura de Ma. hydrocarbonoclasticus e
quantidade de PCc purificada, utilizando diferentes concentraes de nitrato de sdio.
Tabela 3.2 Tabela de purificao da peroxidase do citocromo c e do citocromo c552 de Ma.
hydrocarbonoclasticus
Tabela 3.3 Variao da massa molecular aparente com a fora inica, Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5), [PCc] = 11,5M, [cit c552] = 10 M.
Tabela 3.4 Valores de g das ressonncias observadas nos espectros de RPE da PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus nas formas oxidada e de valncia mista.
Tabela 3.5 Valores de desvio qumico observado nos espectros de 1H-RMN de PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus
Tabela 3.6 Potenciais formais de PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus em tampo HEPES
(pH 7,5) 10 mM.
Tabela 3.7 Potenciais (Ep), correntes (ip) e largura de pico a meia altura () dos picos catdico
e andico dos voltamogramas cclicos de PCc a diferentes velocidades de varrimento.
Tabela 3.8 Diferena entre o potencial andico e o potencial catdico, Ep, razo ipa/ipc e a
mdia dos potenciais, a diferentes velocidades de varrimento dos voltamogramas cclicos.
ndice
XXVI
Tabela 3.9 Potencial dos dois sinais observados nos voltamogramas de impulso diferencial de
PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus em EGPF (primeiro varrimento).
Tabela 4.1 Correntes catdicas (ipc) e andicas (ipa), potenciais catdicos (Epc) e andicos (Epa) e
razo entre as correntes catdicas e andicas (ipc/ipa), dos voltamogramas cclicos do citocromo
c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus, 35 M, num EMGP.
Tabela 4.2 Razo entre as correntes catdicas e andicas (ipc/ipa), diferena de potenciais entre
os potenciais catdicos e andicos (Ep) e mdia (Epc+Epa)/2 dos voltamogramas cclicos do
citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus, 35 M, num EMGP para as diferentes
velocidades de varrimento.
Tabela 4.3 Variao das correntes catalticas e de k com a fora inica na catlise mediada a
pH 6,5.
Tabela 4.4 Potenciais catalticos, formal e correntes catalticas obtidas no estudo do efeito da
fora inica na catlise mediada entre a PCc e citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus a
pH 7,5.
Tabela 5.1 Variaes no desvio qumico de algumas ressonncias do citocromo c552 de Ma.
hydrocarbonoclasticus, induzidas pela formao do complexo.
Tabela 5.2 Anlise de atracamento molecular entre a PCc nas diferentes formas e os doadores
de electres, efectuado usando as 500 melhores das 5000 solues do algoritmo BiGGER.
Tabela 5.3 Parmetros das melhores solues de modelos de complexos obtidos pelo
atracamento do doador de electres (citocromo c) na Peroxidase do citocromo c de Ma.
hydrocarbonoclasticus usando o programa Chemera e o atracamento com o algoritmo BiGGER.
Tabela 5.4 Anlise de atracamento molecular entre a PCc nas diferentes formas e o citocromo c
de cavalo efectuado usando as 50 melhores das 5000 solues do algoritmo BiGGER.
Tabela 5.5 Parmetros das melhores solues de modelos de complexos obtidos pelo
atracamento da Peroxidase do citocromo c de Ma. hydrocarbonoclasticus com o citocromo c de
cavalo usando o programa Chemera e o atracamento molecular com o algoritmo BiGGER.
Tabela 6.1 Caractersticas espectroscpicas da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, pH 7,5.
ndice
XXVII
LISTA DE ABREVIATURAS
A.a. Aminocidos
Abs Absorvncia
ABTS 2,2-azino-bis(cido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico)
ADN cido desoxirribonucleico
ANR Regulador da arginina diaminase e nitrato reductase
AP Alto potencial
Asc ou asc Ascorbato de sdio
ATCC American Type Culture Collection
Cit Citocromo c
ccp Gene que codifica para as PCc
CNRS Centre National de la Recherche Scientifique
DAD Diaminodurol (2,3,5,6 tetrametil-p-fenileno-diamina)
Dsb Oxidoredutase dissulfureto
HE Hemo de transferncia electrnica
ERO Espcies reactivas de oxignio
EGPF Elctrodo de grafite piroltica com filme de protena
EGPM Elctrodo de grafite piroltica com membrana
FPLC Cromatografia lquida de elevado fluxo
FNR Regulador da reduo do fumarato e nitrato (fumarato reductase)
GP Grafite piroltica
1H-RMN Ressonncia magntica nuclear de proto
HEPES cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanossulfnico
H ou His Histidina
HTP Hidroxiapatite
HP Hemo peroxidctico
IUPAC-IUB Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada- Comisso de
Nomenclatura Bioqumica
MES cido 2-(N-morfolino)etanossulfnico
M ou Met Metionina
k Constante de velocidade para a reaco de transferncia de carga
KM Constante de Michaelis-Menten
Ka Constante de acidez
ndice
XXVIII
Kf Constante de formao
KD Constante de dissociao
OxyR Protena reguladora
PDB Protein Data Bank
PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida
PCc Peroxidase do cotocromo c
pI Ponto isolectrico
RPE Ressonncia paramagntica electrnica
SA Spin-alto
SB Spin-baixo
Sec Sistema de transporte de protenas atravs da membrana (Secretion)
SDS Dodecil sulfato de sdio
TEMED N, N, N,N-tetrametiletilenodiamina
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
TMBZ 3,3,5,5-tetrametilbenzidina
UV Ultra violeta
VC Voltametria cclica
VDP Voltametria de impulso diferencial
Microorganismos
Ec. Escherichia coli
Gs. Geobacter sulfurreducens
He. Herbaspirillum
Ma. Marinobacter
Mh. Marinobacter hydrocarbonoclasticus
Mc. Methlylococcus capsulatus
Mm. Methylomicrobium
Ne. Neisseria
Ni. Nitrosomonas europaea
Pad. Paracoccus denitrificans
Pp. Paracoccus pantotrophus
Ps. Pseudomonas sutzeri
Pa. Pseudomonas aeruginosa
Rb. Rhodobacter
Rc. Rhodobacter capsulatus
ndice
XXIX
Sa Salmomenlla
So. Shewanella oneidensis
Sw Shewanella
ndice
XXX
ndice
XXXI
LISTA DE SMBOLOS
A rea do elctrodo
B Campo magntco
P Baixo potencial
C, c Concentrao da espcie electroactiva no seio da soluo
Ce Centro de transferncia elctrnica
D Coeficiente de difuso
D0(R) Coeficiente de difuso da espcie oxidada (reduzida)
D Dalton
E Potencial
ENH Potencial normal de hidrognio
E0 Potencial formal
E1/2 Potencial de meia onda
Epc(a) Potencial do pico catdico (andico)
g Factor g
gmx g mximo
gmed g mdio
gmin g mnimo
i Corrente
id Corrente de difuso
ip Corrente de pico
ipc(a) Corrente do pico catdico (andico)
l Largura da celula
n Nmero de electres trocados
O Espcie oxidada
R Espcie reduzida
rpm Rotaes por minuto
t Tempo
T Temperatura
v Velocidade de varrimento
ndice
XXXII
V Volume da soluo de trabalho
Ep Diferena entre os potenciais dos picos andico e catdico
Ep,1/2 Largura total a meia altura do pico
Coeficiente de transferncia de carga
Desvio qumico
Absortividade molar
Constantes
F Constante de Faraday (96485 C mol.-1)
R Constante dos gases ideais (8,314 JK-1mol-1)
1
CAPTULO 1| INTRODUO
Captulo 1| Introduo
2
1.1 As espcies reactivas de oxignio e o stress oxidativo in vivo
Ao longo da evoluo, os organismos vivos tiveram que se adaptar ao aumento da
quantidade de dioxignio na atmosfera. Uma atmosfera primordial rica em vapor de gua,
dixido de carbono e dinitrognio deu origem a uma atmosfera rica em oxignio molecular [1].
Actualmente so conhecidos quatro processos biolgicos que geram dioxignio, a fotossntese, a
desintoxicao de espcies reactivas de oxignio (ERO), o metabolismo de reduo de
percloratos ou cloratos e a via metablica que converte xido nitroso em dinitrognio e
dixignio [2, 3]. Estes processos associados a processos qumicos contriburam para a
alterao da composio da atmosfera terrestre [1- 3].
A presena de dioxignio e a sua utilizao no metabolismo celular, origina ERO,
quando este no completamente reduzido a gua. A acumulao de ERO tem efeitos nocivos
nos organismos, quer procariticos quer eucariticos [4- 6] (equao 1.1).
+ 2H + H+
O2 O2 - H2O2 OH H2O (Eq. 1.1)
H2O
As fontes de ERO podem ser tanto de origem endgena como exgena [7- 9]. Isto ,
podem ser produzidas pela exposio a condies externas, como o aumento da presso de
dioxignio, incidncia de radiaes ionizantes (radiaes ), choque trmico, ou ainda pela
presena de metais pesados ou de oxidantes qumicos [10- 13]. Podem tambm ser produzidas
pelos organismos como resposta imunitria, ou serem sub produtos do metabolismo celular,
como o perxido de hidrognio [14, 15]. Algumas ERO podem ser sinalizadores de defesa
celular, mas em quantidades elevadas podem tambm causar a morte celular uma vez que
interagem com macromolculas de cidos nucleicos (ADN e ARN), protenas e lpidos [16- 20].
A peroxidao lipdica consiste na captura por um radical hidroxilo, de um tomo de
hidrognio de uma cadeia de um cido gordo, gerando um radical de cido gordo. Este radical
por sua vez pode reagir com o dioxignio presente no meio celular formando um novo radical
perxido, que poder reagir com outro cido gordo, ou com outras macromolculas, numa
reaco em cadeia. Quando a peroxidao lipdica ocorre nas membranas celulares, as
ERO podero no s atacar os lpidos, como tambm as protenas membranares,
induzindo ligaes cruzadas entre lpidos e entre estes e as protenas, alterando a rigidez, a
fluidez e a permeabilidade membranar bem como a actividade de enzimas ligadas membrana
[12, 14 e 20].
Os acares e as bases dos cidos nucleicos so igualmente atacados pelas ERO
originando rupturas nas cadeias de carbono, formando aductos entre as bases e os acares ou
Captulo 1| Introduo
3
ligaes cruzadas com outras molculas, o que impede a replicao e a transcrio [14, 19 e 20].
O radical hidroxilo, em particular, reage com o ADN, retirando um tomo de hidrognio do
grupo metilo da timina formando um radical alilo, ou quebrando as ligaes C-H do acar
formando radicais aductos com duas novas ligaes (C-OH). Tanto os radicais alil, como os
aductos sofrem reaces em cadeia que levam degradao da cadeia de ADN [15 ,16 e 20].
Algumas das reaces a que esto sujeitas as protenas quando interagem com ERO so
a oxidao de grupos sufidrilo, a reduo de dissulfeto, reaces com aldedos (produzidos por
exemplo durante a peroxidao lipdica) e a fragmentao de peptdeos, o que leva destruio
das protenas [15, 19 e 20].
Entre as espcies reactivas de oxignio produzidas intracelularmente, destaca-se, o
oxignio molecular singleto (O2*), o io superxido (O2-), o radical hidroxilo (HO), os radicais
perxilo (ROO), os radicais alcoxido (RO), o perxido de hidrognio (H2O2) bem como
outros perxidos orgnicos (ROOH) [21- 23]. As espcies reactivas de oxignio tm um poder
oxidante superior ao do oxignio molecular (Tabela 1.1), sendo por isso mais reactivas que este.
Tabela 1.1 Potenciais formais de espcies reactivas de oxignio
produzidas in vivo.
Par redox E0 (V)
Esp
cie
s R
eact
ivas
de
Ox
ign
io
HO, H+ / H2O
H2O2, 2H+ /2H2O
RO, H+ / ROH
ONOO-/ NO2
ROO, H+ / ROOH
H2O2, H+ /H2O, HO
O2, H+/ H2O2
O2 / O2-
+ 2,18
+ 1,76
+ 1,60
+ 1,40
+ 1,00
+ 0,71
+ 0,70
- 0,33
O radical hidroxilo, a ERO com maior poder oxidante (Tabela 1.1), tem um tempo de
vida curto (tempo de meia-vida de 10-9 s) e uma difuso celular limitada, pelo que os seus
efeitos nocivos so reduzidos [7, 24 e 25]. De entre as ERO mais abundantes in vivo destaca-se
ainda o io superxido, com um tempo de meia-vida de 10-6 s, e o perxido de hidrognio, com
um tempo de meia-vida de 10-5 s.
O io superxido (O2-) surge intracelularmente atravs de reaces como a de Haber-
Weiss (equao 1.2), onde ocorre a transferncia de um electro do catio Fe(II) para o
molcula de dioxignio [7- 11, 26 e 27].
Reaco de Haber-Weiss (Fe2+ + O2 Fe3+ + O2-) (Eq. 1.2)
Todos os organismos apresentam, no entanto, mecanismos de defesa das ERO, de forma
a proteger os seus componentes celulares de efeitos nocivos provocados por estas espcies,
mantendo os seus nveis intracelulares em concentraes baixas [7, 10- 12, 22 e 29]. Estes
mecanismos incluem a formao de substncias antioxidantes, como o cido ascrbico ou a
Captulo 1| Introduo
4
glutationa [12, 20] e a sntese de enzimas que catalisam a eliminao de espcies reactivas de
oxignio, como as dismutases do superxido, as catalases e as peroxidases [7, 16 e 17].
A eliminao do io superxido pelas dismutases do superxido um dos mecanismos
de defesa dos organismos contra as ERO (equao 1.3)
O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2 (Eq. 1.3)
O perxido de hidrognio uma espcie reactiva de oxignio no radicalar com origem
exgena e endgena, que se forma intracelularmente em condies de hipoxia, durante a
reaco de dismutao do io superxido (equao 1.3), pela auto-oxidao do quinol, que
produz radicais superxido que dismutam em perxido de hidrognio, ou ainda pela reduo do
oxignio por oxidases terminais no caso de bactrias [30-32]. Este composto, mesmo em
quantidades baixas, pode provocar o aumento da oxidao de tiis de protenas, a carbonilao
de protenas e a peroxidao lipdica [6, 23- 25], uma vez que um forte oxidante que, por
interaco com metais como Fe (II) e Cu (II), forma outras espcies reactivas de oxignio (HO)
[25- 27] (equao 1.4).
Reaco de Fenton (Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO+ OH-) (Eq. 1.4)
A proteco dos organismos vivos contra a acumulao de perxido de hidrognio
implica a sua remoo, tendo os organismos sistemas enzimticos que eliminam este composto.
As bactrias, por exemplo, apresentam dois tipos de enzimas capazes de catalisar a
reduo do perxido de hidrognio: as catalases e as peroxidases [28- 31]. As primeiras
interagem com substncias capazes de dispor de dois electres simultaneamente (equao 1.5),
j as peroxidases interagem com doadores de um s electro (equao 1.6).
2 H2O2 2 H2O + O2 (Eq. 1.5)
H2O2 + 2 H++ 2 Sred 2H2O + 2 Sox (Eq. 1.6)
(Sred substrato no estado reduzido, Sox substrato no estado oxidado)
As catalases catalisam a disproporcionao de H2O2 a gua (equao 1.5). No caso das
peroxidases bacterianas, estas reduzem o perxido de hidrognio a gua, oxidando diversos
substratos, que podem ser molculas orgnicas como o ascorbato ou a lenhina [28, 29], ou
protenas como o caso dos citocromos e das azurinas (que funcionam como doadores
fisiolgicos de electres) [33, 34 e 51], sendo classificadas de acordo com o substrato que usam
[35- 39] (equao 1.6).
As clulas eucariticas tambm apresentam estes dois sistemas de defesa. As catalases
citoplasmticas e as peroxidases eucariticas que esto localizadas no espao intermembranar
das mitocndrias e contm um nico hemo tipo b. A reaco global de reduo do perxido de
hidrognio a gua, pelas peroxidases eucariticas idntica das peroxidases bacterianas, mas
o mecanismo cataltico muito diferente [35].
Captulo 1| Introduo
5
1.2 As peroxidases do citocromo c bacterianas dihmicas
As peroxidases do citocromo c (PCc) dihmicas foram isoladas de diversos organismos,
tais como Pseudomonas (Ps.) aeruginosa [40- 44], Paracoccus (Pa.) pantotrophus [45- 53], Ps.
stutzeri [54- 58], Nitrosomonas (Ni.) europaea [59- 62], Rhodobacter (Rb.) capsulatus [63- 67],
Methylococcus (Me.) capsulatus [68, 69], Marinobacter (Ma.) hydrocarbonoclasticus [70, 71],
Neisseria (Ne.) gonorrhoeae [72, 73], Methylomicrobium (Mm.) lbum. BG8 [74], Geobacter
(Ge.) sulfurreducens [75- 76] e Shewanella (Sw.) oneidensis [77- 80]. As enzimas mais
estudadas so as que foram isoladas das bactrias Ps. aeruginosa e Pa. pantotrophus.
Estas enzimas so na sua maioria periplsmicas, sendo que em alguns casos podem estar
ligadas membrana celular, como acontece no caso da lipocitocromo c peroxidase de Ne.
gonorrhoeae [72] e de Herbaspirillum (He.) seropediceae [81], ou podem estar associadas
parede celular exposta ao periplasma, como no caso das bactrias metanotrficas Me. capsulatus
[68] e Mm. lbum BG8 [69]. Em Mm. lbum BG8 a PCc apresenta como caracterstica
particular, a sua dependncia da biodisponibilidade de io cobre (II).
Em alguns estudos verificou-se um aumento da sua expresso quando as bactrias esto
expostas a peroxinitrito, o que levou h hiptese das PCc estarem tambm envolvidas na
eliminao deste composto [76]. Foi tambm proposto por alguns autores que a PCc interfira na
oxidao de metilaminas [69].
1.2.1 Regulao da expresso gnica das peroxidases do citocromo c bacterianas
Em condies aerbias, as bactrias anaerbias facultativas, como bactria Ma.
hydrocarbonoclasticus, utilizam o oxignio molecular como aceitador final de electres devido
ao seu elevado potencial redox [7]. A alterao do metabolismo aerbio para anaerbio ocorre
quando a quantidade de oxignio no meio diminui e h um aceitador de electres alternativo,
como o io nitrato, sendo este processo acompanhado por represso dos genes ligados
respirao aerbia, enquanto os genes ligados respirao anaerbia so induzidos [82- 84].
Os genes fnr e anr codificam para os reguladores da transcrio FNR (regulador da
reduo do fumarato e nitrato) e ANR (regulador transcripcional anaerbio), respectivamente.
Estas protenas reguladoras esto envolvidas na mudana de metabolismo aerbio para o
anaerbio, controlam a expresso do gene ccp (que codifica para a peroxidase do citocromo c) e
dos genes nar e nir respectivamente. Estes ltimos codificam para protenas que esto
envolvidas na via de desnitrificao, como a NaR (reductase do nitrato) e a NiR (reductase do
nitrito) em condies de baixa tenso de dioxignio (condies de microaerofilia) [54, 68,
84- 98].
Captulo 1| Introduo
6
O gene da PCc expresso em condies aerbias e de microaerofilia e est presente
tanto em bactrias aerbias como estritamente anaerbias como a Ge. sulfurreducens [75, 82, 95
e 97]. Este gene est sob a aco de dois reguladores transcripcionais o FNR e o OxyR [99]. O
primeiro um regulador da activao induzido pelo oxignio e o segundo pelo perxido de
hidrognio [82, 85- 88].
i) O regulador da activao transcripcional FNR
O FNR um regulador transcripcional, produto do gene fnr, que regula um grande
nmero de genes em resposta a mudanas dos nveis de oxignio molecular. Este regulador na
forma activa e dimrica tem um domnio N-terminal com resduos cistena que coordena um
cluster do tipo [4Fe-4S]2+, sensvel ao oxignio que se liga entre dois monmeros. Na presena
de elevadas concentraes de oxignio, o centro [4Fe-4S]2+ (forma activa) sofre alteraes
estruturais e transforma-se num centro [2Fe-2S]2+ (forma inactiva) [84- 92].
A sequncia palindrmica de ADN reconhecida pelo FNR encontra-se na zona a
montante do local de incio da transcrio do gene ccp, sendo a sequncia de ADN do tipo
TTGAT-N4-ATCAA [82, 95, 96 e 98].
Em Ma. hydrocarbonoclasticus a sequncia palindrmica encontra-se, tal como
anteriormente referido, na zona a montante do local de incio da transcrio do gene ccp da PCc,
PCC-MauG (Figura 1.1) [100].
tttcttctgagcataactttataacctaaataaaagcgggagagcacggcttttctgcgc
gacgaaatgccgcagaaagatccacaaattgcagaccggaaccaaacttgatgaacatca
agttcagaaccaactctcgcgtttttgcgatgaaccacgctgccactctgttacgttgga
accagatggataccgagttgttctcaaaggagaaagcgacATGATCAAGCATCCACTGGC
AAAAGCACTCACCCTGAGCCTGGGCGTGGCAGCAGGTTCCGCCATGGCGGACAACCTGAT
GGAACGGGCCAACAGCATGTTCGAGCCCATTCCAAAATACCCACCGGTGATTGATGGCAA
TGAACTCACCCAGGCCAAGGTTGAACTGGGCAAGATGTTGTTCTTTGAACCGCGCCTGTC
TTCCAGCCACCTGATCAGCTGCAACACCTGCCACAACGTCGGGCTGGGCGGTGATGACGA
GCTGCCTACCTCTATCGGCCATGGCTGGCAGAAGGGTCCCCGGAACTCGCCGACGGTGTT
CAACGCCGTGTTTAACGCAGCCCAGTTCTGGGATGGCCGTGCCGCCGACCTGGCCGAACA
GGCCAAAGGGCCGGTACAGGCGGGTGTCGAGATGAGCAGTACGCCGGACCGGGTGGTGGC
TACCCTGAAGAGTATGCCGGAGTATATCGAGCGCTTTGAGGACGCATTCCCGGGCCAGGA
AAATCCGGTCACCTTCGACAATATGGCTGTTGCCATTGAAGCCTATGAAGCAACACTGAT
CACCCCGGAAGCACCTTTCGACAAATATCTGCGCGGAGACACCTCAGCGCTGAACGAGAG
TGAGAAAGAAGGTCTGGCGCTGTTCATGGACCGCGGCTGTACCGCCTGCCACAGTGGTGT
GAACCTCGGCGGTCAGAGCTACCATCCATTCGGGCTGGTTGCCAAGCCGGGTGCCGAGAT
CCTGCCAGAGGGCGATAAAGGCCGCTTCTCTGTCACCGAAACCGCGTCTGACGAGTATGT
GTTCCGCGCCTCTCCGCTGCGTAACATCGAGCTGACCGCGCCCTATTTCCACTCTGGCGC
CGTCTGGAGCCTGGAAGAAGCCGTTGCGGTGATGGGTACGGCCCAGCTGGGTACCGAGTT
GAACGACGATGAAGTGAAATCCATCGTCGCGTTCCTCAAGACGCTTACCGGCAATGTTCC
GGAAGTAACTTATCCGGTACTGCCACCAAGCACCGCCAATACGCCCAAGCCGGTGGACAT
GATCCCGTAAgtcacgggctctgcattcaccctcgaaggcgcgctttcccggcgcgcctt
Figura 1.1 Sequncia de ADN (NCBI Referncia da sequencia: NC-017067.1) do gene ccp-MauG
(VIMSS3521861: Maqu-0372 citocromo c peroxidase 349 a.a.) da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus
(140 bases a montante, 1050 pares de base (gene ccp a negrito), 50 bases a jusante do gene ccp-Maug),
onde se destaca a sequncia de bases nuclecas reconhecida pelo regulador da transcripo FNR (dados
retirados de www.microbesonline.org, acedido a 1 de Fevereiro 2013).
http://www.microbesonline.org/
Captulo 1| Introduo
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Em Pa. pantotrophus [83, 84 e 96], Ps. aeruginosa [93, 94], Ne. gonorrhoeae [91, 92] e
Ps. stutzeri [54] verificou-se que o FNR regula no s a expresso do gene ccp [29, 95 e 97] em
resposta privao de dioxignio [54, 95] mas tambm de vrios genes envolvidos na
desnitrificao. Em estudos com mutantes no gene fnrP em Pa. denitrificans, verificou-se que a
expresso da peroxidase do citocromo c (PCc) muito reduzida pelo que se props que, o
FNRP controle a expresso desta protena [96].
ii) O regulador da activao transcripcional OxyR
Em Ps. aeruginosa, Salmonella (Sa) typhimurium e Escherichia (Ec.) coli, o OxyR
tambm um regulador da transcrio do gene ccp, que codifica para a PCc e para a catalase, na
presena de perxido de hidrognio [101- 106]. Em Ps. aeruginosa o gene oxyR que codifica
para o regulador OxyR, localiza-se no opero com o gene recG [107]. Este gene em resposta a
alteraes dos nveis de perxido de oxignio, induz a transcrio de OxyR.
Cada molcula de OxyR apresenta dois domnios que contm duas cistenas, que se
localizam na interface dos dois dmeros que formam um tetrmero [108- 110]. A sequncia
palindrmica reconhecida pelo OxyR, e qual se liga no ADN, consiste em quatro grupos de 4
bases (ATAG) espaados por 10 pares de bases em Ps. aeruginosa [111, 112]. As formas
oxidada e reduzida deste factor transcripcional contactam em diferentes locais no ADN, uma
vez que nos dois locais activos de reduo e oxidao as cistenas esto em posies diferentes,
resultando em alterao estrutural no domnio regulador [102, 109].
1.2.2 Regulao gentica de peroxidases do citocromo c nas bactrias gram-negativas
As protenas periplsmicas bacterianas, como a PCc, so sintetizadas no citoplasma e
depois transportadas para o periplasma, atravs da membrana citoplasmtica [113, 114]. Em
bactrias gram-negativas com a Pa. denitrificans [115, 116] e Rb. capsulatus [117] a
translocao do apo-citocromo linear faz-se atravs do sistema secretor SecYEG (sistema de
secreo constitudo por protenas translocadoras), j o hemo transportado pelo sistema
CcmABCDGEF (sistema de maturao de citocromos c) [118, 119].
Para a translocao atravs da membrana citoplasmtica, a pr-apo-protena utiliza o
sistema de sinalizao constitudo por um peptdeo-sinal adjacente ao N-terminal da cadeia
polipeptdica, que permite ao sistema de transporte membranar (SecYEG) reconhecer e
translocar para o periplasma a pr-apo-protena. Aps o transporte da pr-apo-protena para o
periplasma, o pptideo-sinal removido por clivagem por aco de uma peptidase-sinal,
formando a apo-protena (Figura 1.2) [115- 119].
Captulo 1| Introduo
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Figura 1.2 Esquema da organizao do sistema de maturao de citocromos tipo c (Ccm) na membrana
citoplasmtica e da translocao do hemos em bactrias Gram-negativas [112, 113]. O pr-apo-citocromo
transferido do citoplasma para o periplasma translocador SecYEG (sistema de transporte secretor) e o
grupo hemo pelo sistema de transporte complexo CcmABC, CcmD e CcmE. A incorporao do hemo no
apo-citocromo ocorre em CcmF, usando electres transferidos pela protena transmembranar DsbD
(oxidoreductase dissulfureto). Os sistemas CcmG e CcmH libertam o citocromo para o periplasma [112,
113 e 119]. O sistema de maturao de citocromo tipo c, Ccm, constitudo por protenas membranares
ou que esto ligadas membrana (CcmABCDEFGH e DsbD). As setas so caminhos do sistema de
maturao (Figura adaptada da referncia 113, 114 e 119).
Na PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, o peptdeo-sinal composto pelos primeiros
resduos que apresentam caractersticas de peptdeo-sinal (peptdeo hidrofbico localizado no
extremo N da cadeia polipetdica) e so reconhecidos pelo sistema secretor SecYEG. Este
peptdeo sinal inicia-se no primeiro aminocido (metionina) terminando no aminocido 23,
sendo o domnio da apo-protena PCc do aminocido 24 ao 289 (previso obtida em
http//www.signalP.4.1) (Figura 1.3) [120].
MIKHPLAKALTLSLGVAAGSAMADNLMERANSMFEPIPKYPPVIDGNELTQAKVELGKML
FFEPRLSSSHLISCNTCHNVGLGGDDELPTSIGHGWQKGPRNSPTVFNAVFNAAQFWDGR
AADLAEQAKGPVQAGVEMSSTPDRVVATLKSMPEYIERFEDAFPGQENPVTFDNMAVAIE
AYEATLITPEAPFDKYLRGDTSALNESEKEGLALFMDRGCTACHSGVNLGGQSYHPFGLV
AKPGAEILPEGDKGRFSVTETASDEYVFRASPLRNIELTAPYFHSGAVWSLEEAVAVMGT
AQLGTELNDDEVKSIVAFLKTLTGNVPEVTYPVLPPSTANTPKPVDMIP
Figura 1.3 Sequncia de aminocidos da PCc de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840,
onde se destaca o peptdeo-sinal (caixa cinzenta). Previso obtida em http//www.signalP.4.1 [120].
Captulo 1| Introduo
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1.2.3 Alinhamento da sequncia primria de peroxidases do citocromo c dihmicas
O alinhamento da sequncia primria das PCc cuja estrutura terciria conhecida,
evidncia uma grande homologia estrutural entre estas enzimas. Na Figura 1.4 apresenta-se o
alinhamento da sequncia primria de algumas PCc bacterianas, onde se destacam a cinzento os
aminocidos conservados e a vermelho os semi-conservados, bem como os hemos e os Loop,
que sero seguidamente descritos.
Hemo P Loop 1
Pp 56 LGKVLFFDPRMSSSGLI SCQTCH NVGLGGVDGL PTSIGHGWQKGPRN EPTMLNA 104
Mh 33 LGKMLFFEPRLSSSHLI SCNTCH NVGLGGDDEL PTSIGHGWQKGPRN SPTVFNA 81
Pa 33 LGKKLFFDPRLSRSHVL SCNTCH NVGTGGADNV PTSVGHGWQKGPRN SPTVFNA 81
Rc 47 LGKALFFDPRMSKSGVF SCOSCH NVGLGGVDGL ETSIGHGWQKGPRN EPTALNA 95
Ps 40 LGHKLWFDPRLSSSHVI SCNTCH NLSIGGSDNV PTSIGHGWQKGPRN SPTVLNA 88
Gs 59 LFFDPRLSRSHVL SCNTCH NVGLGGGDLA ATSTGHGWQKGPRN EPTVLNS 107
So 46 LFFEPRLSKSGFI SCNSCH NLSTGGVDAL PTSIGHHWQEGPIN SPTVLNA 94
Ne 47 LGKMLFFDPRLSKSGFI SCNSCH NLSMGGTDNI TTSIGHKWQQGPIN EPTVLNS 95
Loop 2
Pp 105 IFN AAQFWDGRAADLAEQAKGPVQAGSEMS NTPDQVVKTINSMPEYVEAFKKAFPEEADPVTFDNFAAAI 170
Mh 82 VFN AAQFWDGRAADLAEQAKGPVQAGVEMS STPDRVVATLKSMPEYIERFEDAFPGQENPVTFDNMAVAI 147
Pa 82 VFN AAQFWDGRAKDLGEQAKGPIQNSVEMH STPOLVEOTLGSIPEYVDAFRKAFPKAGKPVSFDNMALAI 147
Rc 96 VFN VAQFWDGRAEDLAAQAKGPVQAGVEMN NTPENLVATVQSMPGYVEAFAKAFPGQKDPISFDNFALAV 161
Ps 88 VFN AAQFWDGRAKDLQEQAKGPVQASVEMN STPERVVSTLQSIPEYAAEFKKAFPNDKEPVSFDNMAYAL 156
Gs 108 VFN TAQFWDGRAKDLAEQAKGPVQASVEMN NTPDQVVKTLNSIPDYVALFKKAFPGEKDPVTFDNMAKAI 173
So 95 DFM LAQFWDGRASNLKEQAAGPIANPKEMG FTHELATETIASMPAYRARFAKVYGDEKVDIFDRLTDAI 160
Ne 96 SMN LAQFWDGRAKDLKEQAAGPIANPKEMA STHEIAEKVVASMPQYRERFKKVFGSDEVTIIDRITTAI 161
Hemo E
Pp 171 EQFEATLITPNSAFDRFLAGDDAAMTDQEKRGLOAFMETG CTACH YGVNFGGQD 233
Mh 148 EAYEATLITPEEAFDKYLRGDTSALNESEKEGLALFMDRG CTACH SGVNLGGQN 210
Pa 148 EAYEATLVTPDSPFDLYLKGDDKALDAQQKKGLKAFMDSG CSACH NGINLGGQA 210
Rc 162 EAFEATLITPNSKFDQWLMGADGAMSADEKAGLKLFIDTG CAACH NGINIGGNG 224
Ps 157 EAFEVSLTTPNSPFDRFLKGEDGALDDKQKQGLALFMDAG CSSCH NGVNLGGQG 210
Gs 174 EVFEATLITPDSPFDQYLKGKKKALDGKQTAGLKLFLGKG CVACH GGLNLGGTG 236
So 161 AAFEKTLVTPNSPFDQYLLGKQDAISGDAKAGYQLFKAKG CVSCH NGPAVGGTM 223
Ne 162 AQFEETLVTPGSKFDKWLEGDKNALNODELEGYNLFKGSG CVQCH NGPAVGGSS 224
loop 3
Pp 234 YHPFGLIAKPGAEVLPAGDTGRFEVTRTTDDEYVF RAAPLRNVALTAPYFHSGVVWELAEAVKIMS 299
Mh 211 YYPFGLVAKPGAEILPEGDKGRFSVTETASDEYVF RASPLRNIELTAPYFHSGAVWSLEEAVAVMG 276
Pa 211 YFPFGLVKKPDASVLPSGDKGRFAVTKTQSDEYVF RAAPLRNVALTAPYFHSGQVWELKDAVAIMG 276
Rc 225 YYPFGVVEKPGAEVLPAGDKGRFAVTATADDEYVG RAGPLRNIALTAPYFHSGKVWDLREAVSVMA 290
Ps 211 YFPFGVIKKPGAEVLPTGDKGRFAVTNTASDEYVF RAAPLRNVALTPPYFHSGEVWELEQAVAIMG 276
Gs 237 YFPFGVVEKPAENILPLGDKGRFAVTNTAKDEYVF RAPSLRNVAITYPYFHSGVVWSLKEAVAVMG 302
So 224 FMKMGLIK-PFHTNNPAETGRKGVTGKDADKFVF KVPTLRNIELTYPYFHDGSVWTLEEAVNTMA 289
Ne 225 YQKMGVFK-PYETKNPAATGRMDVTGNEADRNVF KVPTLRNIELTYPYFHDGGAATLEQAVETMG 290
Figura 1.4 Alinhamento da sequncia primria das peroxidases do citocromo c bacterianas mais
estudadas: Pa, Ps. aeruginosa, Pp, Pa. pantotrophus, Mh, Ma. hydrocabonoclasticus, Ps, Ps. stutzeri, Rc,
Rb. capsulatus, Gs, Gb. sulfurreducens, So, Sw. oneidensis e Ne Ni. europaea. Os aminocidos ligados
aos hemos (CXXCH) esto indicados como hemo E (C-terminal) e hemo P (N-terminal). A cor cinzenta
esto assinalados os aminocidos conservados e a vermelho os semi-conservados. () Ligandos H
(histidina) e M (metionina) ao ferro hmico, () resduos de cistena covalentemente ligados ao hemo,
() ligandos do io clcio. Figura adaptada das referncias [65, 71, 75, 77 e 97].
Observando a Figura 1.4 possvel constatar que os resduos conservados localizam-se
nas proximidades dos hemos e nos loops, verificando-se uma diminuio de resduos
conservados entre a PCc de Ni. europeae e de Pa. pantotrophus. Pelas sequncias de
Captulo 1| Introduo
10
alinhamento da estrutura primria possvel determinar a percentagem de sequncias de
resduos comuns (Tabela 1.2)
Tabela 1.2 Percentagem de sequncia de alinhamento idnticas1
das estruturas primrias apresentadas na Figura 1.4
Bactrias Ma. hydrocarbonoclasticus Ni. europaea
Pa. pantotrophus 73 % 46 %
Ps. aeruginosa 72 % 43 %
Rb. capsulatus 69 % 46 %
Ps. stutzeri 71 % 48 %
Gb. sulfurreducens 67 % 45 %
Sw. oneidensis 49 % 65 %
Ni. europaea 50 % 100% (1 http://proteinstructures.com/Sequence/Sequence/sequence-alignment.html).
Pelos resultados apresentados na Tabela 1.2, confirma-se uma elevada percentagem de
identidade, ou seja elevada similaridade nas sequncias de aminocidos, entre a estrutura
primria da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus, da PCc de Pa. pantotrophus (73 %), da PCc de
Ps. aeruginosa (72 %) e da PCc de Rb. capsulatus (69 %). Comparando as sequncias de
resduos idnticas da PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus junto dos hemos e loops, podemos
verificar que esta semelhana aumenta, sendo de 87 % para Pa. pantotrophus e de 80% para Ps.
aeruginosa mas somente de 53% para Ni. europaea.
A percentagem de sequncias idnticas entre a PCc de Sw. oneidensis e de Ni. europaea
de 60 %, mas somente de 44% entre a PCc de Sw. oneidensis e de Ps. aeruginosa [77, 97].
Verifica-se que, por exemplo, a homologia estrutural entre a PCc de Ma.
hydrocarbonoclasticus e a PCc de Ps aeruginosa, considerando resduos semelhantes, de
80 % e que entre PCc de Ma. hydrocarbonoclasticus e a PCc de Ni. europaea de 73% [71,
97]. Estes valores de homologia, revelam uma elevada percentagem de sequncias semelhantes
de aminocidos e predizem estruturas tercirias semelhantes.
1.2.4 Estrutura das peroxidases do citocromo c dihmicas
As PCc so dmeros cuja estrutura terciria est organizada em dois domnios, cada um
contendo um hemo tipo-c. Estudos espectroscpicos revelaram que estes dois hemos no so
equivalentes, o que se reflecte nos seus diferentes papis na activao e na catlise enzimtica
[42, 121- 123]. O hemo peroxidctico (hemo P) encontra-se no domnio N-terminal e apresenta
uma coordenao axial bis-histidina. O outro hemo (hemo E), encontra-se no domnio C-
terminal e tem como ligandos axiais uma metionina e uma his