Universidade Federal de Santa CatarinaCentro de Ciências Biológicas

PPG Neurociências – Neuroquímica IProfº Roberto Baine Leal

Tatiani de S. Barbosa

O MPTP é uma potente neurotoxina com efeitos neurotóxicos em neurônios dopaminérgicos nigroestriatais (IRWIN e LANGSTON, 1985, OGAWA et al., 1987), produzindo disfunções cognitivas comparáveis às observadas na DP.

Introdução

Disfunções motoras devido a devido a perda progressiva de células dopaminérgicas no SNpC:TremoresRigidezAscinesiaHiposcinesiaBradiscinesia

A descoberta deste composto foi

fundamental para a compreensão dos mecanismos que

conduzem à neurodegeneração

dopaminérgica (Przedborski et al.,

2001). Assim, depois de uma

administração sistemica de MPTP

(molécula altamente lipofílica), este

atravessa, facilmente, a

barreira hemato-encefálica (BHE)

- Embora a MAO-B das células gliais parece ser a principal enzima envolvida na bioativação de MPTP, o citocromo P450 2D6 (CYP2D6), localizado nos neurônios dopaminérgicos da substância nigra, parece desempenhar uma atividade importante na determinação da toxicidade MPTP.

- A CYP2D6 está predominantemente localizada na membrana microssomal de fracções do fígado, cérebro e outros tecidos periféricos. Vários estudos têm sugerido concordância entre o polimorfismo do gene CYP2D6 e a incidência da doença de Parkinson

Cytochrome P450, family 2, subfamily D, polypeptide 6

Demonstrar que mitocôndrias marcadas com CYP2D6 podem catalizar o metabolismo de

MPTP em MPP+

Objetivos

Resultados

Oxidação Mitocondrial do MPTP em MPP+ tóxico

Verificação da atividade da MAO em mitocôndrias em células COS 7 em comparação com mitocôndrias cerebrais. Verificou-se que a atividade da MAO total foi maior nas mitocôndrias cerebrais (4 vezes maior que nas mitocôndrias em células COS-7). Atividade da MAO A (inibição por clorgilina) nas mitocôndrias em células COS, foi 5 vezes maior que a atividade da MAO B (inibição por deprenil)

A análise imunoquímica do lisado total de células, demonstrou que a proteína CYP2D6 foi induzida por Dox apenas nas células transduzidas com WT CYP2D6 cDNA.

Extrato celular a partir de COS-7 expressando WT CYP2D6 tratados com e sem Doxiciclina (para induzir CYP2d6)

Ensaio de integração de membrana no ret. endoplasmático pancreático canino. Houve avaliação da afinidade de SRP (partícula recombinante) para o WT. T= produto total do ensaio M= fração proteínas ligadas ao RE da membrana que foram re - isoladas e lavadas.

Aprox 25% de WT CYP2D6 foi marcada para mitocondria

Ambas construções mutantes -SRP e +SRP exibiram um nível mais baixo de expressão de CYP2D6 do que WT, embora o +SRP mutante foi preferencialmente marcado para microssomos, e –SRP mutante foi preferencialmente marcado para mitocondria.

Estes resultados suportam a hipótese que a eficiência de ligação de SRP é um fator limitante na marcação de novas cadeias para microssomos e mitocôndria.

Formação de MPP+ em mitocôndria isolada

- Alto nível de de MPP+ tóxico

- Não foi inibido pelo controle ascite

- Houve inibição (65%) pelo anticorpo específico

- A atividade foi inibida pelo inibidor específico de cyp2d, a quinidina, além disso sugerindo que muita da atividade metabólica foi devido ao cyp2d6.

Oxidação do MPTP por CYP2D6 purificado

A) - Houve maior oxidação do MPTP em MPP+, na presença de CYP2D6 e ADX/ADR

- Na presença de Quinidina e do anticorpo inibitório houve inibição da atividade daDa CYP2D6

Oxidação do MPTP por CYP2D6 purificado

B) Deprenil (inibidor da CYP2D6) em maior

concentração, inibiu a oxidação do MPTP.

C,D) Deprenil em concentrações aumentadas, também inibiu a atividade

de hidroxilação do bufuralol dos microssomos, e da

CYP2D6 purificada

A inibição da atividade da CYP2D6 por Deprenil não é restrita a apenas

um substrato. Embora não mostrado, Pargilina também inibe a

CYP2D6 atividade dependente.

Os resultados demonstram que CYPD2D6 pode oxidar eficientemente MPTP em MPP+ em um “ Adx/Adr-

supported system”

Padrão Respiratório das células Neuro- 2 A expressando várias formas de CYP2D6

Os níveis de proteínas mitocondriais em WT e +SRP CYP2D6, foram significativamente maiores do que os que foram demonstrados no sistema lentiviral

induzível (Fig 1)

Esta diferença pode ser devido a expressão

constitutiva no sistema retroviral

B) Os níveis do marcador gênico (mRNA) para puromicina acetiltransferase foi identificado, sugerindo um nível similar de expressão.

C) Os níveis de vetor de DNA integrado foram quase iguais, sugerindo um nível similar de integração genômica e possível expressão.

- A análise do padrão respiratório mostrou que o OCR basal, produção de ATP e respiração máxima, foram aumentadas em +SRP se comparadas com WT- O vazamento de prótons para OCR, foi aproximadamente igual em WT. Todos estes parâmetros foram significativamente baixos em – SRP2D6.- A adição de MPTP inibiu OCR basal, produção de ATP e OCR máximo em todas as células, embora o vazamento de prótons tenha sido aumentado pela adição de MPTP principalmente em –SRP 2D6.

Atividade metabólica do WT e CYP2D6 mutante.

- Altos níveis de MPDP (7,6 nmol/mg de ptna) e MPP+ (1,3 nmol/mg de ptna) foram encontrados em –SRP 2D6

- Estes valores parecem estar próximos dos níveis de metabólitos formados nas mitocondrias cerebrais de ratos, o qual demonstrou valores altos.

Conteúdo de Citocromo P450 e atividade metabólica mitocondrial e microssomal em células Neuro 2 A.

Para +SRP CYP2D6: o conteúdo mitcondrial foi aprox 0,27 nmol/mg, microssomal 0,95 nmol/mg

Para –SRP CYP2D6: o conteúdo mitocondrial foi 0,99 nmol/mg, e valores microssomais próximos dos valores para “mock-transfected cells”.

B) Valores quase idênticos do número de turnover para hidroxilação do bufurolol;

C) Enzimas mitocondriais a partir de WT2D6 e –SRP , apresentaram turnover comparável para formação de MPP-

“A diferença na atividade das enzimas mitocondriais contra as microssomais para o metabolismo MPTP é em grande parte devido à diferença entre as proteínas transportadoras de elétrons, ao invés de mutações direcionadas para os domínios de sinal N-terminal.”

Efeitos do MPTP na atividade do complexo I e produção de ROS em células Neuro 2 A.

A) Houve níveis aumentados de produção de ROS para todas as linhagens celulares, a adição de MPTP induziu esta produção. Estes dados são consistentes vários estudos que sugerem o efeito inibitório de MPTP na respiração mitocondrial.

B) Experimento controle, tratamento com peróxido dismutase, resultados sugerem que estas células produzem altos níveis de O2. A presença de catalase diminui o sinal de fluorescência.

Os níveis da produção ROS em células –SRP 2D6, foram atenuados na presença de quinidina, o que confirma o papel da mitocôndria marcada com CYP2D6 na indução do MPTP para produção de ROS .

Inibição da atividade do complexo I, em neurônios diferenciados e indiferenciados.

MPTP inibiu a atividade do complexo I em células “mock-tranfected” apenas marginalmete, embora a inibição tenha sido mais notável (45%) em -SRP

A inibição MPTP mediada, foi alta em –SRP, moderadamente alta em WT e não foi visível em +SRP

C) A inibição do complexo I foi alta em células Neuro 2 A diferenciadas ( aprox 50%)

D) Quinidina e Deprenil resturaram a inibição por MPTP.

A atividade da MAO foi determinada na mitocondria a partir de células fígado de rato, células C6 e células Neuro 2 A.

Na presença do inibidor a atividade foi diminuída.

i,iii) Houve diferenciação em mock transfected e - SRP em resposta a adição de cAMP e não de MPTPii) A adição de MPTP afetou a diferenciação das mock transfected cells.iv) Diferenciação atenuada em resposta a adição de MPTP

“O metabolismo de MPTP pela mitocondria marcada com CYP2D6 afeta a diferenciação neuronal.”

TH: é um marcador para diferenciação de neurônios dopaminérgicos

i) Tratamento de MPTP em células MOCK, reduz os níveis de TH, o qual não foi aumentado pelo tratamento com quinidina

ii) Quantificação do imonoblot

Efeitos do MPTP na localização mitocondrial de “marcador de autofagia” Parkin

- Tratamento com MPTP de células mock tranfected, produziu aumento marginal na localização mitocondrial de Parkin (i)

- o que não foi alterado pelo tratamento do inibidor de quinidina CYP2D (iii)

- Em – SRP 2D6, o tratamento com MPTP aumentou a marcação da localização mitocondrial da Parkin (ii)

- o qual foi substancialmente reduzido pelo tratamento com quinidina (iii)

Estes resultados demonstraram que a atividade metabólica da CYP2D6 é crítica para o recrutamento de Parkin MPTP induzido, do compartimento mitocondrial.

Efeitos do MPTP na indução de Drp-1, um marcador de de fissão mitocondrial

- Os níveis de Drp-1 mitocondrial no controle de células mock tranfected foram relativamente baixo (i)

- Houve aumento pelo tratamento com MPTP (ii)- Não houve efeito no tratamento com quinidina

- Células –SRP CYP2D6 também demonstraram quantidade baixa de Drp-1 (i)

- Houve aumento com tratamento com MPTP (ii)- Tratamento com quinidina reduziu os níveis de DRP-1

Efeito do tratamento com MPTP em neurônios primários em cérebro de camundongos

A) Houve morte celular em aproximadamente 15% das células, no controle de células não tratadas

B) Após o tratamento com MPTP , a quantidade de morte celular aumentou para aprox. 25%

C) O inibidor da CYP2D6 (quinidina), reduziu a morte celular em 25%, sugerindo que a CYPD6 mitocondrial desempenha algum papel na morte celular induzida por MPTP

i , ii) Neurônios dopaminérgicos TH positivo, expressando CYP2D6

iii) Tripla coloração de neurônios dopaminérgicos com anticorpo CYP2D6 (vermelho), anticorpo TH (azul) e Mitotracker green.

Parece que neurônios TH expressam CYP2D6.

Localização de CYP2D6 mitocondrial em neurônios dopaminérgicos primários.

Efeitos do MPTP em neurônios primários dopaminérgicos

A) Neurônios dopaminérgicos “TH-Stained” sem tratamento.

B) Neurônios tratados com MPTP, demonstrando que o crescimento axonal foi prejudicado.

C) MPTP +QuinidinaD) MPTP + PargilinaE) MPTP + Deprenil

Os inibidores demonstraram um papel protetor?

De maneira geral, os resultados demonstraram

- Controle respiratório celular alterado;

- Aumento dos níveis da produção de ROS

- Inibição do complexo I nas CYP2D6 mitocondriais, em resposta a adição de MPTP

- O metabolismo de MPTP pela mitocondria marcada com CYP2D6 afeta a diferenciação neuronal.

- A CYP2D6 pode oxidar eficientemente MPTP.

OBRIGADA!!