técnicas de separação cromatográficas cromatografia de

Técnicas de Separação Cromatográficas

Cromatografia de exclusão molecular

Métodos Instrumentais de Análise: 2012-2013

Sumário

• Princípios básicos

• Mecanismo de separação

• Normalização do comportamento de eluição

• Curvas de selectividade

• Propriedades dos géis

• Aplicações

• Cuidados práticos

Tipos de cromatografia: Exclusão Molecular

• moléculas com pequenas dimensões permite distinguir diferenças de

Mr na ordem dos 10%;

• macromoléculas tem de ocorrer uma variação de cerca de 2 x na Mr

para ocorrer separação

• técnica usada para separar

moléculas tendo por base

diferenças nos seus

tamanhos (volumes

hidrodinâmicos)

Tipos de cromatografia: Exclusão Molecular

outras designações: Filtração em Gel; Crivagem molecular

Designação Área Fase

estacionária

Fase

móvel

Compostos a

separar

Exclusão

Molecular

ou Filtração

em Gel

Bioquímica Hidrófila

Aquosa

Biomoléculas

Permeação

em Gel

Química Hidrófoba Solventes

orgânicos

Polímeros

Cromatografia de Exclusão Molecular ou Filtração Gel:

Princípios Básicos

Scanning electron micrograph

of an agarose gel.

Magnification x 50,000.

http://www.chromatography.amershamb

iosciences.com/aptrix/

Difusão

Partícula

de gel

Gel com rede porosa tridimensional preparado sob a

forma de grânulos ou partículas esféricas Fase

estacionária

Fase móvel Eluente que atravessa a coluna

As proteínas apresentam

formas e tamanhos muito

variáveis

Proteína Massa

subunidade

(kDa)

Nº

subunidades

Ribonuclease

(pâncreas bovino)

13 .7 1

Lisozima (clara do

ovo de galinha)

14.3 1

Mioglobina (coração

de cavalo)

16.9 1

Hemoglobina

(eritrócitos de coelho)

16.0 4

Álcool

desidrogenase

(levedura)

35.0 4

Catalase

(fígado de vaca)

57.5 4

-galactosidase

(E. Coli)

130.0 4

Aspartato

transcarbamoílase

(ATCase) (E. Coli)

C - 34 kDa

R - 17kDa

12

(C6R6 )

Mecanismo de separação

• tem por base o tamanho (massa molecular relativa) e a forma das

moléculas (depende do seu raio de Stokes), utilizando as propriedades

de crivo molecular da fase estacionária

Molécula

esférica

raio de

Stokes é o raio da esfera

descrito pela rotação da

molécula ao longo do

seu eixo longo

MW 50 kDa MW 50 kDa MW 50 kDa

o raio de Stokes de uma proteína

aumenta à medida que esta assume uma

forma mais alongada (desviando-se de

uma forma globular), para a mesma MM

e densidade de empacotamento

Cromatografia de Exclusão Molecular ou Filtração Gel:

Princípios Básicos

Voet, B

iochem

istr

y, 3

e

Caracterização das colunas de exclusão molecular

vt – volume total do leito do gel na coluna

vo – volume morto da coluna (~ 35% vt)

volume de eluente exterior ao gel

vi - volume de eluente no interior do gel

vg – volume ocupado pela matriz do gel

vt = vo + vi + vg

h

r

hrv 2t

r – raio da coluna

h – altura de gel na coluna

vt vo vi vt - vo = vg + vi

b c a

Permeação

Fase estacionária

Exclusão

Fase móvel

Mecanismo de separação

Composto Comportamento Volume de eluição

moléculas com dimensões

superiores aos poros do gel (a)

passam todo o tempo na fase móvel:

são as 1as a serem eluídas ve = vo

moléculas com dimensões da

ordem dos poros do gel (b)

penetram apenas numa fracção dos

poros: são fraccionadas pelo gel vo < ve < vo +

vi

moléculas com dimensões

inferiores aos poros do gel (c)

têm acesso livre a todo o eluente

presente no interior dos poros:

são as últimas a serem eluídas

ve = vo + vi

Difusão

O volume de eluição de um componente depende das características da coluna (vt e empacotamento)

Parâmetros de distribuição

Coeficiente de distribuição, Kd - fracção da fase líquida estacionária

acessível a um componente

i

oed

v

vvK

Ve –V0 - volume da fase liquída

estacionária acessível a um componente

Vi - Volume da fase líquida estacionária no

interior dos poros dos grânulos

Ve = V0 + KdVi Expressão clássica do volume de eluição ou retenção

0 ≤ Kd ≤ 1 Ve = V0 (soluto completamente excluído Kd = 0

Ve = V0 + Vi (soluto com retenção máxima) Kd = 1

Constante de distribuição Kav

Vt - vol. total da coluna

• Vi - difícil de determinar

• Substitui-se Vi por Vt - Vo

• Vt - Vo inclui o vol. da matriz do gel (Vm)

• Vt - Vo = Vi + Vm

Vo Vt-Vo Vt

Kav = Ve - Vo

Vt - Vo

• Determinação de Ve e Vo

Perfil de eluição do azul dextrano 2 000 (fracções 4 e 5)

e do azul de bromofenol (fracções 24 a 56) em

Sephadex G 25

Cromatografia de Exclusão Molecular

MM do azul dextrano 2 000 2 000 000

Da

Curvas de Calibração


Para cada gel e numa gama de MM de uma série homóloga de solutos

relação linear entre Kav e Ve e o log MM dos solutos

Tempo (horas)

Ab

s.

(206 n

m)

Vo

lum

e

elu

ição

(m

l)

Log MMR

Cada gel é designado pelo limite de exclusão das MM

Ex: Sephadex G200 limite de exclusão de 200 000

A escolha do gel é feita de modo a que os componentes fiquem compreendidos na

zona linear da curva

Massa molecular

Kav

Sephadex do tipo G


Propriedades dos géis

Características ideais

disponibilidade sob a forma granular esférica na fase sólida

elevada resistência química e mecânica (não devem colapsar)

porosidade controlada e uniforme

Tipos de gel

Nome Tipo Aplicação

Sephadex gel de dextrano

entrecruzado com epicloro-

hidrina

- não podem ser fabricados com limites de exclusão

superiores a 600 000 pois o estabelecimento de um nº

de ligações cruzadas reduzidas não é suficiente para

evitar o colapso das partículas

Sephacryl gel de dextrano

entrecruzado com N-N’-

metilenobisacrilamida

- matriz semi–rígida e muito estável

- separações rápidas com elevada resolução de

moléculas de grandes dimensões

Sepharose gel de agarose - grande porosidade, ou seja, têm limites de exclusão

muito elevados

- ideal para a separação de substâncias de elevada Mr

Estrutura dos géis

Sepharose gel de agarose (polissacárido natural componente do agar)

Sephadex

gel de dextrano

entrecruzado com

epicloro-hidrina

Sephacryl

gel de dextrano

entrecruzado com

metilenobisacrilamida

Ge

l F

iltra

tio

n –

Prin

cip

les a

nd

Me

tho

ds, A

me

rsh

am

Ph

arm

acia

Bio

tech

Propriedades dos géis

Porosidade e dos grânulos condiciona a aplicação do gel

Sephadex do tipo G

Grau

(m)

Resolução da

separação

Velocidade

de fluxo

Aplicação

Superfino 10 - 40 elevada baixa Escala analítica com

elevada resolução

Fino 20 – 80 intermédia Aplicações

analíticas

Médio 50 – 150 baixa Aplicações

preparativas

Grosseiro 100 - 300 muito baixa elevada Aplicações industriais

e preparativas

Aumento do dos grânulos perda de resolução mas diminuição do tempo

de separação

Gel usado: Sephadex G100, (partículas)= 40 - 120m

Efeito do tamanho das partículas do gel

Perfis de eluição do ácido uridílico em

Sephadex G-25 de várias granulometrias

(fino, médio e grosseiro)

velocidade de fluxo 24 cm3/h

Ge

l F

iltra

tio

n –

Prin

cip

les a

nd

Me

tho

ds, A

me

rsh

am

Ph

arm

acia

Bio

tech

Ab

so

rvê

nc

ia (

28

0 n

m)

Volume de eluente (mL)

fino médio

grosseiro

= 20 -80m

= 50 -150m

= 100 - 300 m

Aplicações

(virus, proteínas, enzimas, hormonas, ac. nucleicos, polissacáridos)

Purificação de substâncias de elevada M.M.


• Determinação da M.M. de proteínas (Ve - função linear do log. MM)

Amostra

desconhecida (0,3cm3 de sol.

5mg/cm3)

Ab

s 280n

m

0,500

0,375

0,125

Fluxo: 0,5cm3/min

Registo original: 5mm/min

Registo digitalizado:

1,75mm/min

Tempo

Padrões (0,3cm3): Citocromo c, 12kDa (2,5mg/cm3)

Ovalbumina, 43kDa (5,0mg/cm3)

g-globulina, 150kDa (5,0mg/cm3)

Ab

s 280n

m

0,500

0,375

0,250

0,125

Fluxo: 0,5cm3/min

Registo original: 5mm/min

Registo digitalizado:

1,75mm/min

Tempo

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25

Log (MM)

Kav

r2= 0,997

Citocromo c

12kDa

Ovalbumina

43kDa

-globulina

150kDa

Amostra

28kDa

Cromatografia de Exclusão Molecular MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

CROMATOGRAFIA

• Concentração de soluções de substâncias de elevada M.M.

Sephadex G 25 seco

• Dessalificação

coluna de Sephadex G 25

• Mudança de tampão

coluna de Sephadex G 25


Equipamento usado

.

Cuidados a observar na aplicação da amostra

• Não perturbar a

superfície do gel

empacotado na

coluna

• Não diluir a amostra

durante a sua

aplicação na coluna

• Não deixar secar a

coluna durante a

aplicação da

amostra

.

Cuidados a observar na eluição da amostra

• o aumento do fluxo utilizado

acelera a separação ...

• mas o fluxo usado na eluição

da coluna tem de dar tempo a

que ocorra a difusão da

amostra para o interior e

exterior das partículas do gel

• quanto maior a altura da

coluna, maior a resolução na

separação

Cromatografia de exclusão molecular: balanço

Cromatografia de exclusão molecular

Vantagens Desvantagens

Técnica simples, barata e rápida Baixa capacidade

(análise de um pequeno volume

de amostra)

Aconselhável para graus de

purificação de 2x a 6x

Baixa resolução

Em geral, é aplicada nas fases

finais de um processo de

purificação, podendo fornecer

informação adicional sobre a MM

da proteína

O fluxo utilizado influencia a

separação

técnicas de separação cromatográficas cromatografia de

Documents