CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA – COORDENAÇÃO DE ENSINO PROFISSIONAL

LABORATÓRIO DE QUÍMICA ORGÂNICA

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

- SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS DE COUVE -

Professor: Rodrigo Verly

Turma: QUI3A – T2

ALUNOS: Maria Luiza Andrade Aquino e Mariana Gabriela de Oliveira

Belo Horizonte

02 de março de 2011

I. Introdução

Cromatografia é uma técnica de separação e de análise de substâncias em solução,

mediante um processo de adsorção seletiva. Ela funciona de acordo com as interações

entre moléculas de polaridades diferentes, que podem ser ou não arrastadas da fase

estacionária para a fase móvel em diferentes intensidades. A técnica foi descoberta em

1906 pelo botânico russo Mikahail Tswett, mas não foi largamente utilizada até os anos 30.

Tswett separou pigmentos de plantas adicionando um extrato de folhas verdes em éter de

petróleo sobre uma coluna com vários sólidos em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto

a solução percorreu através da coluna, os componentes individuais da mistura migraram

para baixo em diferentes taxas de velocidades e então a coluna apresentou-se marcada

com gradientes de cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma.

O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia de papel. É uma das técnicas

mais simples e que requer menor instrumentação para realização, porém apresenta

restrições para realização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, depois de

demarcada a amostra no papel, o eluente flui verticalmente pelo fenômeno de micro

capilaridade, e os componentes da amostra depositam-se em locais específicos. Utiliza-se o

papel de filtro de celulose, por ser altamente hidrófilo, mantendo um revestimento de água

imperceptível. Esse revestimento é a fase estacionária e o solvente utilizado é a fase móvel.

A couve é uma hortaliça que tem sido de fundamental importância desde a antiguidade.

Conhecida pelos celtas e os gregos, foi mencionada nos scripts de dramaturgos como

Epicharmus (S. VI A. C), cujos personagens aconselhavam o seu uso na cura de doenças.

No Império Romano, é mencionado por Cato, em seu livro "De re rustica" como um remédio

para problemas intestinais e pulmonares, e, sobretudo, para aumentar a produção de leite

em mulheres que estão amamentando.

É uma excelente fonte de vitamina C e beta-caroteno, que o corpo humano transforma em

vitamina A. Uma xícara de couve contém o dobro das necessidades diárias desses

nutrientes. Outros nutrientes presentes na couve são vitamina E, folato, cálcio, ferro e

potássio. Além disso, a couve contém mais ferro e cálcio que quase qualquer outra verdura;

seu alto teor de vitamina C aumenta a capacidade de absorção destes minerais pelo

organismo.

As clorofilas são moléculas formadas por complexos derivados da porfirina, tendo como

átomo central o Mg. Esse composto é uma estrutura macrocíclica assimétrica totalmente

insaturada constituída por quatro anéis de pirrol. Esses anéis numeram-se de 1 a 4 ou de “a”

a “d”, de acordo com o sistema de numeração de Fisher (SCHOEFS, 2002). As clorofilas a e

b encontram-se na natureza numa proporção de 3:1, respectivamente, e diferem nos

substituintes de carbono C-3. Na clorofila a, o anel de porfirina contém um grupo metil (-CH3)

no C-3 e a clorofila b (considerada um pigmento acessório) contém um grupo aldeído (-

CHO), que substitui o grupo metil-CH3. A estabilidade da clorofila b deve-se ao efeito

atrativo de elétrons de seu grupo aldeído no C-3 (VON ELBE, 2000).

Os cloroplastos são organelas vegetais onde ocorrem duas reações vitais para as plantas: a

fotoquímica, nas membranas dos tilacóides e a bioquímica, no estroma do cloroplasto. Tais

organelas, além das clorofilas, contêm outros pigmentos como os carotenóides (carotenos e

xantofilas). As ligações entre as moléculas de clorofilas são muito frágeis (não-covalentes),

rompendo-se com facilidade ao macerar o tecido em solventes orgânicos. O caráter

hidrofílico/hidrofóbico de uma substância influi diretamente na escolha do melhor solvente

para a sua extração. Os solventes polares como a acetona são os mais eficazes para a

extração completa das clorofilas. No caso das clorofilas a e b, o aumento da polaridade da

clorofila b em relação à clorofila a deve-se ao substituinte aldeído (VON ELBE, 2000;

MUSSI, 2003), como observado na Figura 02.

As técnicas cromatográficas são essenciais para a separação de substâncias puras de

misturas complexas e são amplamente utilizadas nas análises de alimentos, drogas,

sangue, produtos derivados de petróleo e produtos de fissão nuclear.

Sendo assim, o objetivo dessa prática é determinar o melhor eluente para a separação das

substâncias responsáveis pelos pigmentos da couve, através da cromatografia de papel e

medir seus Rf.

II. Materiais e Reagentes

- 1 béquer

- 4 Pipetas de Pasteur

- 8 tiras (16x1 cm) de papel poroso

- 8 tubos de ensaio

- Almofariz e pistilo

- Capilar

- estante para tubos de ensaio

- 1 mL de acetato de etila

- 1 mL de álcool etílico

- 1,25 mL de éter etílico

- 2 mL de diclorometano

- 3,20 mL de hexano

- Acetona

- Couve

III. Metodologia e resultados

A separação dos pigmentos da couve, através da técnica de cromatografia, exigiu que fosse

preparado o extrato do vegetal, as tiras de papel poroso (fase estacionária) e que se

escolhesse o eluente (fase móvel) mais adequado para a separação.

Primeiramente, preparou-se o extrato adicionando-se a pequenos pedaços de couve fresca

cerca de 50 mL de acetona. O material foi prensado em almofariz, com um pistilo, obtendo-

se um líquido esverdeado, o qual foi utilizado no processo. A fase estacionária consistiu

numa tira de papel poroso adequado ao recipiente utilizado, no caso, o tubo de ensaio.

Foram cortadas oito tiras de papel de 16 cm de altura e cerca de 1 cm de largura. Em cada

tira, foi marcado 1 cm da extremidade inferior e 1,5 cm da extremidade superior do papel,

que representam respectivamente o volume limite de eluente adicionado ao tubo de ensaio

e a altura limite de eluição.

Na extremidade inferior do papel, no centro da marcação e com o auxílio do capilar, aplicou-

se o extrato de couve, formando uma mancha circular com diâmetro com cerca de 5 mm,

para que o extrato estivesse em maior concentração, facilitando a separação e visualização

dos pigmentos.

Nos tubos de ensaio 1, 2, 3, 4 e 5 adicionou-se, respectivamente, 1 mL de hexano, de

diclorometano, de éter etílico, de acetato de etila e de álcool etílico, observando-se a ordem

de polaridade dos solventes, a fim de facilitar a escolha do mais adequado. Após adição dos

eluentes, introduziram-se as placas de papel em cada tubo de ensaio e observou-se a

eluição. Na placa 1, tendo hexano como eluente, houve separação dos pigmentos verdes

dos amarelos, porém não houve grande eluição, ou seja, a amostra continuou concentrada

no ponto de aplicação. Na placa 2, tendo diclorometano como eluente, observou-se que os

pigmentos verdes eluiram pela placa, acompanhando o solvente, enquanto os amarelos

permaneceram concentrados no ponto de aplicação da amostra. Nas placas 3 e 4, com éter

etílico e acetato de etila, respectivamente, observou-se o mesmo que ocorrido na placa 2,

porém na placa 4 a distância percorrida pelo pigmento verde foi maior. Na placa 5, ambos

os pigmentos percorreram a mesma distância, observando uma “cauda” amarelada na parte

inferior da placa.

Observando os resultados obtidos anteriormente, constatou-se que os eluentes que

obtiveram resultados mais satisfatórios foram o hexano (placa 1) e o diclorometano (placa

2). Dessa forma, adicionou-se 1 mL da mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v em outro

tubo de ensaio, a fim de observar a separação promovida por ambos eluentes, atuando

paralelamente. Nessa placa (6), houve separação dos pigmentos amarelos, porém os

verdes eluiram juntos. De acordo com os resultados verificados anteriormente, verificou-se

que a polaridade do eluente deveria aumentar um pouco para que a separação dos

pigmentos verdes ocorresse. Adicionou-se então 1 mL da mistura de hexano e

diclorometano, agora na proporção 1:1 v/v, em outro tubo de ensaio (7), observando-se a

separação dos quatro pigmentos. Os pigmentos verdes (clorofilas) apresentaram maiores

distâncias percorridas.

Figura 01. Cromatograma das separações dos pigmentos da couve utilizando diferentes eluentes

IV.Discussão e conclusão

O eluente mais adequado é aquele que promove a separação dos quatro pigmentos, dois

esverdeados (clorofila-a e clorofila-b) e dois amarelados (carotenóides: carotenos e

xantofilas).

Para constatar que a mistura feita no tubo 7 consistia no eluente mais adequado, adicionou-

se ao tubo de ensaio (8) 1 mL da mistura de hexano e éter etílico 3:1 v/v, sendo o éter mais

polar que o diclorometano. Observou-se a separação dos pigmentos verdes, porém os

amarelos eluiram juntos.

A separação cromatográfica e extração de produtos naturais podem ser utilizadas para

ilustrar vários fenômenos envolvendo interações intermoleculares. Ambos os processos

dependem diretamente dessas interações estabelecidas entre os componentes da mistura e

as fases estacionária e móvel. Na medida em que o solvente (fase móvel) passa pela

mistura, os componentes químicos são arrastados, de forma que a substância que possuir

maior afinidade química com ele será deslocada a uma velocidade maior.

A amostra analisada, obtida por maceração das folhas de couve, tinha pigmentos verdes e

amarelos, sendo, respectivamente, clorofila-a e clorofila-b; e carotenóides (carotenos e

xantofilas). A extração foi feita com a acetona (propanona), porque a água, por exemplo, é

muito polar, sendo necessário utilizar um extrator com grau de polaridade intermediário,

capaz de extrair o máximo possível de pigmentos tanto lipossolúveis quanto hidrossolúveis.

Figura 02. Estrutura das clorofilas a e b

Os carotenos, como o beta-caroteno (Figura 03), são hidrocarbonetos apolares, nos quais

prevalecem interações intermoleculares do tipo Forças de Van der Waals. Esses

hidrocarbonetos devem, portanto, ser eluídos com facilidade por fases móveis de baixa

polaridade e, durante a “corrida” cromatográfica, são os que mais se distanciam do ponto de

aplicação da amostra, no caso de a fase estacionária ser polar, como o papel hidrófilo,

utilizado nesse experimento.

As xantofilas monooxigenadas apresentam apenas um grupamento hidroxila (Figura 03) e

têm moderada afinidade com a fase estacionária utilizada nesse experimento, já que a

hidroxila pode formar ligações de hidrogênio com a água adsorvida no papel. Assim,

apresentam certa tendência à retenção pela fase estacionária e, durante a “corrida”

cromatográfica, distanciam-se moderadamente do ponto de aplicação da amostra.

Figura 03. Estrutura dos carotenóides: beta-caroteno e xantofila

Os eluentes utilizados primeiramente para observação foram, de acordo com a ordem

representada na Figura 01, hexano, diclorometano, éter etílico, acetato de etila, álcool

etílico. O hexano não foi capaz de arrastar com eficiência os quatro pigmentos, porém

observou-se separação das clorofilas dos carotenóides, já que se obteve duas cores

distintas. Dentre todos os solventes utilizados, este apresentava menor polaridade, por isso

foi capaz de arrastar os carotenóides, já que estes são pouco polares, enquanto a fase

estacionária (papel hidrófilo) reteve as clorofilas, já que estas apresentam maior polaridade.

A eluição não foi totalmente eficiente, pois os carotenóides possuem certa polaridade, o que

dificultou a interação com o solvente apolar.

O diclorometano não foi capaz de separar os pigmentos verdes e amarelos, porém

conseguiu arrastar as clorofilas, mostrando-se assim que sua polaridade foi suficiente para

interagir com estas, porém não foi capaz de interagir com os carotenóides.

Sendo assim, constatou-se que a polaridade do melhor eluente estaria entre o hexano e o

diclorometano, já que o éter etílico, o acetato de etila e o álcool etílico são mais polares que

o último, tornado-se desnecessária a análise dos resultados obtidos em 3, 4 e 5 (Figura 01).

Testou-se então, uma mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v, acreditando-se que a

apolaridade do hexano separaria os quatro pigmentos, enquanto a polaridade do

diclorometano promoveria o arraste, evidenciando a separação das cores. Porém a

polaridade da mistura não foi suficiente para separar a clorofila b da clorofila a, já que a

primeira é mais polar que a segunda, enquanto a apolaridade foi suficiente para a separação

dos carotenos das xantofilas.

A partir dos resultados obtidos anteriormente, constatou-se que era necessário aumentar a

polaridade da mistura. Desta forma, fez-se uma mistura de hexano e diclorometano na

proporção de 1:1 v/v. Percebeu-se assim a separação dos quatro pigmentos (Figura 01/7). A

clorofila b foi a mais retida, em decorrência de sua maior afinidade com a fase estacionária

(água), já que ela é a mais polar das substâncias em análise, estabelecendo, assim,

ligações de hidrogênio com a água. A clorofila a foi mais arrastada que a clorofila b por

apresentar uma polaridade inferior em relação à última, porém foi retida pela fase

estacionária antes dos carotenóides, por ser mais polar que estes. A xantofila foi retida

acima das clorofilas por possuir uma polaridade um pouco maior que os carotenos, já que

esta possui grupos –OH, que não estão presentes nestes, lhe conferindo essa propriedade.

Por último, têm-se os carotenos, mais apolar das substâncias analisadas que teve uma

maior afinidade pela fase móvel (menos polar que a água).

O resultado acima pode ser conferido através dos Rf’s das amostras, onde a clorofila b teve

um Rf 0,07, a clofofila a 0,48, a xantofila 0,79 e o caroteno 0,89.

Através do Rf também é possível concluir que o solvente não foi o ideal, já que o Rf da

clorofila b ficou muito próximo de 0.

Assim, fez-se uma nova mistura, aumentando a polaridade do solvente para que este

pudesse arrastar mais a clorofila b, afastando-a do ponto de aplicação. Essa mistura foi feita

com hexano e éter etílico na proporção 3:1 v/v. Porém não houve uma separação nítida das

cores, observando que a cauda de uma substância interferiu no ponto de maior

concentração de outra substância. Sendo assim, a mistura que apresentou resultado mais

satisfatório, separação nítida dos quatro pigmentos, foi a de hexano e diclorometano na

proporção de 1:1, sendo essa de média polaridade.

V. Referências bibliográficas

FRACETO, Leonardo Fernandes; LIMA, Sílvio Luís Toledo de. Aplicação da Cromatografia em papel na separação de corantes de pastilhas de chocolate. Química Nova na Escola, São Paulo, nº 18, p. 46-48, nov. 2003.

FONSECA, Sebastião F.; GONÇALVES, Caroline C. S. Separação de pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, São Paulo, nº 20, p. 55-58, nov. 2004.

AGRIZZI, Tiago; NASCIMENTO, Isabella Oliveira; FERRAZ, CECÍLIA. Cromatografia em Papel/ Espectrometria De Absorção Atômica/ Espectroscopia de Ressonância Magnética do Infravermelho. Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo - Curso de Agronomia. 2009. Disponível em: <http://www.conteudojuridico.com.br/?artigos&ver=2.29699>. Acesso em: 11 mar. 2011

Cromatografia em papel. Pontifica Universidade do Rio Grande do Sul. Disponível em: <http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL>. Acesso em: 11 mar. 2011

A Separação de Compostos por Cromatografia. Disponível em: <http://alkimia.tripod.com/cromatografia>. Acesso em: 11 mar. 2011.