pigmentos histoquimica

Métodos e Técnicas de HistoquímicaPigmentos e Minerais

ÍndiceÍndice............................................................................................11. Introdução Teórica................................................................22. Protocolo...............................................................................6

2.1. Material:.........................................................................62.2. Técnica de Perls.............................................................6

2.2.1. Procedimento:............................................................62.3. Fontana Masson.............................................................7

2.3.1. Procedimento:............................................................72.4. Técnica de redução de sais - Azul Turnbull....................7

2.4.1. Procedimento:............................................................72.5. Branqueamento do pigmento de melanina....................8

2.5.1. Procedimento:............................................................82.6. Soluções elaboradas pelo grupo.....................................8

3. Resultados obtidos...............................................................93.1. Resultado Fontana Masson.............................................93.2. Resultado Branqueamento do pigmento de melanina. . .93.3. Resultados Azul Turnbull..............................................103.4. Resultado do Perls........................................................10

4. Discussão de Resultados....................................................115. Conclusão...........................................................................126. Bibliografia..........................................................................127. Anexos................................................................................13

7.1. Soluções:......................................................................13

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1. Introdução Teórica No organismo humano ocorrem uma série de processos

metabólicos e catabólicos que originam a formação de pigmentos, sendo estes, substâncias especiais porque dão coloração ao tecido que os possui, podendo estarem presentes de forma normal ou patológica.

Os pigmentos podem classificar-se como endógenos, exógenos ou artefactos, em que os endógenos se devem a um efeito do metabolismo em situações normais ou patológicas; os exógenos são depósitos de substâncias que têm origem no exterior do organismo e os artefactos estão ausentes do tecido vivo e presentes no tecido fixado.

Dos pigmentos endógenos fazem parte a hemoglobina, hemossiderina, bilirrubina, lipofucsina, ceróide e cobre, enquanto que nos exógenos se encontra o pigmento de tatuagem, de melanina, de malária, de mercúrio e de crómio.

A hemossiderina é um pigmento proteico que contém no seu interior ferro no estado iónico e que aparece como grânulos intercelulares de cor amarela e castanha refringentes, que se agrupam em amontoados. Este pigmento depois da fixação em formol é insolúvel em soluções básicas, mas solúvel em soluções fortemente ácidas.

A hemossiderina apresenta 3 características próprias: Apresenta-se sob a forma de grânulos acastanhados e

isótopos visíveis ao microscópio óptico. É revelador do ferro férrico. Aparece no organismo em determinados locais e em

resposta ao metabolismo normal da hemoglobina e pode aparecer em proporções superiores ou inferiores ao normal em consequência de determinados estados patológicos.

O ferro, quando presente no organismo em quantidades normais encontra-se associado a uma proteína solúvel, apoferritina a que se dá o nome de ferritina, mas quando a apoferritina não se consegue ligar a todo o ferro existente, pode dever-se aos mecanismos de absorção que não funcionam correctamente.

A demonstração da hemossiderina é feita graças à detecção do ferro que ela contém e que está normalmente sob a forma férrica, através do método de azul da Prússia de Perls. Por vezes o ferro pode estar em forma de ferro ferroso e aí o azul da Perls já não é aconselhável, tendo de se utilizar um método mais específico, o método de azul de Turnbull.

O método de Perls é baseado na obtenção de uma substância colorida insolúvel, derivada de reacção entre o ferro férrico e o ferrocianeto de potássio. Esta reacção é desencadeada pelo ácido clorídrico, pois este transforma o ferrocianeto de potássio em ferrocianeto férrico na presença de ferro férrico.

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H


Como resultado final, a hemossiderina e os sais férricos coram de azul intenso e o tecido e os núcleos de vermelho ou de cor do contraste usado.

A melanina é um pigmento de origem não hemática e produzida pelos melanócitos. Encontra-se em muitos tecidos normais, devido ao papel fundamental da enzima tirosina ou de componentes que a contenham. Quando existe uma deficiência em tirosinase, não há produção de melnina, sendo esta a causa de albinismo.

O pigmento da melanina está presente na pelo, olhos, cérebro, folículos pilosos e cabelos, em que no cérebro se revela na substância negra, mas ao ser detectada uma quantidade de melanina inferior ao normal, está-se perante a doença de Parkinson.

Na pele a melanina encontra-se nas camadas mais profundas da epiderme, essencialmente na camada germinativa do epitélio, mas caso haja uma determinada patologia, observa-se o pigmento nas células fagocitárias (melanófagos) da parte superior da derme. Assim os “sinais” são uma lesão benigna, que produz grandes quantidades de melanina, ao contrário dos melanomas que também forma elevadas quantidades do pigmento, sendo estes tumores malignos que podem metastizar.

O pigmento da melanina pode ser identificado através das suas características gerais:

A melanina não é solúvel em solventes orgânicos e em bases e ácidos fracos.

Em soluções alcalinas fortes dissolve-se. Branqueia com agentes oxidantes.

Para se demonstrar a melanina pode-se usar vários métodos, que se dividem em 4 grupos:

- Métodos baseados nas características “físicas” da melanina (solubilidade e branqueamento.

- Métodos baseados no carácter redutor da melanina.- Reacção de fixação dos iões ferrosos.- Detecção da tirosinase.

O branqueamento da melanina é feito por oxidantes fortes, o que permite que ela possa se diferenciada dos lipopigmentos, que não são branqueados ou que o são muito lentamente. Os agentes oxidantes mais usados são o permanganato de potássio acidificado e o peróxido de hidrogénio.

A rapidez com que a melanina branqueia, depende da sua origem, pois na melanina de origem cutânea o branqueamento é mais rápido do que a de origem ocular.

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3K4[Fe²+(CN)6] + 4Fe³+Cl3 Fe4³+[Fe³+(CN)6]3 + 12KCl

Ferrocianeto de potássio Azul de Prússia

HCl


Neste método usa-se normalmente lâminas adesivadas, porque a solução ao ser muito forte provoca o descolamento do tecido.

Com esta técnica a melanina fica corada de castanho e os núcleos de vermelho.

Outro método usado para a detecção deste pigmento é o método baseado no carácter redutor da melanina, em que se faz a visualização desta com a ajuda de reacções argirófilas, reacções argentafins, técnicas de redução de sais férricos ou outros.

A argirofilia é a propriedade que determinadas estruturas tecidulares possuem em unir-se a iões de prata derivados do nitrato de prata ou prata amoniacal, de forma a que posteriormente as iões de prata atraídos pelo tecido são precipitados a prata metálica por acção de um agente redutor externo, como a hidroquinona. Por isso, as reacções argirófilas são menos específicas, pois as células são impregnadas com prata, mas é necessário um agente redutor para reduzir a prata a um produto metálico visível.

A argentafinidade é a propriedade que têm alguns tecidos em reduzir o nitrato de prata amoniacal a prata metálica sem intervenção de agentes redutores externos. Esta propriedade é característica de determinadas granulações citoplasmáticas presentes em células cutâneas como os melanócitos que secretam melanina. O mecanismo que desencadeia esta reacção não se conhece com exactidão, ainda que parece depender da presença de 5-hidroxitriptamina que é convertida em tetrahidro-4-carbolina devido ao formol. Assim as reacções argentafins são ainda mais específicas quando se usa técnicas com pH neutro ou ácido. Nestas ocorre uma reacção em que as células reduzem soluções de prata a prata metálica sem recorrer a um agente redutor externo, porque a melanina possui argentafinidade.

A técnica mais usada no carácter redutor da melanina é o método de Fontana-Masson. Neste método utiliza-se uma impregnação argêntica em dois tempos, ou seja, usa-se procedimentos químicos para obter prata metálica a partir do nitrato de prata, mediante reacções sucessivas. Numa primeira fase é necessário tratar o nitrato de prata com bases fortes, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amoníaco, etc, com o qual se obtém um óxido de prata que precipita em forma de granulações cinzentas-escuras.

Mediante a adição de amoníaco à solução anterior, obtém-se um complexo iónico de prata e amoníaco, denominado de óxido diaminoargentico ou prata amoniacal, solúvel em água ainda que muito instável.

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2AgNO3 + 2NaOH Ag2O + 2NaNO3 + H2O


Ag2O + 4NH3 [Ag(NH3)2]2O

O óxido diaminoargentico reduz ao juntar-se formol a 10%, o qual tem a capacidade de captar oxigénio até precipitar a prata, dando como produto da reacção prata metálica, ácido fórmico e amoníaco.

[Ag(NH3)2]2O + CHOH 2Ag + 4NH3 + HCOOH

Esta prata metálica é a que se deposita sobre o tecido em forma molecular muito estável.

Assim na impregnação a dois tempos, o amoníaco realiza a primeira redução do nitrato de prata a óxido diaminoargentico e o tecido a segunda redução, precipitando a prata metálica sobre s granulações com capacidade redutora.

A incubação do tecido com a prata amoniacal é prolongada e deve realizar-se no escuro para evitar precipitados, pois estes são a causa da acção da luz solar.

A principal dificuldade da técnica encontra-se na preparação da solução, pois tem de se levar a prata até a um momento em que esteja a ponto de precipitar. Com isto, as substâncias capazes de reduzir directamente os sais de prata são evidenciados. No final os grânulos argentafins e a melanina ficam de cor negra, enquanto que os núcleos e o citoplasma ficam da cor do contraste utilizado.

Na reacção de fixação dos iões ferrosos, a melanina forma complexos com iões ferrosos, a partir da exposição do tecido a uma solução de sulfato ferroso (agente que permite a ligação do ferrocianeto com os iões ferrosos), em que o complexo formado é posto em evidência com a reacção do azul de Turnbull. Esta reacção é específica para a melanina, porque vai fazer-se o tratamento do tecido com ferrocianeto de potássio, em que este combina com iões de ferro ferroso dando origem ao pigmento de ferrocianeto ferroso (pigmento azul brilhante). A menlanina cora então de azul-escuro ou verde-escuro

O ferro ferroso como não é tão comum como o ferro férrico, tem de se adicionar ferrocianeto de potássio para se formar um complexo visualizável, enquanto que no ferro férrico se usa ácido clorídrico para libertar o ferro.

2. Protocolo2.1.Material:• Esguicho• Pipetas de Pasteur• Tinas de ranhuras baixas e de colo alto • Gobelés • Tabuleiro de coloração• Provetas de 5mL, 10mL e 100mL• Erlenmayer

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• Funis• Fracos de âmbar• Papel de celulose• Balança • Colheres de plástico para fazer medição de reagentes• Frascos de recolha de urina• Estufa a 56ºC

2.2.Técnica de Perls

2.2.1. Procedimento:(1) Desparafinar as lâminas em xilol – 10 min(2) Hidratar em soluções decrescentes de álcoois e depois

em água corrente;(3) Colocar uma solução de partes iguais de Ferrocianeto

Potássio a 2% e de Ácido Hidrocloridrico a 2% durante 25 min.;

(o ácido liberta os iões férricos da hemorriderina e ferrocianeto potássio reage com os iões, dando origem ao

pigmento Azul de Prússia)(4) Lavar em água corrente durante 5 min. e de seguida por

água destilada;(5) Contrastar com solução de kernechtrot durante 3 min.;(6) Passar rapidamente em água corrente;(7) Desidratar em álcoois crescentes e depois em xilol;(8) Montar;(9) Observar ao M.O. hemossiderina corada de azul, o

citoplasma e núcleos corados de vermelho.

2.3.Fontana Masson

2.3.1. Procedimento:(1) Desparafinar as lâminas em xilol – 10 min(2) Hidratar em álcoois decrescentes e depois em água

corrente.(3) Colocar as lâminas em Nitrato de Prata filtrada a 56ºC

durante 1 hora;(até o corte ficar com cor castanha devido à precipitação de prata metálica sobre estruturas do tecido com capacidade

redutora)(4) Lavar em água destilada(5) Colocar Cloreto de Ouro a 1% durante 1 min.;

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(6) Lavar em água destilada(7) Colocar Tiossulfato de Sódio a 5% durante 5 min.;

(retira excesso de prata)(8) Lavar em água;(9) Contrastar com verde metilo durante 1 min.;(10) Lavar em água(11) Desidratar em álcoois crescente e depois em xilol;(12) Montar;(13) Observar ao M.O. a melanina e grânulos argentafins

corados de preto.

2.4.Técnica de redução de sais - Azul Turnbull

2.4.1. Procedimento:(1) Desparafinar as lâminas em xilol – 10 min(2) Hidratar em álcoois decrescentes e depois em água

corrente.(3) Colocar sulfato ferroso 2.5% durante 1 hora(formação de complexos: melanina + iões ferrosos do sulfato

ferrosso)(4) Tratar o tecido com ferrocianeto de potássio a 1% em

ácido acético a 1% durante 30 min.;(evidencia o complexo formado anterior)

(5) 1 ou 2 passagens rápidas em acido acético a 1%;(retirar excesso de reagente)

(6) Contrastar com kernechtrot;(7) Desidratar em álcoois crescentes e depois em xilol;(8) Montar;(9) Observar ao M.O. a melanina corada de azul-escuro ou

verde-escuro.

2.5.Branqueamento do pigmento de melanina

2.5.1. Procedimento:(1) Desparafinar as laminas (estas devem ser adesivadas)

em xilol durante 10 min.;(2) Hidratar em álcoois decrescentes e depois em água

corrente;(3) Tratar com solução de branqueamento durante 10 min. (4) Lavar em várias passagens de água destilada;(5) Colocar ácido oxálico a 1% durante 1 a 2 min.;(remove o excesso de cor castanho dado pelo permanganato

de potássio acidificado)(6) Lavar com cuidado em água corrente (para o corte não

descolar da lâmina) – 30 min.;(7) Contrastar com kernechtrot durante 1 min.;

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(8) Lavar em varias passagens de água destilada;(9) Desidratar em álcoois crescentes e depois em xilol;(10) Montar;(11) Observar ao M.O. o corte sem melanina, se existir

alguma coisa marcada são lipopigmentos)

2.6.Soluções elaboradas pelo grupo

Nitrato de prata

Dissolver 10gr de nitrato de prata em 100ml de água destilada, juntar hidróxido de Amónia até não ter precipitado. Depois de limpa de precipitado, diluir cada 25ml da solução de nitrato de prata em 75ml de água destilada (solução de trabalho) e filtrar. Guardar o resto no frigorífico (solução de stock) e diluir só na altura.

Cloreto de ouro 1%→ Cloreto de ouro – 1gr→ Água destilada – 100ml

Tiosulfato de sódio 5 % → Tiossulfato de sódio – 5gr→ Água destilada – 100ml

Ácido acético a 1 %→ Ácido acético – 1ml→ Água destilada – 99ml

Ferrocianeto de potássio a 1% em ácido acético a 1% → Ferrocianeto de potássio – 1gr→ Ácido acético a 1% (sol. anterior) – 100 ml

Ácido oxálico a 1%→ Ácido oxálico – 1gr→ Água destilada – 100ml

3. Resultados obtidos

3.1.Resultado Fontana Masson

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3.2.Resultado Branqueamento do pigmento de melanina

3.3.Resultados Azul Turnbull

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3.4.Resultado do Perls

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4. Discussão de Resultados

A técnica de Fontana Masson tem como objectivo corar os grânulos argentafins e melanina de preto, e as restantes estruturas com a cor de contraste, que de acordo com a técnica usada seria de verde, visto que, o contraste era o verde de metilo.

Relativamente aos resultados obtidos para as laminas onde se executou esta técnica podemos observar diversos pigmentos de diferentes tamanhos com uma tonalidade preta localizados próximo da zona epitelial, o que significa, que no tecido existia grânulos argentafins e melanina. Contudo no que diz respeito ao contraste, este não se apresentava muito evidente, tal facto deveu-se a que no processo de desidratação o corante diferenciou com extrema facilidade.

Nas lâminas da técnica Branqueamento podemos observar que no tecido em causa não apresentava vestígios de pigmentos, sendo apenas visualizável a morfologia do tecido com uma coloração rosa, causado pelo corante de contraste usado, que neste caso foi o kernechtrot. Tais resultados significam que reacção de branqueamento que era pretendida, foi realizada e logo que muito provavelmente os pigmentos observados na técnica de fontana masson serão melanina; uma vês que a maioria dos lipopigmentos, não possuem muita capacidade de branqueamento com oxidantes fortes.

A técnica de Azul de Turnbull é a mais específica para a melanina. Nesta ocorre a redução de iões férricos, presentes na melanina, em iões ferrosos; que em caso de positividade para a reacção deve aparecer no tecido pigmentos verde-escuros ou azul escuros. Contudo paralelamente ao Azul de Turnbull é necessário realizar a técnica de Perls, visto que, por vezes embora muito raramente, a hemossiderina, também possa executar a mesma redução que a melanina, uma vez que, esta também contem iões férricos. Porem na técnica de Perls caso exista hemossiderina no tecido a estudar, esta deverá aparecer num tom azul “vivo”, designado por azul de Prússia.

Relativamente as restantes estruturas de ambas as técnicas devem apresentar-se coradas de vermelho/rosa devido ao facto de o corante de contraste utilizado ter sido o kernechtrot.

No que diz respeito aos resultados das laminas onde foram executadas as técnicas anteriores podemos observar que nas laminas do método de Azul de Turnubull apresentavam pigmentos localizados perto da zona epitelial com uma tonalidade verde-escuro, que significa que a reacção desejada foi realizada com sucesso e que o pigmento será mesmo melanina.

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Nas lâminas onde foi executado o método de Perls, não foi visualizável qualquer tipo de pigmento com tonalidade azul vivo, mas apresentavam-se diversos pigmentos com tonalidade castanha junto da camada epitelial. Estes últimos resultados puderam levar-nos a concluir definitivamente que os pigmentos do Azul te Turnubull, bem como a maioria dos outros pigmentos das outras técnicas, se tratavam mesmo de melanina, visto que na técnica de Perls, ao não ser visualizável pigmentos azul nos pode excluir a possibilidade de existir hemossiderina no tecido, e por outro lado os pigmentos apresentados a castanhos nesta ultima técnica eram melanina uma vez que esta, regra geral pode apresentar-se castanha. Relativamente ao contraste este apresentava-se como seria de esperar, ou seja, corava de rosa todas as outras estruturas do tecido.

5. ConclusãoCom a execução das técnicas realizadas na actividade

experimental foi nos possível adquirir conhecimentos mais aprofundados quanto as técnicas especiais que se podem realizar para a detecção de alguns pigmentos, nomeadamente a melanina. Para alem destes factor podemos observar que para a determinação de pigmentos existem uma enorme diversidade de técnicas que se podem utilizar e que apenas a execução de uma técnica por vezes pode induzir em erro quanto ao tipo de pigmento existente no tecido, daí a necessidade de executar diversas técnicas diferentes para a pesquisa de um pigmento, de modo a permitir que as conclusões quanto ao tipo de pigmento sejam exactas.

6. Bibliografia

o Apontamentos das aulas fornecidos pela docente

o Garcia del moral, R.; Laboratorio de anatomia patológica, 1ª edição, Interamericana – McGraw-Hill editora

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7. Anexos

7.1.Soluções:

Verde de metilo 1%

→ Verde de metilo- 1gr→ Água destilada – 100ml

Sulfato ferroso 2,5%

Solução de branqueamento:

Ácido sulfúrico 0,3%

→ Acido sulfúrico - 0,3 ml→ Agua destilada - 95ml (misturar ate perfazer ate 100ml)

Permanganato de potássio acidificado

→ 100ml de acido sulfúrico a 0,3% + 0,3 g de permanganato de potássio

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