EXPERIMENTO 2 - SEPARAÇÃO DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM 4PAPEL

1) OBJETIVOS

1) Analisação cromatográfica de uma mistura de aminoácidos, usando como padrões aminoácidos conhecidos que são aplicados separadamente em papel, onde sua posição é revelada pela reação com ninidrina.

2) Introduzir o conceito de Rf (razão de fluxo) e demonstrar a separação e identificação de aminoácidos através da cromatografia em papel.

2) REAGENTES E SOLVENTES

Soluções de ninidrina (0,1% em acetona) Mistura desconhecida de aminoácidos Aminoácido desconhecido Soluções-padrão de aminoácidos Mistura de n-butanol: ácido acético: água (4:1:1, v / v / v)

3) MATERIAL

Papel Whatman nº1 Lápis, régua, clip Béquer (2L) Placa de Petri Capilar de vidro

4) PROCEDIMENTOS

Fazer um traço de lápis ao longo do comprimento maior e a 2cm da borda de uma folha (21x16cm) de papel Whatman nº1, evitando tocar com os dedos o papel durante toda a operação. Marcar 5 pontos sobre o traço que distem 3cm um do outro e numerá-los a lápis de 1 a 5. Aplicar as amostras nos pontos numerados com o auxílio de um capilar de vidro, de forma que a mancha sobre o papel tenha o menor diâmetro possível. Nos pontos de 1 a 4 aplicar os padrões e no 5 a amostra a ser analisada. Enrolar o papel de modo a transformá-lo num cilindro e prender as extremidades superiores com a ajuda de um clip. Colocar 25ml do solvente de Patridge (n-butanol:

ácido acético: água 4:1:1, v, v, v) em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente vertical. Evitar que o papel toque a parede da placa. Cobrir o sistema com um béquer de 2 litros e deixar o solvente migrar cerca de 10cm. Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente usando lápis. Secar o papel na capela com o exaustor ligado, mergulhar em solução 0,1% de ninidrina em acetona e levar à estufa (80-100ºC) durante 3 a 4 minutos. Delimitar com lápis as manchas que aparecem no papel.

Figura 2.1: Ilustração da parte inicial da experiência (montagem do sistema onde o solvente irá subir ao longo da folha de papel por capilaridade, carregando consigo os aminoácidos depositados previamente e representados por manchas cinzas na figura).

RESULTADOS OBTIDOS

Aminoácido Deslocamento do centro imaginárioProlina 2 cmAlanina 1,8 cmLeucina 4 cmHistidina 0,8 cmMistura 0,8 cm / 1,8 cm / 2 cm / 4 cm

Desconhecido 0,8 cm

Tabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidos simultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, por isso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa mistura continha prolina, alanina, leucina e histidina.

Essa migração dos aminoácidos ocorre devido ao fato de que o solvente sobe ao longo do papel por causa da capilaridade e arrasta os aminoácidos previamente depositados. Caso o solvente seja menos polar que a celulose do papel, pode-se prever que substâncias pouco polares migrarão mais do que as polares. É justamente esta diferença do comportamento que permite uma separação eficiente. As posições dos aminoácidos (depois de concluída a experiência) são reveladas pois eles reagem com a ninidrina formando compostos que apresentam cor.

A tabela abaixo apresenta os valores de Rf calculados e os valores de Rf fornecidos para comparação. Os valores de Rf calculados foram obtidos através da fórmula

onde d é a distância migrada pela substância (as distâncias fornecidas na tabela 2.1) e Lf é a distância percorrida pelo solvente. Considerando a reta formada pelos pontos de aplicação dos aminoácidos como o marco 0, o valor de Lf obtido na experiência foi de 6,5 cm.

Aminoácido Valor de Rf calculado Valor de Rf fornecidoProlina 0,30 0,43

Rf = d / Lf

Alanina 0,27 0,38Leucina 0,61 0,73Histidina 0,12 0,20Mistura 0,12 / 0,27 / 0,30 / 0,61 ----

Desconhecido 0,13 ----

Tabela 2.1: Resultado da cromatografia realizada em diversos aminoácidos simultaneamente, sendo que uma solução continha uma mistura de aminoácidos, por isso são apresentados quatro valores (um para cada mancha detectada). Essa mistura continha prolina, alanina, leucina e histidina.

A identificação do aminoácido desconhecido aponta para uma forte contradição: enquanto o valor obtido para seu Rf indica que ele é a lisina, a sua distância de migração é praticamente a mesma da histidina. Em compensação, se ao invés de se utilizar o centro hipotético da mancha for utilizado o ponto de maior alcance da mancha, os valores de Rf obtidos possuem grande concordância com os valores fornecidos.

Aminoácido Valor de Rf calculado Rf fornecido Ponto máximo da manchaProlina 0,40 0,43 2,6 cmAlanina 0,38 0,38 2,5 cmLeucina 0,75 0,73 4,9 cmHistidina 0,20 0,20 1,3 cmMistura 0,2 / 0,38 / 0,40 / 0,75 ---- 1,3 cm / 2,5 cm / 2,6 cm / 4,9 cm

Desconhecido 0,21 ---- 1,4 cm

Tabela 2.2: Ao invés de ser utilizado o centro hipotético para o cálculo dos valores de Rf os valores acima foram calculados a partir do alcance máximo de cada mancha de cada aminoácido. Observe que a concordância com os valores de Rf fornecidos é grande, o que torna relevante esse fato.

Uma possível explicação para o fato de os valores de Rf só terem concordados com os fornecidos é a seguinte: na aplicação dos aminoácidos no papel Whatman nº1 as soluções dos aminoácidos não foram aplicadas de forma a preencher os pontos marcados, ou seja, os aminoácidos acabaram se "espalhando" e, ao migrarem, formaram manchas muito grandes. Isso indica que, se estes aminoácidos tivessem sido aplicados numa região menor, a mancha também seria menor e o centro hipotético acabaria por estar bem próximo do topo da mancha (o topo da mancha é justamente onde estão localizados os aminoácidos que estava no ponto correto no início da experiência). Essa explicação também tem seu valor dado o fato de que os aminoácidos com menores manchas tiveram maior precisão nos valores de Rf calculados, visto que são minimizados erros sistemáticos (imprecisão na demarcação do centro hipotético e medição das distâncias).

Figura 2.2: Reação da ninidrina com a alanina.

Figura 2.3: Reação da ninidrina com a histidina.

Figura 2.4: Reação da ninidrina com a leucina.

A reação da ninidrina com os aminoácidos primários produz um pigmento púrpura, conforme exibido nas figuras 2.2, 2.3 e 2.4. É a partir desse pigmento que se torna possível localizar o deslocamento dos aminoácidos na cromatografia em papel. O único aminoácido que é exceção é a prolina que, por possuir um grupo imino ao invés de um grupo amino (tem radical cíclico ligado ao N), forma um composto de cor amarela ao invés de púrpura. Por ser mais complexa e diferente, a reação da ninidrina com a prolina não está exibida nesse relatório, porém sua fórmula estrutural está exibida abaixo:

Figura 2.5: Fórmula estrutural da prolina.

Os comportamentos cromatográficos (maior ou menor migração em relação aos padrões) dos aminoácidos estão justificados abaixo:

ALANINA

A alanina é um aminoácido não polar e alifático. Apesar disso, o seu pequeno grupo R (somente um grupo CH3), estando ligado diretamente ao carbono-, sofre polarizações devido à interação com a parte carregada do aminoácido. Ignorar esse fato acabaria levando à conclusões erradas, ou seja, acabaria levando à idéia de que a alanina iria subir bem mais durante a cromatografia.

PROLINA A prolina apresenta um comportamento de certa forma análogo ao da alanina, mas isso acontece por ela ter uma cadeia cíclica (ver figura 2.5), onde o carbono- está ligado diretamente ao grupo imino (NH2

+), sendo que a carga positiva desse também exerce influência sobre tal átomo de carbono. Assim como acontece com a alanina, essa polarização da uma parte da cadeia da prolina acaba gerando interações mais fortes com a celulose (polar), o que faz com que ela suba menos.

LEUCINA

A leucina é a que tem a cadeia (grupo R) mais apolar de todas, estando ela também no grupo de aminoácidos não polares e alifáticos. Isso justifica o fato de ela ter subido mais do que todos os outros aminoácidos e apresentar, portanto, o maior valor de Rf (razão de fluxo). A fórmula estrutural da leucina está disponibilizada na figura 2.4.

HISTIDINA

A histidina difere dos três aminoácidos acima pois pertence ao grupo dos aminoácidos com grupo R carregado positivamente. Assim como era esperado, a sua polaridade evitou que ela subisse tanto durante a cromatografia, justamente porque o meio imóvel (celulose) também é apolar (ver estrutura da histidina na figura 2.3).