2 cromatografia 2.1 princípios gerais da cromatografia

1 Métodos Instrumentais Capítulo 2

2 CROMATOGRAFIA

2.1 Princípios Gerais da Cromatografia

A cromatografia é uma técnica de separação química

Neste capítulo será objeto de tratamento/discussão apenas a separação

cromatográfica realizada em coluna.

Não serão abordados os processos cromatográficos realizados em meios de

separação em forma de lâmina, tais como a cromatografia de camada fina ou

de papel.

2.1.1 Perspetiva Histórica

Há evidências históricas que sugerem que a separação cromatográfica em

coluna é realizada desde a Idade Média.

13:44:40


A sua explicação e desenvolvimento só surgiu no início do século XX.

Mikhail Tswett, um botânico Russo, foi quem pela

primeira vez usou e interpretou a técnica de separação

que veio a dar origem às técnicas modernas de

cromatografia em coluna.

Tswett, em 1906, usou éter de petróleo como fase

móvel e uma coluna de vidro empacotada com CaCO3

para separar alguns pigmentos extraídos de plantas.

À técnica de separação usada atribuiu-lhe a designação

de cromatografia, que provém do termo Grego - chromatos – que significa cor.

A separação dos vários pigmentos foi interpretada como consequência das

diferentes mobilidades com que se movimentavam no interior da coluna.

13:44:40


Tswett concluiu que a fase estacionária comporta-se como uma resistência à

progressão dos pigmentos ao longo da coluna.

A resistência foi interpretada como o resultado da adsorção dos pigmentos à

fase estacionária, o que permitiu atribuir à fase estacionária as características

de um agente adsorvente.

Adsorvente é um material sólido capaz de reter espécies químicas à sua

superfície, em consequência de interacções físico/químicas estabelecidas

entre as espécies químicas e o adsorvente.

Apesar da adsorção ter tendência para imobilizar os pigmentos na fase

estacionária é, no entanto, contrariada pela passagem contínua de fase móvel,

que remove os pigmentos que eventualmente estejam adsorvidos.

Na figura a seguir ilustra-se a cromatografia em coluna usada por Tswett

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q

A + B

B

B

A

A + B

eluente

B

A

eluente

B

13:44:40


B

A

eluente

B

A

eluente

A

eluente

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O equipamento simples usado por Tswett sofreu considerável evolução até

aos nossos dias.

Na figura abaixo encontra-se ilustrado o equipamento contemporâneo de

cromatografia líquida em coluna.

Controlo e

aquisição

de dados

UV

VIS

DetectorBomba

InjectorReservatório

de eluente

Coluna em compartimento

termostático

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2.1.2 Classificação dos Processos Cromatográficos

Os processos cromatográficos são sistematizados de acordo com diversos

critérios, o que leva ao aparecimento de várias classificações para as diferentes

formas de cromatografia.

Diferentes formas de cromatografia

Critério: Tipo de suporte Modo de separação Natureza da fase móvel

Classificação: Coluna Adsorção Cromatografia gasosa

Planar Partição Cromatografia líquida

Permuta iónica Cromatografia supercrítica

Exclusão de tamanho

Afinidade

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a) Cromatografia de adsorção (gasosa ou líquida )

i) É o tipo de cromatografia mais usado.

ii) Utiliza uma fase móvel líquida ou gasosa.

iii) A fase estacionária é sólida (sílica gel, alumina ou celulose).

iv) A separação é garantida pelo equilíbrio de adsorção do soluto, que se

encontra dissolvido na fase móvel e adsorvido na fase estacionária.

v) As forças envolvidas são de natureza física. Interações eletrostáticas e

forças de Van Der Waals

b) Cromatografia de partição (gasosa ou líquida )

i) Este tipo de cromatografia baseia-se na partição do soluto entre a fase

móvel e um filme fino líquido que se encontra estabilizado à

superfície de um sólido inerte, que serve apenas de suporte ao filme.

ii) O filme fino líquido é a fase estacionária.

iii) Utiliza uma fase móvel líquida ou gasosa.

iv) A partição é garantida por forças de natureza físico/química

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c) Cromatografia de Permuta Iónica (líquida)

i) Usa-se uma resina permutadora de iões como fase sólida estacionária.

ii) A separação cromatográfica é garantida pelo equilíbrio de permuta

iónica.

iii) Utiliza uma fase móvel líquida.

iv) As forças envolvidas são do tipo eletrostático.

d) Cromatografia de exclusão

i) A separação é conseguida pela passagem da fase móvel através de um

gel poroso, que tem por objetivo separar as espécies químicas por

tamanho molecular, eluindo primeiro as moléculas maiores

ii) A separação é alcançada pela exclusão diferencial ou inclusão de

componentes dentro das partículas do enchimento e,

além da separação de componentes discretos, a

técnica é utilizada para caracterizar a distribuição de

peso molecular de polímeros.

iii) Utiliza uma fase móvel líquida.

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e) Cromatografia de afinidade

i) É o tipo de cromatografia com maior grau de especificidade. Ocorre uma

ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante

imobilizado na fase estacionária

ii) Aproveita a existência de interações específicas entre a espécie química

a separar e uma outra que se encontra imobilizada na fase estacionária.

iii) As forças envolvidas na retenção são fundamentalmente de natureza

química, pelo que haverá necessidade de se alterar a composição da fase

móvel para extrair posteriormente a espécie química.

iv) Utiliza uma fase móvel líquida.

v) É usada para separar produtos biológicos: ligações enzimas e substratos,

anticorpos e substratos e recetores de hormonas.

f) Cromatografia gasosa

i) Permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás

através de uma fase estacionária.

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ii) A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido que propicia a

distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases através de

processos físicos e químicos (adsorção, diferenças de solubilidades,

volatilidades).

iii) Como fase móvel é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que

transporta a amostra através da coluna cromatográfica até ao detetor.

g) Cromatografia líquida

i) A cromatografia líquida é uma técnica adequada para a separação dos

componentes de soluções líquidas e utiliza-se quer para fins analíticos quer

para fins preparativos.

ii) A amostra é injetada na coluna usando uma microseringa na

cromatografia analítica.

iii) A fase móvel transportando a amostra é forçada a percolar através da

coluna por uma ação externa que pode ser a simples força da gravidade –

cromatografia de baixa pressão – ou uma força mais intensa gerada por uma

bomba – cromatografia de alta pressão.

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2.1.3 Parametrização da Cromatografia

A parametrização cromatográfica é definida por um conjunto de parâmetros

que permitem caracterizar o processo cromatográfico.

A posição, a forma e a resolução dos picos cromatográficos são exemplos de

parâmetros cromatográficos de elevada relevância para a caracterização da

cromatografia. Estes parâmetros encontram-se ilustrados na Figura abaixo.

13:44:40


a) Parâmetros Individuais de um Pico Cromatográfico

tM

tR1

tR2

tR3

t’R1

t’R2)

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h1

1

W1

W1/2h1/2

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(1) linha de base

(2) tempo morto (tM)

(3) tempo de retenção (tR)

(4) largura do pico (W)

(5) largura do pico a meia altura (W1/2)

(6) desvio padrão. Para picos com forma gaussiana ()

(95% do soluto)

Os parâmetros acima descritos são suficientes para caracterizar convenientemente

a separação cromatográfica. A quantificação destes parâmetros permite avaliar o

desempenho da separação cromatográfica.

Por vezes caracteriza-se os picos cromatográficos através de outros parâmetros

que resultam dos anteriores por simples cálculo aritmético.

iiW 4

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(1) tempo ajustado (corrigido) de retenção (t’R).

(2) fator de capacidade, k

b) Eficiência

O êxito da separação cromatográfica depende:

(1) largura dos picos

(2) espaço em tempo entre dois picos consecutivos

A separação efetiva de um par de componentes pode ser conseguida quer os seus

picos sejam estreitos, quer sejam largos. O tempo de separação destes últimos

será invariavelmente mais longo.

MRiRi ttt ,

M

MRii

t

ttk

13:44:40


Os picos mais

estreitos são

separados mais

cedo

Os picos mais

largos são

separados mais

tarde

tempo

sinal

sinal

sinal

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Se todos os outros parâmetros forem iguais, deve-se preferir separações

cromatográficas que apresentem picos estreitos.

Esta preferência é quantificada através do parâmetro designado por eficiência (N).

Esta razão compara a largura do pico com o tempo (ou volume) de retenção,

pelo que N é uma medida do alargamento do pico por unidade do tempo.

A eficiência é determinada por fatores relacionados com a construção da

coluna e seu empacotamento, bem como da velocidade da fase móvel.

222

16

i

Ri

i

Ri

i

Ri

W

ttVN

13:44:40


C) Parâmetros Atribuídos a Pares de Picos Cromatográficos

O grau de mistura de dois solutos quando avaliado a partir dos

correspondentes picos é quantificado por dois parâmetros: fator de

separação, ai,j e resolução, Rs.

O fator de separação para dois picos adjacentes é caracterizado por:

No cálculo do fator de separação, o numerador identifica-se sempre com o pico

de maior tempo de retenção.

Mas em cromatografia o grau de mistura entre dois solutos não pode ser avaliado

apenas à custa do parâmetro de localização dos correspondentes picos.

1

2

1

22,1

k

k

tt

tt

MR

MR

a

13:44:40


É necessário também atender à dispersão de cada um deles, uma vez que a largura

dos picos vai condicionar a separação dos dois solutos.

RESOLUÇÃO

Rs define a condição de separação aplicada a dois picos adjacentes.

12

12

5,0 WW

ttR RR

s

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Condição de separação:

ou

W1 W2

t1

t2sinal

tempo

12122

1WWtt RR 5,1sR

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A resolução é determinada pela escolha da:

(1) fase estacionária

(2) fase móvel

(3) temperatura

(4) comprimento da coluna (fase estacionária)

d) Comparação das Eficiências Cromatográficas

A eficiência cromatográfica, N, é bastante útil quando se pretende comparar

separações cromatográficas realizadas sob diferentes condições

experimentais.

A eficiência cromatográfica é também designada por número de pratos teóricos.

13:44:40


Quando uma coluna cromatográfica tem um comprimento L, a altura equivalente

de cada um dos seus pratos teóricos é definida por:

Um processo de separação cromatográfico torna-se mais próximo do ideal à

medida que a altura equivalente do prato teórico, H, tende para zero.

2.1.4 Quantificação em Cromatografia

Para as mesmas condições experimentais, isto é, mantendo constante:

(1) a fase estacionária

(2) a fase móvel

(3) a velocidade da fase móvel

(4) a temperatura da separação

(5) o detetor

2

16

Ri

i

t

WL

N

LH

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Os parâmetros característicos dos picos individuais podem ser usados para

identificar a presença de uma espécie química na mistura inicial.

Como resultado, o cromatograma pode ser usado para efetuar a identificação

(análise qualitativa) dos vários constituintes de uma mistura.

Os cromatogramas são representações gráficas do registo de um sinal analítico

proveniente de um detetor, colocado imediatamente a seguir à coluna, em função

do tempo a partir do qual se fez a injeção da amostra.

Quando o sinal analítico é linear com a concentração do soluto, isto é

a quantidade total de soluto é proporcional à área do pico registado no

cromatograma.

O cálculo das áreas dos picos é feito pelos Integradores.

Solutokalsin

áreakq ssoluto

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2.1.5 Separação Cromatográfica

A interpretação da separação cromatográfica tem vindo a sofrer evolução ao

longo dos anos.

Dada a sua complexidade para o nível desta disciplina , abordar-se-á apenas

3 modelos interpretativos, que se complementam mutuamente.

a) Teoria de eluição

É intuitivo afirmar-se que um soluto quando se encontra distribuído pela fase

móvel desloca-se à velocidade com que a fase móvel se encontra animada.

Deste modo, poder-se-á afirmar que:

A velocidade média de um soluto num processo de separação cromatográfico

depende do tempo que permanece na fase estacionária comparativamente

com o tempo em que se move conjuntamente com a fase móvel.

13:44:40


Esta lei é traduzida pela equação:

Dado que:

Então

ou

uma vez que

móvelfmóvelfsoluto tempofracçãoVelocidadeVelocidade ..

iaestacionárfiaestacionárf tempofracçãoVelocidade ..

0. iaestacionárfVelocidade

móvelfmóvelfsoluto tempofracçãoVelocidadeVelocidade ..

móvelfsoluto tempofracçãouVelocidade .

móvelfVelocidadeu .13:44:40


A fracção de tempo que um soluto passa na fase móvel identifica-se com

fracção da sua quantidade de substância que se distribui pela fase móvel.

A fracção do soluto A na fase móvel é dado por:

fasesasambasemAdemolesdetotaln

móvelfasenaAdemolesnAfracção móvelf

º

º.

SSMM

MMmóvelf

VCVC

VCAfracção

.

MM

SSmóvelf

VC

VCAfracção

1

1.

13:44:40


Se a partição do soluto A pelas duas fases é descrita por um coeficiente de

distribuição KDA, a expressão anterior toma a forma:

A velocidade com que o soluto A percorre a coluna é, então, dada por:

A relação entre o tempo de retenção e a velocidade com que o soluto se

desloca ao longo da coluna permite conhecer o comprimento da trajectória

percorrida pelo soluto ao longo da coluna, que não é necessariamente igual a

L.

M

SDA

móvelf

V

VK

Afracção

1

1.

M

SDA

A

V

VK

uu

1

1

13:44:40


ou

o que mostra que um aumento da velocidade de fluxo da fase móvel, , leva

à diminuição do tempo de retenção, tRA.

Simultaneamente, é possível constatar que para a mesma separação

cromatográfica, isto é para condições em que a razão VS/VM permanece

constante, a separação de dois ou mais solutos fica-se a dever à diferença de

valores da constante de distribuição de cada um dos solutos.

A equação anterior, conjuntamente com a equação de Van´t Hoff, permite

ainda prever a influência da temperatura no tempo de retenção

M

SDA

RAef

V

VK

utL

1

1

M

SDA

efRA

V

VK

u

Lt 1

u

13:44:40


Uma vez que

Então, o fator de capacidade pode ser expresso em termos da constante de

distribuição e da razão de volumes entre as fases móvel e estacionária.

A equação de Van´t Hoff é expressa por:

ou

M

MRAA

t

ttk

M

SDAA

V

VKk

2

ln

RT

H

T

KD

M

SDA

RAef

M

V

VK

tu

Lt

1

1

R

S

RT

HKD

ln

13:44:40


Admitindo que a razão de volumes VS/VM é independente da temperatura,

então:

pelo que

ou

De onde se conclui que o logaritmo do fator de capacidade (tempo de

retenção) é inversamente proporcional à temperatura.

T

K

T

k D

lnln

2

ln

RT

H

T

k

R

S

RT

Hk

ln

13:44:40


Principal desvantagem da teoria de eluição: não prevê a ocorrência de

dispersão nos picos cromatográficos.

tempo

limites

imaginários

Fase

estacionária

Fase

móvel

CM

CM

C

S

CS

pico 1

pico 2sinal

KD

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Conclusão:

(1) A teoria de eluição baseia-se apenas nos valores de tRi para explicar a

separação cromatográfica.

(2) tRi é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel.

(3) tRi é directamente proporcional a Kdi quando Kdi é elevado

(4) ln ki é inversamente proporcional à temperatura.

(5) A teoria de eluição não prevê a ocorrência de dispersão (largura do pico).

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b) Teoria de pratos

A incapacidade da teoria de eluição prever a dispersão dos picos

cromatográficos levou ao aparecimento de teorias mais complexas.

A teoria de pratos foi proposta em 1941 por Martin e Synge. Foi

desenvolvida por analogia com a destilação e a extração em contracorrente.

Esta teoria admite que, do ponto de vista teórico, a coluna cromatográfica é

constituída por uma sequência contínua de pequenos fragmentos, designados

por pratos.

pratos13:44:40


A teoria de pratos prevê que o soluto se distribui por um número restrito de

pratos ao longo do seu avanço através da coluna.

Nestas condições, a concentração de soluto à saída da coluna é dada por uma

distribuição gaussiana do tipo:

Em que

n é o nº de moles de soluto N é o nº de pratos teóricos

V é o volume eluido de fase móvel VR é o volume de retenção

Da expressão anterior conclui-se que:

2

12

2

RV

VN

R

eN

V

nc

N

VR

2

2

1

22

1

x

ey

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Quando VR é substituído por tR, toma a forma:

A partir da expressão anterior é possível encontrar a expressão para a

eficiência de uma coluna cromatográfica:

ou

dado que

Apesar da teoria de pratos prever a dispersão dos picos, não consegue,

contudo, explicar o desvio da dispersão ao comportamento gaussiano. Este

desvio é explicado pela teoria cinética.

N

tR

2

RtN

4W

2

16

W

tN R

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c) Teoria Cinética

A teoria cinética descreve o alargamento dos picos cromatográfico através da

equação de Van Deemter.

ou

Esta equação estabelece que a altura do prato teórico, um dos parâmetros que

caracteriza a eficiência e depende do alargamento do pico, é influenciada

por três termos: A, B e C

Os parâmetros A, B e C são constantes determinadas por algumas propriedades

físicas das fases estacionária e móvel. Os seus valores são sempre positivos.

O parâmetro C é frequentemente desdobrado em duas contribuições: uma da fase

estacionária, CS, e outra da fase móvel, CM.

uCu

BAH uCC

u

BAH MS

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O parâmetro A está diretamente relacionado com:

(1) a heterogeneidade microscópica dos poros que resultam do empacotamento

da coluna

(2) a tortuosidade do percurso da fase móvel ao longo do seu trajeto.

Estas duas características proporcionam atrasos e avanços na velocidade da fase

móvel.

Quando se considera o fluxo no interior de um poro

13:44:40


A velocidade do fluído varia desde um valor máximo atribuído à zona

central do poro até à velocidade nula junto das paredes do poro.

Ampliando um pouco mais a escala microscópica, de modo a reunir um conjunto

de poros, prevê-se também que a fase móvel siga trajetórias tortuosas através

das pequenas partículas do enchimento da coluna, o que obriga a velocidade

da fase móvel a mudar frequentemente de direção, percorrendo, assim,

diferentes trajetórias.

λ é uma constante que depende do

empacotamento da coluna

dp é o diâmetro da partícula de empacotamento.

pdA 2

13:44:40


O termo está diretamente relacionado com o transporte de massa por

difusão do soluto na fase móvel devido à existência de um gradiente de

concentração.

Quando um soluto se encontra concentrado numa zona específica da fase móvel, o

soluto tem tendência a espalhar-se, diluindo-se, por todo o volume que o

rodeia por ação da sua difusão para as regiões de menor concentração.

Como habitualmente as colunas cromatográficas são estreitas e compridas é de

esperar que este efeito se faça sentir com maior intensidade na direção

longitudinal.

γ é uma constante que depende do empacotamento da coluna.

DM é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel

u/B

MDB 2

13:44:40


Como a difusão é um processo de transporte de massa lento, o seu efeito só se

vai fazer sentir para velocidades baixas da fase móvel.

após difusão longitudinal

do soluto

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O termo ou ou

está diretamente relacionado com a cinética do processo de interação do soluto com

a fase estacionária.

Tal como o parâmetro anterior, também a influência do termo depende da

velocidade com que a fase móvel se desloca.

Fase móvel lenta

interação rápida

Cs e CM são descritos apenas por KD

uC

uC

uCC MS

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Fase móvel rápida

interação lenta

Atrasa a mobilidade do soluto

ao longo da coluna

Cs é superior ao que seria de

esperar atendendo apenas a KD

DS e DM são os coeficientes de difusão do soluto nas fases estacionária e móvel, respetivamente.

df é a espessura da fase estacionária. dp é o diâmetro da partícula de empacotamento da coluna.

fS(k) e fM(k) são duas funções de k.

CsCs CM

S

fSS

D

dkfC

2

M

pMM

D

dkfC

2

13:44:40


Influência da velocidade da fase móvel na eficiência da separação cromatográfica

13:44:40


2.1.6 Otimização da Separação Cromatográfica

Otimizar uma separação cromatográfica é otimizar a resolução dos picos

cromatográficos e/ou diminuir o tempo despendido na realização da

separação cromatográfica.

Para que a otimização da separação cromatográfica aconteça é necessário atender a

algumas expressões anteriormente referidas:

12

12

50 WW,

VVR RR

s

1

2

1

221

k

k

VV

VV

MR

MR,

a

M

MRii

V

VVk

222

16

i

Ri

i

Ri

i

Ri

W

ttVN

13:44:40


Quando se admite que:

As expressões anteriores permitem avaliar a dependência da resolução como a

eficiência e os factores de capacidade e de separação

Em que k2 é o factor de capacidade relativo ao pico com maior tempo de retenção

dos dois usados para definir Rs.

A equação anterior estabelece que a resolução de dois picos adjacentes pode ser

ajustada fundamentalmente por 3 factores.

(1) Eficiência da coluna, que é uma função de L e H.

(2) Factor de separação. É uma medida da diferença entre KD1 e KD2.

(3) Factor de capacidade, k2.

2

2

1

1

4 k

kNRs

a

a

2

2

1

1

4

1

k

k

H

LRs

a

a

WWW 12

13:44:40


Para Rs = 1,5 a sobreposição dos picos adjacentes é inferior a 0,1%.

Por vezes é necessário calcular o nº de pratos teóricos que uma coluna deveria

possuir para se alcançar uma dada resolução.

A expressão que permite efetuar esse cálculo é definida por:

Por sua vez, o efeito da resolução sobre o tempo de retenção é expresso por:

2

2

22

2 1

116

k

kRN s

a

a

22

32

22

2

1

1

16

k

k

u

HRt sr

a

a

13:44:40


0 3 6 9 120

1

2

3

4

5

N = 20 000

a = 1,02

a = 1,05

a = 1,1

a = 1,2

a = 1,3

Rs

k2

13:44:40

2 cromatografia 2.1 princípios gerais da cromatografia

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