introduÇÃo ao laboratÓrio roteiro de aulas … file-técnicas de laboratório aula prÁtica no....

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA

BIOQUÍMICA

Prof:..........................................

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INDICE

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

AULA PRÁTICA Nº 01

-Técnicas de Laboratório

AULA PRÁTICA No. 02

-Cromatografia de Aminoácidos em papel


- Propriedades das Proteínas


-Propriedades das Enzimas


-Identificação de Carboidratos


- Fermentação Alcoólica


-pH, Tampões


- Extração e Caracterização de Lípideos


- Pesquisa Quantitativa dos constituintes químicos do Leite


- Constituinte do Ovo

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A - OBJETIVOS GERAIS DO CURSO DE LABORATÓRIO

O Curso de Laboratório de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os

estudantes ao final do curso sejam capazes de:

01. Reconhecer e manipular o equipamento freqüentemente utilizado em laboratório de Bioquímica

02. Manipular material biológico: extrair, fracionar e identificar.

03. Conhecer, por meios de reações efetuadas no laboratório, propriedades químicas das substâncias

que compõem os organismos vivos.

04. Interpretar os resultados experimentais.

B - LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

01. Os estudantes se organizarão em bancadas que ocuparão sempre o mesmo lugar no laboratório.

02. Cada lugar no laboratório será equipado com o material necessário à execução do trabalho

programado.

03. Em dias e horas destinadas aos trabalhos práticos, os estudantes terão à sua disposição professor

encarregado de orientá-los na execução e interpretação dos exercícios de laboratório.

04. Após o uso de gás ou água, não deixar as torneiras abertas, tomando o cuidado de fechá-las

completamente.

05. Ao lançar nas pias das mesas os produtos das reações, fazê-lo simultaneamente com descarga de

água, para evitar a corrosão dos encanamentos

06. Não lançar nas pias e calhas papéis de filtro usados ou substâncias sólidas que possam obstruir os

encanamentos.

07. Não lançar fósforos acesos nos locais destinados à coleta de lixo

08. Fotocolorímetros, peagâmetros, balanças analíticas, centrifugadores, microscópios ou outros

aparelhos somente deverão ser usados pelos alunos depois de instruídos nas respectivas

manipulações a fim de se evitar danos irrecuperáveis

C - MATERIAL DO ESTUDANTE

Cada estudante deverá trazer para os trabalhos práticos o material abaixo relacionado:

01. Avental - necessário para proteger a sua roupa e lhe facultar desembaraço na execução das

operações. Não será permitida a presença do aluno sem avental.

02. Guia dos trabalhos práticos - sem o qual é impossível realizar qualquer trabalho no laboratório. O

Guia é individual

03. Pincel atômico - para marcar adequadamente a vidraria durante a execução dos trabalhos práticos.

04. Lápis, borracha e régua

D - GUIA DOS TRABALHOS PRÁTICOS

Este Guia dos Trabalhos Práticos é constituído de roteiros para a execução das tarefas

programadas. O roteiro de cada trabalho prático deverá ser estudado previamente pelo estudante para

facilitar sua execução no laboratório. As dúvidas deverão ser resolvidas antes do início dos trabalhos.

O roteiro consta dos seguintes itens:

a) Objetos específicos - relação dos objetos que deverão ser alcançados após o término de cada aula.

b) Material necessário - relação do material necessário à execução do trabalho.

c) Reagentes - relação dos reagentes necessários à execução do trabalho.

d) Procedimento - marcha do trabalho a ser seguida, etapa por etapa.

e) Interpretação - explicação de reações, detalhes de técnica ou cálculos a serem feitos durante o

trabalho prático.

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f) Relatório – deverá ser preenchido logo após o término de cada trabalho prático, no laboratório. A

presença do aluno só será computada depois do relatório ter sido examinado e visado pelo

professor responsável.

E - MATERIAL RECEBIDO E SUA LIMPEZA

01. Para a execução de cada trabalho prático as bancadas de estudantes receberão o material

relacionado no roteiro.

02. O aluno não deverá utilizar o material de seus colegas, sobretudo quando eles estiverem ausentes.

03. Cada bancada é responsável pela manutenção da ordem em seu lugar e conservação de seu

material de trabalho.

04. No caso de inutilização de algum material recebido, o estudante deverá dar conhecimento ao

professor responsável, a fim de ser providenciada a sua substituição.

05. O aluno não deverá jogar fora o material que julga inutilizado, pois às vezes o mesmo poderá ser

recuperado.

06. Terminados os trabalhos, o estudante deverá proceder à limpeza de seu material, deixando

inteiramente limpos e em condições de ser utilizado novamente. Somente será dado o visto no

relatório após a observação desta recomendação.

07. A limpeza da vidraria deverá ser procedida imediatamente após o seu uso. Quando necessário,

empregar sabão. Em seguida, lavar abundantemente com água corrente e água destilada. O

material é posto para secar espontaneamente, e no caso dos tubos de ensaio, os mesmos devem

ficar emborcados no respectivo suporte.

F - REAGENTES

01. Para cada trabalho prático haverá à disposição dos estudantes uma provisão dos reagentes

relacionados no roteiro

02. Imediatamente após o uso, cada reagente deverá ser colocado, para que possa ser utilizado por

outro colega, na prateleira acima das mesas ou em seu lugar próprio.

03. Devem ser tomados os seguintes cuidados com os vidros de reagentes e as soluções neles contidas

a fim de se evitar contaminações:

a) não trocar as rolhas;

b) não introduzir pipetas nas soluções padrões. Deve-se transferir um pouco da solução (volume

aproximado ao que vai ser gasto) para um tubo de ensaio ou um béquer limpo de onde se pipetará

a quantidade indicada.

c) não restituir ao frasco original as soluções retiradas em excesso.

d) caso seja autorizado, pipetar diretamente do vidro do reagente, usar sempre uma pipeta limpa.

G - EXECUÇÃO DOS TRABALHOS PRÁTICOS

01. Todos os trabalhos práticos devem ser executados com atenção rigor técnico e disciplina.

02. A inobservância de qualquer dos requisitos enumerados no item anterior pode introduzir erros que

invalidam, parcial ou totalmente, o trabalho realizado. Isto significa desperdício de tempo,

reagentes e material.

03. Para que o aluno alcance a eficiência desejada é necessário que tenha conhecimento prévio do

trabalho prático a ser executado e seja pontual, assíduo e ordeiro.

04. Cálculos e anotações devem ser efetuadas no próprio guia de trabalhos práticos.

H - PREVENÇÃO DE ACIDENTES

01. Trabalhar sempre protegido por avental.

02. Não fumar dentro do laboratório.

03. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira antes de ter à mão a chama que

deve acendê-lo.

04. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter, etc) nas proximidades de uma chama.

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05. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, como alcalis ou ácidos fortes e concentrados não deverão ser

pipetados, porém medidos em cilindros graduados ou, em alguns casos, em buretas.

I - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Durante este curso de laboratório o estudante tem a oportunidade de travar contato com

algumas técnicas empregadas não só em análise de constituintes de líquidos fisiológicos, como

também na pesquisa. Ao mesmo tempo, o estudante fica a par de alguns princípios teóricos suficientes

apenas para uma compreensão e interpretação dos resultados experimentais. Para um conhecimento

mais aprofundado da teoria e de outros métodos de dosagens, o estudante poderá consultar:

1. COOPER, T.G.; The Tools of Biochemistry. New York: John Willey & Sons. 1977. 423p.

2. VILELA, G.G.;BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.

3. WHARTON, D.C. McCARTY, R.E., Experiments and Mthods in Biochemistry. New York:

The MacMillan Company. 1972. 350p.

COMO ESCREVER UM RELATÓRIO?

Deve conter uma breve introdução teórica sobre o assunto a ser estudado no laboratório. É

importante que esta introdução não seja uma cópia de livros e, principalmente, da apostila, mas sim,

represente o que o aluno assimilou sobre a teoria envolvida no assunto estudado.

Os dados obtidos nas experiências realizadas no laboratório devem ser mostrados de forma

clara. Junto aos resultados, deve vir uma discussão sobre os erros obtidos, a eficiência dos métodos

utilizados etc, e a conclusão referente ao experimento.

A bibliografia utilizada deve ser mencionada em um capítulo à parte. Um esquema de relatório

é mostrado abaixo:

I - Introdução teórica.

II - Objetivos da Aula.

III - Resultados e conclusões.

IV – Bibliografia.

Bibliografias

NOME DO(S) AUTOR(ES) Título da obra. Edição. Local da Publicação: Nome da Editora, Ano da

publicação número de páginas ou volume da obra.

Exemplo:

VILLELA, G. G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e experimentos de Bioquímica. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 1973. 552p.

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TÉCNICAS DE LABORATÓRIO

A - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

01. Identificar balão volumétrico, bureta, pipeta, proveta, béquer, erlenmeyer, tubo de ensaio e funil

de vidro.

02. Ler as graduações de pipetas, buretas e provetas

03. Usar pipeta, bureta, proveta e balão volumétrico para medir, transferir e completar volumes

definidos de soluções.

04. Reconhecer as zonas na chama de gás.

05. Aquecer água em tubos de ensaio no bico de gás, sem risco de acidentes.

06. Lavar o material de acordo com as instruções

B - MATERIAL E SUAS CARACTERÍSTICAS

O estudante deve conhecer o material que será usado no laboratório, saber manipulá-lo e ter

conhecimento dos cuidados relativos á sua conservação.

01. Balões Volumétricos - vidro comum ou pirex, com diversas capacidades. Contém um volume

exato, a determinada temperatura (geralmente 20oC), podendo ser utilizados sem erro apreciável

em temperaturas mais ou menos 8oC acima e abaixo da indicada. Utilizados para o preparo de

soluções. Tratando-se de equipamento volumétrico aferido, não submetê-lo a altas temperaturas.

02. Buretas - vidro comum ou pirex, de diversas capacidades. Utilizados em titulações e para medidas

precisas de volume. Antes de ser usada, a bureta deve ser lavada com água corrente; em seguida

várias vezes com água destilada e depois três vezes com pequenas porções do líquido a ser

medido. Não usar escova para lavar a bureta nem colocá-la na estufa para secar.

03. Pipetas - vidro comum ou pirex. Distinguem-se dois tipos fundamentais:

Volumétricas, destinadas à transferência de volumes em múltiplos inteiros de 1 ml (ex. pipetas

Volumétricas de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 25 ml).

Graduadas, usadas para transferência de volumes que envolvem frações de 1 ml (ex. pipetas

graduadas de 1 ou 2 ml com divisões de 0,01 ml; de 5 ml ao 0,1 ml). Antes de serem usadas

devem ser lavadas com os mesmos cuidados indicados anteriormente para as buretas. Devem ser

lavadas inclusive com água destilada, logo após o uso.

04. Cilindros graduados ou provetas - vidro comum ou pirex com diversas capacidades, com ou sem

rolhas esmerilhada, utilizada para medir volumes com precisão até 0,5%.

05. Béqueres ou copos de Griffin - geralmente de vidro pirex, diversas capacidades. São destinados a

conter e não a medir volumes.

06. Frascos erlenmeyers - vidro pirex; diversas capacidades. Destinados principalmente a conter

volumes, para serem titulados.

07. Tubos de ensaio - vidro pirex ou comum, com ou sem orla; de diversos tamanhos. Utilizados para

reações.

08. Funis de vidro - de diversos diâmetros. Usados para filtrações ou transferência de líquidos para

recipientes de boca estreita.

09. Bicos de gás - possuem uma entrada para gás ajustável e uma entrada de ar, que permite regular a

composição da mistura gás e ar. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a entrada de

gás antes de ter à mão a chama para acendê-lo. Na chama do bico de gás distinguem-se três zonas:

uma neutra (sem combustão do gás, sendo portanto relativamente fria); uma redutora (onde a

combustão do gás é ainda incompleta) e uma oxidante (onde se dá a combustão completa do gás).

C – REAGENTES

Solução corada

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D – INTERPRETAÇÃO

01. Na parte I aprende-se: a técnica de pipetar soluções incolores e coradas; a preparar uma série de

soluções de reagentes de volume conhecido e de concentrações diferentes; a técnica de misturar

soluções em tubos de ensaio; a correlacionar altura de líquido no tubo de ensaio com o volume do

mesmo, o que é útil para testes qualitativos.

02. Na parte II aprende-se: a técnica de diluir uma solução de concentração conhecida; a forma pela

qual se completa o volume num balão volumétrico; a técnica de misturar soluções em balão

volumétrico. Esta técnica é utilizada no preparo ou na diluição de soluções de concentrações

definidas (molar, normal, etc.).

03. Na parte III aprende-se: como usar corretamente uma bureta, minimizando as causas de erro como

deixar bolhas de ar no seu interior; e fazer transferências de volumes exatos, o que é aplicado para

medida de reagentes tóxicos ou corrosivos, como soluções de cianeto ou ácidos concentrados; que

volumes medidos em provetas são menos exatos que os medidos em bureta, fonte de erro que deve

ser evitada.

04. Na parte IV aprende-se: a usar adequadamente um bico de gás; a aquecer líquidos em tubos de

ensaio, observando-se o volume contido no mesmo, que não deve ser superior a metade da

capacidade do tubo; a seguir as regras de segurança a fim de se evitar acidentes e perda de

material. Não se deve deixar ferver até evaporação completa do líquido. Geralmente a primeira

ebulição é suficiente.

E - PROCEDIMENTO

I - EMPREGO DE PIPETAS GRADUADAS

01. Treinar a técnica de pipetar usando água destilada. Observar: a leitura do menisco (solução incolor

parte inferior do menisco) se faz ao nível do olho; não se sopra a pipeta; no fim do escoamento

toca-se a ponta da mesma na parede interna do recipiente; mantêm-se sempre a pipeta na posição

vertical. Mede-se a quantidade de 1íquido escoado, por isto deve-se partir sempre da marca zero.

02. Completar as tabelas dadas no relatório (item F1).

03. Transferir para o béquer uma quantidade de solução corada um pouco maior do que a que se vai

utilizar. Transferir água destilada para o erlenmeyer.

04. Marcar 20 tubos de ensaio, de mesmo diâmetro e altura para cada série, de 1 a 5, de 6 a 10, de 11 a

15 e de 16 a 20

05. Usando a pipeta graduada de 1 ml ao 0,01, pipetar alíquotas da solução corada (ler o menisco na

parte superior) para os respectivos tubos, seguindo o esquema do relatório (item F-1 série A).

06. Lavar a pipeta com água comum e água destilada.

07. Utilizando a mesma pipeta, adicionar água destilada de modo a se completar o volume final da

pipeta em questão (1 ml).

08. Misturar bem os dois líquidos, sem inversão.

09. Observar e correlacionar a altura do líquido contido nos tubos com o seu volume. Registrar em cm

na tabela correspondente.

10. Repetir as operações 5 a 8 com as outras pipetas graduadas (itens F-1 séries B e D).

II - EMPREGO DE PIPETA VOLUMÉTRICA E BALÃO VOLUMÉTRICO

01. Medir com pipeta volumétrica 10 ml da solução corada.

02. Transferir esta alíquota para um balão volumétrico de 100 ml.

03. Adicionar cerca de 80 ml de água destilada.

04. Completar cuidadosamente o volume com água destilada até a marca (parte inferior do menisco),

empregando pipeta ou pisseta.

05. Misturar bem invertendo o balão pelo menos 10 vezes. Conservar a solução para uso posterior.

06. Ler a interpretação.

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07. III - OPERAÇÃO COM BURETA E PROVETA

01. Lavar a bureta segundo as instruções do item B.

02. Transferir para a bureta, com o auxílio do funil, uma pequena porção da solução preparada acima.

Remover o funil. Enxaguar a bureta e escoá-la totalmente. Repetir a operação.

03. Encher novamente a bureta com a solução de modo que o líquido ultrapasse a marca zero.

Remover o funil.

04. Retirar as bolhas de ar da extremidade inferior e acertar o menisco em zero (a altura do olho).

05. Transferir sucessivamente alíquotas de 1,00 - 2,50 - 5,65 - 10,38 ml para tubos de ensaio. Fazer as

leituras a altura do olho para evitar erro de paralaxe.

06. Acertar o menisco para o próximo número inteiro e transferir 20,00 ml da solução para a proveta.

07. Confrontar o volume transferido da bureta (20,00) com o marcado na proveta. Registrar.


IV - OPERAÇÃO COM BICO DE GÁS

01. Colocar cerca de 5 ml de água destilada em um tubo de ensaio.

02. Aquecer a água na chama de gás com agitação até a primeira fervura, empregando a pinça para

segurar o tubo de ensaio. Observar: agitação contínua do tubo para evitar projeção do líquido;

nunca manter a boca do tubo dirigida para si ou seu colega.


F - RELATÓRIO

Responder o relatório. Lavar todo o material recebido. Apresentar o relatório ao professor

responsável.

01. Esquema que deve ser preenchido e seguido no item F.

Série A

Tubos

Pipeta de 1,00 ml

Série B

Tubos

Pipeta de 2,00 ml

Solução

corada (ml)

H2O (ml) Solução

corada (ml)

H2O (ml)

1 0 1,00 1 0 2,00

2 0,26 0,74 2 0,53 1,47

3 0,40 0,60 3 1,00 1,00

4 0,55 0,45 4 1,55 0,45

5 0,80 0,20 5 1,80 0,20

Série C

Tubos

Pipeta de 1,00 ml Série D

Tubos

Pipeta de 2,00 ml

Solução

corada (ml)

H2O (ml) Solução

corada (ml)

H2O (ml)

1 0 5,0 1 0 10,0

2 1,7 3,3 2 2,4 7,6

3 2,5 2,5 3 4,0 6,0

4 3,0 2,0 4 6,3 3,7

5 4,2 0,8 5 8,0 2,0

02. Dar as características do material que encontrou em seu lugar, principalmente quanto a vidraria:

tipo de graduação, capacidade e temperatura de calibração.

a)___________________________________________________________

b)___________________________________________________________

c)___________________________________________________________

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d)___________________________________________________________

e)___________________________________________________________

f)___________________________________________________________

g)___________________________________________________________

h)___________________________________________________________

03. Indicar que material deve ser utilizado para as seguintes operações:

a) preparo de soluções normais (N):___________________________

b) medir volumes exatos de soluções tóxicas corrosivas ou muito concentradas:

________________________________

c) medir volumes com precisão de 0,5%:________________________

d) 20,00 ml de solução escoada da bureta corresponderam a ____________________________

na proveta.

04. Ao pipetar-se líquidos incolores emprega-se como referência a parte _______________ do

menisco (superior ou inferior).

05. Ao pipetar-se líquidos corados emprega-se como referência a parte _______________ do menisco

(superior ou inferior).

06. Indicar qual o tipo de pipeta que deve ser utilizado para se medir os seguintes volumes com maior

e menor precisão, lembrando que habitualmente não são usadas pipetas volumétricas de volumes

inferiores a 1 ml.

a) 5,00 ml ______________________ e ______________________

b) 1,00 ml ______________________ e ______________________

c) 0,50 ml ______________________ e ______________________

d) 0,32 ml ______________________ e ________

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CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS EM PAPEL


No final desta aula prática o estudante deverá saber:

01. Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia de aminoácidos.

02. Fazer a aplicação de aminoácido no papel de filtro.

03. Executar com precisão as operações necessárias à cromatografia ascendente.

04. Revelar um cromatograma.

05. Identificar aminoácidos de um cromatograma calculando seu Rf.

06. Ordenar solventes empregados em cromatografia de aminoácido baseado em sua polaridade.

07. Definir coeficiente de partição, fase móvel, fase fixa.

B - MATERIAL NECESSÁRIO

tubo de ensaio de 25 x 200 mm com uma rolha de cortiça com percevejo.

papel de filtro Whatman no.1, em tiras de 17 x 170 mm.

tubos capilares

1 forro de papel.

lápis e régua

estufa a 90o – 100

o C

1 placa de Petri

C - REAGENTES

Mistura de três amino-ácidos padrões (+ 0,2 M)

Mistura de amino-ácidos desconhecidos (+ 0,2 M)

Solvente: mistura butanol - ácido acético - água (4:1:5)

Revelador: solução de ninhidrina 0,25% em acetona.

D - INTERPRETAÇÃO

Cromatografia é uma técnica de grande importância na bioquímica moderna por permitir a

separação, identificação e até dosagem de misturas que são de difícil resolução, como por exemplo:

amino-ácidos, glúcides, ácidos graxos, assim como todos os seus derivados ou polímeros.

01.Princípio - A distribuição (partição) das substâncias (solutos) ocorre entre a fase aquosa

estacionária e a fase solvente em movimento. O soluto move-se na direção do fluxo do solvente a

uma velocidade que dependerá da sua atração, seja pela fase aquosa estacionária POLAR, seja

pela fase orgânica (apolar) implica numa velocidade maior de migração.

02. Suportes - O sistema de soluto e solvente necessita de um suporte inerte, que variará com o

objetivo da cromatografia. Pode-se utilizar papel de filtro, resinas e sais inorgânicos.

03. Tipos - Há várias formas de se efetuar uma cromatografia, donde os diversos tipos, de acordo com:

a) suporte usado: papel, camada fina (silica gel), coluna e troca iônica (resinas e sais inorgânicos).

b) fluxo do solvente: ascendente mono - e bidimensional, descendente mono- e bidimensional; disco.

Adota-se geralmente as bidimensionais para os casos em que há acúmulo de solutos num único

local na monodimensional.

04. Fatores - A migração do soluto é influenciada por: seu peso molecular, tipo de suporte,

temperatura ambiente, sistemas de solventes, pH, polaridade, ação capilar, tempo de corrida,

quantidade de soluto, etc.

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05. 05. Identificação - são vários os métodos para identificar e até dosar os componentes de mistura

cromatografada. Sua aplicação dependerá apenas do objetivo proposto e do tipo da cromatografia

adotado. No caso da cromatografia em papel, deve-se fazer uma revelação. Isto é, aplica-se sobre

o cromatograma um reagente que dê com o soluto uma reação corada, tornando-o portanto visível.

No caso dos amino-ácidos emprega-se como revelador uma solução de ninhidrina que dá um

produto azul com todos eles, exceto a prolina, cuja mancha é amarelada. No caso de se desejar

fazer uma determinação quantitativa deve-se localizar a mancha e eluir a mesma.

06. Índice - Quando se realiza uma cromatografia em papel obtém-se um índice adicional que é

característico para cada substância, desde que se fixe as condições da técnica. Este índice, Rf

(ratio front) é dado pela relação existente entre a distância percorrida pela mancha e a distância

percorrida pelo solvente, a partir do ponto onde foi colocada a mistura. O Rf deverá ser sempre

maior que zero. Se for igual a zero ou a 1, significa que a substância ou não se moveu, ou migrou

com o solvente. Nestes casos, deve-se então modificar o sistema de solventes. Devido aos fatores

mencionados acima, é aconselhável correr-se sempre que possível um padrão em paralelo com as

misturas.

E - PROCEDIMENTO

IMPORTANTE: Em todas operações abaixo evitar tocar no papel de filtro com os dedos.

Contaminações aparecerão, como manchas que prejudicarão o resultado da cromatografia. As

bancadas de estudantes deverão executar as duas partes (I e II) em paralelo.

I - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS PADRÕES

01. Em uma das extremidades de tira de papel de filtro, a uma distância de 25 mm traçar a lápis uma

linha transversal como referência para o ponto de origem.

02. Tocar com a ponta do tubo capilar contendo a mistura de três amino-ácidos padrões, o meio da

linha transversal traçada (ponto de origem), deixando escoar um pouco da mistura, evitando que o

mesmo se espalhe por uma área maior de 5 mm. Secar.

03. Repetir a mesma operação por duas vezes, tendo o cuidado de secar a mistura depositada antes do

toque seguinte. Os três toques colocarão 2,5 a 20 l de mistura a ser cromatografa.

04. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrária é quela onde foi feita a aplicação da

amostra. Fixar a tira de papel de filtro na face inferior da rolha de cortiça por meio de um

percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seu diâmetro.

05. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada à tira de papel de filtro, tendo o cuidado de não deixar

que a tira permaneça em contato com a parede interna do tubo.

06. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente + 1,5 cm, evitando que o ponto de aplicação da

mistura permaneça em contato com o solvente.

07. Esperar o tempo suficiente para a frente do solvente chegar até + 1,5 cm da rolha.

08. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente o tubo.

09. Marcar imediatamente a lápis o ponto atingido pela frente do solvente.

10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a 90-100o C.

11. Revelar o cromatograma. Para isto mergulhar rapidamente a tira de papel de filtro em uma placa

de Petri contendo o revelador.

12. Secar a estufa a 90-100o C.

13. Calcular os Rf . Para isto observar a figura abaixo

Rf = A

B

II - CROMATOGRAFIA DE AMINO-ÁCIDOS DESCONHECIDOS

01. Repetir todo o procedimento anterior usando agora uma mistura de amino-ácidos desconhecidos.

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02. Identificar estes amino-ácidos desconhecidos utilizando os dados de Rf determinados para os

aminoácidos padrões.

F - RELATÓRIO

01. Qual é a ordem crescente de polaridade das três substâncias presentes no solvente?

02. Como é calculado o Rf ?

03. Citar três aplicações práticas de cromatografia em papel.

04. Citar três condições que interferem em uma cromatografia em papel.

05. Registrar os Rf dos amino-ácidos padrões e dos desconhecidos, identificando-os:

Padrões Rf Desconhecidos - Rf

________________________________ __________________________________

________________________________ __________________________________

________________________________ __________________________________

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AULA PRÁTICA No 03

PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS


No final desta aula prática, o estudante deverá saber:

01. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento das propriedades das

proteínas.

02. Definir os termos: desnaturação e precipitação salina.


1- Tipos de ensaio

- Pinça para tubos de ensaio

Pipetas graduadas: 1 ml, 2 ml, 10 ml

Papel de filtro

Funis de vidro

Espátula

Bequeres

1 termômetro

C - REAGENTES

Solução de albumina de ovo a 0,5% em tampão acetato de sódio a 0,025 M,

pH = 4,5.

Solução de glicina a 2%

Solução de ácido tricloroacético a 2%

Solução de ácido pícrico a 5%

Solução de cloreto férrico a 1%

Solução saturada de (NH4)2SO4

leite

Solução de gelatina

Tampão acetato de sódio pH 6,0; 4,7 e 3,5

álcool etílico a 95%

NaOH 2N

Solução de HCl 2N

Espátula

Solução de CuSO4 1%

D - INTERPRETAÇÃO

01. Neste procedimento verifica-se a desnaturação das proteínas pelo calor. A intensidade de

desnaturação pode ser observada através da reação das proteínas aquecidas a diferentes

temperaturas, com o Biureto (que contém CuSO4 e NaOH): polipeptídeos contendo mais que 2

ligações peptídicas reagem com o Biureto formando compostos coloridos, enquanto os

aminoácidos não reagem com o Biureto.

02. São reagentes alcalóides: ácido pícrico, ácido fosfomolíbdico, ácido tricloroacético, ácido

ferrocianico, ácido sulfosalicílico e outros.

Os ânions destes ácidos combinam-se com as proteínas que possuem carga positiva, formando

sais insolúveis. (As proteínas apresentam-se carregadas positivamente quando estão em meio

mais ácido em relação ao seu ponto isoelétrico (pH < pI).

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03. Proteínas quando colocadas em solução de pH situado no lado alcalino ao seu ponto isoelétrico

(pH > pI) estão carregadas negativamente e combinam-se com cátions de metais pesados

formando proteinatos insolúveis.

04. Neste procedimento estamos fracionando as proteínas pela remoção da fase sólida de uma ou mais

frações deixando outras na fase líquida, por adição de um sal neutro. As proteínas que ficaram no

precipitado e aquelas que passaram no filtrado são testadas neste procedimento pelo reagente de

Biureto.

05. As proteínas tem solubilidade mínima no pH correspondente ao seu ponto isoelétrico. Entretanto, a

gelatina mesmo no pH do PI é parcialmente solúvel. Desta maneira, para melhor visualizar a

precipitação no pH isoelétrico da gelatina, acrescenta-se um agente que compete com a proteína

pelo solvente, num processo semelhante ao "salting-ou". Naturalmente, a maior precipitação é

observada no pH correspondente ao pH isolétrico, devido a maior afinidade proteína-proteína.

E - PROCEDIMENTO

01. Desnaturação pelo calor

- Tomar 4 tubos de ensaio e numerá-los 1, 2, 3, 4.

A cada um dos 4 tubos adicionar 4 ml de solução de albumina de ovo a 1% em tampão acetado de

sódio 0,025 M pH = 4,5.

- Aquecer cada um dos tubos durante dois minutos nas seguintes temperaturas. (veja primeiro a

observação)

Tubo 1 – 100oC

Tubo 2 – 80oC

Tubo 3 – 60oC

Tubo 4 – 40oC

Observação: Para conseguir as diversas temperaturas, proceda do seguinte modo:

Aqueça 250 ml de água até a ebulição. Nesta temperatura, aqueça o tubo 1. Após aquecer o

tubo 1, adicione água fria até atingir 80oC(use termômetro); aqueça então o tubo 2. Adicionar água fria

até atingir 60oC; aqueça o tubo 3. Adicionar água fria até atingir 40

oC, aqueça o tubo 4. Filtrar no tubo

utilizando papel de filtro pré-umidecido em água.

Retirar de cada tubo 0,3 ml e fazer a reação de biureto do seguinte modo:

A cada tubo contendo 0,3 ml adicionar 1 ml de NaOH 2N e, gota a gota, CuSO4 a 1% (ler a

interpretação).

02. Precipitação pelos agentes dos alcalóides

2.1.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente.

A cada um dos tubos adicionar 3 ml de ácido tricloroacético a 2% observar se ocorre

precipitação

2.2.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina, e albumina de ovo, separadamente.

A cada um dos tubos de ensaio colocar 2 ml de NaOH 2N. Adicionar 3 ml de ácido

tricloroacético a 2%. Observar se ocorre precipitação.

2.3.Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente.

A cada um dos 2 tubos adicionar 1 ml de ácido pícrico. Observar se ocorre precipitação (ler a

interpretação).

03. Precipitado de proteínas pelos Sais de Metais Pesados

3.1. Em 2 tubos de ensaio separados adicionar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo.

Adicionar, gota a gota, solução de cloreto férrico a 1%. Verificar a formação de precipitação.

3.2. Em 2 tubos de ensaio colocar 2 ml das soluções de glicina e albumina de ovo, separadamente.

A cada um dos 2 tubos adicionar 2 ml de HCl 2N. E gota a gota, solução de FeCl a 1%.

Observar se ocorre precipitação. (ler a interpretação).

04. Precipitação Salina

15

4.1. Em um tubo de ensaio adicionar: 5 ml de leite, 5 ml de solução saturada de (NH4)2SO4.

Filtrar. Recolher o filtrado. (ler a interpretação)

4.2. Tomar 2 tubos de ensaio e marcá-los F e P.

No tubo F adicionar 1 ml do filtrado

No tubo P;

Com uma espátula remover um pouco do precipitado e transferí-lo para o tubo P. Adicionar

água para dissolver o precipitado.

Nos tubos F e P realizar o teste de Biureto, procedendo da seguinte maneira:

A cada um dos tubos adicionar:

A 1 ml de NaOH 2N, gota a gota CuSO4 a 1%. (ler a interpretação).

05. Precipitação no Ponto Isoelétrico

Preparar uma série de tubos da seguinte maneira:

Tubos Tampão Acetato de sódio Solução de

Gelatina PH = 6,0 PH = 4,7 PH = 3,5

1 2 ml

-

-

-

2 ml

-

-

-

2 ml

2 ml

2 2 ml

3 2 ml

Homogenizar. Adicionar 7 ml de Etanol a 95% a cada um dos 3 tubos. Observar os tubos após 20

minutos e concluir qual é o valor de pI da gelatina.

F - RELATÓRIO

01. Discutir os resultados obtidos em cada item da prática.

02. Fazer um gráfico no qual se estabeleça a relação entre temperatura e perda de cor das soluções

obtidas no procedimento 1.

03. Explicar o fenômeno da precipitação salina.

04. Construir um gráfico de pH em função da solubilidade para procedimento 5, mostrando que a

solubilidade é mínima no pH correspondente ao pI da gelatina.

05. Em que condições de pH, as proteínas são melhor precipitadas:

a) por reagentes de alcalóides?

b) por sais de metais pesados?

16

AULA PRÁTICA No 04

PROPRIEDADES DAS ENZIMAS

A - OBJETIVOS ESPECIFICOS


01. Manipular experimentalmente soluções de enzimas.

02. Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidades.

03. Manipular reações catalizadas por enzimas com a finalidade de determinar semi-

quantitativamente a influência da concentração de enzima, da temperatura e do pH na atividade

enzimática.

04. O significado das operações e reações realizadas.


pipetas graduadas de 1 ml

tubos de ensaio e suporte

banho maria a 37o C e banho de gelo

1 bico de gás

1 termômetro

algodão

1 espátula

1 béquer de 200 ml

3 béqueres 100 ml

suporte de pipeta

pinça de tubo de ensaio

conta-gotas

C - REAGENTES

Éter ou parafina

Solução de sacarase (levedo de padaria 1g%)

Solução de sacarose a 1%

Solução de amido a 5%, 0,5%

Reagente de Benedict

Lugol


A saliva contém uma enzima digestiva chamada amilase salivar que hidrolisa amido e

glicogênio até maltose (dissacarideo redutor). A sacarase é também uma enzima digestiva presente no

suco intestinal que hidrolisa a sacarose até glicose e frutose (monossacarideos redutores).

Na pesquisa I, observa-se a propriedade "especificidade enzimática", isto é, a sacarase não

hidrolisa o amido e a amilase salivar não hidrolisa a sacarose.

Os resultados obtidos na pesquisa II mostram que as enzimas são termolábeis, isto é, perdem

sua atividade quando aquecidas a altas temperaturas.

A pesquisa III demonstra que quanto maior é a concentração da enzima maior é a intensidade

de hidrólise evidenciada pela maior quantidade de redução de cobre. O 4o e 5

o tubos funcionam como

controles.

Com a pesquisa IV é constatada a influência da temperatura sobre a atividade das enzimas.

17

A pesquisa V mostra a influência do pH na atividade enzimática. Todas as enzimas possuem

um pH ótimo, cuja atividade é máxima. No caso de pepsina este pH é em torno de 1,5.

E – PROCEDIMENTO

Coletar 1 ml de saliva e adicionar 9 ml de H2O destilada.

I - ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA

01. Colocar respectivamente em quatro tubos de ensaio numerados:

1o - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de sacarose a 1%

2º - 1 ml de sacarase 1% + 1 ml de amido a 5%

3º - 1 ml de saliva + 1 ml de sacarose a 1 %

4º - 1 ml de saliva + 1 ml de amido a 5%

02. Deixar ` temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos.

03. Adicionar, em seguida, a cada um dos tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até

ebulição.

04. Observar os resultados notando em quais tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

II - TERMOLABILIDADE

01. Colocar respectivamente em dois tubos de ensaio numerados.

1o - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada. Ferver e resfriar.

2o - 1 ml de sacarase + 1 ml de H O destilada.

02. Adicionar a ambos os tubos 1 ml de sacarose a 1%.

03. Incubar os dois tubos em banho maria a 37oC por 10 minutos.

04. Adicionar aos 2 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.

05. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

III - INFLUÊNCIA EM CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

01. Colocar respectivamente em 5 tubos de ensaio numerados:

1º - 0,2 ml de sacarase + 0,8 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%.

2º - 0,5 ml de sacarase + 0,5 ml de H O destilada + 1 ml de sacarose a 1%.

3º - 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de sacarose.

4º - 1,0 ml de H O destilada + 1,0 ml de sacarose.

5º 1,0 ml de sacarase + 1,0 ml de H O destilada.

02. Adicionar aos 5 tubos 1 ml do reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição.

03. Observar os resultados notando em que tubo houve atividade enzimática (redução do cobre).

IV - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver as seguintes técnicas:

Tubos Amido 5% (ml) Água Destil. (ml) Enzima (ml) Temperatura para

Incubação

1 2,5 2,5 - 30 – 37oC

2 2,5 2,0 0,5 30 – 37oC

3 2,5 2,0 0,5 0 – 10oC

4 2,5 2,0 0,5 70 – 100oC

Agitar os tubos e incubá-los nas respectivas temperaturas durante 15 minutos. Adicionar 2

gotas de lugol em cada tubo e agitá-los virogorosamente. Observar os resultados.

18

V - INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÀTICA

Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver a seguinte técnica:

Tubos Amido 5%

(ml)

Tampão pH

3,0 (ml)

Tampão pH

7,0 (ml)

Tampão pH

12 (ml)

H2O dest.

(ml)

Enzima (ml)

1 2,5 - - - 2,5 -

2 2,5 2,0 - - - 0,5

3 2,5 - - - - 0.5

4 2,5 - 2,0 2,0 - 0,5

Agitar os tubos e incubá-los em condições ambientais (30 - 37 C) durante 15 minutos.

Adicionar 1 gota de lugol em cada tubo e agitá-los vigorosamente. Observar os resultados.

VI - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

Numerar 4 tubos de ensaio e desenvolver a seguinte técnica:

Tubos Amido 5% (ml) H2O destilada (ml) Enzima (ml)

1 1,0 3,5 0,5

2 2,0 2,5 0,5

3 3,0 1,5 0,5

4 4,0 0,5 0,5

Agitar os tubos e incubá-los em condições ambientais (30 - 37 C) durante 15 minutos.

Adicionar 2 gotas de lugol em cada tubo e agitá-los vigorosamente. Observar os resultados.

F - RELATÓRIO

01. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função da concentração de enzima.

02. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função da temperatura.

03. Fazer um gráfico mostrando a atividade enzimática em função do pH.

04. Das propriedades estudadas nesta aula prática qual é mais característica da catálise enzimática?

05. Explicar porque o aquecimento até fervura determina perda de atividade das enzimas.

06. Citar as enzimas, seus respectivos substratos e produtos que foram utilizados neste trabalho

prático.

Enzimas Substratos Produtos

a.

b.

c.

07. Mostrar os resultados observados em cada experimento.

19


IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS



01. Executar testes qualitativos para reconhecimento de glúcides.

02.O significado dos seguintes testes: iodo, Benedict, Seliwanoff, Molish.

03.Aplicar os testes acima para identificar três glúcides desconhecidos.



1 bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca

1 pinça para tubo de ensaio

1 bastão de vidro fino

lâmina e microscópio

C - REAGENTES

Soluções padrões de glúcides (ver relatório)

Soluções de 3 glúcides desconhecidos,

Solução de lugol: 0,5 g iodo metálico, 1,0 g iodeto potássio, dissolvidos em 100,0 ml de água

Regente de Benedict: 17,3 g sulfato de cobre, 173,0 g citrato de sódio e 100,0 g carbonato de

sódio anidro dissolvidos em 1.000,0 ml de água

Reagente de Seliwanoff: 0,05 g ressorcinol dissolvidos em 100,0 ml HCl + 6 N.

Solução alcoólica de alfa-naftol a 1%

H2SO4 concentrado.


Este experimento pode servir de modelo para caracterizá-1o dos constituintes de material

biológico por meio de um conjunto de reações qualitativas. Pelo sistema de identificação e eliminação

progressiva pode-se dizer, ao final do trabalho prático, quais foram os glúcides fornecidos dentre os

seguintes: glicerose, glicose, frutose, lactose, manose, sacarose e amido, por exemplo.

01. O teste de iodo serve para diferenciar homopolissacárides dos outros glúcides. Os

homopolissacárides, do tipo amido, formam com o iodo um complexo (produto de adsorção)

colorido.

Pela coloração resultante pode-se identificar, por exemplo: azul-amido; avermelhado-glicogênio;

roxo avermelhado-dextrinas, incolor-inulina.

02. O teste de Benedict serve para diferenciar glúcides redutores de não redutores. Glúcides que

tenham 1 carbono anomérico livre dão reações positivas, pois podem sofrer oxidação. A solução

de Benedict contém um complexo de citrato e cobre. Em presença de açúcar redutor o Cu+2

(azul)

é reduzido a Cu+, que é menos solúvel em solução alcalina, e precipita sob a forma de Cu2O

(amarelo ou vermelho). O açúcar, por sua vez, é oxidado, quebrado e polimerizado na solução.

03. O teste de Seliwanoff serve para diferenciar cetoses (por exemplo: frutose, sacarose) de aldoses

(glicose, lactose).

20

Cetoses, quando em solução ácida e aquecimento, formam composto 4- Hidroximetil furfural que

reage com o resorcinol (reagente de Seliwanoff) dando um produto de cor vermelha, cuja

estrutura não é bem conhecida.

H2SO4 composto vermelho

Açúcar

As Soluções concentradas de Aldoses também dão reação positiva, porém a velocidade da reação

é pequena. Assim, corre-se um padrão contendo cetose (frutose, por exemplo) para, se fazer um

controle do tempo de formação do produto colorido.

04. O teste de Molish serve para diferenciar açúcares de 5 ou mais átomos de carbono dos de menor

número de átomos de carbono. Os de maior número de carbono (5 ou mais), sob a ação

desidratante ao H2SO4, transformam-se em furfural ou Hidroximetil furfural. Estes reagem com

os fenóis (no caso, o -naftol) dando origem a um composto marron-avermelhado. Para o bom

êxito desta reação é necessário que o tubo de ensaio esteja bem seco e que haja a menor agitação

possível.

E - PROCEDIMENTO

Para esta unidade prática o estudante deverá preparar antes de começar a mesma o quadro geral

de reações de glúcides que consta no Relatório. Quando houver dúvida num resultado de reação, deve-

se realizar o mesmo teste empregando a solução do glúcide padrão suposto. Não há necessidade de se

medir com pipetas os reagentes fornecidos. Usar gotas, considerando que 1 ml = 20 gotas. Para as

Soluções de glúcides desconhecidas, tomar volumes aproximados.

I - TESTE DE IODO

01. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução de glúcide a ser identificado.

02. Adicionar 1 gota da solução lugol. O aparecimento de coloração azul, indica reação positiva.


II - TESTE DE BENEDICT

01. Colocar em tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.

02. Adicionar 1 ml do reagente de Benedict e misturar.

03. Aquecer, com agitação e diretamente, na chama. Deixar em ebulição por + 1 minuto.

04. Observar a solução. A mudança de coloração (azul para verde até vermelho tijolo) e/ou formação

de precipitado (cor de tijolo) indica reação positiva.


III - TESTE DE SELIWANOFF

01. Colocar em um tubo de ensaio + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.

02. Colocar em um tubo + 0,5 ml da solução de frutose (C = controle).

03. Acrescentar a cada um dos tubos 1 ml de reagente de Seliwanoff e misturar.

04. Colocar os tubos num banho de água em ebulição.

05. Observar periodicamente. No momento em que a coloração do tubo C ficar vermelha, retira-se os

tubos do banho.

06. Comparar o tubo D com o controle. O aparecimento da cor vermelha indica reação positiva.


21

IV - TESTE DE MOLISH

01. Colocar em um tubo de ensaio seco + 1 ml da solução do glúcide a ser identificado.

02. Acrescente 3 gotas da solução alcoólica de alfa-naftol e misturar.

03. Gotejar + 2 ml de H2SO4 concentrado pela parede do tubo inclinado, de modo que os dois líquidos

não se misturem. Voltar, cuidadosamente, o tubo à posição vertical.

04. Deixar em repouso. O aparecimento de estrias ou de anel roxo na superfície da separação dos dois

líquidos indica reação positiva.


F - REALTÓRIO

Preencher a tabela abaixo, marcando os testes positivos com (+) e os negativos com (-).

IODO BENEDICT SELIWANOFF MOLISH

Glicerose

Glicose

Frutose

Lactose

Maltose

Sacarose

Amido

Desconhecido

A-

B-

C-

22

AULA PRÁTICA No 06

FERMENTAÇÃO ALCÓOLICA

I- INTRODUÇÃO

Glicólise é o processo pelo qual os organismos vivos degradam glicose em ácido lático na

ausência de oxigênio molecular, para propósitos de obtenção de energia química. É uma das várias

vias usadas por diferentes espécies de organismos para degradar glicose anaerobicamente e que são

conhecidos genericamente como fermentações. A glicólise é o tipo de fermentação anaeróbica da

glicose que ocorre nas células dos animais superiores e em muitas plantas e microrganismos.

Um outro tipo de fermentação da glicose é a fermentação alcoólica de leveduras em que a

glicose é degradada em Etanol e Dióxido de Carbono. A glicólise e a fermentação alcoólica possuem

vias aproximadamente idênticas. A via comum é a formação de Piruvato. Na glicólise o Piruvato é

reduzido a lactato:

Piruvato + NADH + H +

lactado + NAD+

Na fermentação alcoólica o Piruvato é descarboxilado em presença da enzima Piruvato

descarboxilase:

CH3 – C – COO- + H

+ CH3 – C-H + CO2

|| ||

O O

No passo final da fermentação alcoólica o Acetaldeído é reduzido a Etanol pela NADH + H+,

uma reação catalizada pela desidrogenase alcoólica.

CH3C – H + NADH + H+ CH3 – CH2OH + NAD

+

||

O

A equação global da fermentação alcoólica pode ser escrita:

C6H12O6 + 2Pi + 2ADP 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O

Em adição, podemos dizer que todos os organismos heterotróficos obtêm sua energia de

reações de oxidação-redução, isto é, reações nas quais elétrons são transferidos de um composto, o

doador de elétrons, ou agente redutor para um aceptor de elétrons, o agente oxidante. Na fermentação

alcoólica o oxidante final ou aceptor de elétrons é alguma molécula orgânica, produzida no próprio

processo de fermentação que no caso é o Acetaldeído.

II- MATERIAL E MÉTODOS

Em um balão de fundo de 1000 ml(A) acrescentar 200 ml de solução aquosa de Sacarose a

15%. À parte, num gral, suspender 1/2 tablete de fermento Fleischmann (fermento de padaria)

finamente esmiuçado, em 100 ml de água destilada. Juntar suspensão de fermento a solução aquosa de

Sacarose; agitar para que a suspensão se torne uniforme. Obturar a boca do balão com uma rolha

atravessada por um tubo curvo(B) que vai até no fundo do tubo (C), passando pela rolha que a obtura.

O tubo C (25 x 180mm) contém aproximadamente 20 ml de uma solução saturada de Hidróxido de

bário (Ba(OH)2.8H2O) (aproximadamente 6 g%), a rolha deste tubo é ainda atravessada por um tubo

com bulbo contendo Hidróxido de bário (D).

Agitar, em um agitador magnético, a suspensão celular, para homogeinização. Notar a

passagem de gás na solução de Hidróxido de bário. Como o gás (CO2) borbulha, um precipitado de

carbonato de bário (BaCO3) será formado. Deixar fermentando aproximadamente por 2 (duas) horas.

23

Desmontar o aparelho. Deixar o tubo C em repouso para sedimentação. Decantar o

sobrenadante e lavar por decantação com água destilada o precipitado de Carbonato de bário formado.

Suspender o precipitado em aproximadamente 15 ml de água destilada. Colocar 1 ml da

suspensão, em tubo de ensaio, e juntar gotas de ácido clorídrico a 10%. Notar a efervescência

(produção de CO2).

III- REAÇÕES

1. Formação de Carbonato de bário:

Ba(OH)2 + CO2 BaCO3 + H2O

2. Liberação de CO2:

BaCO3 + 2HCl BACl2 + H2O + CO2

Conectar o balão a um condensador (ver figura abaixo) e destilar, recolhendo as primeiras

porções do destilado (aproximadamente 15 ml).

Pesquisar álcool etílico no destilador. Para isso colocar 1 ml em um tubo de ensaio e

alcalinizar com 3 gotas de solução de Hidróxido de sódio a 10%. Adicionar Lugol diluído (ver abaixo)

gota a gota, com agitação, até persistência de coloração amarelada (excesso de iodo). Deixar em

repouso para sedimentação.

Inicialmente, pela adição de Lugol, a solução torna-se opalescente. Em excesso do iodo forma-

se iodofórmio, um precipitado amarelo de cheiro característico. Com auxílio de pipeta, retirar pequena

porção do precipitado a verificar ao microscópio os cristais formados.

LUGOL DILUÍDO

Iodo metálico 0,5 g

Iodeto de potássio 1,0 g

água destilada 100 ml

Reações para formação de iodofórmio:

CH3CH2OH + I2 + 2NaOH CH3CHO + 2NaI + 2H2O

CH3CHO + 3I2 + 4NaOH CHI3 + 3H2O + 3NaI + HCOONa

IV- TESTE ADICIONAL

A uma pequena porção do destilado inicial, em vidro de relógio, acender chama verificando

ser inflamável (teste inicial). Proceder aos testes para comprovar formação de Etanol, usando iodo, e

verificar produção de Carbonato de bário no tubo coletor e gás.

V- QUESTÕES PARA RESPONDER NO LABORATÓRIO

01. Qual a enzima responsável pela hidrólise de Sacarose, presente na levedura?

02. A frutose produzida pela hidrólise será metabolizada? Como?

03. Qual o Saldo em ATP's formados a partir de um mol de Sacarose?

04. Lactato produzido no músculo é 1utilizado par formação de Glicose? Etanol, em presença de

levedura, é substrato para formar Glicose? Por quê?

05. Se adicionarmos Iodoacetato ou Fluoreto ao balão contendo levedura e Sacarose haverá produção

de Etanol? Por quê? Qual o composto que se acumula no meio de reação?

06. Um substrato do Ciclo dos ácidos tricarboxilicos, poderia formar Etanol em presença de levedura?

Explicar dando exemplo.

07. Qualquer componente da via glicolítica pode servir como substrato para fermentação alcoólica?

Por quê?

08. Em ausência de NADH + H+ a fermentação se processaria? Porque?

24

AULA PRÁTICA No 07

pH, TAMPÕES


No final desta parte da aula prática o estudante deverá saber:

01. Definir pH e reconhecer sua importância nos sistemas biológicos.

02. Transformar concentração de H em pH e vice-versa.

03. Definir indicadores e usá-los adequadamente.

04. Definir sistemas tampões, explicar como funcionam e observar seu efeito.

05. Usar a equação de Henderson-Hasselbalch.

B - MATERIAL

Tubos de ensaio e suporte

Pipetas graduadas de 1,00 - 5,0 e 10,0 ml

Bequer de 100 ml

C - REAGENTES

Ácido clorídrico 0,1 N

Ácido acético 0,1 N

Hidróxido de sódio 0,1 N

Reativo de Topfer: solução alcoólica de p-dimetilaminoazobenzeno a 0,5%.

Soluções Tampões de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

Indicador Universal: 0,05 g laranja de metila; 0,15 g vermelho de metila; 0,30 g azul de

bromotinol; 0,35 g fenolftaleina, dissolvidos em 1 litro de álcool 66%.

D - INTERPRETAÇÃO

Os seres vivos são equipados com mecanismos que regulam o pH de seus líquidos

intra e extra celulares dentro de limites muito estreitos. Embora ácidos e bases sejam

formados constantemente no metabolismo, a concentração hidrogeniônica varia muito pouco,

em virtude da presença de sistemas tampões eficientes nos tecidos e líquidos do organismo. O

pH do sangue, por exemplo, deve se conservar entre 7,0 e 7,8 para ser compatível com a vida.

É portanto, importante que o estudante compreenda o significado de pH, o papel e o

mecanismo da ação dos tampões.

01. Concentração hidrogeniônica (pH) - A acidez de uma solução pode ter DUAS

significações. Primeira: medida da quantidade total de íons H , dissociadas ou

dissociáveis, encontrados em uma solução. É chamada acidez titulável ou total e depende

apenas da concentração do ácido. Segunda: medida de quantidades de íons H+ livres na

solução. Esta depende da concentração do ácido e de sua constante de dissociação.

Costuma-se expressar a concentração de íons H em moles por litro. Mas nos sistemas

biológicos seus números são muito pequenos, por isso Sobrensen sugeriu que se adotasse

a termo pH, definindo-o da seguinte forma:

25

pHH

H

log log

1

Exemplos de transformações de [H ] em pH e vice-versa:

a) Dada a concentração hidrogeniônica igual a 0,00634 M ou

6,34 x 10-3

M, calcular o pH.

[H+] = 6,34 x 10

-3M

log [H+] = log (6,34 x 10

-3) = log 6,34 + log 10

-3

log [H+] = 0,8021 + (-3) = - 2,1979

- log [H+] = 2,20; portanto pH = 2,20

b) Dado o pH 2,20, determinar a concentração hidrogeniônica.

[H+] = 10

-pH = 10

-2,20 = 10

-3,0 x 10

+0,8

Se log = 0,8, então y = 6,3l

portanto [H] = 6,31 x 10-3

M ou 0,00631 M

02. Indicadores - São substancias usadas para determinar valores de pH, podendo ser por isso

utilizadas também em alcalimetria e acidimetria. Quimicamente são ácidos ou bases

orgânicos fracos cuja forma dissociada apresenta uma cor diferente de forma não

dissociada.

Exemplo: HIn -------- H+ + In

-

vermelho amarelo

Por isso a predominância de uma ou outra das cores dependerá da concentração de

íons H+ no meio. Quando o indicador está 50% dissociado e 50% não dissociado, diz-se que o

mesmo está no seu ponto de viragem. Isso ocorre num intervalo definido para cada indicador,

como pode-se observar na tabela abaixo:

Tabela 1 - Características dos indicadores (Clark e Lubs)

Indicador PKIn Cores e Zonas do pH

Azul de timol

Amarelo de metila

Laranja de metila

Azul de bromofenol

Verde de bromocresol

Vermelho de metila

Clorofenol

Púrpura de bromofenol

Azul de bromotimol

Vermelho de fenol

Cresol

Azul de timol

Fenolftaleina

1,7

3,3

3,5

4,0

4,7

5,0

6,0

6,2

7,1

7,8

8,3

8,9

9,7

Vermelho 1,2 – 2,8 amarelo



Amarelo 3,1 – 4,7 azul



Amarelo 5,1 – 5,7 vermelho

Amarelo 5,4 – 7,0 púrpura





Incolor 8,3 – 10,0 vermelho

26

Se adicionarmos algumas gotas de solução de um dos indicadores mencionados na

tabela à uma solução de pH desconhecido, um deles se encontrará em sua zona de transição

apresentado cor intermediária, tendo-se desta forma, medida aproximada do pH da solução.

a) Indicador Universal - é uma mistura adequada de indicadores que apresenta variação de cor

em toda escala de pH. é usado na determinação aproximada do pH.

Tabela 2 - Coloração do Indicador Universal em vários pH

PH Cor PH Cor

3 ou menos

4

5

6

7

Vermelho

Vermelho-laranja

Laranja

Amarelo

Verde amarelo

8

9

10

11 ou mais

Verde-azulado

Azul

Violeta

púrpura

b) Papel indicador - em vez da solução de indicador costuma-se usar também um papel

impregnado de indicador, que também determina aproximadamente o pH. É o papel

indicador.

NOTA: O pH de uma solução pode ser também determinado de modo muito preciso por

meio de potenciômetros, aparelhos que medem a diferença de potencial entre uma

solução contendo uma quantidade conhecida de íons H e a solução desconhecida.

Esta diferença é diretamente proporcional à concentração de íons H .

03. Tampões - Soluções tampões são sistemas que tendem a manter constantes seu pH quando

a eles é adicionado ácido ou alcali. Este sistema consiste geralmente de uma mistura de

ácido fraco e seu sal. O pH de uma solução tampão depende das proporções relativas de

seus componentes. A dissociação de um ácido fraco HA pode ser expressa por:

AH A- + H

+

Introduzindo a constante de dissociação (K ), rearranjando e tomando os logaritmos,

tem-se:

K

A H

AHa

, donde

1 1

H K

A

AH

. , e

log

1

H

= log 1

K + log

A

AH

por definição, pH = log

1

H

. Chamando log 1

K de pK,

tem-se:

pH = pK + log

A

AH

27

Em uma mistura de ácido fraco e seu sal de alcali forte, praticamente todos os ânions

provém do sal, pois o ácido está pouco dissociado. Pode-se então escrever:

pH = pK + log

sal

acido

Vê-se que o pH de uma solução tampão depende não das concentrações absolutas mas

das concentrações relativas do ácido e do sal. A relação acima é a clássica equação de

Henderson-Hasselbalch para as soluções tampões e deve ser empregada na resolução dos

problemas.

E - PROCEDIMENTO

I- CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO E pH

01. A partir de HCl 0,1 N, preparar 0,01N, 0,001 N, 0,0001 N, 0,00001 N, 0,000001 N.

02. Calcular o pH aproximado de cada solução, supondo que o ácido esteja completamente

dissociado (consultar a parte teórica).

03. Adicionar a cada tubo 1 gota de reativo de Topfer e misturar, sem inversão.

04. Observar a cor correspondente a cada tubo e conservá-los para comparação.

05. Determinar o pH aproximado de uma solução de ácido acético 0,1 N, usando o indicador

de Topfer e comparando com os tubos de HCl de pHs conhecidos (usar 9 ml de ácido

acético 0,1 N e 1 gota de reativo de Topfer). Anotar os resultados.


II- DEMONSTRAÇÃO DO EFEITO TAMPÃO

01. Tomar 8 tubos de ensaio iguais. Colocar no primeiro 1,0 ml de tampão pH 3, no segundo

1,0 ml de tampão pH 4 e assim sucessivamente, até tampão pH 10. Acrescentar a cada

tubo 9,0 ml de água destilada. Adicionar a cada tubo 5 gotas de indicador universal.

Misturar sem inversão. Observar as cores formadas e comparar esta escala com as cores

indicadas na tabela 2 do item D-2. Conservar esta escala de pH.

02. Tomar outros 4 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 4. Colocar 5 gotas de indicador

universal em cada um.

03. Aos tubos 1 e 3 adicionar 10 ml de água destilada.

04. Aos tubos 2 e 4 adicionar 1,0 ml de tampão pH 7 e 9,0 ml de água destilada.

05. Acrescentar aos tubos 1 e 2, 2 gotas (2) de NaOH 0,1 N. Misturar, sem inversão. Observar

se há mudanças de pH, comparando com a escala preparada no item 1. Anotar.

06. Por meio de uma pipeta de 1 ml soprar ar através da solução do tubo até que não se

verifique mais mudança de cor da solução. Determinar o pH, comparando a escala e

anotar.

07. Com a mesma técnica descrita no item anterior, soprar no tubo 2 por um tempo mais

prolongado. Anotar o que foi observado.

08. Tratar os tubos 3 e 4 como no item 5, usando HCl 0,1 N em vez de NaOH 0,1 N.

09. Continuar a adição de HCl 0,1 N ao tubo 4, gota a gota. Determinar quantas gotas de

ácido devem ser acrescentadas até que se obtenha a mesma cor do tubo 3.


F – RELATÓRIO

28

TRABALHO ITEM I

a) Qual é o pH aproximado do ácido Acético 0,1 N?

b) Como se explica a diferença de pH entre o ácido acético 0,1 N?

c) A acidez titulável de volumes iguais de HCl e CH3 COOH na mesma concentração é

(igual/diferente).

Trabalho Item II

a) Houve variação detectável de pH pela adição de NaOH ao ___________________

__________________________(tubo 1/tubo 2). Porque? ________________________

___________________________________________________________________________

_____

b) Soprando através de uma pipeta nos tubos 1 e 2 houve maior variação de pH no

___________________________________________________________(tubo 1/tubo 2).

c) Soprando no tubo 2 durante muito tempo ________________________________

(conseguiremos/não conseguiremos) abaixar seu pH do tubol. Isso se explica porque

_________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

_____

d) Quantas gotas de HCl 0,1 N foram adicionadas ao tubo 4 para atingir o mesmo pH

atingindo no tubo 3 com 2 gotas de HCl 0,1N?

EXERCÍCIOS PARA CASA

Estes problemas devem ser resolvidos em casa e constituem uma aplicação da equação

de Henderson-Hassalbach.

Considerando-se o sistema tampão ácido acético/acetato e sabendo-se que pK do ácido

acético é 4,70, calcular:

a) O pH de uma solução resultante da adição de 30 ml de ácido acético 0,1 M a 30 ml de

acetato de sódio 0,1 M.

b) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5 ml de HCl 0,1 N à solução obtida em a.

c) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5 ml de HCl 0,1 N a uma solução obtida

diluindo-se 7 ml do tampão obtido em a com 93 ml de H2O destilada.

d) O pH da solução resultante da adição de 70 ml de ácido acético 0,2 M a 30 ml de acetato de

sódio 0,2 M.

e) O abaixamento de pH resultante da adição de 0,5ml de HCl 0,1 N à solução obtida em d.

f) A concentração de H da solução obtida em d.

29

AULA PRÁTICA No 08

EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDIOS



01. Caracterizar triacilgliceróis através de hidrólise alcalina (saponificação).

02. Evidenciar a formação de produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades.

03. Caracterizar um esterol através de suas reações de coloração.


1 béquer de 100 ml

- 1 béquer de 250 ml

- buretas

- tubos de ensaio grandes

- agitador

- pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 ml)

papel de filtro (2)

bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca

funil (2)

termômetro

balança analítica

papel manteiga

fotocolorímetro (filtro vermelho)

C - REAGENTES

Soja moída e seca

Acetona

Solução de potassa alcoólica: - 1 volume de KOH a 40% + 1 volume etanol a 95%.

óleo vegetal (ou gordura)

ácido acético concentrado

Solução de Cloreto de cálcio a 10%

Solução saturada de cloreto de sódio

Solução clorofórmica de colesterol a 0,1%

ácido sulfúrico concentrado

Soro humano.

D - INTERPRETAÇÃO

O termo lipídeo aplica-se a uma grande variedade de compostos que se caracterizam em geral:

01. Pela insolubilidade em água e pela solubilidade em solventes orgânicos tais como o clorofórmio,

éter, benzeno, mistura de FOLCH (clorofórmio + metanol), etc.

02. Pela presença de ácidos graxos esterificados;

03. Pela sua utilização por parte dos seres vivos, onde desempenham importantes funções

fisiológicas.

A grande maioria dos lipídios apresenta ácidos graxos esterificados em sua estrutura, abrangendo

os acilgliceróis ou glicerídeos, os cerídeos, os fosfolipídios e os glicolipídeos.

Esta família de compostos mediante aquecimento na presença de bases fortes como o NaOH ou

KOH produzem os sais de sódio ou potássio dos ácidos graxos que participam da estrutura original, ou

seja, os sabões alcalinos. Devido a esta propriedade, essa classe corresponde aos LIPÍDIOS

SAPONIFICÁVEIS que podem então ser caracterizados, entre outros ensaios, pela saponificação.

30

Outros compostos enquadrados como lipídios são os ESTERÓIDES e os TERPENOS, os quais

em sua forma livre, são denominados de LIPÍDIOS não SAPONIFICÁVEIS. Sua caracterização pode

ser procedida por reações de formação de cor. Certos esteróides hidroxilados (= esteróis como por

exemplo o colesterol) podem em parte, ocorrer nos organismos vivos sob forma esterificada e sua

hidrólise ácida ou alcalina libera o esterol livre.

01. Com o procedimento de extração acima descrito obtemos o óleo da semente de soja utilizando da

acetona como solvente. Pode-se utilizar também o dietil éter.

02. O teste de caracterização. No teste de Saponificação (hidrólise alcalina) de triacil-gliceróis ou

triglicerídeos, o óleo é saponificado (significando, formação de sabão), obtendo-se uma solução

opalescente de sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol. Esta é a primeira reação

química envolvida na produção de sabões para uso doméstico a partir de triacilgliceróis.

Exemplo:

Etanol

100oC, 30 min

Oleato de

(sabão)

CH3

|

CH3

(CH2)7 CH2OH

|

(CH2)7

|

H2C-O-CO-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH3

3.CH + CHCO(3)

||

CH +

||

CH2OH

|

HC-O-CO-(CH2)7.CH=(CH2)7CH3+3KOH

CH CH2OH

CH

|

HOCH

|

H2O-O-CO-(CH2)7.CH=CH(CH2)7CH3

Trioleil glicerol ou trioleína

(CH2)7Glicerol

(CH2)7

|

CH2OH

C=O C = 0

|

Glicerol

OK OK

K Oleato de

Potássio

(sabão)

03. Propriedades dos sabões. A formação de espuma é devido a uma diminuição da energia de coesão

das moléculas (tensão superficial).

O aparecimento de um precipitado branco de ácidos graxos é que a reação tende para a formação

de ácidos graxos que são insolúveis devido ao seu baixo grau de dissociação sendo portanto,

compostos muito menos polares que os sabões.

Exemplo:

CH3

CH3.(CH2)7.CH=CH.(CH2)7COOK+ + | CH3.(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + CH3.COO

-K

+

COO-K+

Oleato de potássio ácido acético ác. Oleico acetato

(insolúvel) (insolúvel) de K

O aparecimento de um precipitado de sabões de cálcio resulta de que os sabões de metais alcalino

terrosos são insolúveis porque se encontram praticamente não dissociados.

Exemplo:

2CH3.(CH2)7.CH=C.CH(CH2)7COO-K

++CaCl2CH3(CH2)7.CH=CH(CH2)7COOCa + 2KCl

oleato de potássio cloreto Oleato de Cloreto de K

de cálcio Cálcio

31

A precipitação de sabões pela adição de excesso de sais neutros pode ser explicada pelo efeito do

íon comum, que reprime a dissociação dos sabões, fazendo com que as micelas percam a carga e

precipitem.

04. Os esteróides formam um grupo de compostos biológicos que apresentam em sua estrutura um

grupo químico comum: o ciclopentanoperidrofenantreno (corresponde à estrutura anelar

geminada C1 até C10 da figura (a)).

(a) colesterol ácido graxo (b)

Por suas propriedades de solubilidade análoga à dos lipídeos, os esteróides são classificados entre

estes, embora sua estrutura e propriedades biológicas sejam diferentes.

Os esteroídes mais abundantes são os esteróides que são alcóois de esteróides. O colesterol é o

principal esterol nos tecidos animais (estruturas completa representada acima). Observa-se pela figura

que o colesterol apresenta uma função alcoólica em C3, uma insaturação entre C 5 e C6 e uma cadeia

alquil substituintes em C17. No organismo o colesterol pode se apresentar livre ou esterificado com

ácidos graxos, através do grupo alcoólico em C3 (ester de colesterol, figura (c).

O colesterol é percursor de outros esteróides importantes como ácido biliares, esteróides fecais

(coprostanol e colestan) e hormônios esteróides.

O colesterol e outros esteróis podem ser evidenciados através de reações de coloração.

Reação de Salkowski (qualitativa). Essa reação é comum para os esteróis de uma maneira geral. O

aparecimento da cor vermelha é própria de esteróis que são insaturados no anel A ou B ou em ambos

dando origem a cromóforos, fato que serve para distingui-los dos que possuem anel A ou B saturados.

E – PROCEDIMENTO

I - EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DE SEMENTES DE SOJA

01. Em um erlenmeyer de 100 ml pesar 10 g de soja moída e seca.

02. Adicionar 25 ml de acetona e agitar por 5 minutos. (shoker).

03. Filtrar através de papel de filtro, para um béquer, de peso conhecido, anotando seu valor.

04. Lavar o resíduo com 5 ml de acetona por 2 vezes, e evaporar o filtrado em banho-maria, à

temperatura de 97oC com agitação constante até a eliminação total da acetona.

05. Observar o resíduo amarelo e oleoso, pesar novamente o béquer e por diferença de peso calcular o

rendimento da extração.

06. Este óleo será 1utilizado como material para as provas de caracterização.


II - CARACTERIZAÇÃO

Saponificação (hidrólise alcalina) de triacil-gliceróis ou trigliceróis.

32

01. Em um tubo de ensaio grande, colocar 15 gotas de óleo vegetal e 5 ml de solução de potassa

alcoólica.

02. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos.

Propriedades dos sabões

01. Repartir a solução de sabões obtida na experiência anterior em 3 tubos de ensaio e realizar os

seguintes testes.

a) Diminuição da tensão superficial - Agitar a solução de sabões e verificar a formação de espuma.

b) Precipitação de ácidos graxos - A este mesmo tubo adicionar, gota a gota, ácido acético

concentrado até notar o aparecimento de um precipitado branco de ácidos graxos.

c) Precipitação de sabões de cálcio - Ao segundo tubo adicionar cloreto de cálcio a 10%, gota a gota,

até notar aparecimento de um precipitado de sabões de cálcio.

d) Precipitação por excesso de eletrólitos - Ao terceiro tubo, adicionar um volume igual de solução

saturada de cloreto de potássio . Observar a formação de um precipitado de sabão por excesso de

eletrólitos.

III - ESTERÓIDES: CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DO COLESTEROL

Reação de Salkowski (qualitativa)

01. Em um tubo de ensaio bem seco pipetar 1 ml da solução de colesterol a 0,1% + 1 ml de ácido

sulfúrico concentrado.

Observar o desenvolvimento de cor vermelha.

F - RELATÓRIO

I- Dizer o que foi observado em cada teste feito.

II- Responder

01. Escrever a reação de hidrólise alcalina de um triglicerídeo (ou triacilglicerol; TAG, diferente do

exemplo).

02. Explicar a ação detergente dos sabões.

02. Explicar a precipitação de sabões por excesso de eletrólitos.

33

AULA PRÁTICA No 09

PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO LEITE



01. Separar proteínas do leite por precipitação e decantação.

02. Identificar a presença de proteínas sem líquidos biológicos pelo teste de biureto.

03. Identificar em líquidos biológicos a presença de gordura, lactose, fósforo, cálcio e cloretos.

04. Definir pI.

05. Explicar o significado das reações e operações realizadas.


1 erlenmeyer de 250 ml

1 bequer de 100 ml

1 bequer de 250 ml


pipetas graduadas (1, 2, 5 e 10 ml)

bico de gás, 1 tripé, 1 tela, 1 caneca

algodão: filtração em algodão

funil

vidro de relógio ou placa de Petri

C - REAGENTES

leite

água destilada

ácido acético 5%

álcool absoluto

éter

- solução de NaOH a 10%

solução de CuSO4 a 1%

reagente de Benedict

solução de molibdato de amônio a 5%

leite x

leite y

reagentes de Sulkovitch: 2,5 g ácido oxálico; 2,5 g oxalato de amônio; 5,0 ml ácido acético

glacial; água q.s.p. 150 ml

NHO3 concentrado

solução de AgNO3 a 5%

D - INTERPRETAÇÃO

O leite é um dos alimentos mais completos que o homem conhece. Sua composição: 87%

água; 4,9% carboidratos; 3,9% lípides; 3,5% proteínas; 0,7% sais minerais; além de vitaminas e certas

enzimas. Seu pH é 6,6. Devido ao seu alto teor em água é um alimento diluído, mas seu valor nutritivo

é elevado.

01. Com o procedimento de extração obteremos o seguinte:

34

a) precipitação isoelétrica de proteína (caseína) pela adição de ácido ao leite, obtendo-se

inicialmente um precipitado que contém água, proteínas, lípides e um soro, que contém água,

substâncias orgânicas e inorgânicas, nela solúveis.

b) a lavagem por duas vezes com álcool absoluto tem a finalidade de retirar a água que

permaneceu junto à proteína coagulada.

c) com a segunda filtração (soro) procuramos separar lactose, cloretos, fosfatos, etc das proteínas

coaguladas e outros sais que se precipitavam com o aquecimento.

02. O reagente de Benedict dá reação positiva para glúcides redutores. Aplicando-se o teste no soro do

leite ele deve dar reação positiva devido a presença de alguns carboidratos, dos quais o

dissacáride lactose é o mais abundante.

03. O aparecimento da cor amarelo-esverdeada na reação do soro com o molibdato de amônio é

devido a formação de fosfomolibdato, indicando que o fósforo é um dos constituintes minerais do

leite.

04. O reagente de Sulkowitch contém oxalato de amônio que em presença de cálcio irá formar oxalato

de cálcio, insolúvel e branco. Se o teor de cálcio é baixo nota-se apenas ligeira turvação. A reação

positiva para o soro indica pois que o cálcio é outro constituinte mineral do leite. Juntamente com

o fósforo tem grande importância na calcificação dos recém-nascidos. Além disso, o cálcio

participa da coagulação do leite.

05. O aparecimento de turvação ou precipitação branca resulta da formação de AgCl, ao reagir-se o

soro com AgNO3. Evidência-se assim a presença de cloretos no leite.

E - PROCEDIMENTO

I - EXTRAÇÕES

01. Adicionar 50 ml de água destilada morna e 50 ml de leite em um bequer de 250 ml.

02. Acrescentar CH3COOH 5% gota a gota, com agitação lenta até que o leite se coagule (queijo).

03. Deixar em repouso por cerca de 5 minutos.

04. Decantar o líquido sobrenadante sobre o filtro de algodão, recolhendo o filtrado no erlenmeyer de

125 ml. Lavar o precipitado 2 vezes com 5 ml de álcool absoluto.

05. Transferir o filtrado acima para o béquer de 250 ml.

Aquecê-lo diretamente na chama, até a ebulição. Deixar fervendo até reduzir o volume a 40 ml.

Agitar constantemente com bastão de vidro para evitar formação de bolhas (cuidado com o rosto).

06. Filtrar em papel de filtro e deixar esfriar. (Filtrado 2)

II - PESQUISA DE GLÍCIDES REDUTORES

01. Colocar 2 ml do reagente de Benedict em um tubo de ensaio.

02. Adicionar 1 ml do filtrado 2. Misturar.

03. Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente.


III - PESQUISA DE FÓSFORO

01. Colocar 2 ml do filtrado respectivamente em 2 tubos de ensaio.

02. Adicionar 1 ml de solução de molibdato de amônio a 5% a um dos tubos. Misturar.

03. Observar o aparecimento de cor amarelo-esverdeada, comparando com o tubo controle.

04. Ler a interpretação correspondente.

IV - PESQUISA DE CÁLCIO

01.Colocar 2 ml do filtrado em um tubo de ensaio.

02.Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até o aparecimento de uma turvação ou precipitado

branco.

35


V - PESQUISA DE CLORETOS

01. Colocar 2 ml de filtrado em um tubo de ensaio.

02. Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado.

03. Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado branco.

VI - TESTES PARA VERIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ESTRANHAS AO LEITE.

Nos 3 testes abaixo, fazer com as 2 amostras de leite.

01. Pesquisa de amido Colocar em um béquer, 5 ml de leite. Aquecer. Em seguida, adicionar 6 gotas

de reativo de lugol.

02. Pesquisa de urina. Pipetar 5 ml de leite e colocar em um béquer. Juntar em seguida 5 ml de HCl, 5

ml de álcool Etílico e 0,5 ml de HNO4

03. Pesquisa de sacarose. Colocar 5 ml de leite em um béquer e 1 ml de reativo de Seliwanoff.

Aquecer em banho maria durante 10 minutos. Agitar de vez em quando.

F - RELATÓRIO

01.Como a caseína do leite pode ser separada?

02.Explicar qual o mecanismo de coagulação espontânea do leite que não sofreu fervura ou

pasteurização.

03.O pI da caseína é maior ou menor que 7,0? Explique.

04. Por que os lípides são extraídos do leite pelo tratamento com éter?

05. Citar as reações ou testes utilizados neste trabalho prático, bem como os seus objetivos:

06. Por que se reduz o volume de soro até 40 ml?

07. Citar as reações ou testes utilizados neste trabalho prático, bem como os seus objetivos.

08. Por que se reduz o volume do soro até 40 ml?

08. Qual leite (x ou y) é de melhor qualidade? Explique.

36

AULA PRÁTICA No 10

CONSTITUINTES DO OVO



01. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína e lípides da gema.

02. Determinar experimentalmente a percentagem de proteína da clara.

03. Determinar aproximadamente o pI de proteína.

04. Identificar a presença de proteína em líquido biológico usando sua propriedade de precipitação por

agentes químicos e físicos.

05. Determinar experimentalmente o valor calórico aproximado do ovo.

Explicar o significado das reações e operações realizadas.


2 bequeres de 100 ml

1 cilindro graduado de 50 ml

1 cilindro graduado de 100 ml

balança

algodão

1 funil

2 papéis de filtro

lâmpada infra-vermelho

chapa de aquecimento para banho de areia

estufa


1 bastão de vidro

bico de gás

1 pipeta graduada de 2 ml ao centésimo

1 pipeta graduada de 10 ml ao décimo

C - REAGENTES

1 ovo (por bancada)

álccool a 95%

Eter destilado

Sulfato de sódio

Sulfato de sódio anidro

Clorofórmio

Solução saturada (22%) de triclorato de antimôniol em clorofórmio

Acetato de sódio a 0,1 N

Ácido acético a 0,1 N

Ácido nítrico concentrado

Cloreto de mercúrio a 1%

Solução saturada (13%) de ácido pícrico

D - INTERPRETAÇÃO

A gema do ovo contém como constituintes principais proteínas e lípides que podem ser

isolados. Nas pesquisas I e II as proteínas são precipitadas e extraídas pela adição de álcool, ao passo

que os lípides serão solubilizados e extraídos pelo éter. Após a filtração de mistura, o precipitado

representará a fração protéica da gema e o filtrado representará a fração lipídica. O sulfato de sódio

37

anidro é adicionado ao filtrado com o objetivo de se remover a água do solvente. Tendo-se o peso da

gema, o cálculo de porcentagem de proteínas e de lípides na gema do ovo será feito por simples regra

de três.

A clara do ovo também é constituida de proteínas e lípides. Entretanto aqui a fração mais

importante é a protéica, formada principalmente de albumina. Na pesquisa III as proteínas são

precipitadas por adição de álcool. Conhecendo-se o volume total de clara do ovo, pode-se facilmente

calcular o teor de proteínas na clara de ovo. A fração lipídica e carboidratados são tão pequenos que

podem ser desprezados para cálculo do valor calorífico do ovo.

As substâncias orgânicas quando oxidadas no organismo libertam uma certa quantidade de

calor que irá variar segundo o tipo de substância. Assim, as proteínas liberam uma média de 4 Kcal

por grama de substância; os lípides liberam 9 Kcal por grama e os carboidratos 4 Kcal por grama.

Portanto, na pesquisa VI conhecendo-se os valores percentuais de proteínas e lípidos na gema e na

clara do ovo pode-se calcular o valor calórico total de um ovo.

Uma das técnicas de isolamento de proteínas é a sua precipitação no ponto isoelétrico, onde as

mesmas são menos solúveis mas sem perder a atividade. O objetivo da pesquisa V é determinar o

ponto isoelétrico de albumina do ovo. Para isto preparou-se soluções da albumina em diferentes pHs e

observou-se aquela em que ocorreu a precipitação da proteína. Entretanto certas proteínas, entre elas a

albumina, apresentam grande solubilidade em água e por isso torna-se difícil observar a sua

precipitação no ponto isoelétrico. Adiciona-se então à solução um agente que compete com a proteína

pelo solvente, num processo semelhante ao "salting out". No presente caso empregou-se o álcool.

Entretanto é bom levar em consideração que o álcool quando permanece muito tempo em contato com

a proteína introduz modificações intramoleculares na mesma, acarretando uma desnaturação.

A pesquisa VI permite observar a ação do calor e de alguns agentes precipitantes sobre a

albumina do ovo e para extensão, sobre as proteínas. São os processos conhecidos por coagulação a

desnaturação.

a) O calor promove a coagulação da albumina num processo de desnaturação irreversível.

b) A adição de ácidos fortes a uma solução de proteína promove a sua desnaturação com a

consequente precipitação. O presente teste (Reação de Heller) é comumente empregado nos

laboratórios clínicos quando se deseja verificar a presença de albumina do soro na urina em casos

de suspeita de albumina (doença renal).

c) A adição de solução de sais de metais pesados a uma solução da proteína promove a formação de

proteinatos insolúveis. Em casos de envenenamentos por sais de chumbo e mercúrio costuma-se

administrar clara de ovo aos pacientes, pois a reação é imediata e sua eliminação é facilitada.

d) Os reagentes de alcalóides (ácido pícrico, fosfotungstico, tânico, metafosfórico, etc) precipitam os

alcalóides de suas soluções por formarem com os mesmos sais insolúveis. Estes reagentes agem da

mesma forma quando adicionados a uma solução de proteína formando igualmente sais insolúveis.

E - PROCEDIMENTO

01. Pesar 2 bequeres de 100 ml.

02. Separar bem a gema da clara e colocar cada uma das partes nos respectivos bequeres.

03. Pesar os bequeres e anotar o peso da gema e da clara.

04. Transferir a clara para o cilindro graduado de 100 ml e anotar o seu volume.

I - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA GEMA

Nota: Durante todas estas operações não deve haver nenhum bico de gás ligado no laboratório.

01. Adicionar à gema isolada 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos.

02. Adicionar 30 ml de éter. Agitar por 5 minutos.

03. Filtrar através de algodão para um erlenmeyer de 125 ml.

04. Lavar o precipitado no funil com 3 porções de 10 ml de éter. Adicionar somente uma porção de

éter depois da precedente ter sido completamente drenada no erlenmeyer que está recebendo o

filtrado. Guardar o filtrado.

38

05. Pesar um papel de filtro grande.

06. Transferir o precipitado extraído para o papel de filtro, desprezando o pedaço de algodão.

07. Secar o papel com o precipitado usando lâmpada infra-vermelho como fonte de calor. Não usar

estufa.

08. Pesar o papel de filtro mais o precipitado seco.

09. Calcular a porcentagem de proteína na gema.


II - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE LÍPIDES NA GEMA

01. Pesar um bequer seco de 100 ml.

02. Adicionar 3 g de sulfato de sódio anidro ao filtrado obtido em I, item 4. Agitar por 5 minutos.

03. Filtrar em papel de filtro recolhendo o filtrado no béquer pesado.

04. Evaporar o solvente em manta aquecedora.

05. Pesar o béquer com o resíduo. Conservar o resíduo.

06. Calcular a percentagem de lípides na gema.


III - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE PROTEÍNAS NA CLARA

01. Transferir 10 ml da clara do ovo (medir com pipeta) para um béquer de 50 ml.

02. Adicionar 15 ml de álcool a 95%. Agitar bem por alguns minutos.

03. Pesar um papel de filtro.

04. Filtrar pelo papel anteriormente pesado. Desprezar o filtrado.

05. Abrir o papel de filtro e levá-lo à estufa para secar completamente.

06. Pesar o papel com o precipitado.

07. Calcular a porcentagem de proteínas na clara.


IV - DETERMINAÇÃO DO VALOR CALÓRICO DO OVO

De posse dos dados obtidos nas pesquisas anteriores, calcular o valor calórico do ovo

analisado. Ler a interpretação correspondente.

V - DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA ALBUMINA DO OVO

Nota: Preparar para esta pesquisa e as subsequentes uma solução de albumina de ovo a 1%, diluindo 1

ml da clara com 100 ml de água.

01. Tomar 5 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 5.

02. Adicionar aos mesmos as soluções abaixo relacionadas, segundo o esquema:

Tubo Acet. Sódio 0,1

N (ml)

Ác. Acético 0,1

N (ml)

Ác. Acético 1,0

N (ml)

H2O dest. (ml) Albumina 1%

(ml)

1 2,00 0,25 - 3,75 2,00

2 2,00 0,50 - 3,50 2,00

3 2,00 2,00 - 2,00 2,00

4 2,00 - 0,80 3,20 2,00

5 2,00 - 3,20 0,80 2,00

03. Agitar bem os 5 tubos.

04. Adicionar ao tubo 3, cuidadosamente, e com agitação, empregando a pipeta graduada de 10 ml,

álcool a 95% até se produzir pequena turvação. Anotar a quantidade gasta.

05. Adicionar a mesma quantidade de álcool a cada um dos outros tubos.

06. Deixar em repouso por 10 minutos e anotar depois em qual dos tubos ocorreu maior formação de

precipitado.


39

VI - PRECIPITAÇÃO DE ALBUMINA DO OVO

a) Precipitação pelo calor

01. Colocar 2 ml da clara em um tubo de ensaio.

02. Aquecer a chama (CUIDADO: manter vidros de álcool e éter longe da chama).

03. Observar a formação de um precipitado.


b) Precipitado por ácidos fortes (reação de Heller)

01. Colocar 2 ml da solução de albumina em um tubo de ensaio.

02. Acrescentar lentamente no fundo do tubo 2 ml de HNO3 concentrado. Para isto introduz-se a

pipeta contendo o ácido na solução, mantendo-se a extremidade superior tampada com o dedo.

Somente quando a ponta da pipeta atingir o fundo do tubo de ensaio é que deverá ser escoado o ácido

da pipeta.

03. Observar a formação de um anel na superfície de separação das duas camadas.


c) Precipitação por sais de metais pesados


02. Adicionar 3 gotas de HgCl2 a 1%.

03. Observar o precipitado formado.


d) Precipitação por agentes de alcalóides


02. Adicionar 3 gotas de solução saturada de ácido pícrico.

03. Observar a formação de um precipitado.


F - RELATÓRIO

01. Completar o quadro abaixo: (Pesquisas I, II, IV e V)

Valores normais dados na

literatura

Valores obtidos neste trabalho

Proteína

%

Lípides

%

Proteína

%

Lípides

%

Gema

Clara

16

10

31

--

Valor calórico do

ovo em Kcal

90-100

02. a) Completar o quadro abaixo (Pesquisa V)

Tubo no. 1 2 3 4 5

PH das soluções turvação ou

precipitado observado

5,5 5,0 4,5 4,0 3,5

b) O ponto isoelétrico da albumina do ovo é em torno de ________________________

________________________________________________________________________________

c) O efeito observado após a adição à solução de albumina chama-se _____________

________________________________________________________________________________

03. Citar as reações ou testes utilizados nesta aula prática que eram até agora desconhecidos por você,

bem como os seus objetivos ou aplicações.

04. Discutir os resultados obtidos nas experiências.

introduÇÃo ao laboratÓrio roteiro de aulas … file-técnicas de laboratório aula prÁtica no....

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