07/01/2013

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Sistemas de cromatografia e suas aplicações

Prof. Alan McBride

Proteômica

Biotecnologia, CDTec, UFPel

Cromatografia - uma definição

• A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária).

• A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina.

Cromatografia

• Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel através de uma fase estacionária (sólido)

Cromatografia

• Conceito de coeficiente de partição:

– Qualquer soluto particionar entre dois solventes imiscíveis;

– Um soluto imóvel (sólido ou estacionário) e o outro é móvel representa as aplicações mais comum na cromatografia;

– Cromatografia de fase para a frente: o suporte é polar, ex. papel, silica;

– Cromatografia de fase reversa: o suporte é não-polar.

Cromatografia - os tipos principais

• Preparativo

– Separação dos componentes de uma mistura para uma aplicação avançada;

– É um tipo de purificação

• Analítico

– Menor quantidade de material;

– Determinar as proporções relativas na mistura.

Misturas e compostos

• Analito - substância a ser separada durante a cromatografia.

• Mistura – duas ou mais substâncias misturadas, mas não quimicamente combinado – Ar: uma mistura de gases – Nevoeiro: água suspenso em ar

• Composto – dois ou mais elementos quimicamente

combinado – Sal: um composto de sódio e cloro (NaCl) – Água: um composto de hidrogênio e oxigênio (H2O)

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Soluções

• Solução – uma mistura onde uma substância é dissolvida em uma outra.

• Uma solução tem duas partes:

– Soluto: é a substância dissolvida.

– Solvente: é a substância que dissolver a outra.

• Solubilidade – a capacidade de uma substância de se dissolver.

Os processos cromatográficos

TIPOS DE CROMATOGRAFIA

Cromatografia em camada delgada

• É uma técnica de adsorção líquido–sólido

• Aplicações:

– Separação de misturas

– Química orgânica – monitor reações

Cromatografia de

papel Pode separar os compostos

de tintas, plantas (ex

clorofila), maquiagem e

outras substâncias.

Cromatografia em camada delgada

Uso de placas de plástico ou vidro para

identificar pigmentos, químicos e outros

substâncias desconhecidos.

Cromatografia líquida

• A fase móvel é liquida e é arrastada através da coluna apenas por força da gravidade

• Tipos:

– HPLC, FPLC, Íon, Afinidade

Cromatografia liquido Usada para identificar pigmentos e

outros compostos desconhecidos de

plantas.

HPLC

• High-performance liquid chromatography

• Cromatografia líquida de alta eficiência

• Aplicações:

– Separação de misturas de compostos – química analítica e bioquímica, medicina, doping

– Idenitificação, quantificação e purificação dos componentes da mistura

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FPLC

• Fast protein (performance) liquid chromatography

• Cromatografia líquida de proteína rápida

– Mais comum é troca iônica

• Aplicações:

– Anaizar e purificar misturas de proteínas

• A fase móvel é um gás e é feito usando uma coluna;

• Com base no equilíbrio de partição de analito entre a fase sólido e um gás móvel.

Cromatografia gasosa Usada para determinar a composição

química de substâncias desconhecidos,

ex composto de gasolina, ver cada peco

no gráfico abaixo.

Cromatografia gasosa ou líquida-gasosa

Cromatografia gasosa

• Aplicações:

– Química analítica

• Separação e analise de misturas de compostos que podem ser vaporizado (< 300 °C) sem decomposição

– Testes de pureza

– Cromatografia preparativo

Cromatografia em Camada Delgada

• CCD é uma técnica de adsorção líquido–sólido:

– A separação é em função da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos).

• O fenômeno é principalmente de adsorção:

– A separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.

– Os adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida.

CCD • Utiliza-se pequena quantidade de amostra

(microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

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CCD

• Fator de retenção (Rf):

– O qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.

– Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.

CCD

• A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa.

• Método simples, rápido, visual e econômico.

• A CCD pode ser usada para:

– Identificar os compostos presentes em uma mistura;

– Determinar a pureza de uma substância.

Cromatografia Gasosa

• Partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações.

• Técnica analítica mais utilizada: – Além de possuir um alto poder de resolução, é muito

atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10–9 a 10-12 g).

• A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente.

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

• É baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida.

• A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência.

a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.

HPLC

• Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de

padrões de aminoácidos. Fonte: Lehninger, 1990.

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HPLC

• As separações em HPLC podem se dar por adsorção, partição ou ambos.

– O suporte mais utilizado é a sílica.

• As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos.

– Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.

HPLC

• Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa – A fase C18 (octadecilsílica) é a mais usada. – Separações no modo reverso utilizam fases móveis

aquosas.

• Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.

Cromatografia de afinidade (CA)

• Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a outra partícula.

• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da proteína de interesse.

• As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH diferente do de ligação.

CA

• Superfície da espera ligada ao epóxi, aldeído ou grupos de éster aril.

• Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) – Iminodiacético +

Ni2+/Zn2+/Co2+

CA 2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc

2004dez03no002:1_Fractions

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0

20

40

60

80

100

%B

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0 20 40 60 80 min

1 3 5 7 9 121518 Waste

IMAC purificação

SDS-PAGE das frações

Cromatografia iônica (CI)

• É a troca de íons de mesmo sinal entre uma solução e um corpo sólido muito insolúvel.

• Corpo sólido = trocador de íons = resina útil

– polímeros portadores de carga elétrica que possuem íons ativos que permutam reversivelmente de posição com outros íons de uma solução.

• Aplicações:

– Proteínas grandes, nucelotídeos pequenas e aminoácidos

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CI

• Importante: o grau que um íon é absorvido preferencialmente em relação a um outro íon: – Cresce com o aumento da carga dos íons

permutantes: • (Na+ < Ca2+ < Al3+ < Th4+ )

– Cresce com a diminuição do tamanho do íon hidratado: • (Li+ < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+)

• A afinidade relativa do íon de maior carga cresce em proporção direta com a diluição.

CI

• Análise consiste de quatro etapas:

– Transporte

– Separação

– Detecção

– Análise de dados

CI

• Transporte

– A amostra líquida é transportada por um eluente líquido, com composição e concentração conhecidos.

– O sistema opera sob pressão.

• Separação

– Os diferentes íons da amostra migram completamente na coluna de separação em diferentes períodos de tempo, de acordo com as interações com os sítios ativos da coluna de separação.

CI

• Detecção – Feita por uma célula de condutividade, que

monitora e mede a condutância elétrica dos íons da amostra, produzindo um sinal baseado em uma propriedade física ou química do analito.

• Análise de dados – Software que recebe o sinal da célula de

condutividade e analisa os dados comparando os picos da amostra em um cromatograma com os produzidos por uma solução padrão.

Vantagens de CI

• Permite a determinação de espécies iônicas, orgânicas e inorgânicas;

• Sensibilidade a baixas concentrações (μg/L ou menos);

• Tempo de análise (15 minutos);

• Pequenos volumes de amostra (1 mL).

Desvantagens de CI

• Custos alto

– Equipamento e treinamento

– Produtos químicos (eluente e regenerante)

• Mão de obra especializada

– Técnico capacitado em operar o equipamento e analisar os resultados.

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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

O lisado de E. coli contém milhares de proteínas

Meio de cultura

~10 proteínas

Lipopolissacarídeos

Membrana externa

Periplasma

~100 proteínas

Citoplasma

~2000 proteínas

Membrana interna

Peptídeoglicano

Os 5 princípios de separação

Gel filtração

Recombinant Protein Purification Handbook, GE Healthcare

Interação hidrofóbica

Troca iônica Afinidade Fase reversa

Gel filtração

• A técnica mais simples de cromatografia.

• As proteínas maiores não entram nos poros da matriz – saem primeiro.

• As proteínas menores demoram mais para sair da coluna.

• Dois tipos:

– Separação de grupos.

– Separação de alta resolução.

Troca iônica

• Separação baseada na carga global da superfície de cada proteína.

– Dependente do pH.

• Eluição com gradiente de NaCl.

• Pode diferenciar entre duas proteínas que diferem por só um aminoácido.

Preparação de amostra

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Proteínas de fusão

• Vários tipos de caudas:

– 6× His

– GST

– MBP

Purificação por Afinidade

• Proteína de fusão com cauda de histidina (6×His)

• Cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC): – Cu2+, Zn2+, Co2+ e Ni2+ tem afinidade para 6×His

• A sefarose pode ser usada em colunas:

Purificação por Afinidade

Expressar a proteína

em larga escala

Seletor os poços

que tem expressão

das proteínas

(vermelho)

IMAC para purificar

a proteína

Produto final

2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc

2004dez03no002:1_Fractions

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0

20

40

60

80

100

%B

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0 20 40 60 80 min

1 3 5 7 9 121518 Waste

Purificação por Afinidade

1. Ressuspender o pellet em tampão de lise (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Imidazol 10-40 mM ) e sonicar a suspensão;

2. Centrifugar a suspensão (4°C, 16.000 rpm, 30 min) e coletar o sobrenadante;

Purificação por Afinidade

3. Equilibrar a coluna de sefarose com tampão 1 (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Imidazol 10-40 mM ) e aplicar o sobrenadante a coluna;

4. Lavar a coluna 1x com tampão 1;

5. Aplicar tampão 1 e tampão 2 (PBS, 500 mM Imidazol) para formar um gradiente 10-40 até 500 mM Imidazol (eluição das proteína recombinantes) e coletar as frações.

Purificação por Afinidade

2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc

2004dez03no002:1_Fractions

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0

20

40

60

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100

%B

0

200

400

600

800

1000

1200

mAu

0 20 40 60 80 min

1 3 5 7 9 121518 Waste

AKTAprime

SDS-PAGE das frações

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Purificação por Afinidade

• Trocar o tampão final e remover o imidazol;

– Diálise

– Gel filtração

• Verificar a concentração de proteína recombinante:

– Ex. métodos de Bradford ou Lowry

Purificação por Afinidade • Verificar a purificação de sua proteína

recombinante: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

THE CUBE – SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS

Fontes de informação

Handbooks, GE Healthcare