CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) ?· Evolução das Técnicas Cromatográficas M 1906…

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  • CONSELHO REGIONAL DEQUMICA - IV REGIO (SP)

    Ministrante: Guilherme Julio ZocoloDoutor em Qumica Analtica - Unesp/AraraquaraContatos: gjzocolo1@gmail.com

    Araraquara, 15 de setembro de 2012

    Princpios e Aplicaes da CromatografiaLquida de Alta Eficincia (HPLC)

    Apoio

    Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formatoPDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)

    facebook.com/crqiv twitter.com/crqiv

  • MMiinnii Princpios e Aplicaes da Cromatografiaccuurr

    Princpios e Aplicaes da Cromatografia Lquida

    de Alta Eficincia (HPLC)rrssoos s

    de Alta Eficincia (HPLC)

    s s --2200

    Dr. Guilherme Julio ZocoloE mail: gjzocolo1@gmail com00

    1122

    E-mail: gjzocolo1@gmail.com

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta Efi i i (HPLC)

    MM

    Eficincia (HPLC)

    Toxicologiaiinnii

    Toxicologia

    Cosmticos

    ccuurr HPLC

    Frmacos

    P ti idrrssoos s

    HPLC Pesticidas

    Alimentoss s --2200

    ProtenasPr-requisito: a amostra deve ser solvel00

    1122

    AminocidosPr requisito: a amostra deve ser solvel

    na fase mvel

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Corantes

  • Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

    MMiinniiccuurrrrssoos s Solvente

    Sistema de HPLC

    s s --2200

    ColunaSistema

    001122

    Injetor de dados

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Bomba Detector Descarte

  • Histrico

    MM

    Mikhael Semenovich Tswett (1906)

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Mikhael Semenovich Tswett (1906)

    MM

    Cromatografia

    Cromatogramaiinnii

    Mtodo cromatogrfico

    B i ht d D t h B t i h G ll h ftccuurr Mtodo fsico-qumico de separao de

    Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft

    rrssoos s

    q p

    componentes de uma mistura, que envolve a

    distribuio diferencial destes em um sistemas s --2200

    distribuio diferencial destes em um sistema

    heterogneo bifsico:1 - FASE ESTACIONRIA;

    001122

    1 FASE ESTACIONRIA;2 - FASE MVEL.

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Evoluo das Tcnicas Cromatogrficas

    MM 1906 Tswett CROMATOGRAFIAEMCOLUNA(CC)

    g

    iinnii

    ( )extratosvegetais;colunac/CaCO3;terdepetrleo

    1938 IzmailoveShraiber CROMATOGRAFIAEMCAMADADELGADA(CCD,TLC)ccuurr

    extratosvegetais;placadevidroc/alumina

    ERAdaCromatografiaModerna:PrmiosNobel 1937,1938,1939.rrssoos s

    1941 MartineSynge CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

    1952 Martin e James CROMATOGRAFIA GASOSA (CG GC)s s --2200

    1952 MartineJames CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

    Dcadasde1960/1970Karr Jentoft Gouwn Huber Hulsman Snyder e Kirkiland00

    1122

    Karr,Jentoft,Gouwn,Huber,Hulsman,SnydereKirkilandCROMATOGRAFIALQUIDADEALTAEFICINCIA(CLAE,HPLC)

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Mecanismo de separao cromatogrfica

    MM

    A separao cromatogrfica obtida a partir de interaes diferenciadasentre os analitos componentes da mistura, fase estacionria e fasemvel

    iinnii

    mvel.

    ccuurr

    FASE MVEL AMOSTRAFM FErrssoos s

    FASEESTACIONRIAamostra

    s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • CROMATOGRAFIA:CLASSIFICAOPELAPOLARIDADEDAFASE ESTACIONRIA

    MM

    FASEESTACIONRIA

    iinnii

    Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar.

    Ex.: slica gelccuurr

    Ex.: slica gel

    O SiR OHOR

    rrssoos s Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa

    OR

    s s --2200

    Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa polaridade.

    001122

    Ex. slica de fase ligada C18

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200

    O SiR OHOR

    001122

    OR

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurr R = CN, Diol, Fenila, NH2

    X=Cl

    rrssoos s

    Quando se utiliza silica-gelderivatizada com grupos

    s s --2200

    polares (fenila, ciano, amino,diol), tais fases estacionriaspodem ser utilizadas tantopara cromatografia em modo00

    1122

    para cromatografia em modonormal (fase estacionria polar eluente apolar) ou em fasereversa (fase estacionria

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    apolar eluente polar).

    Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurrrrssoos s

    Eluem primeiro as substnciasapolares que possuem uma menorinterao com a fase estacionrias s

    --2200

    interao com a fase estacionriapolar.

    001122 Aplicvel a anlise de substncias insolveis em gua: leos,

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    p g ,gorduras, lipdios. Destaca-se na separao de ismeros.

    Fonte: Waters corporation

  • Mecanismo de separao cromatogrfica

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalFonte: Adaptado de Waters corporation

  • Caractersticas das FASES NORMAIS

    MMiinnii

    Vantagens Desvantagens

    1. Versatilidade na mudana de seletividade alterando as fases mveis e

    1. Amostras inicas so de difcil separao e so mais viveis de se separar por fase

    ccuurr

    seletividade alterando as fases mveis e estacionrias

    e so mais viveis de se separar por fase reversa

    2. Colunas estveis quando se utiliza solventes no aquosos

    2. Controle da fora de eluio menos previsvel e mais demorado que em fase rr

    ssoos s

    solventes no aquosos reversa

    3. Uma grande variedade de substncias orgnicas so mais solveis nos solventes 3 Pior resoluos s

    --2200

    usados em fase normal (til em LC preparativa)

    3. Pior resoluo

    4. Decrscimo de presso menor devido 4. Ponto de ebulio reduzido pode gerar 001122

    pbaixa viscosidade dos solventes

    p gbolhas

    5. til para amostras que possam se decompor em solues aquosas 5. Alto custo dos solventes orgnicos

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

    decompor em solues aquosas.

  • Ganhos e Perdas em

    MM

    Ganhos e Perdas em FASE NORMAL

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Fases mveis em Fase Normal

    MM Baixa (solvente A) Hexano

    Fora de Eluio

    iinnii

    Mdia Clorofrmio, acetonitrila, tetrahidrofurano

    ccuurr

    Forte (solvente B) Isopropanol, metanol

    rrssoos s

    Reteno aumenta com aumento da polaridade dos solutos.s s --2200

    Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica

    001122 Picos assimtricos

    cido actico ou frmico para cidos.

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Amnia ou trietilamina para bases.

  • EFEITOS DA FASE MVEL EM FASE NORMAL

    MM Solvente fraco (A): no-polar 0 5 < k < 20iinnii

    Solvente forte (B): polar0,5 < k < 20

    ccuurr

    Seletividade () fortemente influenciada pela proporo do solvente B utilizado na fase mvel.rr

    ssoos s

    Seletividade () ainda mais fortemente influenciada pelo tipo do l t B tili d f ls s

    --2200

    solvente B utilizado na fase mvel.

    F E s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano001122

    F.E.s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano

    F E s (poder de separao): ciano > slica > diol > amino

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    F.E.s (poder de separao): ciano > slica > diol > aminoFonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

  • Efeitos da variao de solvente POLAR na separao cromatogrfica

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200

    Condies cromatogrficasB: Acetato de etila00

    1122

    B: Acetato de etilaA CiclohexanoColuna de silica 150x4,6 mmx5 m

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Vazo de 2 mL min-1

  • Desenvolvimento de mtodo em FASE NORMAL

    Estratgias

    MMA. Coluna Ciano (solvente A:

    hexano; solvente B:

    Estratgias

    iinnii

    ;propanol).

    B. Verifique a presena de d i

    ccuurr

    cauda nos picos.

    C. Mudar a proporo do solvente B; substituindo rr

    ssoos s

    o tipo de solvente B (diclorometano, ACN) e sua proporo.Em ltimo caso substitua o tipo des s

    --2200

    caso, substitua o tipo de coluna (diol, amino, slica).

    D Oti i di d001122

    D. Otimize as condies da coluna (L; diametro da particula e vazo da fase mvel.)

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    )

    Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

  • Fase ligada amino (NH2)

    MMAnlise de esterides em sangue

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Fase ligada amino (NH2)

    MM Amostra de suco de frutas:l jii

    nnii

    uva, tomate laranja...

    ccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • FASE REVERSA

    MM

    Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18.

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Mecanismo de Interao em Fase Reversa

    MMiinniiccuurrrrssoos s Interaes ANALITO X FE e FM X FMs s --2200

    Interaes ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):

    Van der Waals001122

    Dipolo dipoloDipolo dipolo induzidoDipolo induzido dipolo induzido

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Interaes residuais: pte. H

  • FASE REVERSA:Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18

    MMR = C2, C4, C8 E C18

    iinnii

    C2=

    ccuurr X=Cl

    C4=

    rrssoos s

    X=ClC8=

    s s --2200

    C18=

    001122

    Modo de HPLC mais utilizado (~80%): compostos no inicos,compostos polares a mediamente apolares.

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Cromatografia de Fase Reversa (FR)*

    MM

    FE menos polar que FM.

    C l F R C18iinnii

    Coluna Fase Reversa C18:Aplicao quase universal (~ 70% das aplicaes na literatura)

    ccuurr

    ( p )Permite anlise desde substncias hidrossolveis e/ou inicas at substncias lipoflicas.

    rrssoos s *Vantagens:*Vantagens:s s --2200

    Vantagens:Vantagens:- Equilbrio mais rpido - Menor adsoro irreversvel-gua no influi na reprodutibilidade

    001122

    g p-Stios de adsoro mais homogneos-Eluio em gradiente facilitada

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Cromatografia de Fase Reversa (FR)

    MM

    Si O Si

    Si O Si

    ODS, RP-18, C-18

    RP-8, C-8iinnii

    Si O Si

    Si O Si

    RP 8, C 8

    Fenil

    TMS C 1ccuurr

    Si O SiTMS, C-1

    SOLVENTES MAIS COMUNS:gua

    ORDEM DE ELUIO (crescente)rr

    ssoos s

    - gua- Acetonitrila (ACN)- MeOH- Tetraidrofurano (THF)

    (crescente)

    POLAR APOLARs s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Cromatografia de Fase Reversa (FR)FE menos polar que FM

    MM Fraco (solvente A) gua

    FE menos polar que FM.

    iinnii

    Forte (solvente B) Metanol, Acetonitrila, Tetrahidrofurano

    ccuurr

    TetrahidrofuranoNomograma

    rrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica

    MM

    R-COOH R-COO- + H+ pKa 4-5-OH -O- + H+ pKa 10-12

    iinnii

    Picos assimtricos cido actico ou frmico para cidos.trietilamina para bases.

    ccuurr

    trietilamina para bases.

    Coluna: BONDAPAK C18O OH O OH

    OHOH

    9. c. ferlico

    O OH

    Amostras de cidos carboxlicos fenlicos

    rrssoos s

    30 cm X 3,9 mmFM: gua, com 5% HOAcDeteco: UV 254nmTempo: 30 min.

    OH

    O

    OH

    HO

    s s --2200 OHO

    O OHO OH

    OH

    1. cido glico 2. c. protocatecuico 3. c. p-OH-benzico

    8. c. o-coumrico 10. c. cinmicoOH

    OMe4. d-Catequina

    001122

    OHO OHOOHO

    OH

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    OHOH

    OHOHOH

    OH6. c. saliclico

    5. c. cafeico 7. c. p-coumrico

  • Aplicao: antidepressivos tricclicos FASE REVERSA (C18)

    MM

    Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm FM: ACN/Tampo 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFA

    ( )

    iinnii O

    Tampo Fosfato 25 mM pH 2,5Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV

    ccuurr

    O

    N

    rrssoos s

    N

    CH3

    CH3NH

    CH3

    CH4

    1 2

    s s --2200

    N

    CH3

    001122

    N

    CH3

    CH3N

    CH3

    CH33 4

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Aplicao: anlise de tocoferis FASE REVERSA (C18)

    MM

    FASE REVERSA (C18)

    iinnii

    Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mmFM: MeOH a 1,0 mL/minDetector: UV (e: 295 nm) O

    CH3

    CH3

    CH3

    OHCH3 CH3

    CH3 tocoferolccuurr CH3

    OHCH3 CH3

    CH3

    CH3 CH3-tocoferol

    rrssoos s

    OHCH3 CH3

    CH3

    OCH3

    3

    CH3 CH3-tocoferol

    s s --2200

    OCH3

    CH3

    CH3

    3 3

    CH3

    CH3

    -tocoferol (vitamina E)CH3

    001122

    OCH3

    CH3

    CH3

    OCH3 CH3

    CH3

    CH3

    CH3

    O

    Vitamina E - acetato

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Vitamina E - acetato

  • Aplicaes das Principais Fases Estacionrias

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • FASEESTACIONRIA(NormaiseReversas)

    MM

    COLUNASCROMATOGRFICAS

    iinnii

    tubo:aoinoxidvel316tratado;contmFE

    *colunascapilaresenano:tubosdeslicafundida

    ccuurr

    Coluna guarda (pr-coluna): C18 (5 m)

    rrssoos s

    Coluna analtica:C-18 250 x 4,6mm x 5m

    s s --2200

    Coluna semi-preparativa:C-18 250 x 21,2mm x 10m

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    1/37CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Cavalheiro,A.J.IQUNESP

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Cavalheiro,A.J.IQUNESP

  • Otimizao dos parmetros envolvidos na separao cromatogrfica

    MM

    p g

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • CLCULO DO FATOR DE RETENO (k)

    MM

    ( )

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Equao de Purnell: A Equao Fundamental da Resoluo em HPLC

    MM Resoluo (Rs)

    iinnii

    '.)1(. 2 kNRs ccuurr

    )1'(4 2krrssoos s s s --2200

    EFICINCIADepende da configurao do sistema

    001122

    SELETIVIDADE RETENODependem das caractersticas da

    FATORES FSICOS

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    1/37

    Dependem das caractersticas da FM e FE do sistema

    FATORES QUMICOS

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122 Efeito da concentrao de metanol no tempo de reteno de

    compostos analisados

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    compostos analisados

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • EfeitodaSeletividade()sobreRs

    MM

    2.MudanasnaFE geralmenteacompanhadapormudanasnaFM

    iinnii

    Ex.FEinicial =Metil;FEalternativas =C8,C18

    ccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • 3 Mudanas na temperatura

    EfeitodaSeletividade()sobreRs

    MM

    3. Mudanas na temperatura 1 C k de 1-2%

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Journal of Chromatography A Volume 814, Issues 12, 24 July 1998, Pages 97104

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Volume de Injeo x Mxima Resoluo

    MMPara evitar a saturao dos stios de interao da coluna, o que pode causar uma piora na resoluo cromatogrfica , no se deve injetar um

    l i 1% d l d l iiinnii

    volume maior que 1% do volume da coluna vazia.

    Clculo do volume mximoccuurrrrssoos s s s --2200001122 dxL, onde d=dimetro em mm e L=comprimento da

    l

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    coluna em cm

  • Otimizao Cromatogrfica

    MM

    Modos de eluio em Cromatografia Lquida

    iinnii

    Isocrtico Gradiente%B %B

    ccuurr

    tempo tempoTeq.

    Teq.

    rrssoos s

    k = (tR tm)/tm %B k k t

    k* = (20.F)/(Vm.%/min) %/min k*

    k* ts s --2200

    k tR tR W e Int.

    k* tR tR W e Int.

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Otimizao CromatogrficaM d I ti G di t ?

    MM

    Modo Isocrtico ou Gradiente?

    Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:iinnii

    Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:

    Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 mmGradiente Linear: 5 a 100 % de ACN 60

    ccuurr

    Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60Fluxo: 2,0 mL/min.Amostra: < 50 uL; 50-100 mg (0 5 - 1 mg/mL)rr

    ssoos s

    Modo Isocrtico possveltr/tg < 0 25 1 < k < 10

    Modo gradiente ser i

    (0,5 1 mg/mL)

    s s --2200

    tr/tg < 0,25 1 < k < 10

    tr/tg < 0,40 0,5 < k < 20

    necessrio se:

    tr/tg > 0,40001122

    Onde tr = tr do ltimo pico - tr do primeiro pico /tg = tempo total de gradiente exploratro

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • FASE REVERSA C-18 - AVALIAO DA AMOSTRA GRADIENTE EXPLORATRIO

    MMModo Isocrtico possveltr/tg < 0,25 1 < k < 10tr/tg < 0,40 0,5 < k < 20 Amostra muito retina, muito apolarUsar THF ou fase reversa no aquosa (NARP)

    iinnii

    Usar THF ou fase reversa no-aquosa (NARP).Usar coluna menos lipoflica.

    ccuurr

    Modo gradiente ser necessriotr/tg > 0,40rr

    ssoos s

    Amostra muito polar.cidos/Bases/Aucares

    Controlar pH, fora inica.on-par. Troca nica.

    s s --2200 Amostra complexa

    Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 m001122

    Amostra complexaGradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60

    Fluxo: 2,0 mL/min.Detetor: DAD ou 254 nm

    Amostra: < 50 L; 50 100 g

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

    Amostra: < 50 L; 50-100 g (0,5 - 1 mg/mL)

  • Amostra fcil modo isocrtico possvel

    MM

    tR/tG = (24 19)/60 = 0,083 < 0,25

    t 19 i t 24 iiinnii

    tRp = 19 min. tRu = 24 min.Gradiente ExploratrioC18, 150 x 4,6 mm, 5 m5 a 100 % de ACN, 602 0 mL/min

    ccuurr

    Eluio isocrtica possvel1 < k < 10

    2,0 mL/min.

    rrssoos s k = 7 % ACN = 1 7 tR = 1 7 24 = 40 8 % k = 20 % ACN = 1 7 tR - 10 = 30 8 %s s --2200

    k u 7 % ACN 1,7.tRu 1,7.24 40,8 %ACN/gua 40:60

    k u 20 % ACN 1,7.tRu 10 30,8 %ACN/gua 30:70

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Resoluo satisfatriaCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - I

    MM

    tR/tG = (24 9,5)/60 = 0,24 < 0,25

    t = 9 5 min t = 24 miniinnii El i i ti l

    tRp = 9,5 min. tRu = 24 min.Gradiente ExploratrioC18, 150 x 4,6 mm, 5 m5 a 100 % de ACN, 602,0 mL/min.

    ccuurr

    Eluio isocrtica possvel1 < k < 10

    rrssoos s

    ku = 7 % ACN = 1,7.tRu = 1,7.24 = 40,8 % ku = 20 % ACN = 1,7.tRu - 10 = 30,8 %s s --2200

    ACN/gua 40:60 ACN/gua 30:70

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Resoluo insatisfatriaCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - IIOtimizao da FM

    MM

    Otimizao da FM

    Gradiente Exploratrio11

    iinnii

    8

    ku= 7 ku= 20 ACN/gua 40:602 ACN/gua 30:703

    ccuurr

    2 38ACN

    ACN/MeOHgua6 ACN/MeOHgua7rrssoos s

    6 79ACN/MeOH

    4

    20:25:55

    5

    15:20:65

    s s --2200

    4 510MeOHMeOHgua 50:504 MeOHgua 40:605

    001122 %MeOH = 1,22 + 1,37(%ACN) - 0,004(%ACN)

    2

    ACN/MeOHgua23:30:47

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalJ. Chromatogr. A, 721:15 1996. CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Amostra mais difcil modo gradiente - I

    MM

    tR/tG = (23 2)/60 = 0,35 < 0,40

    iinnii

    tRp = 2 min. tRu = 23 min. Eluio isocrtica possvel0,5 < k < 20

    Gradiente ExploratrioC18, 150 x 4,6 mm, 5 m5 a 100 % de ACN, 60

    ccuurr Modo gradiente

    2,0 mL/min.

    rrssoos s

    Modo gradiente%IACN = 1,65.tRp 9 = 1,65.2 9 = -5,7 0%%FACN = 1,65.tRp + 10,3 = 1,65.23 +10 = 48%

    % / i 48/10 4 8 k* 20 F/(V % i ) 8 3 % / i 48/30 1 6 k* 20 F/(V % i ) 12 5s s --2200

    %ACN/min = 48/10 = 4,8 k* 20.F/(Vm.%min) 8,3 %ACN/min = 48/30 = 1,6 k* 20.F/(Vm.%min) 12,50 a 47 % de ACN, 102,0 mL/min. - 30o C

    0 a 47 % de ACN, 302,0 mL/min. - 60o C

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Resoluo insatisfatriaCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Amostra mais difcil modo gradiente - II

    MM Gradiente Exploratrio1iinnii k* = 5 k*= 17

    Gradiente Exploratrio1

    Ajustar % I e % F

    ccuurr

    2 3835o C5 %/min 1,6 %/min 0 a 47 % de ACN, 10

    2,0 mL/min. - 30o C0 a 47 % de ACN, 30

    2,0 mL/min. - 60o C

    rrssoos s

    6 790 a 47 % de ACN, 102,0 mL/min. - 60o C

    0 a 47 % de ACN, 362 0 mL/min - 60o Cs s

    --2200

    4 51065o C

    , 2,0 mL/min. - 60 C

    001122

    0 a 47 % de ACN, 722,0 mL/min. - 60o CCol. 30 cm - 3,5 m

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Gradiente - Otimizao1 Aj % i i % i

    MM

    1. Ajustar % Inicial e % Final de B2. Otimizar k* (considerar tG)3. Verificar influncia do solvente B

    iinnii

    4. Avaliar influncia da temperatura5. Ajustar configurao da coluna6 O t i i

    ccuurr

    6. Outras variveis

    Ajustar % Inicial e % Final de BMistura de Herbicidas: 9 fenilurias e 6 s-triazinas (J. Chromat. , 261:329 1983)

    rrssoos s

    0-100% MeOH50 min. (2%/min.)

    40-100% MeOH30 min. (2%/min.)

    60-100% MeOH20 min. (2%/min.)

    s s --2200

    50-100% MeOH25 min. (2%/min.)

    50-70% MeOH10 min. (2%/min.)

    50-80% MeOH15 min. (2%/min.)

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Gradiente - Otimizao

    MM 1. Ajustar % Inicial e % Final de B2 Oti i k* ( id t )ii

    nnii

    2. Otimizar k* (considerar tG)3. Verificar influncia do solvente B4. Avaliar influncia da temperatura

    ccuurr

    5. Ajustar configurao da coluna6. Outras variveis

    rrssoos s

    Verificar influncia do solvente B Col.: C18 - 10 m30 x 0,42 cm 1 mL/min - t.a.

    Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)s s --2200

    100% ACN

    100% MeOH

    10% MeOH

    20% ACN

    Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)

    001122

    060 min. tempo

    060 min. tempo

    060 min. tempo

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Gradiente - Otimizao

    MM

    1. Ajustar % Inicial e % Final de B2. Otimizar k* (considerar tG)

    iinnii

    3. Verificar influncia do solvente B4. Avaliar influncia da temperatura5. Ajustar configurao da coluna

    ccuurr

    5. Ajustar configurao da coluna

    Aj t fi d lrrssoos s

    Ajustar configurao da coluna: comprimento, partcula, fluxo25 cm - 10 m

    2 mL/min - 1040 psi25 cm - 10 m

    1 mL/min - 520 psi Coluna C18 d.i. 0,46 cmFM: 40 a 77% MeOH a 0,7%/min

    Rs = 1,1 Rs = 1,3

    s s --2200001122

    Mistura de Herbicidas: 9 fenilurias e 6 s-triazinas

    50 cm - 10 m2 mL/min - 2080 psi

    25 cm - 5 m1 mL/min - 2080 psi

    Rs = 1,5 Rs = 2

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    9 fenilurias e 6 s triazinas(J. Chromat. , 261:329 1983)

  • BOMBASDEALTAPRESSO

    MM PermitemvenceraresistnciapassagemdaFMexercidapelaspartculasdaFE.

    Funo:proporcionarfluxoconstanteereprodutveldeFMatodoosistema.iinnii

    u o p p p

    CARACTERSTICASDESEJVEIS:ccuurr

    composiodaFMefluxoprecisoseexatos

    vazocontnuaelivredepulsaesrrssoos s

    respostarpidaaalteraesnofluxoecomposiodaFM gradientedeeluio!!

    pressomxima:700atm(10.000psi)s s --2200

    maiorparteconstrudaemaoinox316;outrosmateriais:titnio,peek,teflon

    inrciaqumicaasolventescomuns

    001122

    manutenosimples

    reservatriodesolventeilimitado

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • BOMBASDEALTAPRESSO

    MM BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTEiinnii

    BombasmaisutilizadasemCLAE

    Vantagem:

    ccuurr

    Capacidadederepetiodosvolumesoufluxose,consequentemente,dasreasdospicos,mesmocommudanasnaviscosidadedaFMoubloqueiodacolunaporpartculas.rr

    ssoos s

    p p

    s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • BOMBASDEALTAPRESSO

    MM BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTEiinnii

    BOMBADOTIPOSERINGA

    ccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal Lanas,2009Collins;Braga;Bonato,2006

  • BOMBASDEALTAPRESSO

    MM BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTEBOMBA DO TIPO PISTO RECIPROCANTE OU ALTERNANTEii

    nnii

    BOMBADOTIPOPISTORECIPROCANTEOUALTERNANTE

    ccuurr

    pistoconectadoaomotorpormeiodeengrenagense1EXCNTRICO

    rrssoos s

    escoamvolumesconstantesdeformanocontnuaoupulsante

    bomba mais empregada em CLAE at almentes s --2200

    bombamaisempregadaemCLAEatualmente

    adequadaparapresseselevadas001122

    reservatriodeFM:ilimitado

    movimentosdopistonacmarageramPULSOS

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    aplicaes:CLAEanalticaepreparativa Lanas,2009

  • SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)INJETORES MANUAIS

    MM

    INJETORESMANUAIS

    amostradeveseraplicadanacolunapressurizadanaformadeumabandaestreitaiinnii

    vlvuladeintroduodeamostramaiscomum:vlvulade6prticos(orifcios)

    aladeamostragemouloop:comprimentoedimetrointernodefinemseuvolumeloop para escala analtica(L)ccuurr

    ( )

    rrssoos s

    loop para escala preparativa(mL)

    s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html

  • SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)

    MM

    INJETORESMANUAIS

    VISOESQUEMTICADOFUNCIONAMENTODAVLVULADE6PRTICOSiinnii sada da amostra

    POSIODECARGALOAD

    ccuurr

    entrada da amostra

    sada da amostra

    ala de amostragem (loop)2

    3rrssoos s

    entrada do eluente

    1

    46

    s s --2200

    coluna 5

    1

    23

    46001122

    4

    5

    6

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    1/37

    POSIODEINJEOINJECT

  • DETECTORES

    MMFuno do detector: identificar a presena de substncias de

    interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrficaiinnii

    interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica.

    Caracterstica desejveis:

    ccuurr

    - alta sensibilidade e baixo limite de deteco- ampla faixa de linearidade rr

    ssoos s

    - confivel e reprodutvel -fcil de operar e manter-informao qualitativa e quantitativas s

    --2200

    informao qualitativa e quantitativa-no destruio do soluto-insensibilidade a mudanas na FM e de T

    t id li lt d t d l t001122

    - resposta rpida e linear a alteraes das concentraes dos solutos-baixo nvel de rudo

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • CLASSIFICAO

    MMDe acordo com as propriedades medidas:Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de

    iinnii

    Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de propriedades do eluente (ex. constante dieltrica)Detectores de propriedades do analito: medem propriedade fsica ou qumica do analito (ex fluorescncia)

    ccuurr

    qumica do analito (ex. fluorescncia)

    De acordo com o tipo de resposta:Detectores sensveis concentrao: resposta proporcional rr

    ssoos s

    etecto es se s e s co ce t ao esposta p opo c o a concentrao de um componente no eluente (ex. UV, fluorescncia).Detectores sensveis ao fluxo de massa: resposta proporcional quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detectors s

    --2200

    quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector por unidade de tempo (ex. eletroqumico, espalhamento de luz).

    De acordo com a seletividade:001122

    Detectores universaisDetectores seletivosDetectores especficos

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    Detectores especficos

  • DETECTORES

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • DETECTORES

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • DETECTORESBASEADOSNAABSORODELUZ

    MM

    C O S S OS SO O UUV/VIS

    iinnii

    Faixas de utilizadas:

    Ultravioleta: 190 - 400 nmccuurr

    Visvel: 400 - 800 nmEspectro eletromagntico

    rrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    1/37

  • DETECTORES

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    1/37

  • DETECTORES

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • DETECTORES

    MM LEI DE LAMBERT-BEERiinniiccuurrrrssoos s

    Leitura = Unidade de Absorbncia (UA)

    1 UA = Depreciao da luz incidente em 90 % s s --2200

    Comprimento de onda

    S l t mximo

    001122

    SolventepH mximo

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    Temperatura > Sensibilidade

  • DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODEONDAFIXO

    MM iinnii

    ccuurr

    rr

    ssoos s

    s s --2200

    001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODE

    MM

    ONDAVARIVEL

    iinnii

    ccuurr

    rrssoos s s s --2200

    Lmpadas: deutrio UV001122

    Lmpadas: deutrio UVtungstnio - visvel

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  • DETECTORNOUV/VISCOMARRANJODE

    MM

    /FOTODIODOS(DAD)

    iinnii

    arranjo de diodos: srie de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal desilcio de modo que cada difratado pela grade atinja um diodo.

    ccuurr

    a absorbncia de uma amostra pode ser determinada em todos os de modosimultneo.rr

    ssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • DETECTOR DETECTOR --UV/VISUV/VIS

    MM Qual o comprimento de onda ideal para a iinnii

    anlise quantitativa ?

    ccuurr 223 252 280

    OH OH

    O O

    500

    mAU

    rrssoos s

    215 nm 223 nm 252 nm 280 nm300

    s s --2200

    100

    250 300 350nm

    001122 == >> > sensibilidade> sensibilidade

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    maxmax sensibilidade sensibilidade

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • DetectorEletroqumico

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • DETECTORES

    MM

    Espectrmetrosdemassas(HPLCMS/MS)

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • DETECTORES

    MMComparaodarespostadealgunsdetectores

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • Algumas Dicas

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • Algumas DicasMM

    Algumas DicasTAMPES EM CLAE

    iinnii < 3,12,1H3PO4/KH2PO4 ou K2HPO4

    210 nm (0,1%)1,5-2,5>> 2cido Trifuoractico (TFA)

    UV limiteFaixapKaTampo

    ccuurr 230 nm (10 mM)2,1-6,4

    3,14,7

    cido ctrico/K3 citrato

    < 200 nm (0,1 %)6,2-8,211,3-13,3

    7,212,3

    rrssoos s < 200 nm (10 mM)5 4 7 46 4KHCO ou K CO /cido actico

    210 nm (10 mM)3,8-5,84,8cido actico/Acetato de K210 nm (10 mM)2,8-4,83,8cido frmico/Formiato de K

    5,4

    s s --2200

    215 nm (10 mM)225 nm (10 mM)

    5,8-7,88,0-10,0

    6,89,0

    Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano

    < 200 nm (10 mM)5,4-7,49,3-11,3

    6,410,3

    KHCO3 ou K2CO3/cido actico

    001122

    < 200 nm (10 mM)10 0-12 011 0Et N HCl/Et N215 nm (10 mM)9,1-11,110,11-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina200 nm (10 mM)8,2-10,29,2NH4Cl/NH3

    205 nm (10 mM)7,3-9,38,3Tris.HCl/Tris

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    < 200 nm (10 mM)10,0-12,011,0Et3N.HCl/Et3N

  • Algumas Dicas

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • Algumas Dicas

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  • Algumas Dicas

    MMT ( i ) % H O % M OH

    Gradiente otimizado

    iinnii

    Tempo (min) % H2O % MeOH

    0 70 30

    15 35 65

    Tempo de equilbrio de 3 min

    ccuurr

    17 0 100

    20 70 30

    25 70 30rrssoos s

    Tempo de equilbrio de 8 minFique atento ao tempo de equilbrio da sua coluna

    s s --2200

    cido cetico 0,1 % foi usado como supressor inico

    001122

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  • O d f HPLCMM

    O que voc no deve fazer em HPLC

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

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  • AgradecimentosMM

    Agradecimentos Ao Conselho Regional de Qumica - CRQ-IV

    iinnii

    g Aos Participantes do Curso

    ccuurr

    ContatoGuilherme Julio Zocolorr

    ssoos s

    E-mail: gjzocolo1@gmail.coms s --2200

    Quaisquer dvidas estarei sempre a disposio

    001122

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  • MinicursosCRQIVPrincpiosdaHPLC

    ApoioCaixaEconmicaFederal

    Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) Dinmica 1 1. O entendimento do processo cromatogrfico e dos fatores de reteno (k), seletividade () e

    eficincia (N) fundamental para o desenvolvimento racional de um mtodo cromatogrfico. Assim sendo, explicar objetivamente:

    a) O que fora de eluio e qual a sua influncia na distribuio de cada componente

    de uma mistura de substncias orgnicas entre as fases estacionria (FE) e mvel (FM);

    b) O que seletividade cromatogrfica? Cite exemplos de solventes e adsorventes com seletividades diferentes.

    c) O que eficincia cromatogrfica? 2. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos modos de eluio isocrtico e gradiente? 3. Para avaliar a qualidade de uma coluna de CLAE, quais parmetros (cite pelo menos trs)

    devem ser freqentemente monitorados e o que eles podem indicar?

  • MinicursosCRQIVPrincpiosdaHPLC

    ApoioCaixaEconmicaFederal

    Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) Dinmica 2 1. a. Qual a caracterstica mais importante de um detetor em sistema de cromatografia

    lquida? Por que? Quais detetores satisfazem essa caracterstica?

    b. Considerando sensibilidade e seletividade, que detetores seriam mais indicados para analise quantitativa em CLAE das misturas abaixo:

    I. lcoois e aminas saturados industria de alimentos.

    II. Antioxidantes polifenlicos presente em medicamentos fitoterpicos.

    III. Hidrocarbonetos policclicos aromticos presentes na fuligem resultante da queima da cana-de-acar amostra ambiental concentraes na ordem de ng mL-1 (ppb)

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