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  • CONSELHO REGIONAL DEQUMICA - IV REGIO (SP)

    Ministrante: Guilherme Julio ZocoloDoutor em Qumica Analtica - Unesp/AraraquaraContatos: gjzocolo1@gmail.com

    Araraquara, 15 de setembro de 2012

    Princpios e Aplicaes da CromatografiaLquida de Alta Eficincia (HPLC)

    Apoio

    Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formatoPDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)

    facebook.com/crqiv twitter.com/crqiv

  • MMiinnii Princpios e Aplicaes da Cromatografiaccuurr

    Princpios e Aplicaes da Cromatografia Lquida

    de Alta Eficincia (HPLC)rrssoos s

    de Alta Eficincia (HPLC)

    s s --2200

    Dr. Guilherme Julio ZocoloE mail: gjzocolo1@gmail com00

    1122

    E-mail: gjzocolo1@gmail.com

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta Efi i i (HPLC)

    MM

    Eficincia (HPLC)

    Toxicologiaiinnii

    Toxicologia

    Cosmticos

    ccuurr HPLC

    Frmacos

    P ti idrrssoos s

    HPLC Pesticidas

    Alimentoss s --2200

    ProtenasPr-requisito: a amostra deve ser solvel00

    1122

    AminocidosPr requisito: a amostra deve ser solvel

    na fase mvel

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Corantes

  • Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

    MMiinniiccuurrrrssoos s Solvente

    Sistema de HPLC

    s s --2200

    ColunaSistema

    001122

    Injetor de dados

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Bomba Detector Descarte

  • Histrico

    MM

    Mikhael Semenovich Tswett (1906)

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Mikhael Semenovich Tswett (1906)

    MM

    Cromatografia

    Cromatogramaiinnii

    Mtodo cromatogrfico

    B i ht d D t h B t i h G ll h ftccuurr Mtodo fsico-qumico de separao de

    Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft

    rrssoos s

    q p

    componentes de uma mistura, que envolve a

    distribuio diferencial destes em um sistemas s --2200

    distribuio diferencial destes em um sistema

    heterogneo bifsico:1 - FASE ESTACIONRIA;

    001122

    1 FASE ESTACIONRIA;2 - FASE MVEL.

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Evoluo das Tcnicas Cromatogrficas

    MM 1906 Tswett CROMATOGRAFIAEMCOLUNA(CC)

    g

    iinnii

    ( )extratosvegetais;colunac/CaCO3;terdepetrleo

    1938 IzmailoveShraiber CROMATOGRAFIAEMCAMADADELGADA(CCD,TLC)ccuurr

    extratosvegetais;placadevidroc/alumina

    ERAdaCromatografiaModerna:PrmiosNobel 1937,1938,1939.rrssoos s

    1941 MartineSynge CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

    1952 Martin e James CROMATOGRAFIA GASOSA (CG GC)s s --2200

    1952 MartineJames CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)

    Dcadasde1960/1970Karr Jentoft Gouwn Huber Hulsman Snyder e Kirkiland00

    1122

    Karr,Jentoft,Gouwn,Huber,Hulsman,SnydereKirkilandCROMATOGRAFIALQUIDADEALTAEFICINCIA(CLAE,HPLC)

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • Mecanismo de separao cromatogrfica

    MM

    A separao cromatogrfica obtida a partir de interaes diferenciadasentre os analitos componentes da mistura, fase estacionria e fasemvel

    iinnii

    mvel.

    ccuurr

    FASE MVEL AMOSTRAFM FErrssoos s

    FASEESTACIONRIAamostra

    s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalCAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • CROMATOGRAFIA:CLASSIFICAOPELAPOLARIDADEDAFASE ESTACIONRIA

    MM

    FASEESTACIONRIA

    iinnii

    Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar.

    Ex.: slica gelccuurr

    Ex.: slica gel

    O SiR OHOR

    rrssoos s Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa

    OR

    s s --2200

    Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa polaridade.

    001122

    Ex. slica de fase ligada C18

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200

    O SiR OHOR

    001122

    OR

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurr R = CN, Diol, Fenila, NH2

    X=Cl

    rrssoos s

    Quando se utiliza silica-gelderivatizada com grupos

    s s --2200

    polares (fenila, ciano, amino,diol), tais fases estacionriaspodem ser utilizadas tantopara cromatografia em modo00

    1122

    para cromatografia em modonormal (fase estacionria polar eluente apolar) ou em fasereversa (fase estacionria

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    apolar eluente polar).

    Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002

  • FASE NORMAL: fase estacionria polar

    MMiinniiccuurrrrssoos s

    Eluem primeiro as substnciasapolares que possuem uma menorinterao com a fase estacionrias s

    --2200

    interao com a fase estacionriapolar.

    001122 Aplicvel a anlise de substncias insolveis em gua: leos,

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    p g ,gorduras, lipdios. Destaca-se na separao de ismeros.

    Fonte: Waters corporation

  • Mecanismo de separao cromatogrfica

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica FederalFonte: Adaptado de Waters corporation

  • Caractersticas das FASES NORMAIS

    MMiinnii

    Vantagens Desvantagens

    1. Versatilidade na mudana de seletividade alterando as fases mveis e

    1. Amostras inicas so de difcil separao e so mais viveis de se separar por fase

    ccuurr

    seletividade alterando as fases mveis e estacionrias

    e so mais viveis de se separar por fase reversa

    2. Colunas estveis quando se utiliza solventes no aquosos

    2. Controle da fora de eluio menos previsvel e mais demorado que em fase rr

    ssoos s

    solventes no aquosos reversa

    3. Uma grande variedade de substncias orgnicas so mais solveis nos solventes 3 Pior resoluos s

    --2200

    usados em fase normal (til em LC preparativa)

    3. Pior resoluo

    4. Decrscimo de presso menor devido 4. Ponto de ebulio reduzido pode gerar 001122

    pbaixa viscosidade dos solventes

    p gbolhas

    5. til para amostras que possam se decompor em solues aquosas 5. Alto custo dos solventes orgnicos

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

    decompor em solues aquosas.

  • Ganhos e Perdas em

    MM

    Ganhos e Perdas em FASE NORMAL

    iinniiccuurrrrssoos s s s --2200001122

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)

  • Fases mveis em Fase Normal

    MM Baixa (solvente A) Hexano

    Fora de Eluio

    iinnii

    Mdia Clorofrmio, acetonitrila, tetrahidrofurano

    ccuurr

    Forte (solvente B) Isopropanol, metanol

    rrssoos s

    Reteno aumenta com aumento da polaridade dos solutos.s s --2200

    Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica

    001122 Picos assimtricos

    cido actico ou frmico para cidos.

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Amnia ou trietilamina para bases.

  • EFEITOS DA FASE MVEL EM FASE NORMAL

    MM Solvente fraco (A): no-polar 0 5 < k < 20iinnii

    Solvente forte (B): polar0,5 < k < 20

    ccuurr

    Seletividade () fortemente influenciada pela proporo do solvente B utilizado na fase mvel.rr

    ssoos s

    Seletividade () ainda mais fortemente influenciada pelo tipo do l t B tili d f ls s

    --2200

    solvente B utilizado na fase mvel.

    F E s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano001122

    F.E.s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano

    F E s (poder de separao): ciano > slica > diol > amino

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    F.E.s (poder de separao): ciano > slica > diol > aminoFonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

  • Efeitos da variao de solvente POLAR na separao cromatogrfica

    MMiinniiccuurrrrssoos s s s --2200

    Condies cromatogrficasB: Acetato de etila00

    1122

    B: Acetato de etilaA CiclohexanoColuna de silica 150x4,6 mmx5 m

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    Vazo de 2 mL min-1

  • Desenvolvimento de mtodo em FASE NORMAL

    Estratgias

    MMA. Coluna Ciano (solvente A:

    hexano; solvente B:

    Estratgias

    iinnii

    ;propanol).

    B. Verifique a presena de d i

    ccuurr

    cauda nos picos.

    C. Mudar a proporo do solvente B; substituindo rr

    ssoos s

    o tipo de solvente B (diclorometano, ACN) e sua proporo.Em ltimo caso substitua o tipo des s

    --2200

    caso, substitua o tipo de coluna (diol, amino, slica).

    D Oti i di d001122

    D. Otimize as condies da coluna (L; diametro da particula e vazo da fase mvel.)

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    )

    Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO

  • Fase ligada amino (NH2)

    MMAnlise de esterides em sangue

    iinnii

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