Tcnicas de Separao Cromatogrficas Princpios gerais I

Mtodos Instrumentais de Anlise: 2011/2012

Sumrio Breve introduo histrica Mecanismo de separao Classificao dos mtodos cromatogrficosEscala da separao Suporte do leito cromatogrfico Mecanismo de separao Estado fsico da fase mvel

Equipamento bsico para a realizao de uma cromatografia em coluna

BiblioTpico Harris, 5 ed (biblioteca) Cap. 23 Skoog 7 ed (biblioteca) Cap. 28

Introduo s Separaes Analticas Cromatografia gasosa (GC) Cromatografia Lquida de Elevada Eficincia (HPLC)

Cap. 24

Cap. 29

Cap. 25

Cap. 30

Mtodos de separaoOs detalhes moleculares de um processo bioqumico no podem ser totalmente elucidados at todas as molculas participantes terem sido isoladas e caracterizadas

ClasseSeparaes mecnicas

Fora da separaoGravidade Fora centrfuga Presso Gradiente de concentrao Presso Campo elctrico Gradiente de concentrao

ExemploFiltrao Centrifugao Filtrao sob presso Dilise Ultrafiltrao Electrodilise Tcnicas cromatogrficas Tcnicas electroforticas

Separaes atravs de membranas

Separaes governadas por difuso Separaes elctricas

Campo elctrico

Cromatografia breve introduo histrica 1903 1906: tcnica desenvolvida por Mikhail Tswett (botnico russo) separao de pigmentos atravs da passagem de extractos de plantas por colunas empacotada com CaCO3 finamente dividido

Cromatografia

Croma = cor Graphien = escrever

os pigmentos fotossintticos separados apareciam como bandas ou zonas coradas na coluna

Cromatografia breve introduo histricaEtapas importantes no desenvolvimento das tcnicas cromatogrficas1850 Runge separa corantes tendo por base a sua adsoro diferencial em papel Tswett inventa a cromatografia lquida em coluna separao de extractos de folhas de plantas em solventes orgnicos atravs de colunas empacotadas com p de giz Martin e Synge desenvolvem a cromatografia de partio (Prmio Nobel Qumica, 1952: princpios tericos da cromatografia e desenvolvimento da cromatografia gasosa) Stein and Moore determinam pela primeira vez a composio em residuos de aminocidos de uma protena, usando inicialmente a cromatografia em colunas de amido e posteriormente atravs do desenvolvimento da cromatografia de troca inica Piel desenvolve a cromatografia lquida de elevada eficincia (HPLC)

1903 1906 1942

1946

1965 1969

Cromatografia Definio IUPAC um mtodo fsico de separao em que os componentes de uma amostra se distribuem entre duas fases:fase estacionria: de grande superfcie (slida ou lquida) fase mvel: fluido (gs ou lquido) que transporta a amostra numa direco definida ao longo da fase estacionriaHarris, Quantitative Chemical Analysis ,6e

B

A

A emerge

B emerge

Factores que influenciam a reteno de um soluto a separao efectuada tendo por base a afinidade qumica relativa de cada componente da amostra para as fases mvel e estacionria este parmetro dependente de: tipo e propriedades da fase estacionria tipo e propriedades da fase mvel foras intermoleculares:

Foras de disperso de London (interaces dipolo induzido dipolo induzido)

analito e fase mvel analito e fase estacionria

Interaces dipolo dipolo induzido Interaces inicas Pontes de hidrognio

temperatura

Cromatografia Mecanismo de separaoKD: Coeficiente de partio ou distribuio do soluto S entre as duas fases

Sst

Sm

M st Vst Kd = = Cm M m Vm

Cst

Cst, Cm: concentrao de soluto na fase estacionria/ mvel Mst, Mm: massa de soluto na fase estacionria/ mvel Vst, Vm: volume da fase estacionria/ mvel

Coeficiente de distribuio efectivo (K) quantidade total de soluto em cada fase Quanto > KD o soluto permanece mais tempo na fase estacionria

a velocidade de migrao inversamente proporcional a Kd

Modelo para a separao cromatogrficaAdmitindo que a fase mvel se move na coluna por incrementos de 1 cm3 em vez de uma forma contnua: Cst KD (A) = 1 Kd = fase estacionria granular slida Cm h = 5 cm fase mvel lquida 1 cm3/cm coluna Cst, concentrao de soluto na fase estacionria 32 g composto em 1 cm3 solvente Cm, concentrao de soluto na fase mvel

1A B C D E 3216 16

216 168 8 8 8

38 16 84 8 4 4 8 4

44 12 12 42 6 6 2 2 6 6 2

52 8 12 8 2

Aps 5 equilbrios, o composto distribui-se ao longo da coluna mas est mais concentrado no seu centro

Separao cromatogrfica KD (A)>1Pico de concentrao acima do centro da coluna

KD (A) = 1

Pico de concentrao no centro da coluna

KD (A) < 1

Pico de concentrao abaixo do centro da coluna

Quanto maior o nmero de equilbrios, maior ser a concentrao do soluto numa parte da coluna.

SEPARAO CROMATOGRFICAFactores que influenciam o padro de separao duma mistura de compostos Resoluosituao real coluna normal

coeficiente de distribuio efectivo n de equilibriosequilibrio ocorre continua/ milhares de equilibrios

n de equilibrios

n de pratos tericos n de pratos tericos

Qt. mais eficiente uma coluna cc. relativa de soluton = 1000

n = 100 n=6

Distribuio relativa na coluna

Classificao dos mtodos cromatogrficos IEscala da separao Cromatografia analtica pretende-se determinar a composio qumica de uma amostra: separar e quantificar os seus componentes em pequena escala

Cromatografia preparativa pretende-se purificar e colectar um ou mais componentes de uma amostra em grande quantidade (g a g), num grau de pureza elevado

colunas com um dimetro interno (ID) mximo de 10 mm; velocidade do fluxo 0.1 30 mL/min

colunas com um dimetro interno (ID) tipicamente entre 7 - 50 mm; velocidade do fluxo 20 1 200 mL/min

Classificao dos mtodos cromatogrficos IISuporte do leito cromatogrfico Cromatografia em coluna a fase estacionria est inserida num tubo/ coluna

Cromatografia planar a fase estacionria tem a forma ou suportada por uma superfcie plana (cromatografia em papel ou em camada fina)

a coluna pode ser operada sob presso ou por aco da gravidade

Voet, Biochemistry, 3e

Classificao dos mtodos cromatogrficos IIIMecanismo de separaoCromatografia de adsoro a separao tem por base as diferentes afinidades adsorventes dos componentes da amostra pela superfcie de um slido activo, com um n finito de centros de ligao

Cromatografia de partio a separao tem por base as diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria (cromatografia gasosa) ou nas fases mvel e estacionria (cromatografia lquida)

Harris, 7e

Classificao dos mtodos cromatogrficos IIIMecanismo de separaoCromatografia de troca inica Cromatografia de excluso estrea ou molecular a separao tem por base as diferenas de raio de Stokes (forma e tamanho) dos componentes da amostra

a separao tem por base as diferenas de carga dos componentes da amostra

Harris, 7e

Classificao dos mtodos cromatogrficos IIIMecanismo de separaoCromatografia de afinidade separao baseada no estabelecimento de uma interaco bioespecfica entre os componentes da amostra e um ligando ligado matriz

Harris, 7e

Classificao dos mtodos cromatogrficos IVEstado fsico da fase mvelClassificao Geral Mtodo especficoLquido - lquido

Fase estacionriaLquido adsorvido num slido Espcie orgnica ligada covalentemente a uma superfcie slida Slido Resina de troca inica

Tipo de equilbrioPartio entre lquidos imiscveis Partio entre a fase lquida e a fase ligada Adsoro Permuta inica Excluso estrea

Cromatografia Fase lquida lquida (LC)ligada

fase mvel: lquido

Lquido - slido Permuta inica

Excluso Molecular Lquido nos interstcios de um gel Gs - lquido Lquido adsorvido num slido Espcie orgnica ligada covalentemente a uma superfcie slida Slido

Cromatografia Gs - fase ligada gasosa (GC) fase mvel: gs

Partio entre o gs e o lquido Partio entre o gs e a fase ligada Adsoro

Gs - slido

Equipamento bsico para cromatografia em colunaBomba peristltica

Coluna

Detector UV = 280nm

Colector

Registador

Colunas- Tubos de vidro ou seringas com l de vidro na parte inferior

- Colunas comerciais: vidro de borossilicato suporte da fase estacionria prato de vidro poroso adaptadores com posio varivel

camisa para circulao de lquido termostatizado tubagem capilar vlvulas e torneiras de vrias vias

Enchimento da colunaa fase estacionria (mistura semi-slida) deve ser adicionada coluna com a sada fechada, de preferncia de uma s vez a fase estacionria vai-se depositando por aco da gravidade

-

- abrir a coluna e iniciar o fluxo da fase mvel se for necessrio repetir este procedimento, evitar a criao de interfaces entre as vrias etapas

- proteger a superfcie da coluna para no se formarem poos durante a aplicao da amostra - nunca deixar secar a coluna

Controlo do fluxo da fase mvel- Eluio por aco da gravidade (reservatrio Mariotte)(A) (B)Presso operativa

- Bomba peristlticaPresso operativa em A e B: presso (em cm de gua) medida em termos da distncia que separa a superfcie de lquido: (A) na coluna ou (B) no reservatrio da soluo tampo e a sada do tubo capilar

Cuidados a observar na aplicao da amostra no perturbar a superfcie do gel empacotado na coluna aplicada na coluna

.

no diluir a amostra no deixar secar acoluna durante a aplicao da amostra

a densidade daamostra pode ser aumentada por adio de sacarose a 1%

no sobrecarregar acoluna com amostra (separaes irregulares)

Desenvolvimento da colunaDefinies: eluente: fase mvel eluio: migrao do analito na coluna devido ao movimento da fase mvel eludo: fase mvel que vai saindo da coluna Desenvolvimento da coluna: Separao isocrtica Eluio por gradiente pH I polaridade

Recolha e anlise das fraces Recolha das fraces: - Manual - Colector automtico tambor circular que suporta tubos de ensaio movimento peridico do porta tubos pr-determinado: - tempo - volume vazado - n de gotas vazadas

Anlise das fraces- Colorimetria - Absoro no UV (detector de UV) - Fluorimetria - Contagem de cintilaes (radioactividade) - RIA ...

Vantagens das tcnicas cromatogrficas

Processo muito selectivo devido ao grande nmero de combinaes possveis de fases mveis e estacionrias Permite separar misturas muito complexas: glcidos, protenas, produtos farmacuticos, drogas, enantimeros .... Os componentes separados podem ser colectados individualmente ou analisados posteriormente por outras tcnicas (tcnicas hfenadas) que auxiliam a sua identificao No caso de separaes analticas so necessrias amostras de tamanho muito reduzido As anlises podem ser muito exactas e precisas Em geral, trata-se de uma tcnica simples e rpida