UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

Departamento de Biologia

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS EM PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION,

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE), ELETROFORESE E BANDEAMENTO

G (BANDEAMENTO GIEMSA)

Hugo Eduardo Azevedo Fialho

São Luís

2013

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Hugo Eduardo Azevedo Fialho

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS EM PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION,

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE), ELETROFORESE E BANDEAMENTO G

(BANDEAMENTO GIEMSA)

Relatório apresentado ao Departamento de Biologia desta Universidade Federal do Maranhão para obtenção de segunda nota na disciplina de Genética.

São Luís

2013

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................4

2. OBJETIVOS..........................................................................................................................5

3. REFERENCIAL TEÓRICO................................................................................................6

4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................9

5. REFERÊNCIAS..................................................................................................................12

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INTRODUÇÃO

As anomalias gênicas incluem transtornos de um único gene e assim compreendem

uma quantidade relevante de doenças, síndromes, resistências, disgenesias, distrofias,

displasias, má absorções, intolerâncias, sobrecargas, atresias, deficiências, ataxias, paralisias e

desordens agrupadas por deficiências em fatores de transcrição, desordens em carreadores de

soluto, deficiências em receptores de membrana plasmática, canalopatias, desordens

peroxissomais, desordens lisossomais estruturais e doenças escleroproteicas não referentes à

laminina e à queratina1. Transtornos de um único gene como a doença de Kennedy, a

síndrome de Saethre-Chotzen, resistência aos hormônios tireóideos, disgenesia gonadal XY,

distrofia miotônica do tipo 2, displasia campomélica, má absorção da frutose, intolerância à

proteína lisinúrica, sobrecarga de ferro africana, epidermiólise juncional com atresia pilórica,

deficiência da lipase ácida lisossomal, ataxia episódica do tipo 6, paralisia hipocalêmica

periódica do tipo 1 e desordem de dor extrema paroxística atingem conjuntamente notável

contingente humano1, assim justificando avanços constantes em exames diagnósticos de

biologia molecular, entre os quais estão a PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em

cadeia da polimerase) e a eletroforese, para fins do solicitação adequada de exame e

subsequente adoção eficaz de tratamento e medidas legais pertinentes.

Por sua vez, as anomalias cromossômicas compreendem anomalias estruturais e

anomalias numéricas1. Anomalias numéricas ou aneuploidias abarcam um número anormal de

cromossomos, desde a monossomia à trissomia, tetrassomia e sucessivos; aqui se incluem a

síndrome de Down e a síndrome de Turner, por exemplo1. As anomalias estruturais incluem

deleções, duplicações, translocações recíprocas, translocações robertsonianas, inversões,

inserções, cromossomos anelados e isocromossomos; aqui está, entre outros, a síndrome de

Jacobsen1. Similarmente às anomalias gênicas, as anomalias cromossômicas contêm

conjuntamente notável contigente humano, assim justificando avanços consntantes em

exames diagnósticos de citogenética clínica, entre os quais o bandeamento G (bandeamento

Giemsa), para fins do solicitação adequada de exame e subsequente adoção eficaz de

tratamento e medidas legais pertinentes.

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OBJETIVOS

São objetivos de aula prática realizada no Laboratório de Genética Médica e

adjacências no Departamento de Biologia desta Universidade Federal do Maranhão:

1. Observar e compreender exames recorrentes de biologia molecular - i.e., PCR (Polymerase

Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) e eletroforese em gel de agarose - para

diagnóstico de anomalias gênicas; e

2. Observar e compreender de exames recorrentes de citogenética clínica - i.e, bandeamento G

(bandeamento Giemsa) -, para diagnóstico de anomalias cromossômicas.

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REFERENCIAL TEÓRICO

A PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) é um método

por vezes associado à eletroforese como testes de biologia molecular e útil no diagnóstico de

anomalias gênicas que se baseia na habilidade da DNA-polimerase em sintetizar fitas de

DNA complementares à fita de DNA-molde oferecida2. Para tanto e por protocolos de

utilização laboratorial de PCR - inventada pelo bioquímico Kary Mullis em 19833,4,5,6,7,

rendendo-lhe o Prêmio Nobel de Química de 19938 - é necessária a adição de primer, uma vez

que que a DNA-polimerase adiciona nucleotídeos apenas a um grupo 3’-OH pré-existente,

assim permitindo a adição do primeiro nucleotídeo após o término do primer e ainda o

delineamento da região específica da fita de DNA-molde que se quer ampliar2. Ao fim de uma

PCR, geralmente constituída de 25-35 ciclos3, doravante n, tem-se exatos 2n - n - 1 ou

aproximadamente 2n amplicons ou número de cópias da sequência de DNA-molde

ampliadas3,8.

Pormenorizando-se os protocolos de utilização laboratorial, toda PCR requer para

além de água ultrapura (I) fita de DNA-molde; (II) primers; e (III) DNA-polimerase, a que se

adiciona solução de MgCl2, nucleotídeos e solução-tampão2. A fita de DNA- molde contém a

sequência de DNA-alvo; na fase de desnaturação, o DNA devidamente coletado é exposto a

temperatura de 94-96 ºC em termociclador, assim convertendo a fita dupla de DNA em duas

fitas simples de DNA2,3,4,5. Na fase de anelamento ou fase de hibridização, na qual o

termociclador descende a temperatura a 45-65 ºC, ocorre a hibridização dos forward primers e

reverse primers, pequenas fitas simples de DNA complementares à sequência de DNA-alvo e

partir de que a DNA-polimerase inicia síntese de novo DNA3,4,5. Por fim, urgem DNA-

polimerase, a solução de MgCl2 e os nucleotídeos, envolvidos na fase de extensão, quando da

ascensão da temperatura a 72 ºC pelo termociclador3,4,5.

A DNA-polimerase é um tipo de enzima capaz da síntese de novas fitas de DNA

complementares à fita de DNA-alvo da fita de DNA-molde a partir dos primers e de uso

conveniente por sua alta termoestabilidade, sendo o tipo de DNA-polimerase primeiramente

descoberto e mais empregado a Taq DNA-polimerase, derivada de Thermis aquaticus2. Para a

otimização da Taq DNA-polimerase são necessárias (I) solução de concentração ótima de

cloreto de magnésio (MgCl2), uma vez que o magnésio é requerido como cofator para Taq

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DNA-polimerase, (II) solução-tampão para obtenção de pH ótimo à atividade da Taq DNA-

polimerase e (III) nucleotídeos, disponibilizados sob dNTPs (deoxynucleotide triphosphates,

trifosfatos de desoxinucleotídeos), caracteriazdos como pequenas unidades das bases

purínicas adenina e guanina e das bases pirimidínicas tiamina e citosina3,4,5. Terminada a

PCR, segue-se para a eletroforese em gel de agarose para fins de análise de produto5.

A eletroforese em gel de agarose consiste na separação de moléculas por carga elétrica

e tamanho através da exposição a campo elétrico em cuba de eletroforese contenedora de

placa de gel de agarose corada com solução de brometo de etídio - substância intercalante

que revela os ácidos nucleicos ao fluorescer sob luz ultravioleta ao transiluminador - e

submersa em solução-tampão TBE - base Tris ou tris(hidroxometil)aminometano, ácido

bórico e EDTA dissódico ou ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico dissolvidos em água

ultrapura3,4,5,6,7.

A carga elétrica total negativa do DNA conferida pelos grupamentos fosfatos permitem

a migração de amostras de DNA do ânodo ao cátodo em fenômeno visível ao olho nu após a

aplicação de gel loading buffer, composto de azul de bromofenol e glicerol, às amostras de

DNA antes de seus depósito em poços da placa de gel de agarose5. As mobilidades

eletroforéticas, determinadas por velocidades eletroforéticas, das diversas amostras de DNA

podem ser comparadas através de ladders, marcadores de peso molecular equidistantes e

paralelos aos traçados de pentes na placa de gel de agarose contenedores de amostras de

DNA5.

Em contrapartida, o bandeamento G (bandeamento Giemsa) é o teste de citogenética

clínica mais recorrente para o diagnóstico de anomalias cromossômicas estuturais e

numéricas1,11. Para tanto, (I) a divisão celular é bloqueada em estágio prometafásico ou

metafásico pela aplicação de colchicina através da não formação de fusos mitóticos; (II)

seguida da adição de solução hipotônica para dispersão cromossômica; (III) fixação por

metanol e ácido acético; (IV) tratamento com tripsina, assim provocando desnaturação de

suas proteínas cromossômicas; (V) aquecimento de lâminas; e (VI) coloração desses

cromossomos com coloração Giemsa, obtida a partir de azure B, eosina e azul de metileno, de

forma que cada par de cromossomos cora-se com padrão característico de bandas claras e

escuras alternadas12, conjuntamente denominadas bandas G, resultantes de correlações

imperfeitas com sequências de DNA adjacentes1,11,13. Por fim, realiza-se o (VII) rearranjo dos

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cromossomos em cariótipo por observação ao microscópio óptico ou por fotografia para

interpretação posterior11,13.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais para a PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase)

1. Amostra de DNA humano;

2. Água ultrapura;

3. Primer forward e primer reverse para CRH1 (Corticotropin-Releasing Hormone, receptor 1

ou hormônio liberador da corticotropina, receptor 1) e CRH2 (Corticotropin-Releasing

Hormone, receptor 2 ou hormônio liberador da corticotropina, receptor 2)14;

4. Taq DNA-polimerase;

5. Cloreto de magnésio (MgCl2);

6. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates, trifosfatos de desoxinucleotídeos);

7. Solução-tampão;

8. Pipeta de precisão;

9. Microtubos do tipo eppendorf;

10.Termociclador.

Métodos para a PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase)

1. Preparou-se em um microtubo do tipo eppendorf Mix-PCR com água ultrapura, primer

forward e primer reverse específicos, Taq DNA-polimerase, cloreto de magnésio (MgCl2),

dNTPS (deoxynucleotide triphosphates, trifosfatos de desoxinucleotídeos) e a solução-

tampão através de pipeta de alta precisão;

2. Distribuiu-se a Mix-PCR em microtubos do tipo eppendorf;

3. Colocou-se as amostras de DNA humano a seren testadas nos microtbuso do tipo eppendrof

de Mix-PCR distribuída.

4. Levou-se os microtubos do tipo eppendorf caracterizados para PCR (Polymerase Chain

Reaction, reação em cadeia da polimerase) para termociclador.

5. Interrempeu-se o termociclador antes do período usual por escassez de tempo útil para

realização de aula prática.

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Materiais para a eletroforese em gel de agarose

1. Placa de agarose;

2. Água ultrapura;

3. Solução-tampão TBE6,7;

4. Brometo de etídio;

5. Cuba de eletroforese horizontal;

6. Pente;

7. Ladder;

8. Amostras de DNA humano;

9. Gel loading buffer de azul de bromofenol e glicerol;

10.Cabos;

11.Fonte.

Métodos para a eletroforese em gel de agarose

1. Obteve-se placa de gel de agarose previamente penteada e detentora de ladder já submersa

em água ultrapura com solução-tampão TBE e brometo de etídio em cuba de eletroforese

horizontal.

2. Adicionou-se gel loading buffer de azul de bromofenol e glicerol a amostras de DNA

humano.

3. Conectou-se os cabos e acinou-se as fontes de voltagem da eletroforese.

4. Interrompeu-se a eletroforese em mobilidade eletroforética mediana e antes do período

usual por escassez de tempo útil para realização de aula prática.

5. Simulou-se uso de transiluminador.

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Materiais para o bandeamento G (bandeamento Giemsa)

1. Lâmina com cromossomos humanos em bandeamento G (bandeamento Giemsa);

2. Microscópio óptico.

Métodos para o bandeamento G (bandeamento Giemsa)

1. Obteve-se lâmina com cromossomos humanos em bandeamento G (bandeamento Giemsa);

2. Observou-se ao microscópio óptico a dispersão cromossômica;

3. Localizou-se um cromossomo de cada grupo cromossômico A, B, C, D, E, F e G a partir de

quadrantes imaginários.

4. Simulou-se montagem de cariótipo por escassez de tempo útil para realização de aula

prática.

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REFERÊNCIAS

1. NUSSBAUM, Robert, MCINNES, Roderick, WILLARD, Huntington. Thompson &

Thompson, Genética Médica. 7 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.

2. PROBE DATABASE. PCR. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/

genome/probe/doc/TechPCR.shtml>. Acesso em: 15 jun 2013.

3. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Eletroforese em Gel de Agarose e Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR). Disponível em: <http://biologia.ifsc.usp.br/biomolcel1/

roteiros/Aula%2002.pdf>. Acesso em: 15 jun 2013.

4. CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINÁRIA DO PIAUÍ. Extração de

DNA, Reação de Polimerase em Cadeia e Eletroforese em Gel de Agarose. Disponível em:

<http://www.crmv-pi.org.br/index.php/publicacoes/artigos/121-extracao-de-dna-reacao-de-

polimerase-em-cadeia-e-eletroforese-em-gel-de-agarose>. Acesso em: 15 jun 2013.

5. MENDONÇA, Flávia C. Relatório de Práticas em Biologia Molecular. Disponível em:

<http://www.ebah.com.br/content/ABAAABJxUAA/relatorio-biomol-pcr-eletroforese>.

Acesso em: 15 jun 2013.

6. HELMENSTINE, Anne M. Tris Buffer. Disponível em: <http://chemistry.about.com/od/

acidsbases/a/trisbuffer.htm>. Acesso em: 16 jun 2013.

7. PHILLIPS, Theresa. Make TBE Buffer. Disponível em: <http://biotech.about.com/od/

buffersandmedia/ht/MakeTBE.htm>. Acesso em: 15 jun 2013.

8. VIEIRA, Daniel P. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível

em: <http://www.fea.br/Arquivos/Biotecnologia/Material%20Profª%20Cristina%20-

%20Biologia%20Celular/Principios_da_PCR.pdf>. Acesso em: 16 jun 2013.

9. NOBEL PRIZE. All Nobel Prizes in Chemistry. Disponível em: <http://

www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/>. Acesso em: 16 jun 2013.

10. CALTECH. Assignement 3: PCR and Restriction Enzymes. Disponível em: <http://

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11. COLORADO STATE UNIVERSITY. Preparing a Karyotype. Disponível em: http://

www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/medgen/chromo/cytotech.html>. Acesso em: 16 jun

2013.

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12. MERCK MILLIPORE. Azur-eosina-azul de metileno Segundo Giemsa. Disponível em:

<http://www.merckmillipore.com/brazil/chemicals/azur-eosina-azul-de-metileno-segundo-

giemsa/MDA_CHEM-109203/p_uuid>. Acesso em: 16 jun 2013.

13. MOREIRA, José et al. Processo In Vitro Para Diagnóstico Cariotípico e Kit Para

Diagnóstico Cariotípico In Vitro. BR. Pat. 0602793-8, 26 fev 2008, 16 p.

14. GENE CARDS. Corticotropin Releasing Hormone. Disponível em: <http://

www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CRH&search=CRH>. Acesso em: 16 jun 2013.

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