susceptibilidade de plantas de milho-pipoca ao enfezamento ... · enfezamento pálido e vermelho...

Artigo Revista Científica da UFPA, V. 7, Nº 01, 2009

MÓDOLO, D. G.; SAWAZAKI, H. E.; SAWAZAKI, E. 1

Susceptibilidade de Plantas de Milho-Pipoca ao

Enfezamento Pálido e Vermelho por PCR

Diego Grando Módolo, Bolsista CNPQ/PIBIC/IAC; Haiko E.

Sawazaki; Eduardo Sawazaki; APTA - Instituto Agronômico de

Campinas. C P 28, 13001-970, Campinas, SP. E-mail: [email protected]

Resumo

Estudou-se a susceptibilidade ao enfezamento pálido (espiroplasma) e vermelho

(fitoplasma), em plantas de milho-pipoca coletadas na região de São Paulo em 2003/2004, através

de PCR e sequenciamento. Amostrou-se vinte e seis materiais, sendo dez variedades Co IAC de

Mococa, três híbridos Aiwa 4198 de Capão Bonito (observados como susceptíveis a

enfezamento), três linhagens da variedade Iapoki de Campinas (susceptíveis), oito linhagens

IA14-2-3-1 de Campinas (menos susceptíveis) e duas linhagens com sintomas de vírus. Os

fragmentos amplificados foram clonados em PMOSBlue e seqüenciados com o método Big Dye-

ABI 377 (PE Applied Biosystems). Análises usando os primers universais para fitoplasma

(mF2/R1 e F2n/R2) deram 75% de resultado positivo, enquanto com os primers específicos para

enfezamento vermelho (MBSF1/R1) e pálido (CSSF2/R6), 81% positivo e, apenas para o pálido,

92% positivo. O fragmento amplificado de 460 pares de base (pb), observado para o

espiroplasma (AY998086), mostrou identidade de 100%, com a seqüência correspondente ao

gene da espiralina do Spiroplasma kunkelii (SKU57659), indicando uma estreita variabilidade

genética. O fragmento de 736 pb, observado para o fitoplasma MBS-IAC (AY998085), mostrou

identidade de 96,0% com os nucleotídeos correspondentes ao isolado MBS-Satla01 (EU840177)

e, 84% a dois fitoplasmas patogênicos de planta (Candidatus Phytoplasma asteris), o Aster

yellows witches broom phytoplasma (CP000061) e o Onion yellows phytoplasma (AP006628),

respectivamente subgrupos 16SrI-A e 16SrI-B, os quais apresentaram-se geneticamente mais

Susceptibilidade de Plantas de Milho-Pipoca ao Enfezamento Pálido e Vermelho por PCR MÓDOLO, D. G.; SAWAZAKI, H. E.; SAWAZAKI, E.

Revista Científica da UFPA, V. 7, Nº 01, 2009 2

próximos do que em relação ao MBS-IAC (16SrI-B), indicando que o fragmento amplificado não

diferenciou os subgrupos. A maior ou menor intensidade dos fragmentos amplificados obtidos

por PCR foi em geral correlacionada ao aumento ou diminuição da susceptibilidade a sintomas de

enfezamento.

Palavras-chaves: Zea mays, espiroplasma, fitoplasma, Candidatus Phytoplasma asteris, Spiroplasma kunkelii.

Summary

The susceptibility to pale stunt (spiroplasma) and red stunt (phytoplasma) was studied

in popcorn plants collected in the region of São Paulo in 2003 and 2004, through PCR and

sequencing. Twenty and six materials were sampled, being ten Co IAC varieties from Mococa,

three Aiwa 4198 hybrids from Capão Bonito (observed as susceptible to stunting), three lines of

the Iapoki variety from Campinas (susceptible), eighty IA14-2-3-1 lines from Campinas (less

susceptible) and two lines with symptoms of virus. The amplified DNA fragments were cloned in

PMOS and sequenced with Big Dye-ABI 377(PE Applied Biosystems). Analyses using the

phytoplasma universal primers (mF2/R1 and F2n/R2) gave 75% of positive result, while with the

specific primers for both red (MBSF1/R1) and pale (CSSF2/R6) stunt, 81% positive and, only for

the pale one, 92% positive. The amplified fragment of 460 base pairs (bp) observed for the

spiroplasma (AY998086) showed similarity of 100% with the corresponding sequence to the

spiralin gene of the Spiroplasma kunkelii (SKU57659), indicating a narrow genetic variability.

The 736 bp fragment observed for the MBS-IAC phytoplasma (AY998085) showed identity of

96% with the corresponding nucleotides to the MBS-Satla01 (EU840177), and 84% to two

pathogenic phytoplasma of plant (Candidatus Phytoplasma asteris), the Aster yellows witches

broom phytoplasma (CP000061) and the Onion yellows phytoplasma (AP006628), respectively

subgroups 16SrI-A and 16SrI-B, which presented themselves to be genetically closer than

regarding to the MBS-IAC (16SrI-B), indicating no subgroups differentiation by the amplified

fragment. The bigger or smaller intensity of the amplified fragments obtained by PCR was in

general correlated to the increase or decrease of the susceptibility to symptoms of stunt.



Introdução

Fitoplasmas (inicialmente denominados mycoplasmalike organisms-MLOs) e

espiroplasmas são grupos importantes de molicutes patogênicos de plantas, descobertos em 1967

e 1970, respectivamente (GARNIER, 1997). Molicutes são bactérias de revestimento suave

devido à falta da parede celular, usualmente têm genoma pequeno, baixo conteúdo G+C, poucos

operons rRNA, poucos genes tRNA, e atividade metabólica limitada (BAI et al., 2006).

Fitoplasmas são geralmente responsáveis pela doença de amarelecimento da planta (LEE et al.,

2000). A doença, denominada Maize bushy stunt (MBS), ou enfezamento vermelho (BEBENDO

et al., 2000), é causada por fitoplasma enquanto corn stunt (CS) ou enfezamento pálido

(OLIVEIRA et al., 1998) por espiroplasma (Spiroplasma kunkelii). A incidência destas duas

doenças de milho (Zea mays L.) tem aumentado recentemente, nos países da América Central e

do Sul, incluindo o Brasil (OLIVEIRA et al., 1998; BEDENDO et al., 2000; BARROS, 2001).

Espiroplasmas podem ser cultivados em meio artificial e são bem caracterizados (GARNIER,

1997), enquanto fitoplasmas são classificados na categoria Candidatus, de bactérias não

cultivadas em cultura (RAZIN et al., 1998), sendo nomeados como espécies de Candidatus

phytoplasmas (LEE et al., 2000). Baseando-se na sequência 16S rDNA, foi proposto que uma

simples espécie, a Candidatus phytoplasma asteris, representa todo o grupo aster yellows (AY)

que abrange todos os subgrupos do 16SrI (Lee et al, 2004), sendo o MBS e o CS classificados

nos subgrupos B e C, respectivamente (LEE & DAVIS, 1980). No entanto, análises filogenéticas

baseadas em sequências menos conservadas, como as dos genes da proteína ribosomal (rp) (LEE

et al., 2000) e do secY (LEE et al., 2006), revelaram variações genéticas entre os membros do

grupo de fitoplasma AY, indicando que o mesmo pode compreender mais de uma espécie.

Fitoplasma e espiroplasma habitam o floema em plantas infectadas e são espalhadas por

insetos vetores sugadores de seiva (DAVIS et al., 1972). São transmitidos de modo específico por

insetos vetores, muitos dos quais são cigarrinhas (família Cicadellidae): o molicute ingerido se

liga às células epiteliais do intestino do vetor, multiplica-se, atravessa as paredes intestinais



entrando na hemolinfa onde se multiplica e circula a outros tecidos; para transmissão a uma nova

planta hospedeira, deve penetrar e multiplicar-se na glândula da saliva (BLONQUIST et al.,

2001). A doença MBS é restrita a América Central, do Sul e parte da América do Norte que

correspondem à faixa geográfica dos insetos vetores Dalbulus maydis e D. elimatus (LEE et al.,

2000).

Os sintomas induzidos em plantas infectadas, como enfezamento generalizado (folhas

pequenas e encurtamento dos internódios), descoloração das folhas ou rebentos, listras cloróticas,

amarelecimento ou avermelhamento das folhas, variam com os tipos de enfezamento, meio

ambiente e estágio de infecção (LEE et al., 2000), tornando o diagnóstico baseado apenas na

sintomatologia não confiável. A caracterização por PCR dos agentes causais associados a

sintomas desenvolvidos em campo pelo hospedeiro é imprescindível para permitir medidas

efetivas de controle, e evitar interpretações errôneas que podem levar ao desenvolvimento de

variedades resistentes falsas. O objetivo deste trabalho foi estudar através de PCR e

sequenciamento a susceptibilidade de plantas de milho-pipoca ao enfezamento pálido e vermelho.

Material e Métodos Material de Planta e Extração de DNA

Folhas com sintomas de enfezamento coletadas em campo de produção de milho-pipoca

na região do estado de São Paulo, em 2003 e 2004, forneceram o tecido de floema que foi

estocado a -80°C. Vinte e seis materiais de milho-pipoca foram amostrados, sendo dez variedades

Co IAC de Mococa, três híbridos Aiwa 4198 de Capão Bonito (observados como susceptíveis a

sintomas de enfezamento), três linhagens da variedade Iapoki de Campinas (observadas

susceptíveis), oito linhagens IA14-2-3-1 de Campinas (observadas como menos susceptíveis) e

duas linhagens com sintomas de vírus. Fotografias e sintomas foram anotados na época da coleta.

O DNA total das plantas foi extraído das nervuras centrais das folhas pela metodologia de LEE et

al. (1993) modificada por BIANCHINI (2002).

Amplificação por PCR



Foram usados para amplificação seletiva os pares de primer MBSF1/R1 (HARRISSON et

al., 1996) para fitoplasma e CSSF2/R6 (BARROS, 2001) para uma região específica do gene da

espiralina (a membrana protéica principal do espiroplasma) do S. kunkelii. As reações de

amplificação foram também realizadas para detectar enfezamento vermelho por duplex de PCR,

com os pares de primers universais R16mF2/R1 e R16F2n1R2 (GUNDERSEN et al., 1996). Foi

feita reação de 15 µl utilizando-se 0,7 µM de cada primer; 20 mM Tris-HCl; 50 mM KCl; 2,5

mM MgCl2; 0.17 mM de cada dNTP; 1 U de Taq DNA polimerase e 50 ng de DNA (1 a 2 µl

extrato). O DNA foi amplificado no termociclador 9600 (PE Applied Biosystems), programado

para 94°C for 2minutos, seguido por 35 ciclos (desnaturação a 94°C 50 segundos; anelamento a

50oC para o enfezamento vermelho ou 60oC para o pálido por 1minuto e 30 segundos; extensão a

72°C por 1minuto e 30 segundos) e uma etapa de extensão de 5 minutos a 72°C. Controle

negativo como ausência de DNA foi incluído no PCR. Produtos da amplificação foram

analisados em eletroforese de agarose 1% em tampão TAE (40 mM Tris-acetato; 1 mM EDTA,

pH 8.0) por 2 h a 100 V. O DNA foi detectado pela fluorescência com brometo de etídeo (0.5 µg

mL-1), sob luz UV e as imagens estocadas usando o sistema ImageMaster VDS (Amersham).

Sequenciamento

Os fragmentos amplificados por PCR (Figuras 1A e 2A) com alta intensidade das

amostras 4, 14 e 16 foram purificados com o QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) de acordo

com instruções do fabricante, clonados em PMOSBlue (Amersham) e sequenciados com o

sistema Big Dye/ ABI PRISM 377 (PE Applied Biosystems). Contigs foram montados pelo

Sequencer (PE Applied Biosystems) com obtenção de leitura em ambas direções. As

comparações com o GenBank Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) foram

realizadas pelo BLAST (ALTSCHUl et al., 1997). As seqüências analisadas por BLAST foram

alinhadas com sequências correlatas do Genbank, pelo programa Bioedit v.7.05 (HALL, 1999),

para análise de identidade, e CLUSTAL X (www-igbmc.u-

strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html). A construção da árvore filogenética foi feita pelo

programa NJPLOT (http://pbil.univ-lyon1.fr/software/njplot.html) empregando-se o método

neighbour joining e o teste bootstrap com 1000 repetições.



PCR Semi-Quantitativo

A amplificação seletiva pelos primers (T7/U19) específicos para o fragmento amplificado

do fitoplasma clonado no plasmídeo PMOS (fragmento observado ser ligeiramente maior que

736 pb) foi usada como padrão interno na reação semi-quantitativa do enfezamento pálido. Para

tal, o plasmídeo foi diluído a uma concentração de cerca de 10 ng. No PCR semi-quantitativo

para enfezamento vermelho a amplificação seletiva do plasmídeo foi utilizada apenas em reação

paralela para evitar a interação observada com o DNA das amostras. O PCR semi-quantitativo foi

analisado (6µl) com 16, 22, 30 e 35 ciclos em um duplex-PCR com os pares de primers para o

plasmídeo (T7/U19) e ou o enfezamento vermelho (MBSF1/R1) ou o enfezamento pálido

(CSSF2/CSSR6). Dois tipos de reações foram realizados: 1) usando somente as amostras (para o

enfezamento vermelho); 2) usando as amostras e o padrão interno (para o enfezamento pálido). A

reação foi feita para 30 µl contendo 1-2 µl de DNA (1 µl de 10ng para o plasmídeo); 0,7µM de

primers do fitoplasma ou espiroplasma e 0,35µM de primers do PMOS (T7 e U19); 20 mM Tris-

HCl; 50 mM KCl; 2,5 mM MgCl2; 0,17 mM de cada dNTP; 2 U de Taq DNA polimerase. O

controle negativo, sem DNA, foi incluído em cada PCR. As condições de amplificação e análise

foram as mesmas descritas anteriormente para cada tipo de enfezamento.

Resultados e Discussão

Os fragmentos amplificados de 460 pb (CSSF2/R6) para o enfezamento pálido (Figura

1A) e 736 pb (MBSF1/R1) para o fitoplasma vermelho (Figura 2A), ou 1200 pb (primers

universais para o fitoplasma), confirmaram os sintomas de infecção.



Figura 1. Fragmentos amplificados por PCR com os primers CSSF1 e CSSR6 (enfezamento pálido) de DNA de plantas de milho. A: 1 a 10 (composto IAC); 13 a 15 (A 4198); 16 a 19 (Iapoki); 20 a 26 (IA 14-2-3-1); CN= controle negativo; P= Padrão (123 pb Sigma). B: PCR semiquantitativo com os sets de primers CSSF1/CSSR6 e T7/U19 das amostras 5, 13, 15, 18, 21, 24 e plasmídeo (P); Pd= Padrão (123pb Sigma).

Os primers universais para o enfezamento vermelho mostraram resultado positivo em

75% das amostras enquanto os primers específicos foram mais consistentes com 81% para a

mistura de ambos enfezamento e 92% para o pálido apenas. Estes resultados mostraram uma alta

confirmação dos sintomas de infecção do material coletado ou uma alta incidência da doença

nessas regiões. Mesmo para o híbrido Aiwa 4198 coletado em Capão Bonito em janeiro de 2004

foi observada a doença, embora GOMES et al. (2004) não tenham encontrado o espiroplasma

nesta região. Este fato pode ser decorrente da alta susceptibilidade do Aiwa 4198, enquanto a boa

resistência a enfezamento de cultivares comerciais não teria possibilitado o aparecimento dos

sintomas do enfezamento pálido no material coletado por GOMES et al (2004).

A intensidade das bandas foi no geral confirmada pelas reações de PCR semi-quantitativo

para os fitoplasmas pálido (Figura 1B) e vermelho (Figura 2B). Os materiais susceptíveis como

os híbridos Aiwa. 4198 e linhagens Iapoki amplificaram fragmentos com maior intensidade,



sugerindo uma maior quantidade do patógeno, enquanto os menos susceptíveis como as linhagens

IA14-2-3-1 apresentaram fragmentos de menor intensidade.

Figura 2. Fragmentos amplificados por PCR com os primers MBSF1 e MBSR1 (enfezamento vermelho) de plantas de milho. A: 1 a 10 (composto IAC); 13 a 15 (A4198); 16 a 19 (Iapoki); 20 a 26 (IA 14-2-3-1); CN= controle negativo; P= Padrão (123 pb Sigma). B: PCR semiquantitativo com os sets de primers MBSF1/MBSR1 e T7/U19 das amostras 5, 13, 15, 18, 21, 24 e plasmídeo (P); Pd= Padrão (123pb Sigma).

Para correlacionar os sintomas observados no material coletado com o tipo de infecção,

utilizou-se a sintomatologia relatada pela literatura. O sintoma do enfezamento pálido começa

com pequena descoloração na base das folhas novas que evolui para estrias de cor amarelo-limão

ao longo das nervuras, e planta com porte normal quando a infecção é tardia. Em infecção

precoce a planta apresenta-se raquítica, com numerosas espigas pequenas, maior encurtamento de

internódios e coloração arroxeada nas bordas das folhas mais velhas. Em relação ao enfezamento

vermelho, o sintoma inicial é a descoloração das margens das folhas do cartucho, seguida por

avermelhamento das bordas e pontas das folhas mais velhas que podem necrosar. Em infecção

precoce, ocorre um enfezamento ou nanismo acentuado da planta e a formação de numerosas

espigas pequenas, sem grãos ou com poucos grãos frouxos e pequenos. Porte normal indicando



infecção tardia e amplificação fraca para os enfezamentos vermelho e pálido foram observados

para planta da variedade CoIAC com os sintomas de descoloração amarela nas bordas das folhas

mais novas, avermelhamento das bordas das folhas mais velhas e super espigamento em algumas

plantas, e para linhagem da Campinas IA14-3-2-1, com folhas apresentando estrias amarelas e

pontas e bordas amareladas, com início de necrose das pontas, e super espigamento. Porte normal

indicando infecção tardia e amplificação forte para os enfezamentos vermelho e pálido foram

observados em planta CoIAC com folhas verde-escuras e amarelecimento das bordas, espigas em

todos os nós com folhas nas pontas das espigas e brotação nos interiores, em planta A4198, com

estrias verde-claras longitudinais nas folhas mais novas e pontas e bordas arroxeadas das folhas

mais velhas e, em linhagem Iapoki, com folhas apresentando estrias amarelas no início e depois

avermelhadas, começando pela borda, e folha mais nova com ponta amarelada. Por sua vez,

enfezamento sugerindo infecção precoce e amplificação forte, para os enfezamentos vermelho e

pálido, foram observados em planta CoIAC com folhas de bordas e pontas arroxeadas, com

posterior necrose das pontas, estrias amareladas, espigas em todos os nós com folhas nas pontas,

e em A4198, com estrias verde-claras longitudinais nas folhas mais novas e pontas e bordas

arroxeadas das folhas mais velhas. Todas as linhagens da variedade Iapoki (observada como

susceptível a enfezamento) amplificaram fragmentos com maior intensidade, porém, plantas com

porte normal, sugerindo infecção tardia (Figura 3) com alta quantidade de patógeno. Os híbridos

Aiwa 4898 (também observados como susceptíveis) amplificaram fragmentos de forte

intensidade, com plantas mostrando ou sintomas de enfezamento ou porte normal, sugerindo

também que mesmo em infecção tardia a quantidade do patógeno é alta (Figura 3). A linhagem

IA14-2-4-1 (observada como menos susceptível) amplificou fragmentos de menor intensidade e

plantas com porte normal, mesmo tendo desenvolvido superbrotamento. Portanto, espiga em

todos os nós, com folhas nas pontas, sintoma usual de forte infecção, não foi associada à

amplificação de maior intensidade para a linhagem IA14-2-3 que aparentou baixa quantidade de

patógeno (Figura 3). A variedade CoIAC amplificou fragmentos com maior ou menor

intensidade, respectivamente de plantas com sintomas de enfezamento ou com porte normal,

porém também fragmentos de forte intensidade com plantas de porte normal, sugerindo maior

variabilidade, provavelmente devido a ainda estar sendo observado segregação (Figura 3). Todas

as variedades CoIAC que amplificaram banda forte sugerindo a maior quantidade de patógeno

apresentaram espigas em todos os nós com folhas nas pontas da palha.



Figura 3. Sintoma de enfezamento vermelho e pálido em amostras de

milho-pipoca: da variedade Co IAC; do híbrido Aiwa 4198; da linhagem

da variedade Iapoki e da linhagem IA14-3-2.

A análise de BLAST das seqüências dos isolados estudados mostrou que o enfezamento

pálido (AY998086) apresentou 100% de identidade com o Spiroplasma kunkelii (SKU57659).

Gomes et al. (2004) encontraram 98% de identidade com a mesma sequência de espiroplasma

para amostras coletadas em Assis, SP, Sete Lagoas, MG, Dourados, MS, e Santa Helena, Goiás,

GO, confirmando a estreita variabilidade dentro de populações de espiroplasma. As seqüências

de nucleotídeos dos isolados do enfezamento vermelho MBS-IAC (AY998085) apresentaram

identidade de 96,0% (score 844) com as correspondentes ao isolado de enfezamento vermelho do

México MBS-Satla01 (EU840177) de 2008 (não publicado) e, com relação aos Candidatus

Phytoplasma asteris, 67,0% (score 512) ao australiense (AM422018) de Tran-Nguyen et al



(2008), 84,0% (score 854) ao da linhagem witches broom da aster yellows (AY-WB), Aster

yellows witches broom phytoplasma (CP000061) de BAI et al (2006) dos Estados Unidos

(classificado no subgrupo 16SrI-A) e, 84,7% (score 874) ao da linhagem M da onion yellows

(OY-M) Onion yellows phytoplasma (AP006628) de Oshima et al (2004) do Japão

(subgrupo16SrI-B). As proteínas da sequência do isolado MBS-IAC apresentaram similaridade

mais significativa de 98% às do isolado MBS-Satla01 (proteína hipotética semelhante a Pam562),

enquanto em relação às do AY-WB, de 71% e 74%, respectivamente com as proteínas

conservadas AYWB212 (YP456408) e AYWB376 (YP456571). Em relação às do OY-M, de

76,0% e 69%, respectivamente com as proteínas hipotética PAM562 (BAD04647) e ATP-

dependente Zn protease e, em relação às do australiense, de 49% com a proteína conservada

PA0410 (AM422018).

O dendrograma construído com os nucleotídeos das seqüências dos fragmentos

amplificados do MBS-IAC e de outros isolados correlatos do GenBank (Figura 4) confirmou a

maior identidade do MBS-IAC com o isolado MBS-Satla01. Os isolados AY-WB e OY-M,

respectivamente pertencentes aos subgrupos 16SrI-A e 16SrI-B do Candidatus Phytoplasma

asteris, mostraram maior identidade entre si (com altos valores de boostrap), indicando que o

fragmento estudado não diferenciou os subgrupos, visto o enfezamento vermelho, segundo LEE

& DAVIS (1980) pertencer ao subgrupo 16SrI-B do grupo aster yellows (AY). Esta não

diferenciação sugestiva de que o MBS pode ser uma outra espécie, corrobora LEE et al. (2006),

que encontrando variações genéticas entre os membros do grupo de fitoplasma AY, relataram que

o mesmo pode compreender mais de uma espécie.

Neste trabalho, mesmo as duas linhagens com viroses mostrando sintomas de

amarelecimento foram positivas para o enfezamento pálido. A correta diagnose da doença no

campo é, portanto, difícil de ser avaliada, confirmando a necessidade do teste de PCR para

identificar o agente causal da doença de enfezamento do milho.



Figura 4. Árvore NJ (neighbor-joining) com valores (%) de 1000 réplicas de boostrap e escala de 0,02 representando a distância genética obtida com nucleotídeos de fragmento amplificado usando os primers de Harrison et al. (1996) do isolado de fitoplasma: MBS-IAC (AY998085) e quatro acessos do GenBank.

Conclusões

a - Os fragmentos amplificados pelo enfezamento pálido não mostraram diferença em relação ao

genoma correspondente de Spiroplasma kunkelii indicando uma estreita variabilidade genética

dentro de populações de espiroplasmas. Os de enfezamento vermelho apresentaram similaridade

de 84% com dois fitoplasmas patogênicos de planta dos subgrupos 16SrI-A e 16SrI-B do

Candidatus Phytoplasma asteris, ambos geneticamente mais próximos em relação ao estudado,

indicando que o fragmento amplificado não diferenciou os subgrupos.

b - A correta diagnose da doença no campo foi difícil de ser avaliada, confirmando a necessidade

do teste de PCR para identificar o agente causal da doença de enfezamento do milho-pipoca.

c - A intensidade das bandas foi no geral confirmada pelas reações de PCR semi-quantitativo para

os fitoplasmas pálido e vermelho, confirmando a importância do PCR na identificação dos

fitoplasmas.



Agradecimentos

Agradecemos ao PIBIC/CNPq pelo auxílio-bolsa.

Referências Bibliográficas

ALTSCHUL, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, Oxford University. V. 25, no.17, p.3389-3402, Sep. 1997. BAI, X. et al. Living with genome instability: the adaptation of phytoplasmas to diverse environments of their insect and plant hosts. Journal of Bacteriology, American Society for Microbiology (ASM). V. 188, no.10, p.3682-3696, May 2006. [doi:10.1128/JB.188.10.3682-3696.2006]. BARROS, T.S.L. et al. Design of a polymerase chain reaction for specific detection of corn stunt spiroplasma, Spiroplasma kunkelii. Plant Disease, APS, Saint Paul. V. 85, p.475-480, May 2001. [DOI:10.1094/PDIS.2001.85.5.475]. BEDENDO, I.P. et al. Detection and identification of the maize bushy stunt phytoplasma in corn plants in Brazil using PCR and RFLP. International Journal of Pest Management, Taylor & Francis, London. V. 46, no.1, p.73-76, Jan-March 2000. [DOI:10.1080/096708700227606]. BIANCHINI, L. Identificação molecular de isolados do fitoplasma do enfezamento vermelho do milho coletados no estado de São Paulo. 2002. 44f. Dissertação (Mestrado em Agronomia-Fitopatologia). USP/ESALQ, Piracicaba., SP. BLOMQUIST, C.L. et al. An immunodominant membrane protein gene from the Western X-disease phytoplasma is distinct from those of other phytoplasmas. Microbiology, SGM, UK. V. 147, p.571-580, March 2001. DAVIS, R.E. et al. Helical filaments produced by a mycoplasma-like organism associated with corn stun disease. Science, AAAS, Washington. V. 176, no.4032, p. 521-523, May 1972. [DOI: 10.1126/science.176.4034.521].



GARNIER, M. Non-cultivable phytopathogenic mycoplasmas: characterization, detection and perspectives for control. Wiener Klinische Wochenschrift, SpringerLink. V. 109, no.14-15, p.613-617, Aug. 1997. GOMES, E.A. et al. Genetic variability of Brazilian phytoplasma and spiroplasma isolated from maize plants. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Embrapa, Brasília. V.39, no.1, p.61-65.jan 2004. GUNDERSEN, D.E. et al. Genomic diversity and differentiation among phytoplasma strains in 16S rRNA groups I (aster yellows and related phytoplasmas) and III (X-disease and related phytoplasmas). International Journal of Systematic Bacteriology, SGM, UK. V. 46, no.1, p.64-75, Jan1996. HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, Oxford University. V. 41, p.95-98, 1999. HARRISON, N.A. et al. PCR assay for detection of the phytoplasma associated with maize bushy stunt disease. Plant Disease, APS. V. 80, p.263-269, March 1996. LEE, I.-M.; DAVIS, R.E. DNA homology among diverse spiroplasma strains representing several serological groups. Canadian Journal of Microbiology, NRC, Canada. V. 26, no.11, p.1356-1363, 1980. [doi:10.1139/m80-224]. LEE, I.-M. et al. Universal amplification and analysis of pathogen 16SrRNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. Molecular Plant Pathology, Blackwell.V. 83, no.8, p.834-842, Aug. 1993. LEE, I.-M. et al. PHYTOPLASMA: Phytopathogenic Mollicutes. Annual Review of Microbiology, Palo Alto, USA. V. 54. p.221-255, Oct. 2000 [doi:10.1146/annurev.micro.54.1.221]. LEE I.-M., et al.Candidatus Phytoplasma asteris, a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows and related disease. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, SGM, UK. V. 54. p. 1037–1048, July 2004 [DOI 10.1099/ijs.0.02843-0].



LEE, I.-M. et al. SecY gene sequence analysis for finer differentiation of diverse strains in the aster yellows phytoplasma group. Molecular and Cellular Probes, Elsevier BV. V. 20. no. 2. p.87-91, April 2006. [doi:10.1016/j.mcp.2005.10.001]. OLIVEIRA, E. et al. Enfezamento pálido e enfezamento vermelho na cultura do milho no Brasil Central. Brasília, Fitopatologia Brasileira, SBF, Brasília. V. 23 no1. p.45-47, 1998. OSHIMA,K. et al. Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant pathogenic phytoplasma. Nature Genetics, NPG, London, UK. V.36 no.1 p.27-29, 2004.�[doi:10.1038/ng1277]. RAZIN, S. et al. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews, ASM. Washington. V. 62 no 4. p.1094-1156, Dec. 1998. TRAN-NGUYEN, L.T. et al. Comparative genome analysis of 'Candidatus Phytoplasma australiense' (subgroup tuf-Australia I; rp-A) and 'Ca. Phytoplasma asteris' Strains OY-M and AY-WB. Journal of Bacteriology, ASM, Washington. V.190 no.11 p. 3979-3991, 2008. [DOI:10.1128/JB.01301-07].

susceptibilidade de plantas de milho-pipoca ao enfezamento ... · enfezamento pálido e vermelho...

Documents