relatório 2

2010-2011

15 de Março de 2011

1º ano-2º semestre

2010-2011

Caracterização de Aminoácidos e Proteínas

Bioquímica I

Alunas:

Andreia Sousa

n.º 40261

Alexandra Salvado

n.º 40267

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1. Apresentação, Tratamento e Discussão de Resultados

1.1.Reacções coradas de aminoácidos e proteínas

Teste Solução

Observações

Resultado Início Após aquecimento

Ninidrina

Água destilada Amarelo muito claro Amarelo muito claro Positivo

Glicina Incolor Púrpura intenso Positivo

Albumina Amarelo muito claro Púrpura intenso Positivo

Clara do ovo Amarelo muito claro Púrpura menos intenso Positivo

Biureto

Água destilada Azul muito claro Negativo

Glicina Azul muito claro Negativo

Albumina Violeta Positivo

Clara do ovo Violeta Positivo

Quadro 1. Observações e resultados dos testes da ninidrina e do biureto.

Figura 2 – Observações das cores do teste do

biureto.

Figura 1 – Observações iniciais das cores

antes dos testes.

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1.1.1. Teste de ninidrina

A ninidrina é um produto químico usado para a

detecção de aminoácidos pois é um poderoso agente

oxidante que reage com α-aminoácidos, entre pH 4 e 8.

Os α-aminoácidos possuem um átomo de carbono

central (α) onde estão ligados covalentemente um grupo

amina primário (−NH2), um grupo carboxílico (−COOH),

um átomo de hidrogénio e uma cadeia lateral (R)

diferente para cada aminoácido.

A reacção dos aminoácidos com a ninidrina origina um composto de

cor púrpura, no geral, e amarelo para a prolina, não apresentando sempre a

mesma intensidade de coloração. Para além da formação de um composto

corado, devido à descarboxilação dos α-aminoácidos, o teste com a ninidrina

produz também CO2, água e aldeídos, como se pode ver na reacção que a

seguir se segue.

Figura 3 – Observações das cores do teste da ninidrina após aquecimento

Figura 4 – Estrutura geral

de um α-aminoácido.

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A reacção da ninidrina foi positiva com todas as soluções testadas.

A glicina é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, como

tal era de esperar que reagisse com a ninidrina. Inicialmente não se observou

claramente uma reacção deste aminoácido com a ninidrina, mas assim que o

tubo de ensaio foi colocado em água a ferver a reacção foi instantânea pelo

que se comprovou que, de facto, a ninidrina estava na presença de um

aminoácido – a glicina, que em contacto com a ninidrina, sofre uma grande

oxidação e origina um composto de cor púrpura, no entanto isso não se

observou no momento instantâneo da sua junção, apenas no momento em que

esteve exposta a altas temperaturas, o que provocou um aumento da

velocidade da vibração molecular que “ajudou” a ninidrina a reagir com a

glicina.

Figura 5 – Reacção dos α-aminoácidos com a ninidrina e formação do composto corado.

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No caso da albumina, que é uma proteína hidrossolúvel do tipo globular

cuja função é armazenar nutrientes, não reagiu instantaneamente com a

ninidrina e por conseguinte não se formou o composto corado. Isto aconteceu

porque, sendo a albumina uma proteína, os aminoácidos que a constituem

estão ligados por ligações peptídicas e não no estado livre – motivo pelo qual

não reagem com a ninidrina visto que esta apenas detecta os aminoácidos

livres. No entanto, depois de expor a albumina a uma temperatura elevada (≈

100 °C), esta reagiu com a ninidrina uma vez que as ligações peptídicas foram

quebradas, pois houve um aumento da vibração das partículas (consequência

do aumento da temperatura) alterando a conformação desta proteína e

expondo os aminoácidos livres á ninidrina – daí a observação da cor púrpura

da solução após o aquecimento durante 10 minutos a 100 °C,

aproximadamente.

Em relação à clara do ovo, esta é composta por proteínas,

nomeadamente a albumina e por outras substâncias que dificultam a reacção

com a ninidrina, pelo que inicialmente também não se observou a formação do

composto corado. Novamente, depois do aquecimento a uma temperatura

elevada (≈ 100 °C), a ninidrina reagiu com os aminoácidos da clara do ovo,

pela mesma razão explicitada no parágrafo anterior. No entanto, a cor do

composto foi a menos intensa uma vez que, sendo a clara do ovo um material

biológico possui mais substâncias na sua composição para além de proteínas.

Assim, a quebra dessas ligações peptídicas foram dificultadas pela presença

de outras substâncias, o que contribuiu também para um menor número de

aminoácidos livres a reagir com a ninidrina, resultando num número inferior de

compostos corados, daí a cor menos intensa desta solução comparada com as

da glicina e da albumina.

Em conclusão, a solução da glicina, depois de aquecida, foi a mais

corada uma vez que este aminoácido é livre e reagiu em maior quantidade com

a ninidrina. A solução da albumina apresentou uma cor intensa, mas menos

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que a da glicina, porque como a albumina é uma proteína, só os aminoácidos

libertos pela quebra das ligações peptídicas que os uniam é que vão reagir com

a ninidrina.

1.1.2. Teste do biureto

No que se refere à reacção do biureto este detecta a presença de

ligações peptídicas. Os compostos com duas ou mais ligações peptídicas

tomam uma coloração violeta quando tratadas com uma solução diluída de

sulfato de cobre em meio alcalino, devido ao complexo entre cada ião de cobre

e quatro átomos de azoto (dois de cada ligação). A intensidade da cor varia

com a concentração de proteínas. A reacção que ocorre é a seguinte:

Neste teste, o tubo de ensaio com água destilada foi utilizado como

tubo controlo pois é sabido que a água não contém proteínas. Assim, este tubo,

no qual não ocorre reacção, serve de referência para os restantes. Os tubos

cujos comportamentos forem semelhantes ao do biureto com a água, pode-se

dizer que têm um resultado final negativo – não ocorre reacção. Por outro lado,

os tubos cujos comportamentos se mostrem diferentes ao da água destilada

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Cu 2+

OH -

Biureto

Complexo de biureto

Figura 6 – Reacção do biureto.

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quando se adiciona biureto, dizem-se ter um resultado positivo – ocorre

reacção e é de esperar que apresentem uma cor violeta.

Uma vez que o teste com o biureto apenas dá positivo (apresentação

de uma cor violeta) quando existem ligações peptídicas no meio, podíamos

logo deduzir que o teste à glicina seria negativo uma vez que é um aminoácido.

E assim se verificou – ao adicionar biureto à glicina não se observou a

formação de um complexo de cor violeta.

Como já foi referido, a albumina é uma proteína cujos aminoácidos

formam uma cadeia e estão ligados por ligações peptídicas. Assim, o teste à

albumina resultou positivo – foi possível também observar a formação de um

composto de cor violeta.

Igualmente positivo, foi o teste à clara de ovo porque, para além de

outras substâncias, contém proteínas (albumina, inclusive) que apresentam

ligações peptídicas – também se observou a cor violeta, característica da

presença de ligações peptídicas.

1.2. Agentes desnaturantes de proteínas

1.2.1. Fluxograma explicativo do processo de isolamento das

ficobiliproteínas.

Procedimento

Cápsula de Células Spirulina

Registar a

massa

(sem cápsula)

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Transferir para um

almofariz

Triturar bem a mistura

durante 10 minutos

(de preferência contra os

lados) Dividir a mistura por 4

tubos de ensaio

Adicionar 7mL de tampão de

fosfatos (pH 7.0) 100mM a

cada tubo de ensaio

Suspender a mistura da

solução tampão com

uma vareta

Centrifugar a 2000 rpm

durante 4min, à

temperatura ambiente

Remover o sobrenadante

(não perturbar o

precipitado)

Recolher o filtrado (a

solução deve ser límpida e

apresentar uma cor azul

petróleo)

Figura 7 – Divisão da mistura opor 4 tubos de ensaio.

Figura 8 – Observação da cor azul petróleo da solução proteica preparada.

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1.2.2. Testes qualitativos de desnaturação das ficobiliproteínas

por diversos agentes assim como o efeito da temperatura e agitação

mecânica na estrutura das proteínas.

Quadro 2 – Reacção da solução de proteínas com vários agentes desnaturantes.

Ensaio Agente Desnaturante Observações

Resultado Cor Transparência

1 Tampão de Fosfatos (pH 7.0)

100nM Azul claro Translúcido Negativo

2 NaCl 100mM Azul claro Translúcido Negativo

3 Água destilada Azul claro Translúcido Negativo

4 Acetona Azul muito claro Opaco Positivo

5 Etanol Azul muito claro Opaco Positivo

6 Ureia 8M em tampão de fosfatos

(pH 7.0) 100 mM Incolor Translúcido Positivo

7 SDS 5% (v/v) Incolor (formação

de espuma) Translúcido Positivo

8 Ácido tricloroacético a 10% (m/v) Azul claro Opaco Positivo

9 HCl 1M Azul claro Opaco Positivo

10 NaOH 1M Verde claro Translúcido Positivo

11 T=0 °C Incolor Translúcido Positivo

12 T= 100 °C Azul claro Translúcido Negativo

13 Agitação mecânica Azul claro Translúcido Negativo

Figura 9 – Observação das cores da solução proteica por adição de diversos agentes desnaturantes.

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Nestes ensaios, são considerados resultados negativos aqueles que

não desnaturam as proteínas e resultados positivos os que, pelo contrário,

provocam modificações na sua conformação e as desnaturam.

O tubo de ensaio de controlo é o de tampão de fosfatos (pH 7,0) 1M,

uma vez que já tinha sido utilizado anteriormente quando se adicionou

quantidades do mesmo aos 4 tubos de ensaio contendo as células de Spirulina

(não faria sentido preparar uma solução proteica adicionando tampão de

fosfatos se esta pudesse desnaturar as células). Por isso, quando se adicionou

novamente tampão de fosfatos, não se verificou nenhum tipo de alteração na

solução proteica. Tal também se comprova uma vez que esta solução tem

iguais concentrações de ácido e base – pH neutro (solução estabilizada) – e

onde se encontram moléculas polares que solubilizam as proteínas, não

alterando a sua conformação. O resultado final pode-se dizer negativo uma vez

que não ocorreu desnaturação das proteínas. Comparando os outros ensaios

com este, que é o tubo de controlo, os resultados finais negativos serão

aqueles em que não ocorrerá desnaturação das proteínas e os positivos serão

aqueles em que ocorrerá.

Figura 10 – Observação das cores da solução proteica a uma temperatura de 0 °C, 100 °C e por

agitação mecânica, respectivamente.

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A água destilada, conhecida como uma substância pura, é um

composto isento de qualquer substância e por isso não provoca nenhuma

alteração nas proteínas quando entra em contacto com elas, pelo que

apresenta um resultado negativo.

A presença de um sal (NaCl) em solução resulta na estabilização dos

grupos iónicos das proteínas, o que aumenta a sua solubilidade - NaCl é um

composto polar. Assim, podemos afirmar que a presença do NaCl em solução

não provoca nenhuma alteração na conformação da proteína, não a

desnaturando. Apresenta, portanto, um resultado negativo.

A acetona e o etanol são solventes orgânicos miscíveis com a água e

como as proteínas também são solúveis em várias soluções aquosas, pois

apresentam grupos polares hidrofílicos (que têm afinidade com os grupos

polares das soluções), vão reagir com o etanol e com a acetona e estes vão

provocar a ruptura das pontes de hidrogénio e das ligações hidrofóbicas nas

proteínas, fazendo com que ocorra a sua desnaturação e com que se tornem

insolúveis, verificando-se então um precipitado. Este resultado final diz-se

positivo pois ocorreu a desnaturação das proteínas.

A ureia é uma molécula tóxica também polar e por isso entra em

contacto com os grupos hidrofílicos das proteínas, alterando a sua

conformação e inactivando-as. Neste caso ocorre a desnaturação das

proteínas, mas não ocorre precipitação das mesmas. O resultado diz-se, então,

positivo.

O SDS é um detergente aniónico que ao entrar em contacto com as

proteínas, lhes confere uma forte carga negativa. Este detergente rompe,

assim, quase todas as interacções não covalentes existentes numa proteína,

destruindo a sua estrutura nativa, ou seja, desnaturando-a. O resultado final é,

então, positivo.

Ao adicionar os ácidos tricloroacético e clorídrico ou o hidróxido de

sódio, as cargas das proteínas foram modificadas e por conseguinte também o

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seu pH. Meios mais básicos ou mais ácidos alteram o estado de ionização das

cadeias laterais dos aminoácidos e ocorre o rompimento de atracções

eléctricas que ajudavam a manter a configuração espacial da proteína (ligações

de hidrogénio e ligações iónicas). Assim sendo, como o pH da proteína foi

alterado, assim como a sua conformação ela deixou de estar no seu estado

nativo, pelo que o resultado final foi positivo.

Com o aumento da temperatura, aumentou-se a velocidade da

vibração molecular o que levou a uma quebra das ligações fracas – de

hidrogénio – que leva também a uma alteração na conformação da proteína.

Mais uma vez a proteína tornou-se inactiva (desnaturada) pelo que o resultado

se considera também positivo.

Com o arrefecimento da temperatura não se observaram modificações

na solução proteica uma vez que apenas se deu a inactivação das proteínas e

não a sua desnaturação, pelo que se se repusesse a temperatura a que elas se

encontravam inicialmente, estariam de novo activas. Assim sendo, este

resultado diz-se negativo.

A agitação mecânica também não provocou a alteração na estrutura

das proteínas, pois as ligações fortes não se quebram assim tão facilmente. O

resultado foi também negativo.

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2. Bibliografia

Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New

York, pp. 56-62 & 105-119.

L. Nelson, David e M. Cox, Miaches, Lenhinger, Princípios de Bioquímica, 3ª

ed.

Quintas, A.,Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica – Organização

Molecular da Vida”, Lidel, Lisboa, 2008

3. Questionário

3.1. Defina grupo prostético, apoproteína e holoproteína.

Concretiza para as ficobiliproteínas.

As proteínas são um dos constituintes básicos dos organismos, sendo

uma das classes de moléculas mais estudadas em Bioquímica. São polímeros

(compostos orgânicos) de alto peso molecular não ramificados de aminoácidos

ligados entre si por ligações peptídicas, podendo ser constituídas por um ou

mais de tais polímeros. Representam cerca de 50 a 80% do peso seco da

célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante da matéria viva.

Quanto à composição das suas moléculas, as proteínas podem ser

classificadas em simples e conjugadas. As proteínas simples, ou

homoproteínas, são formadas exclusivamente por aminoácidos. As proteínas

conjugadas, ou heteroproteínas, são constituídas por aminoácidos mais outro

componente não-proteico, denominado grupo prostético, essencial para a

actividade biológica dessas proteínas. Proteínas que são desprovidas deste

grupo prostético denominam-se apoproteína – partes proteicas que compõem

uma proteína conjugada.

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Assim, uma proteína diz-se completa, ou holoproteína, quando é

constituída pela sua cadeia polipeptídica (união de aminoácidos) juntamente

com o seu grupo prostético. Então, sendo a ficocianina e a aloficocianina duas

ficobiliproteínas das cianobactérias da Spirulina que contêm um grupo

cromógrafo (ficocianobilina) ligado covalentemente à proteína – grupo

prostético –, podemos classificar as ficobiliproteínas como holoproteínas.

3.2. Quais são os diferentes níveis de estrutura possíveis

apresentados por uma proteína e como são afectados durante o seu

processo de desnaturação?

Existe um nível hierárquico de organização estrutural das proteínas –

podem ser primárias, secundárias, terciárias ou quaternárias.

A sequência dos aminoácidos nos polipéptidos que constituem uma

molécula proteica é chamada estrutura primária – é a sequência linear de

aminoácidos. Essa sequência é muito importante para a função da proteína.

Em geral, a substituição de um único aminoácido basta para prejudicar a

actividade da proteína, com sérias consequências para o organismo.

No entanto, a cadeia polipeptídica é flexível podendo enrolar-se sobre si

mesma, assumindo conformações espaciais diferentes. As conformações mais

comuns são as hélice-α - nesta estrutura o esqueleto polipeptídico está

estreitamente enrolado ao longo do maior eixo da molécula e os grupos R dos

resíduos de aminoácidos projectam-se para fora do esqueleto helicoidal. A sua

estabilização dá-se pela presença de múltiplas ligações de hidrogénio no

interior da hélice – e a folha-β – é uma estrutura também mantida por pontes de

hidrogénio entre as unidades peptídicas. No entanto, neste caso, as ligações

são estabelecidas entre cadeias polipeptídicas diferentes, distendidas e

paralelas, ou entre segmentos distantes e distendidos de uma mesma cadeia.

As pontes de hidrogénio são perpendiculares ao eixo das cadeias, e os grupos

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cadeia_polipept%C3%ADdica

http://pt.wikipedia.org/wiki/Grupo_prost%C3%A9tico

http://pt.wikipedia.org/wiki/Helicoidal

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R dos aminoácidos projectam-se para cima e para baixo do plano –. Este nível

de organização diz-se secundário e, para além das ligações peptídicas,

também envolve ligações por pontes de hidrogénio.

A estrutura terciária de proteínas resulta do enrolamento da hélice-α ou

da folha-β, sendo estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes dissulfeto.

Esta estrutura confere a actividade biológica às proteínas e descreve o

dobramento final de uma cadeia, por interacções de regiões com estrutura

regular ou de regiões sem estrutura definida, podendo haver interacções de

segmentos distantes de estrutura primária, por ligações não covalentes.

Enquanto a estrutura secundária é determinada pelo relacionamento estrutural

de curta distância, a terciária é caracterizada pelas interacções de longa

distância entre aminoácidos, denominadas interacções hidrofóbicas, pelas

interacções electrostáticas, pontes de hidrogênio e de sulfeto. Todas têm

sequências de aminoácidos diferentes, reflectindo estruturas e funções

diferentes.

Para finalizar, as proteínas podem também adquirir um nível de estrutura

quaternária. Esse nível de estrutura é adquirido quando as proteínas são

constituídas por duas ou mais cadeias polipeptídicas. Esta transformação das

proteínas em estruturas tridimensionais é a designada estrutura quaternária,

que são estabilizadas pelas mesmas interacções da estrutura terciária. A

junção de várias cadeias polipeptídicas pode produzir diferentes funções para

os compostos.

Contudo, as proteínas podem perder a sua estrutura se forem expostas

a condições químicas adversas, tais como: pH’s extremos, ambientes

hidrofóbicos, altas concentrações de sais ou altas temperaturas. Este processo

é denominado desnaturação. Uma proteína desnaturada não tem uma

estrutura definida e tende a agregar-se em massas insolúveis, especialmente

se se encontrar numa concentração relativamente elevada. A desnaturação é

um processo, geralmente irreversível, que consiste na quebra das estruturas

secundária e terciária de uma proteína. Nestas estruturas, quando uma

http://pt.wikipedia.org/wiki/Tridimensional

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proteína é exposta a um ambiente diferente daquele onde ela se desenvolveu,

há a quebra das interacções fracas aí existentes, havendo uma alteração na

distribuição espacial do polipéptidos e por conseguinte, uma alteração na sua

composição.

3.3. Explique detalhadamente o mecanismo de desnaturação de

uma proteína por adição de um solvente orgânico (por ex., etanol). Qual

a dependência que este processo deverá apresentar com a temperatura

do meio?

A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que

em água. Isso acontece porque a capacidade de interacção com as partículas

do soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade

de interacção do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica.

Com a adição de solventes orgânicos, como o etanol, às soluções

aquosas de proteínas pode ocorrer a precipitação das mesmas. Isto pode ser

explicado pelo facto destes solventes apresentarem uma constante dielétrica

inferior à da água.

Numa solução contendo exclusivamente água e moléculas proteicas

existe uma interacção água-proteína e uma interacção proteína-proteína. Neste

caso, podemos afirmar com certeza que o primeiro tipo de interacção

prevalecerá sobre o segundo porque a água possui uma grande capacidade de

separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada).

Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente. Como este

tipo de solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água,

a interacção proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água

(interacção água-proteína), pelo que a proteína precipita.

A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura.

Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante

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úteis na separação de misturas de proteínas. Quando a temperatura é mais

elevada, este tipo de solventes pode levar à desnaturação das proteínas por

rompimento das pontes de hidrogénio, interacções fracas, por aumento da

vibração molecular do meio.

3.4. Porque é que, no caso das proteínas globulares solúveis, a

sua desnaturação é, em geral, acompanhada por precipitação? Porque

não acontece este fenómeno quando o agente desnaturante usado é um

detergente aniónico, como por exemplo o SDS?

A maioria das proteínas é solúvel em água, facto que poderá ser

atribuído às interacções que se estabelecem entre as moléculas de água e os

grupos polares e/ou ionizados das moléculas proteicas.

A precipitação das proteínas ocorre quando existe um agente que altera

a constante dieléctrica ou força iónica de uma solução aquosa, influenciando a

solubilidade das proteínas. A precipitação dá-se quando as forças de atracção

proteína-água são excedidas pelas forças de coesão entre as diferentes

moléculas proteicas.

Quando o solvente considerado é um detergente aniónico, por exemplo,

o SDS que tem uma grande cadeia polar e uma cadeia hidrofóbica, não se dá a

precipitação das proteínas uma vez que, apesar da proteína desnaturar, as

forças de coesão entre as moléculas proteicas não excedem as forças de

atracção entre o novo solvente e a proteína dado que este é aniónico e não

influencia a mobilidade de cargas, apenas por interacções hidrofóbicas as

converte em estruturas com uma forte carga negativa e privilegia a repulsão em

vez da atracção das moléculas.

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3.5. O processo inverso também pode ocorrer, isto é, pode

realizar-se uma precipitação selectiva de proteínas sem que acorra a sua

desnaturação. Como se designa e realiza esta técnica?

A precipitação induzida por um sal é o tipo de precipitação selectiva mais

comum para as proteínas sem que ocorra a sua desnaturação.

No entanto, e de entre outros factores, a solubilidade de uma proteína

depende da concentração de sal presente na solução.

Quando as concentrações do sal são baixas, a sua presença vai estabilizar os

vários grupos electricamente carregados da proteína, atraindo deste modo a

proteína para a solução e aumentando a solubilidade da proteína. Este

processo é conhecido como salting-in. Se, por outro lado, se aumentar a

concentração do sal na solução, é atingido o ponto máximo de solubilidade da

proteína. Se se aumentar ainda mais a sua concentração, vão existir cada vez

menos moléculas de água disponíveis para solubilizar as proteínas. Quando já

não existem moléculas de água suficientes para interagir com as proteínas,

estas começam a precipitar. A este processo de precipitação de proteínas em

presença de excesso de sal dá-se o nome de salting-out. Esta precipitação vai

ser selectiva porque as proteínas têm diferentes graus de solubilidade.

relatório 2

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