ISSN 2175-8395

Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Instrumentação Agropecuária

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Rede de Nanotecnologia Aplicada ao AgronegócioAnais do V Workshop 2009

dílio Benedito Garrido de AssisWilson Tadeu Lopes da Silva

Luiz Henrique Capparelli MattosoEditores

Embrapa Instrumentação AgropecuáriaSão Carlos, SP

2009

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Anais do V Workshop da rede de nanotecnologia aplicada aoagronegócio 2009 - São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuana, 2009.

IrregularISSN: 2175-8395

I. Nanotecnologia - Evento. I. Assis, Odílio Benedito Garrido de.11.Silva, Wilson Tadeu Lopes da. III. Mattoso, Luiz HenriqueCapparelli. IV. Embrapa Instrumentação Agropecuaria

© Embrapa 2009

Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V Workshop

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AVALIAÇÃO DA ADERÊNCIA BACTERIANA SOBRE FILMESENZIMÁTICOS PROTELÍTICOS PARA APLICAÇÕES

EM, BIOSSENSORES

Luis C. Morais', Tatiane Duarte Mattos', Odilio B.G Assis', Rubens Bernardes Filho'

'Universidade Federal do Acre - UFAC, Rio Branco, AC.2Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, SP. odilio@cnpdia.embrapa.br

Projeto Componente: PC2 Plano de Ação: 01.05.1.01.02.02

Resumo

Filmes enzimáticos multicamadas foram preparados pela técnica de auto-montagem. Soluções depepsina, lisozima e tripsina na concentração de 10-5 M (em pH 6.4, pH 6.4 e pH 7.6respectivamente) foram usados como precursores para a formação dos filmes. Os padrões desuperficie foram examinados por microscopia de força atômica (AFM) sendo as característicasanteriores e posteriores a interação com a bactéria (E. coli) avaliada. Os resultados indicam que ograu hidrofilicidade tem papel fundamental na adesão da bactéria e que a rugosidade pode serconsiderada um fator secundário. A avaliação objetiva usos na confecção de biossensores paraalimentos.

Palavras-chave: filmes enzimáticos, proteases, auto-montagem, interação bacteriana.

Introdução

Biossensores podem ser definidos comodispositivos que utilizam um bioreceptor seletivocom afinidade com uma amostra ou analíto deinteresse. Os bioreceptores (geralmente uma espéciebioquímica tal como anticorpo, oligonucleotídeo ouenzima) são conectados a um transdutor que faz usodo sinal típico do reconhecimento bioquímico econverte o resultado da interação em um sinalmensurável. O uso de enzimas em associação comum eletrodo é um dos mais simples e eficiente tipo debiossensor. Essa configuração faz uso daespecificidade de uma reação enzimática com adetecção de um sinal eletroquímico.

Proteases ou enzimas proteolíticas sãoindicadas para a interação com bactériasconsiderando que estas têm uma função catalíticaque hidrolisa as ligações peptídicas destruindo asestruturas extracelulares das bactérias (BARRET etal., 2003), atividade essa que pode ser interpretadaem termos do mecanismo de Phillips (PHILLIPS,1996), envolvendo uma transferência iônica cujo

Padrão pode ser amplificado e reconhecido.Segundo a literatura a intensidade deste sinal estárelacionada com o número de camadas(KOBAYASHI e ANZAI, 2001). A formação defilmes multicamadas sobre um substrato sólido podeser conseguida pela técnica de auto-montagem(LVOV et al., 1995). Por sua vez, as interações entrefilme e bactéria podem ser entendidas, em umaprimeira análise, como um fenômeno superficialenvolvendo a molhabilidade e adsorção, que sãopassíveis de avaliação por microscopia e demaistécnicas. No presente estudo, três tipos de filmesformados por proteases globulares (lisozima,tripsina e pepsina) em formação multicamadas sãocaracterizados e suas interações com soluçõescontendo E. coli, são avaliadas usando AFM.

Materiais e métodos

Tripsina (EC 3.4.21.4), pepsina (EC 3.4.23.1)e lisozima (EC 3.2.1.47) foram adquiridas daSigma-Aldrich Chemical Co. Laminas de vidro(5mm x 10mm x 2mm optical glass plates) foram

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quimicamente funcionalizadas pelo método'piranha' (KERN, 1993). Os filmes foram formadospela imersão direta dos slides tratados nas soluçõesenzimáticas (10.5 M) por 10minoOs substratos foramentão removidos e brevemente lavados em águadestilada para a remoção de frações não-aderi das.Após secagem as laminas foram novamente imersasnas soluções, cujos procedimentos foram repetidosaté a formação de 10 camadas de cada material (cadaimersão é assumida como formadora de umacamada). As soluções foram obtidas pela dissoluçãodas proteinas em tampão fosfato e pHs ajustados a7,6 para tripsina e 6,4 para lizosima e pepsina,

Imagens topográficas foram avaliadas porAFM no modo contato (TopoMetrix 2010 DiscoverSystem). A avaliação da rugosidade se deu em 5 e 10camadas em áreas de 3 x 3 um. A espessura foiestimada como a diferença entre regiões do substratocom e sem deposito.

Cultura de bactérias E.co/i (microorganismoteste) foi crescida a 37°C em meio LB e suspensãopreparada com a média de ~ 108 células/mL, segundodeterminação ótica (KOCH, 1994). A suspensão foicentrifugada e os microorganismos dispersos nasolução tampão seguido de desagregação em sistemavortex. Depósitos com 10 camadas foramseparadamente imersos na suspensão com bactériaspor 30min. Após breve lavagem e secagem aslaminas foram analisadas por AFM.

Resultados e discussão

A adsorção de proteínas sobre superficiesólida é frequentemente modelada como umaformação bi-dimensional ordenada com arranjosparalelos à superficie. O principal mecanismo querege a formação de filme é assumida como ainteração eletrostática entre as moléculas dasenzimas e a superficie (PASCHE et al., 2005). Aspropriedades finais de um filme de proteínadependem do volume de moléculas adjacentes àsuperficie (FIGUEIREDO et al., 2005) e dauniformidade com que essas moléculas ocupam ossítios na superficie. A Tabela 1 apresenta os dadosobtidos por AFM. De um modo geral todas assuperfícies aparentam estar completamenterevestidas, cujos detalhes topográficos podem serencontrados em MORAIS et al., 2009.

Proteínas globulares tendem a mudar aconformação quando adsorvidas na superficie,normalmente formando filmes de alta densidade(SETHURAMAN et al. 2004). O, cálculo darugosidade realizado sobre os filmes indica que alisozima forma filmes menos rugoso que as demais.O caráter hidrofilico ou hidrofóbico da superficie étambém fundamental na interação commicroorganismos. Como registrado, a adesãobacteriana com uma superficie parece ser superiorcom o aumento do caráter hidrofóbico da superficie(GALLARDO-MORENO et al., 2002; SHENG etal., 2007). Em nossos filmes a superficie de tripsinamostrou ser a mais hidrofóbica (MORAIS et al.,

2009) e os resultados da interação com bactériasconfirmam os dados da literatura.

Tabela 1. Dados obtidos para 5 e 10 deposições.

5 depósitos 10 depósitos

Enzirna Rugosidade Espessura Rugosidade EspessuraRMS (nrn) (nrn) RMS(nrn) (nrn)

Lisozirna \,2\ \7,0 \,06 40,0Tripsina \,32 28,0 2,\0 40,0Pepsina 4,25 28,0 5,26 40,0

A Figura 1 apresenta a aparência dassuperficies após a interação com a E.coli nas quaisduas características principais são notadas: regiõesde intumescimento e bactérias aderidas à superficie(identificadas na superficie da lisozima, Fig. Ia).Uma contagem direta no número de bactériasaderi das por unidade de área indica para a pepsina0,034 ± 0,002 organismos por um-; 0,038 ± 0,005para lisozima e 0,097 ± 0,0 11para a tripsina.

Fig. 1. Examplos das superficies enzimáticas apósinteração com solução contaminada com E. coli:

(a) pepsina, (b) lisozima e (c) tripsina.

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A tripsina é a enzima mais hidrofóbica na quale a densidade de bactérias aderi das éaproximadamente 3 vezes superior as contadas nassuperficies de lisozima e de pepsina, o que confirmaa afinidade de superficies hidrofóbicas com a E.coli.

E importante observar que analises similaresrealizadas por Silva Jr e Teschke (2005), baseadasem imagens por AFM de E.coli imobilizadas sobremica (suporte altamente hidrofilico) após interaçãocom peptídeo antimicrobiano, observou-se que orompimento da membrana exterior domicroorganismo provoca uma redução daestabilidade de aderência à superficie o que podeinterferir em uma contagem precisa sobre os filmesenzimáticos.

Conclusões

Filmes de enzimas proteolíticas como alisozima, a tripsina e a pepsina podem ser facilmenteformados por técnica de auto-montagem. A tripsina éa molécula mais hidrofóbica em comparação com asdemais e apresenta comportamento distinto.Observações microscópicas revelam que a lisozimaforma filmes menos rugosos enquanto a tripsinaatinge uma melhor aderência bacteriana. Osresultados indicam boa relação entre propriedadesfisico-químicas e interação com E.coli, dados quepodem ser úteis na seleção de materiais para aconfecção de biossensores para a detecção debactérias em meio aquosos. O próximo estágio destetrabalho é avaliar esses filmes como geradores desinais quando depositados sobre superfíciecondutora. e-

Agradecimentos

CNPq, FINEP/MCT, EMBRAPA

Referências

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