RELATÓRIO 1 - Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

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Purificao do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca inicaBioqumica Experimental IDepartamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Carla Real Afonso Trabalho realizado por:Alexandra Salvado, n 40267 Andreia Sousa, n 40261 Telmo Paiva, n 40243 PL 3

26 e 27 de Setembro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

ndiceResumo ... 3 Material Mtodos. 4 Material . 4 Mtodos .. 5 Resultados e Discusso .. 12 Concluso ... 33 Bibliografia . 35 Anexos I

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

ResumoEste trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um processo de purificao enzimtica atravs da realizao da purificao parcial do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catinica. Posteriormente purificao realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinao do grau de purificao do enzima (atravs de uma electroforese SDS-PAGE), a determinao da actividade enzimtica de algumas fraces recolhidas durante a cromatografia e, por ltimo, o clculo do rendimento deste processo. Na cromatografia de troca inica efectuada foi utilizada uma resina de troca catinica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os caties do meio. Nesta cromatografia usou-se como fase estacionria um permutador catinico fraco, o CMSephadex G-25 e como fase mvel utilizaram-se dois tipos de tampo com diferentes valores de pH. O primeiro tampo utilizado, o tampo Tris (pH 8,2) foi usado para a lavagem da coluna e para as protenas de pI inferior a 10 serem eludas. O segundo tampo, o tampo Carbonatos de Sdio (pH 10,5), foi usado para a eluio das protenas com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluda com o segundo tampo, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10. Como tambm j foi referido, neste trabalho realizou-se tambm uma electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propsito de determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparao com um padro do enzima puro. Como ser possvel ver mais frente, nota-se umas marcas de arrastamento no poo do lisozima recolhido, pelo que sinal da existncia de impurezas (nomeadamente outras protenas). Por fim, de notar que nas fraces onde as actividades enzimticas foram superiores de suspeitar a existncia do enzima. O rendimento associado cromatografia de troca inica foi de 112,2% e o grau de purificao obtido foi de 2002,7 vezes, os quais so incomportveis com o esperado, pois foi usada uma absorvncia de PCO de outro grupo, visto terem sido os nicos a medi-la.

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Material e MtodosMaterialCromatografia de troca inica Coluna Cromatogrfica 40 x 2,6 cm Bomba peristltica Cronmetro Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de quartzo Aparelho medidor de pH Gaze Material corrente de laboratrio

Doseamento da actividade enzimtica Homogeneizador de Potter-Elvejam Cuvettes de plstico Pipeta automtica Pipeta graduada de 5mL

SDS-PAGE Sistema de polimerizao de gis Placas de vidro para electroforese (mini) Tina de electroforese vertical (mini) Espaadores (0,75mm) e pentes (0,75mm) Fonte de alimentao (500V/150mA) Pipetas automticas

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

MtodosCromatografia de troca inica Montagem da Coluna Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna Decantar a maior parte do tampo (75% gel sedimentado e 25% tampo sobrenadante) Guardar num recipiente com rolha a 4oC Montar a coluna na vertical e ver se est bem fechada Encher a coluna com Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M Abrir a vlvula para a entrada do tampo e introduzir cerca de 5-10 mL do tampo anterior. Manter a sua sada fechada Verter a mistura do gel em tampo na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, at encher completamente Abrir a vlvula de sada da coluna, mantendo um caudal de tampo Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min Medir o fluxo de tampo atravs da coluna, medindo o volume eludo em 2 min. ATENO: Nunca deixar secar o topo da coluna Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura Equilibrar a coluna atravs da passagem de um volume de tampo inicial de eluio aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel, assim como o dimetro da mesma

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Preparao da Amostra Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL

Comprimir a gaze suavemente e o material que passar o filtrado

Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL

Diluir com 35 mL de Tampo Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluio 1/8)Passar a mistura atravs de uma camada de l de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL. O nome do filtrado ser Preparado da Claro do Ovo (PCO) Manter o PCO a 4C, bem identificado at ao final do trabalho

Aplicao da Amostra

Calibrar um aparelho medidor de pH

Ligar a bomba peristltica e controlar o fluxo de entrada do tampo para 1,6 - 1,8 mL/min

Parar a eluio da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua sada

Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a sada da coluna e iniciar a sua eluio. Cuidado para no secar o gel! Pgina | 6

Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Recolher fraces de 15 mL em diferentes provetas at passar na coluna um volume total de tampo aproximadamente igual ao volume da coluna preparada. Controlar o fluxo! Medir o volume de pH de cada fraco recolhida. Coloc-las, s depois, em gelo! Proceder eluio da coluna com tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5) 0,2 M Recolher fraces de 10 mL at registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5 Reduzir, depois, o volume de cada fraco para 5 mL Parar a eluio da coluna quando o valor de pH das fraces estabilizar perto de 10,5 Realizar as leituras de absorvncias das fraces a 280 nm (acertar o zero com gua destilada). Ler tambm as absorvncias do tampo Tris e de carbonatos de sdio Conservar as fraces bem identificadas Lavar a coluna com um volume de tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna Regenerar as condies iniciais passando 2 volumes de soluo tampo de eluio Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) atravs da coluna Indicar na coluna qual o ltimo tampo utilizado

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Doseamento da actividade enzimtica

Ajustar o zero do espectrofotmetro a 450 nm com tampio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M

Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma clula de absoro

Adicionar 0,1 mL da fraco em estudo e misturar rapidamente por inverso, tapando o topo da clula com parafilm

Medir o decrscimo da absorvncia a 450 nm da amostra durante um minuto

SDS-PAGE Lavar muito bem as placas de vidro, os espaadores e os pentes com etanol e secar Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaadores colocar a placa de vidro mais pequena

Introduzir a "sandwich" na pea de suporte para a mesma

Apertar os parafusos e confirmar se no h fugas

Introduzir um pente na "sandwich" at ficarem totalmente inseridos entre as duas placas Marcar com uma cante um trao 1,0 cm abaixo do nvel inferior dos dentes do pente. Este ser o nvel at ao qual se introduzir a soluo de gel resolvente ou de separao

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Preparao dos gis Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) soluo de gel resolvente Adicionar a soluo do gel resolvente "sandwich" com o auxlio de uma pipeta de Pasteur Introduzir um pouco de gua destilada Evita a formao de uma superfcie de polimerizao irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar Deixar a caixa de polimerizao em repouso at que o gel polimerize Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerizao de modo a escorrer toda a gua da superfcie do gel Introduzir o pente na "sandwich" de modo a no criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar a posio dos poos do pente no gel Quando o gel de concentrao polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poos do gel com gua destilada

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Montagem da cmara electrofortica

Retirar a pea auxiliar de montagem da caixa de polimerizao

Deitar na bancada a pea central da cmara de electroforese Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na pea central da cmara de electroforese Introduzir a pea central no reservatrio de tampo inferior da cmara de electroforese

Electroforese Colocar a tampa da cmara electrofortica

Ligar os elctrodos fonte de tenso (ateno polaridade!)

Colocar a voltagem nos 100 V

Registar a intensidade de corrente no incio e no fim da electroforese

Deixar correr a electroforese at o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)

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Purificao do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Remoo do gel Desligar a fonte de alimentao e despejar a soluo de electroforese Deitar a pea central da cmara de electroforese na bancada e remover a pea auxiliar de montagem Remover a "sandwich" Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente Levantar o espaador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel Remover a placa O gel ficar agarrado a uma das placas Cortar

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