relatÓrio 1 - purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

Bioquímica Experimental I

Departamento de Química e Bioquímica

Licenciatura em Bioquímica

26 e 27 de Setembro de 2011

Ano Lectivo 2011/2012

Purificação do

Lisozima da

clara do ovo por

cromatografia de

troca iónica

Docente: Carla Real Afonso

Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, nº 40267

Andreia Sousa, nº 40261

Telmo Paiva, nº 40243

PL 3

Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por

Cromatografia de Troca Iónica

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Índice

Resumo …………………………………………………………………………... 3

Material é Métodos………………………………………………………………. 4

Material …………………………………………………………………. 4

Métodos ………………………………………………………………….. 5

Resultados e Discussão ………………………………………………………….. 12

Conclusão ………………………………………………………………………... 33

Bibliografia ………………………………………………………………………. 35

Anexos …………………………………………………………………………… I



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Resumo

Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um

processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do

lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à

purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de

purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da

actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por

último, o cálculo do rendimento deste processo.

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca

catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta

cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CM-

Sephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes

valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a

lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo

tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas

com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o

segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10.

Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma

electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de

determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima

puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no

poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente

outras proteínas).

Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram

superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à

cromatografia de troca iónica foi de 112,2% e o grau de purificação obtido foi de 2002,7

vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de

PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la.



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Material e Métodos

Material

Cromatografia de troca iónica

Coluna Cromatográfica 40 x 2,6 cm

Bomba peristáltica

Cronómetro

Espectrofotómetro UV-Vis

Cuvettes de quartzo

Aparelho medidor de pH

Gaze

Material corrente de laboratório

Doseamento da actividade enzimática

Homogeneizador de Potter-Elvejam

Cuvettes de plástico

Pipeta automática

Pipeta graduada de 5mL

SDS-PAGE

Sistema de polimerização de géis

Placas de vidro para electroforese (mini)

Tina de electroforese vertical (mini)

Espaçadores (0,75mm) e pentes (0,75mm)

Fonte de alimentação (500V/150mA)

Pipetas automáticas



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Métodos

Cromatografia de troca iónica

Montagem da Coluna

Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna

• Guardar num recipiente com rolha a 4oC

Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25% tampão sobrenadante)

Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada

Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M

• Manter a sua saída fechada

Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10 mL do tampão anterior.

Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente

Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min

• ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna

Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume eluído em 2 min.

Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura

Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada

Medir a altura do gel, assim como o diâmetro da mesma



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Preparação da Amostra

Aplicação da Amostra

Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL

Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado

Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL

Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluição 1/8)

• O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO)

Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL.

Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho

Calibrar um aparelho medidor de pH

Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1,6 - 1,8 mL/min

Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída

Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total

• Cuidado para não secar o gel!

Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e iniciar a sua eluição.



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• Controlar o fluxo!

Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao volume da coluna preparada.

Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo!

Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M

Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5

Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL

Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10,5

• Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio

Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o zero com água destilada).

Conservar as fracções bem identificadas

Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna

Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) através da coluna

Indicar na coluna qual o último tampão utilizado



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Doseamento da actividade enzimática

SDS-PAGE

Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e secar

Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena

Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma

Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas

Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas

Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de separação

Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M

Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção

Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão, tapando o topo da célula com parafilm

Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um minuto



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Preparação dos géis

Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente

Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur

• Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar

Introduzir um pouco de água destilada

Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize

Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água da superfície do gel

Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar

Deixar a repousar para polimerizar

Marcar a posição dos poços do pente no gel

Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado

Lavar os poços do gel com água destilada



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Montagem da câmara electroforética

Electroforese

Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização

Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese

Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara de electroforese

Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara de electroforese

Colocar a tampa da câmara electroforética

Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)

Colocar a voltagem nos 100 V

Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese

Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)



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Remoção do gel

Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese

Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e remover a peça auxiliar de montagem

Remover a "sandwich"

Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente

Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel

Remover a placa

O gel ficará agarrado a uma das placas

Cortar um dos cantos do gel

Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol



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Resultados e Discussão

Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280

nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. Discussão do

gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca

catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a

composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína, a carga global

destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim:

as proteínas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH é inferior

ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina catiónica.

as proteínas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH é superior

ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina aniónica.

Como a resina é de troca catiónica, ligou as proteínas que apresentavam carga

global positiva. As outras proteínas, como não se ligam à coluna foram eluídas com o

tampão.

A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina é de

troca catiónica, para que esta adira à coluna, é necessário que tenha carga global

positiva, logo, o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao

valor de pI da proteína, bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna.

Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes

proteínas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual à da coluna e

como tal não se ligam, sendo eluídas com a solução inicial. Ao aumentar o pH do

tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como

tal são também eluídas com o tampão. Desta forma, obtêm-se as diferentes proteínas

contidas na PCO variando o pH das soluções.

Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna, pode-se

aumentar a força iónica do tampão, adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de

potássio (KCl). Assim, a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o

sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão.



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Quadro 1. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.

Volume

de cada

fracção

Volume

de

eluição

total

Fracções Absorvância

a 280 nm pH Diluição

15 mL

15 1 0,080 8,21 -

30 2 0,872 8,21 1:2

45 3 0,936 8,23 1:3

20 mL 65 4 0,098 8,18 -

10 mL

75 5 0,049 8,16 -

85 6 0,033 8,14 -

95 7 0,032 8,15 -

105 8 0,044 8,17 -

115 9 0,037 8,36 -

125 10 0,032 8,58 -

5 mL

130 11 0,031 8,63 -

135 12 0,040 8,65 -

140 13 0,032 8,67 -

145 14 0,042 8,69 -

150 15 0,041 8,69 -

155 16 0,189 8,89 -

160 17 0,291 9,52 -

165 18 0,270 9,95 -

170 19 0,275 10,16 -

175 20 0,108 10,35 -

180 21 0,078 10,45 -

185 22 0,056 10,5 -



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Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada, sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada

fracção em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 1), da fracção 1 à 4, ou seja, dos 15

aos 65 mL eluídos, é quando se observa maior absorvância; havendo um pico de

absorvância quando o volume eluído é 45 mL, ou seja, na fracção 3. Como o pH do

tampão inicial é de 8,2, todas as proteínas, à excepção da Lisozima e da Avidina, são

eluídas juntamente com o tampão, pois não se ligam à coluna por terem carga negativa

(como é visível no quadro abaixo – quadro 2). Ao alterar a solução tampão de eluição

para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das proteínas e como tal

a sua ligação com a coluna. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais

altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluída com o tampão de

eluição, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga

nula.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2 1

5

30

45

65

75

85

95

10

5

11

5

12

5

13

0

13

5

14

0

14

5

15

0

15

5

16

0

16

5

17

0

17

5

18

0

18

5

pH

Ab

sorv

ân

cia

a 2

80

nm

Volume eluído /mL

Absorvância e valor de pH VS volume de

eluição

Absorvância

pH



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Quadro 2. Ponto isoeléctrico (pI) das principais proteínas presentes na clara do ovo.

Proteínas pI

Ovalbumina 4,5

Ovotransferrina 6,05

Ovomucoide 4,1

Lisozima 10,7

Ovoinibidor 5,1

Ovomacroglobulina 4,5

Ovoglicoproteína 3,9

Avidina 10

Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções

colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida

pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Cálculo da força iónica

das soluções tampão utilizadas.

A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na

cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes:

Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4

fracções – volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos – I)

Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fracções)

Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado, aumentando-se o seu

pH gradualmente, a variação que se veria nas fracções seria contínua, e não descontínua

como foi o caso.

A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna

inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões.

A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em

solução. Assim, está relacionada com a concentração de electrólitos, catiões e aniões. A

forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte

expressão:

Onde é a concentração da espécie com carga e é a carga da respectiva

espécie.



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Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M

As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica



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Força Iónica do Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M

As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica

Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro, o

segundo tampão causa o compactamento da coluna. As partículas de gel carregadas

negativamente, unem-se mais aos iões Na+ do tampão de carbonatos de sódio por a

concentração destes catiões ser superior neste tampão, o que em conjunto com outros

iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna.

Este processo de compactação é reversível – basta adicionar um tampão com menor

força iónica para que a coluna descompacte.



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Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de

Absorvância a 280 nm

Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de

coeficiente de absorção molar.

(mistura de proteínas)

(lisozima)

Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 – 19) utilizou-

se o segundo valor apresentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura

de proteínas (fracções 1 – 16 e 20 – 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:

Fracção 1 (mistura de proteínas)


Fracção 17 (lisozima)

(lisozima)

No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma

absorvância mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da

diluição. Por exemplo, a fracção 2:




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Como a solução foi diluída com factor 2, a concentração real da fracção é:

Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.

Doseamento Proteico

Amostra

Volume

da

Fracção

(mL)

Volume

de

eluição

Total

(mL)

pH Abs280nm

Diluição

do

ensaio

[Prot] (mg/mL)

PCO - - 8,3 1,487 1:12 17,844

1 15 15 8,21 0,080 - 0,080

2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744

3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808

4 20 65 8,18 0,093 - 0,093

5 10 75 8,16 0,049 - 0,049

6 10 85 8,14 0,033 - 0,033

7 10 95 8,15 0,032 - 0,032

8 10 105 8,17 0,044 - 0,044

9 10 115 8,36 0,037 - 0,037

10 10 125 8,58 0,032 - 0,032

11 5 130 8,63 0,031 - 0,031

12 5 135 8,65 0,040 - 0,040

13 5 140 8,67 0,032 - 0,032

14 5 145 8,69 0,042 - 0,042

15 5 150 8,69 0,041 - 0,041

16 5 155 8,89 0,189 - 0,189

17 5 160 9,52 0,291 - 0,012

18 5 165 9,95 0,270 - 0,017

19 5 170 10,16 0,275 - 0,014

20 5 175 10,35 0,108 - 0,108

21 5 180 10,45 0,078 - 0,078

22 5 185 10,5 0,056 - 0,056



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Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Sugestão de um

método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra.

Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na

cromatografia de troca iónica, foi medida a absorvância de cada uma delas e

seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer ( ).

O método utilizado pode induzir em erro, visto que a concentração medida não foi

apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções.

Assim, para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter

sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas, por exemplo o método

de Lowry. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o

reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas, na

presença do catalisador cobre (II). A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta

sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. No entanto, apesar do

método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas, o mesmo

possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de

interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvância do

branco, diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados.

Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do

Biureto (ver anexos – II). No entanto, para além deste método ser muito menos sensível

que o método apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampão Tris-HCl, já que

este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu2+

presente

na mistura).

Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína

para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior

actividade enzimática. Resumir os cálculos num quadro.

Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à

quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas

enzimas não são encontradas puras, não é possível quantificá-las, pelo que os resultados

são expressos em termos de unidades de actividade (UA), que são definidas



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arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0,001 unidades de

absorvância por minuto.

Relativamente à lisozima, a unidade enzimática é dada pela quantidade de

centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0,001

unidades por minuto.

Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que

relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). Para calcular

, fez-se uma regressão linear das rectas obtidas na realização dos ensaios

enzimáticos, onde

representa o declive dessas rectas. Nesta fórmula o tempo vem

em minutos, mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos

(60 segundos), foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por

minuto. Estes valores foram também divididos por 0,001, de modo a obter-se o número

de unidades enzimáticas.

Assim, a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é:

, em que a unidade é U, sendo este U = µmol.min

-1

Nos ensaios enzimáticos realizados, só a PCO e a fracção 17 foram diluídas, pois

são as que se espera registar maior actividade enzimática. Ainda assim mediu-se a

actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se

tinham a lisozima ou não. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como

modelo os seguintes cálculos:

PCO diluição 1:5

O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos – III, Figura III). Neste caso,

.



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O número de unidades enzimáticas é:

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Fracção 17 diluição 3:5


Anexos – III, Figura IX). Neste caso,

.



Fracção 2


Anexos – III, Figura XII). Neste caso,

.





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Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos

picos do gráfico 1.

Amostra Diluição

realizada

[Prot]

(mg/mL)

|∆Abs450nm/∆t|

(UA/min)

Actividade

(U/mL)

PCO

1:1 17,844 0,0007 420

1:2 8,922 0,0006 360

1:5 3,5688 0,0004 240

1:10 1,7844 0,0002 120

1:20 0,8922 0,0002 120

1:40 0,4461 0,0002 120

Fracção 17

1:1 0,012 0,0008 480

4:5 0,0096 0,0008 480

3:5 0,0072 0,0007 420

2:5 0,0048 0,0006 360

1:5 0,0024 0,0004 240

Fracção 2 1:1 1,744 1,8

Fracção 3 1:1 2,808 0,36

Fracção 8 1:1 0,044 48

Fracção 18 1:1 0,017 0,0002 120

Fracção 19 1:1 0,014 0,0001 60



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Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.

Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da

fracção 17.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0,4461 0,8922 1,7844 3,5688 8,922 17,844

Act

ivid

ad

e E

nzi

má

tica

(U

/mL

)

Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade Enzimática em função da

concentração de proteína para as

diferentes diluições de PCO

Actividade Enzimática

0

100

200

300

400

500

600

0,0024 0,0048 0,0072 0,0096 0,012

Act

ivid

ad

e E

nzi

má

tica

(U

/mL

)

Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade Enzimática em função da

concentração de proteína para as

diferentes diluições da fracção 17

Actividade Enzimática



Página | 25

Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da

coluna

A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de

substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de

enzima. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por

unidade de massa de enzima usada no ensaio.

Assim, para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída, tem-se que:

, onde as unidades enzimáticas são dadas por U.mg

-1.

Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450

manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração

proteica. Desta forma, apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a

actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do

cálculo da actividade específica para uma das fracções:

Fracção 8



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Quadro 5. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

Doseamento

Proteico

Doseamento da actividade

enzimática

Am

ost

ra

Volu

me

da

Fra

cção

(mL

)

Volu

me

de

elu

ição

Tota

l

(mL

)

pH

Ab

s 28

0n

m

Dil

uiç

ão d

o

ensa

io

[Pro

t]

(mg/m

L)

(UA

/min

)

Act

ivid

ad

e

(U/m

L)

SA

(U/m

g)

PCO - - 8,30 1,487 1:12 17,844 0,0007 420 23,54

1 15 15 8,21 0,080 - 0,080

2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744 1,8 1,03

3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808 0,36 0,13

4 20 65 8,18 0,093 - 0,093

5 10 75 8,16 0,049 - 0,049

6 10 85 8,14 0,033 - 0,033

7 10 95 8,15 0,032 - 0,032

8 10 105 8,17 0,044 - 0,044 12 272,73

9 10 115 8,36 0,037 - 0,037

10 10 125 8,58 0,032 - 0,032

11 5 130 8,63 0,031 - 0,031

12 5 135 8,65 0,040 - 0,040

13 5 140 8,67 0,032 - 0,032

14 5 145 8,69 0,042 - 0,042

15 5 150 8,69 0,041 - 0,041

16 5 155 8,89 0,189 - 0,189

17 5 160 9,52 0,291 - 0,012 0,0008 480 40000

18 5 165 9,95 0,270 - 0,017 0,0002 120 7058,82

19 5 170 10,16 0,275 - 0,014 0,0001 60 4285,71

20 5 175 10,35 0,108 - 0,108

21 5 180 10,45 0,078 - 0,078

22 5 185 10,50 0,056 - 0,056



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Gráfico de eluição da cromatografia realizada representando a concentração de

proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. Discussão dos

resultados obtidos.

Figura 4. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 4), a actividade específica é maior

onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração

proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105), a enzima não está

presente, ou está presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras

fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas, ou seja,

todas as que tem pI inferior a 8,2, que não é o caso do lisozima, enzima do qual se está a

calcular a actividade específica.

Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por

cromatografia de troca iónica foi eficiente, já que nas fracções em que se esperava obter

o enzima, existe actividade enzimática.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

30 45 105 160 165 170

Act

ivid

ad

e E

spec

ífic

a (

SA

) (U

/mg

)

Co

nce

ntr

açã

o d

a P

rote

ína

(m

g/m

L)

Volume de Eluição (mL)

Concentração de Proteína e SA em função

do volume de eluição

[Prot] (mg/mL)

SA (U/mg)



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Estudo do electroforama obtido e identificação das principais proteínas em cada

pista. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores.

A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese

unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE).

Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resolução

originando, portanto, uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura.

Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar, permitindo

revelar e identificar facilmente os compostos separados.

Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS, que

é um detergente), que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto, permitindo a

identificação aproximada, por comparação, do tamanho da proteína

Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.

Na realização do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O

gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel

concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem

poros mais pequenos. Desta forma, as proteínas maiores, com maior massa molecular



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ficam retidas na camada superior, enquanto as proteínas de menores dimensões passam

para a camada inferior.

Em cada poço seria suposto colocar de proteína, podendo ter no máximo

da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito

baixas, o volume a colocar nos poços era muito maior que 10 logo, na

impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se .

No electroforama obtido, a ordem de colocação das amostras nos poços é a

seguinte:

1- Amostra de PCO; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

2- Amostra do pico 1 (Fracção 3); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5

minutos;


minutos;


minutos;

5- Amostra do lisozima; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

6- Marcador; tampão e β-mercaptoetanol;

7- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol;

8- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos:

9- Amostra de β-globulina; tampão de aplicação; aquecidos durante 5 minutos.

Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro

6), cujas massas moleculares são conhecidas, é possível verificar se a fracção que se

suspeita ter lisozima está pura.

Quadro 6. Proteínas que constituem o marcador.

Proteína Mr (KDa) Rf Erro

Fosforilase b 94 0,36 0,32-0,40

BSA 67 0,44 0,39-0,47

Ovalbumina 43 0,52 0,46-0,56

Anidrase carbonica 30 0,65 0,58-0,70

Inibidor de tripsina 20 0,75 0,66-0,80

α-lactalbumina 14,4 0,84 0,75-0,91



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Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14,3 KDa, é de esperar que as

amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparação

com o marcador, a massa molecular é 14,4 KDa. Assim, é possível concluir que as

amostras colocadas no poço 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima.

Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o

efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura

conjugados (8) na β-globulina. A β-globulina é construída por 2 subunidades, quando

fica sujeita à acção de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se,

mostrando no electroforama três bandas distintas. Uma banda para a proteína não

desnaturada, e duas para cada uma das subunidades.

No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7), é possível

observar várias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o β-

mercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se

separarem uma da outra, ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde

94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poço 8, a proteína também desnaturou dando

origem a 4 bandas distintas, ou seja, fracções com tamanhos variáveis. No caso em que

se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se

aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos

bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o

descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a proteína

não desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a

subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do

electroforama).

Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo

Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as

fracções com maior actividade específica, pois é nestas fracções que se encontra a maior

parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fracções seleccionadas foram

a 17, 18 e 19, já que apresentam actividade específica 40 000, 7058,82 e 4285,71,

respectivamente.



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Para exemplificar o cálculo do rendimento e da purificação do enzima,

procedeu-se a este cálculo para a fracção 17, sendo o cálculo para as outras fracções e

para a PCO semelhante.

Fracção 17

Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as

fracções.

Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma

das massas totais de enzima purificado.



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Quadro 7. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica.

Pa

sso

de

Pu

rifi

caçã

o

Vo

lum

e T

ota

l

(mL

)

[Pro

t]

(mg/m

L)

Ma

ssa

Pro

teic

a t

ota

l

(mg)

Act

ivid

ad

e

(U/m

L)

Act

ivid

ad

e

To

tal

(U)

SA

(U

/mg)

Ren

dim

ento

(%)

Pu

rifi

caçã

o

(x)

PCO 7*1

17,844 124,91 420 2 940 23,54

112,2 2002,7

Fra

cções

17 5 0,012 0,06 480 2 400 40 000

18 5 0,017 0,085 120 600 7 058,8

19 5 0,014 0,07 60 300 4 285,7

Total 15 0,014*2

0,215 660 3 300 47 142,86*3

*1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL.

*2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção.

*3

Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a

purificação dão valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realização deste

trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como

tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o

valor de absorvância registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentração e

consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho, deveria ser

maior que aquele que obtemos do outro grupo.



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Conclusão

Globalmente, este trabalho laboratorial foi constituído por quatro etapas

principais:

Cromatografia de troca iónica;

Doseamento da concentração de proteína;

Doseamento da actividade enzimática;

Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da

amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes soluções constituídas por

diferentes conjuntos de proteínas. Após a sua análise, ao serem medidas as absorvâncias

das fracções, foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima)

na sua constituição. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar

diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do

lisozima.

Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção, às quais se

adicionou substrato de parede celular de células de M. luteus, foi possível medir o

decréscimo da absorvência a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a

actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Calculou-se

também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da

amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância.

Por fim, pela realização da electroforese unidimensional em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes

em cada poço, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos

três picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir

que, de facto, o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição, enquanto que

os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da

constituição da clara de ovo. Este método permitiu, assim, concluir que foi possível

purificar o lisozima, tal como se esperava.

Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de

purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores



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obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos,

uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da

PCO de outro grupo, não correspondendo à realidade daquilo que foi observado.

Em suma, apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau

de pureza do lisozima obtido, foi possível verificar qualitativamente a sua presença e

observar a sua actividade catalítica. Desta forma, pode fazer-se um balanço positivo

relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do

lisozima da clara do ovo.



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Bibliografia

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Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in

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Wilson, K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (Wilson, K e Walker, J,

eds.) 4ª ed., Cambridge University Press, Cambridge.

relatÓrio 1 - purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

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