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EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E PEGLAÇÃO DE LISOZIMA
DÉBORA DA SILVA FREITAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/ InstitutoButantan / IPT, para obtenção do Título de Mestre em
Biotecnologia
São Paulo 2007
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EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E PEGLAÇÃO DE LISOZIMA
DÉBORA DA SILVA FREITAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/ InstitutoButantan / IPT, para obtenção do Título de Mestre em
Biotecnologia
Área de concentração : Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. José Abrahão Neto
São Paulo 2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas _______________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Débora da Silva Freitas.
Título da Dissertação: Extração, purificação e peglação de lisozima.
Orientador(a): José Abrahão Neto.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em
sessão pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................. Nome: ....................................................................................
Instituição: ..............................................................................
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................. Nome: ....................................................................................
Instituição: ..............................................................................
Presidente: Assinatura: ............................................................................. Nome: .................................................................................... Instituição: ..............................................................................
Dedico este trabalho
Aos meus pais
Geraldo de Freitas (in memoriam) e
Terezinha da Silva Freitas meus
exemplos de amor, compreensão e determinação.
Aos meus irmãos
Márcia, Marlice, Nilce, Zípora e Duarsem.
Aos meus queridos sobrinhos
Hugo Marques e Mariana Carolina.
AGRADECIMENTOS
Obrigada, Deus, pela vida e por seu amparo durante toda a minha caminhada e principalmente
quando houve apenas uma pegada na areia.
Ao orientador Prof. Dr. José Abrahão Neto, que desde o início depositou confiança em meu
potencial como profissional e pela oportunidade do ingresso na Pós-graduação. Obrigada pela
paciência, durante esses anos de trabalho em conjunto.
À Profa. Dra. Soraia Attie Calil Jorge pelas palavras de apoio, incentivo e amizade.
Aos meus amigos, Ruither O. G. Carolino, Álvaro Braga Paiva de Souza, André e Ana
Paula Lopes obrigada pelo companheirismo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da
bolsa de estudos e auxílio ao projeto.
À secretaria da Pós-graduação em Biotecnologia pelo apoio e suporte.
Aos funcionários do Laboratório de Enzimologia da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas/USP, obrigada pelo suporte.
Obrigada a todos que de alguma maneira contribuíram para a conclusão dessa etapa de minha
vida.
“A ciência tem raízes amargas,
porém seus frutos são doces.”
Aristóteles (384-322 a.C.)
Resumo
FREITAS, D.S. Extração, purificação e peglação de lisozima. 2007. 154f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Dentre as principais tecnologias surgidas desde 1970, a Biotecnologia tem adquirido
relevância em diversas áreas, inclusive na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica.
Nesse âmbito, uma das técnicas utilizadas que trouxe novas perspectivas para o uso de
proteínas terapêuticas é a “PEGlação” – modificação química de polipeptídeos e proteínas
através da introdução de resíduos de polietilenoglicóis (PEG) modificados – o que permite a
modulação das propriedades físico-químicas, catalíticas e farmacológicas das moléculas
nativas de acordo com a finalidade. A lisozima (LZ) é um importante bactericida natural,
sendo uma enzima (EC 3.2.1.17) de ampla distribuição na natureza, cuja principal fonte de
obtenção é a clara de ovos de aves. Recentemente, a LZ adquiriu destaque como um potencial
fármaco antimicrobiano, devido à necessidade de desenvolvimento de novos agentes que
possam suplantar o crescente aumento na resistência bacteriana aos antibióticos. No presente
trabalho, a LZ foi extraída da clara de ovo de galinha por dois procedimentos: extração por
troca iônica em batelada “batch” com as resinas catiônicas IRC-50; IRP-88, seguida de
ultrafiltração, apresentando um rendimento em torno de 60%. Para verificar os efeitos
decorrentes da “PEGlação”, a LZ foi modificada utilizando três tipos de mPEG:
metoxipolietilenoglicol succinimidil succinato de 2 e 5 kDa (mPEG 2000 e mPEG 5000), e
com metoxipolietilenoglicol p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) de 5 kDa. A atividade
enzimática da LZ modificada foi determinada sobre os substratos M. lysodeikticus e Glicol
Quitosana. A atividade enzimática sobre Glicol Quitosana não foi alterada em relação à LZ
nativa, enquanto o perfil de atividade sobre M. lysodeikticus foi modificado em função do pH,
apresentando pH ótimo em 6.0 para conjugados LZ-mPEG 2000, LZ-mPEG 5000 e pH ótimo
em 6.0 e 9.0 para o conjugado LZ-mPEG-pNP 5000. A resistência da LZ nativa e de seus
conjugados à ação de proteases foi determinada e os conjugados obtidos foram mais
resistentes à degradação proteolítica comparado a LZ nativa. Para avaliar a atividade
antimicrobiana da LZ modificada contra bactéria Gram-negativa foi empregada cepa de E.
coli ATCC 29255. O conjugado LZ-mPEG 5000 apresentou maior atividade antimicrobiana
contra E. coli em relação a LZ nativa. Dessa forma, a “PEGlação” da lisozima mostrou-se
interessante, pois a LZ modificada apresentou maior estabilidade à temperatura e pH, sendo
resistente à degradação proteolítica, o que possivelmente pode permitir sua aplicação nas
áreas alimentícia, cosmética e farmacêutica.
Palavras chave: Peglação, lisozima, estabilidade físico-química, atividade antimicrobiana.
ABSTRACT
FREITAS, D.S. Extraction, purification and pegylation of lysozyme. 2007. 154f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Amongst the main technologies appeared since 1970, the Biotechnology has obtained
relevance in diverse areas, including the nourishing, cosmetic and pharmaceutical industries.
In this scope, one of the used techniques that brought new perspectives to the therapeutical
protein use is the PEGylation - chemical modification of polypeptides and proteins by means
of the introduction of modified polyethylene glycols (PEG) residues - what allows the
modulation of the physicochemical, catalytic and pharmacological properties of the native
molecules according to the purpose. Lysozyme (LZ) is an important natural bactericidal,
being an enzyme (EC 3.2.1.17) of large distribution in the nature, whose main source of
attainment is the egg-white from birds. Recently, the LZ acquired prominence as a potential
antimicrobial pharmaco, due to the necessity of development of the new agents that could
supplant the growing increase in the bacterial resistance to antibiotics. In the present work, the
LZ was extracted from the hen egg-white by two procedures: extraction by ionic exchange in
batch mode with cationic resins IRC-50; IRP-88, followed by ultrafiltration, presenting an
yield around 60%. In order to verify the PEGylation decurrent effects, the LZ was modified
using three types of mPEG: methoxypolyethyleneglycol succinimidyl succinate of 2 and
5 kDa (mPEG 2000 and mPEG 5000), and with methoxypolyethyleneglycol p-nitrophenyl
carbonate (MPEG-pNP) of 5 kDa. The enzymatic activity of the modified LZ was determined
on the substrates M. lysodeikticus and Glycol Chitosan. The enzymatic activity on Glycol
Chitosan was not modified in relation to the native LZ, whereas the profile of activity on
M. lysodeikticus was modified in function of the pH, presenting optimal pH in 6.0 for
conjugate LZ-mPEG 2000, LZ-mPEG 5000 and optimal pH in 6.0 and 9.0 for conjugate LZ-
mPEG-pNP 5000. The resistance of the native LZ and its conjugates to the protease action
was so determined and the obtained conjugates showed more resistant to the proteolytic
degradation compared to the native LZ. To evaluate the antimicrobial activity of the LZ
modified against Gram-negative bacterium was used strain of E. coli ATCC 29255. The
conjugate LZ-mPEG 5000 presented major antimicrobial activity against E. coli in relation to
the native LZ. In this way, the lysozyme PEGlyation revealed interesting because the LZ
modified presented a greater stability to temperature and pH, being resistant to the proteolytic
degradation what possibly will allow its application in the food, cosmetic and pharmaceutical
areas.
Key words: Pegylation, lysozyme, physicochemical stability, antimicrobial activity.
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1A – Representação do substrato da lisozima e seu sítio de clivagem................
18
Figura 1B – Mecanismo de hidrólise enzimática da LZ sobre o peptídeoglicano..........
20
Figura 2 – Representação estrutural da nativa lisozima da clara de ovo de galinha......
22
Figura 3 – Comparação entre as estruturas da membrana celular de bactérias Gram-positiva e Gram-negativa................................................................................
28
Figura 4 – Mecanismo proposto para a interação de peptídeos antimicrobiano catiônico com a parede da bactéria Gram-negativa.......................................
30
Figura 5 – Dados de importação e exportação da lisozima e de seu cloridrato por peso líquido (tonelada)..................................................................................
33
Figura 6 – Dados de importação e exportação da lisozima e de seu cloridrato por valores FOB (103 US$)..................................................................................
34
Figura 7 – Principais características da proteína “peglada”............................................
36
Figura 8 – Estrutura tridimensional da lisozima da clara de ovo de galinha..................
40
Figura 9 – Representação esquemática da reação de “PEGlação” de grupos H2N-R com alguns derivados de PEG.........................................................................
41
Figura 10 A – Perfil de atividade (%) de lisozima em diferentes pH (4-12)....................
65
Figura 10 B – Perfil de estabilidade (%) de lisozima em diferentes pH (4-12)................
66
Figura 11 – Curva padrão de concentração molar (M) de sulfato de amônio..................
68
Figura 12 – Perfil Cromatográfico da eluição com gradiente crescente de sulfato de amônio em pH 7.0 com resina IRC-50............................................................
69
Figura 13 – Perfil Cromatográfico da eluição com gradiente crescente de sulfato de amônio em pH 7.0 com resina IRP-88............................................................
70
Figura 14 – Avaliação do perfil de eluição da lisozima das resinas IRC-50 e IRP-88 em função do tempo.....................................................................................
77
Figura 15 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% com resinas IRC-50 e IRP-88............................................................................................
81
Figura16 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% com resina IRP-88..............................................................................................................
83
Figura 17 – Caracterização dos conjugados de lisozima modificada com mPEG 5000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%.......................
85
Figura 18 – Caracterização dos conjugados de lisozima modificada com mPEG 2000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%......................
86
Figura 19 – Caracterização dos conjugados de lisozima modificada com mPEG-pNP 5000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%................
87
Figura 20 – Caracterização dos conjugados de lisozima modificada com mPEG 2000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%......................
94
Figura 21 – Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG 5000.....................................................................................
96
Figura 22 – Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG-pNP 5000..........................................................................
97
Figura 23 – Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 sobre substrato Glicol Quitosana....................................................................................................
97
Figura 24 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 na ausência de 2-mercaptoetanol acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%............................................................................................
101
Figura 25 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 com 2-mercaptoetanol acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%................................................................
102
Figura 26 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 2000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%.........................
102
Figura 27 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG-pNP 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%..............................................................................................................
103
Figura 28 – Representação estrutural (a) mPEG succinimidil succinato e (b) mPEG-p nitrofenil carbonato....................................................................................
104
Figura 29 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%.........................
107
Figura 30 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%........................
107
Figura 31 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% das frações Obtidas por cromatografia de Gel Filtração da LZ-mPEG 5000 e LZ-mPEG 2000...............................................................................................
109
Figura 32 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% das frações obtidas por cromatografia de Gel Filtração da LZ-mPEG-pNP5000.............
110
Figura 33 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% dos conjugados obtidos com a modificação da LZ por “PEGlação”.......................................
111
Figura 34 – Efeitos do pH sobre a atividade enzimática (%) da lisozima nativa e de seus derivados.................................................................................................
113
Figura 35 – Perfil de estabilidade em (%) da lisozima nativa e de seus derivados a 25°C.............................................................................................................
119
Figura 36 – Perfil de estabilidade em (%) da lisozima nativa e de seus derivados a 50°C.................................................................................................................
120
Figura 37 – Comportamento da lisozima nativa frente a ação de diferentes proteases......
124
Figura 38 – Comportamento da lisozima nativa e LZ-mPEG 5000 perante a ação de diferentes proteases.........................................................................................
125
Figura 39 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15% da LZ incubada com diferentes proteases................................................................................
127
Figura 40 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15% da LZ-mPEG 5000 com diferentes proteases.......................................................................
128
Figura 41 – Estabilidade da lisozima nativa e de seus derivados em soro humano...........
129
Figura 42 – Avaliação da atividade antimicrobiana da Lisozima, LZ–mPEG 5000 comparadas com o controle e mPEG 5000 em relação à UFC / mL...............
130
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Exemplos de proteínas terapêuticas conjugadas ao PEG utilizadas Clinicamente.....................................................................................................
44
Tabela 2 – Proporção mPEG 5000 / lisozima.....................................................................
54
Tabela 3 – Proporção mPEG 2000 / lisozima......................................................................
55
Tabela 4 – Proporção mPEG-pNP 5000 / lisozima............................................................
55
Tabela 5 – Proporção mPEG 2000 / lisozima.....................................................................
56
Tablea 6 – Proporção dos diferentes mPEG/lisozima para verificar a cinética da reação de “PEGlação” da LZ......................................................................................
57
Tabela 7 – Ensaio de atividade antimicrobiana da lisozima nativa e modificada LZ-mPEG 5000.................................................................................................
62
Tabela 8 – Medidas de atividade enzimática, quantidade de proteína, atividade específica, condutividade e concentração de sulfato de amônio das frações do processo de eluição em coluna em pH 7.0 com resina IRC-50.............................................................................................................
69
Tabela 9 – Medidas de atividade enzimática, quantidade de proteína, atividade específica, condutividade e concentração de sulfato de amônio das frações do processo de eluição em coluna em pH 7.0 com resina IRP-88..................
70
Tabela 10 – Eluição em batelada com resina IRC-50............................................................ 73
Tabela 11 – Eluição em batelada com resina IRP-88...........................................................
74
Tabela 12 – Resumo das etapas de purificação da lisozima com as resinas IRC-50 e IRP-88..................................................................................................................
78
Tabela 13 – Resumo das etapas de purificação da lisozima com resina IRP-88....................
82
Tabela 14 – Avaliação da atividade antimicrobiana da lisozima nativa, LZ- mPEG 5000, mPEG 5000 em relação à UFC / mL, Log UFC / mL e colônias sobreviventes (%)...............................................................................................
130
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 1.1 Lisozima da clara de ovo de galinha.................................................................................... 1.1.2 Aplicações da Lisozima.................................................................................................... 1.1.3 Estratégias para ampliar o espectro de ação da Lisozima................................................. 1.1.4 Perfil Mercadológico da Lisozima.................................................................................... 1.2 Modificação química de proteínas com polietilenoglicol (PEG)- “Pegylated proteins”....
1.2.1 Aspectos químicos envolvidos na tecnologia de PEGlação............................................
1.2.2 Propriedades do polietilenoglicol (PEG) ........................................................................ 1.2.3 A química da reação de PEGlação...................................................................................
1.2.4 Caracterização do metoxipolietilenoglicol (mPEG) conjugado....................................... 1.2.5 Propriedades terapêuticas do metoxipolietilenoglicol (mPEG)........................................
17
22
24 26 32
34
37
38
39
42 43
2. OBJETIVOS............................................................................................................................ 2.1 Objetivos Gerais…………………………………………………………………………. 2.2 Objetivos Específicos…………………………………………………………………….
45 45 45
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 3.1 MATERIAIS........................................................................................................................ 3.1.1 Aparelhos......................................................................................................................
46 46 46
3.1.2 Reagentes……………………………………………………………………………..
47
3.2 MÉTODOS.........................................................................................................................
3.2.1 Medida da concentração de proteína pelo método de Bradford..................................
48 48
3.2.2 Ensaios enzimáticos...................................................................................................
48
3.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida.........................................................................
49
3.2.4 Extração e Purificação de Lisozima............................................................................
51
3.2.4.1 Resina IRC-50............................................................................................................
51
3.2.4.2 Resina IRP-88.............................................................................................................
52
3.2.4.3 Fluxograma de Extração e Purificação de Lisozima com resinas IRC-50/ IRP-88....
3.2.5 Verificação da influência da proporção mPEG succinimidil succinato 5000,2000Da ou mPEG-p-nitrofenil carbonato 5000 no grau de substituição da lisozima...............
3.2.6 Verificação da influência do tempo no grau de substituição da lisozima utilizando tampão HEPES...............................................................................................................
3.2.7 Isolamento da lisozima modificada................................................................................
3.2.8 Verificação da atividade e da estabilidade biológica da lisozima modificada em
função do pH..................................................................................................................
3.2.9 Verificação da resistência a ação de proteases da lisozima modificada........................
3.2.10 Verificação da estabilidade biológica da lisozima modificada em soro humano..........
3.2.11 Determinação da atividade antimicrobiana da lisozima modificada contra bactéria Gram-negativa E. coli....................................................................................................
53 54 57 58 59 60 61 61
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................ 4.1 Extração e Purificação de Lisozima................................................................................... 4.2 Efeito da proporção mPEG succinimidil succinato 5000, 2000 Da e mPEG-p- nitrofenil carbonato 5000 no grau de substituição da lisozima...........................................
4.3 Influência do tempo no grau de substituição da lisozima................................................... 4.4 Isolamento da lisozima modificada.....................................................................................
4.5 Verificação da atividade e estabilidade biológica da lisozima modificada em função do
pH........................................................................................................................................ 4.6 Verificação da resistência à ação de proteases da lisozima modificada.............................
4.7 Avaliação da atividade antimicrobiana da lisozima modificada contra bactéria Gram-
negativa E. coli..................................................................................................................
63
63
84 101
108
112 124 130
5. CONCLUSÕES....................................................................................................................... 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................
133 135
ANEXOS...................................................................................................................................... 154
17
1. INTRODUÇÃO
Desde o início da utilização de métodos científicos, várias substâncias biológicas têm
sido purificadas e caracterizadas, muitas delas com propriedades valiosas para uso
farmacêutico e alimentício. A Lisozima (LZ), por exemplo, foi descoberta em 1921 por
Alexander Fleming que a descreveu como um extraordinário elemento bacteriolítico presente
nos tecidos e secreções. Ele nomeou a nova proteína como Lisozima, devido à sua capacidade
de lisar bactérias (liso) e por sua propriedade catalítica (zima, de enzima). Além disso,
Fleming mostrou que seu próprio muco nasal possuía LZ e que inibia o crescimento de
espécies de Micrococcus, verificando portanto, que a LZ era um antibiótico endógeno (inato).
Ele também verificou que a LZ estava presente na lágrima e que na clara de ovo de galinha,
particularmente, havia elevada quantidade dessa proteína (FLEMING, 1922; JOHNSON;
LARSON, 2005; MERLINI; BELLOTTI, 2005).
A LZ foi a primeira enzima cuja seqüência primária de aminoácidos foi determinada e
também foi a primeira enzima que teve sua estrutura determinada por cristalografia de raios-X
(BLAKE et al., 1965; PHILLIPS, 1966). Sua atividade catalítica foi demonstrada em 1966 por
John Rupley, o qual verificou que a lisozima hidrolisa os polissacarídeos da parede de
bactérias, e o seu mecanismo de ação é um dos mais bem compreendidos. Seu substrato é o
peptídeoglicano bacteriano que é composto por unidades de N-acetilglucosamina (NAG) e
ácido N-acetilmurâmico (NAM) que se alternam sucessivamente. A função do
peptídeoglicano é a proteção da membrana celular, conferindo resistência à pressão osmótica
gerada pelo interior da célula (WANG et al., 2000). A enzima cliva especificamente os
oligossacarídeos de N-acetilglucosamina contendo a ligação glicosídica β(1→ 4), Figura 1A.
18
Figura 1A – Representação do substrato da lisozima e seu sítio de clivagem.
19
Várias famílias de lisozimas têm sido encontradas, sendo que todas elas possuem em
comum a propriedade de clivar especificamente a ligação glicosídica β(1→ 4) entre o C-1 do
ácido N-acetilmurâmico e o C-4 do N-acetilglusamina do peptídeoglicano, maior componente
da parede das bactérias Gram-positivas, resultando na lise da célula bacteriana
(SALTON,1957; CHIPMAN; SHARON, 1969; JOLLÈS; JOLLÈS, 1984; MASSCHALCK;
MICHIELS, 2003; POOART et al., 2005; ZHAO et al., 2006).
Em relação à atividade catalítica da LZ estudos de cristalografia de raios-X revelaram
que três resíduos contendo grupo carboxil são encontrados numa fenda profunda no interior
da molécula de LZ, seu sítio ativo, onde se situam principalmente, os resíduos de aminoácidos
catalíticos Glutamato 35 (Glu 35) e Aspartato 52 (Asp 52) (MATSUMURA; KIRSCH, 1996).
O sítio ativo da LZ divide a molécula em dois domínios: domínio-α e domínio-β
(IBRAHIM et al., 2001). Segundo estudos do seu mecanismo de ação (Figura 1B) acredita-se
que o Glu 35 protone a extremidade acetal do substrato e o Asp 52 ionize-se negativamente,
estabilizando o carbocátion resultante (QSABA; KUMAR, 1997).
20
Figura 1B – Mecanismo de hidrólise enzimática da LZ sobre o peptídeoglicano. Os aminoácidos aspartato 52 (Asp 52) e glutamato 35 (Glu 35) representam o sítio catalítico da enzima.
Embora tradicionalmente associada à clara de ovo de diversas aves, como a clara de
ovo de galinha (BERGQUIST, 1993) a LZ encontra-se amplamente distribuída na natureza,
sendo encontrada em muitas outras fontes incluindo látex do mamão, larvas de inseto, leite
eqüino, plantas e fungos (JOLLES; JOLLES, 1984; TRANDER, 1994; LAKHTIN et al.,
1995; ELAGAMY et al., 1996; LOCKEY; OURTH, 1996; NOPPE et al., 1996;
MASSCHALCK et al., 2001). A LZ também está presente no colostro humano, nos tecidos e
secreções de mamíferos, tais como leite, saliva, muco, sangue e lágrima. Também encontra-se
em altas concentrações em macrófagos, leucócitos, monócitos e neutrófilos. Além disso, a LZ
desempenha um importante papel na resposta imune dos organismos às reações inflamatórias
e infecções (JOHNSON; LARSON, 2005).
21
Devido à sua grande diversidade, a LZ (EC 3.2.1.17) está classificada em seis famílias,
sendo que as principais diferenças entre elas estão relacionadas com a estrutura primária
determinada pela composição e seqüência de aminoácidos; propriedades bioquímicas e
antimicrobianas e a seqüência de genes responsáveis pela sua codificação (XUE et al., 2004).
Assim, podemos classificar as lisozimas em: lisozima de galinha ou clássica,
“chicken-type” (C) (CANFIELD, 1963); lisozima de ganso, “goose type” (G)
(GRÜTER et al., 1979; SIMPSON et al., 1980); lisozima bacteriana (autolisinas); lisozima de
bacteriófago T4 “phage-type” (INOUE et al., 1970) e lisozima de plantas (JOLLES, 1996).
Ainda recentemente, foram determinadas lisozima de invertebrados “i-type” como de
moluscos bivalves (BACHALI et al., 2002 OLSEN et al., 2003; TAKESHITA et al., 2003;
ZAVALOVA et al., 2003; BACHALI et al., 2004) e lisozima das secreções de pele de anfíbio
(ZHAO et al., 2006).
A lisozima tipo C tem sido amplamente estudada e várias moléculas estão sendo
purificadas e clonadas (WANG et al., 2005). Há relatos, também, de que a lisozima tipo C, ou
da clara de ovo de galinha, é uma proteína naturalmente encontrada em muitos outros
organismos como: vírus, bactérias, plantas, insetos, répteis, aves e mamíferos (OSMAN et al.,
1995; WANG et al., 2005).
22
1.1 Lisozima da clara de ovo de galinha
Aproximadamente 3.5% do total de proteína presente na clara de ovo de galinha
correspondem a lisozima (ALDERTON et al., 1945; YAMAMOTO et al., 1997; SOFOS et
al., 1998; GHOSH; CUI, 2000). A LZ (Figura 2) é uma proteína globular que possui uma
cadeia simples de 129 aminoácidos interligada por quatro pontes dissulfetos (JOLLES et al.,
1963; PHILLIPS, 1966; JOLLES, 1996), possui massa molecular em torno de 14.4 kDa e pI
em torno de 11 (PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988; MASSCHALCK; MICHIELS, 2003;
MINE et al., 2004). A atividade enzimática da molécula é perdida se pelo menos duas das
pontes dissulfetos não estiverem intactas, ou se todas estiverem reduzidas (WANG; SHELEF,
1992; PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988). A LZ possui ainda um centro hidrofóbico com
cadeias de aminoácidos hidrofílicos na superfície, conferindo estabilidade à molécula
(PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988).
Figura 2 – Representação estrutural da lisozima da clara de ovo de galinha (PDB, 1AZF). O esquema demonstra a estrutura dos dois domínios da proteína. O domínio-α (a direita da seta maior) e o domínio-β (a esquerda da seta). O sítio ativo localiza-se na fenda entre os dois domínios (seta). (Adaptado de SETHURAMAN et al., 2004).
23
A lisozima é um dos componentes da clara do ovo que há mais tempo vem sendo
comercialmente utilizado. Vários métodos de purificação já foram descritos (MEYER et al.,
1936; ALDERTON et al., 1945). A LZ que é comercializada para uso em alimentos é obtida
com alto rendimento, mas com baixo grau de pureza, utilizando resinas de troca iônica. Sua
alta afinidade por resina catiônica é devido ao seu pI em torno de 11 que lhe confere um
caráter básico e também devido à sua estrutura monomérica (CUNNINGHAM et al., 1991). A
LZ é eluída da resina utilizando NaCl e é recuperada como sal de hidrocloreto. Após a
extração da LZ, a clara de ovo conserva suas propriedades funcionais e nutricionais sendo
utilizada em alimentos. A LZ é geralmente usada como sal de hidrocloreto, o qual é
facilmente solúvel em água e tampões. O cloridrato de lisozima é um pó branco e apresenta
sabor levemente doce (JOHNSON; LARSON, 2005).
Assim, com objetivo de se obter LZ com maior grau de pureza partir da clara de ovo
de galinha, tem-se usado uma combinação de processos convencionais tais como precipitação,
centrifugação e adsorção (IMOTO et al., 1972).
A purificação da LZ por uma ou muitas etapas cromatográficas também tem sido
descrita (MING et al., 1993; AWADÉ et al., 1994; MCCREATH et al., 1997). Além disso,
tem-se discutido, a purificação direta de LZ a partir da clara de ovo usando um sistema
contínuo de contra-corrente, cromatografia de leito expandido (OWEN;CHASE, 1997). Outra
técnica empregada é a ultrafiltração que apresenta alta seletividade no fracionamento das
proteínas. O processo é baseado na porosidade da membrana de ultrafiltração, fornecendo um
produto com alta pureza. É um processo mais facilmente escalonável em comparação a
cromatografia e eletroforese (GHOSH; CUI, 2000).
24
1.1.2 Aplicações da Lisozima
Além de ser extensivamente utilizada como modelo para estudos estruturais
(estrutura/atividade) e de estabilidade (KHECHINASHVILI, 1990; MASUMOTO et al.,
2002; ELKORDY et al., 2004; SETHURAMAN et al., 2004; MERLINI; BELLOTTI., 2005),
a LZ apresenta também significativo potencial de uso na indústria alimentícia, farmacêutica e
cosmética (MINE et al., 2004).
A LZ possui várias propriedades bioquímicas desejáveis para uso como conservante
alimentar : é estável sob muitas condições tipicamente encontradas nos alimentos, é altamente
solúvel em meio aquoso (RAZAVI-ROHANI; GRIFFITHS, 1996b), apresenta baixa
toxicidade, especificidade de ação contra bactérias Gram-positiva e fungos, além de
apresentar baixo impacto sobre as qualidades sensoriais dos alimentos (SOFOS et al., 1998).
Numerosas patentes japonesas asseguram o uso da lisozima como conservante em
alimentos como legumes em conserva, carnes, frutos do mar, tofu, queijos, manteiga e
alimentos infantis (CUNNINGHAM et al., 1991; TRANTER, 1994; SOFOS et al., 1998).
No saquê, bebida japonesa, contendo 20% de álcool, a lisozima (10 a 20 µg/mL) foi
estável por 20 semanas a 37 °C (YASHITAKE; SHINICHIRO, 1977), por 1 ano a
temperatura ambiente (UCHIDA et al., 1972), e durante a pasteurização a 65 °C de
1 a 5 horas (UCHIDA et al., 1972, YASHITAKE; SHINICHIRO, 1977). Assim, a lisozima
tem sido empregada no Japão para estender o tempo de prateleira do saquê e do vinho
(TRANTER, 1994; GERBAUX et al., 1997; SOFOS et al., 1998).
Nos EUA também encontramos um número significativo de patentes que asseguram o
uso de lisozima em alimentos. Essas patentes incluem o tratamento de L. monocytogenes com
uso de lisozima em laticínios e carne; LZ e EDTA em frutas e legumes; e combinação nisina e
lisozima como ingredientes ou para aplicar na superfície de alimentos sólidos. Existe uma
outra patente que cobre o uso de lisozima ou sal não tóxico de lisozima juntamente com
25
quelantes como EDTA para controlar o crescimento de Clostridium botulinum em alimentos
animais ou frutas e legumes. A LZ adicionada às fórmulas infantis ou ao leite promove o
crescimento de espécies de Lactobacillus e Bifidifobacterium bifidus no intestino de crianças
as quais podem prevenir o crescimento de bactérias nocivas (JOHNSON; LARSON, 2005).
O uso de lisozima na superfície de contato dos alimentos pode prevenir a colonização
de patógenos tais como L. monocytogenes, bem como, outras bactérias que formam biofilme
(BROWER et al., 1998).
A aplicação farmacêutica da LZ está relacionada com a sua capacidade de ser um
efetivo agente imunológico, sendo chamada de “antibiótico endógeno” e utilizada portanto, no
tratamento de infecções bacterianas e virais. Além de ser utilizada no tratamento de resfriados
e preventivo de problemas bucais como periodontite (PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988).
Em estudos recentes têm-se verificado a atividade anti-HIV da LZ assim como, RNase
A e RNase U (urinária) que degradam seletivamente o RNA viral, o que abre perspectivas
interessantes no tratamento de infecção por HIV (SAXENA et al., 1996; LEE-HUANG et al.,
1999; STEINRAUF et al., 1999; LEE-HUANG et al., 2005).
A LZ também tem sido empregada como auxiliar de diagnóstico e como marcador em
terapias agudas e crônicas de infecções do trato urinário. A determinação de LZ no fluído
cerebroespinhal e soro sanguíneo é muito útil para diferenciar entre meningite bacteriana da
não bacteriana e infecções em geral (PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988).
Uma outra interessante aplicação de LZ é a sua utilização em ensaios
imunoenzimáticos devido à sua alta especificidade em relação ao seu substrato (Micrococcus
lysodeikticus) que confere uma ideal capacidade para medir os níveis de metabólicos de
estradiol ovariano e progesterona na urina (SAID; PIETRO, 2002). Por isso, a LZ tem sido
utilizada em um dispositivo que permite monitoramento do ciclo menstrual feminino
identificando o período fértil (SMALES et al., 1999).
26
A LZ pode ser associada a outros antibióticos. Quando associada a certos antibióticos
como amoxicilina, a LZ apresenta um efeito sinérgico, por outro lado, quando associada à
polimixina, neomicina ou canamicina a LZ é inibida. Em produtos cosméticos a LZ tem sido
utilizada em formulações por facilitar a cicatrização de feridas e por prevenir contra infecções
bacterianas. Encontramos também alguns enxaguatórios bucais e dentifrícios que contém LZ
pois, essa enzima atua impedindo a formação de placa dentária, aumentando a defesa das
mucosas (PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988).
1.1.3 Estratégias para ampliar o espectro de ação antimicrobiano da Lisozima
Os microrganismos estão co-evoluindo com os humanos e animais e na maioria das
vezes essa relação é simbiótica. Contudo, quando existe uma competição, por exemplo
doenças, tanto os microrganismos como os humanos tem a oportunidade de desenvolver
estratégias de defesa. As bactérias selecionadas apresentam continuamente resistência a
agentes antimicrobianos alcançando níveis alarmantes. Essa situação está sendo considerada
atualmente um dos maiores problemas de saúde pública. Dessa forma, para a segurança de
drogas e sistemas alimentares, existe a profunda necessidade de desenvolver continuamente
novos agentes antimicrobianos (BERNKOP-SCHURCH et al., 1998; IBRAHIM et al., 2002;
MCPHEE; HANCOCK, 2005).
Os principais fatores que devem ser considerados quando selecionamos um antibiótico
incluem: o espectro de ação e as propriedades físico-químicas do composto, além da
segurança e eficácia contra o microrganismo presente. Dificilmente, essas características são
encontradas em um único antibiótico, por isso, a necessidade de novas estratégias para
garantir um bom desempenho dos agentes antimicrobianos (IBRAHIM et al., 2002)
A LZ é uma proteína antimicrobiana que ocorre na natureza e tem sido utilizada
amplamente. Contudo, o mecanismo de ação da LZ é limitado a certas bactérias Gram-
27
positivas como Staphylococcus aureus, Micrococcus lysodeikticus, Micrococcus luteus,
Bacilulus cereus, Bacillus stearothermophilus, Clostridium thermosaccarolyticum e
Clostridium tyrobutyricum. Bactérias Gram-negativas, as quais são as responsáveis por um
terço de todas as infecções bacterianas, são resistentes à ação lítica da lisozima (WILD et al.,
1997; PROCTOR; CUNNINGHAM, 1988; MASSCHALCK et al., 2000; IBRAHIM et al.,
2001; IBRAHIM et al., 2002; TOUCH et al., 2003; MASSCHALCK; MICHIELS, 2003;
MINE et al., 2004; BRANEN; DAVIDSON, 2004; XU et al., 2004; VANNINI et al., 2004).
A resistência das bactérias Gram-negativas a ação lítica da LZ ocorre devido à
parede externa dessas bactérias. A camada externa da parede das bactérias Gram-negativas é
formada por uma estrutura membranosa composta por 20% de fosfolipídios, 50% de proteínas
e 30% de lipopolissacarídios (LPS) (COSTERTON, 1974). Portanto, para a LZ atuar com
atividade lítica efetiva contra a bactéria Gram-negativa ela deve atravessar a barreira de LPS,
atingindo a camada de peptídeoglicano que nas bactérias Gram-negativas é menos espessa do
que a camada presente nas bactérias Gram-positivas (Figura 3).
28
Figura 3 – Comparação entre as estruturas da membrana celular de bactérias Gram-positiva e Gram-negativa (Adaptado de IBRAHIM et al., 2002).
Assim, apesar desse tópico ser um tanto controverso, vários estudos estão sendo
realizados com o objetivo de se compreender melhor como aumentar a capacidade lítica da
LZ na ação com eficácia sobre a parede de bactérias Gram-negativas .
Membrana externa
Peptídeoglicano
Periplasma
Membrana citoplasmática
(8 nm)
Gram-positiva
PORINA
(8 nm)
Gram-positiva Gram-negativa
29
Recentemente, alguns trabalhos demonstraram existência de uma ação antimicrobiana
da LZ por mecanismo não enzimático e/ou lítico. Essa atividade está relacionada com a
existência de peptídeos catiônicos. Os peptídeos catiônicos são um importante componente do
sistema imune inato de uma ampla variedade de plantas, animais e bactérias
(POWERS; HANCOCK, 2003; MCPHEE; HANCOCK, 2005; HUNTER et al., 2005).
O termo peptídeo catiônico antimicrobiano é classicamente aplicado a um peptídeo que
possui uma cadeia com menos de 50 aminoácidos com carga positiva variando de +2 a +10
devido à presença de resíduos de lisina e/ou arginina e uma porção substancial (mais de 50%)
de resíduos hidrofóbicos. Esses peptídeos (Figura 4) podem apresentar atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e protozoários
(POWERS; HANCOCK, 2003). O peptídeo irá adotar uma estrutura anfipática ou anfifílica
em cada solução ou mais tipicamente, quando interage com as membranas celulares. Esse
atributo é considerado crucial para atividade, porque, na maioria dos casos, o peptídeo
catiônico deve interagir com a membrana biológica obrigatoriamente para exercer sua
atividade.
30
Figura 4 – Mecanismo proposto para interação de peptídeos catiônicos antimicrobianos com a
parede da célula de bactéria Gram-negativa. Esse mecanismo sugere que a passagem
através da membrana externa da célula ocorra pelo reconhecimento de um promotor
próprio do peptídeo catiônico. De acordo com essa hipótese sugere-se que ocorra
uma interação entre as cargas positivas do peptídeo com as cargas negativas da
superfície da membrana externa da bactéria, neutralizando a superfície externa da
bactéria promovendo assim, formação de fendas, através das quais o peptídeo
atravessa a membrana externa alcançando o citoplasma da célula (Adaptado de
POWERS; HANCOCK, 2003).
Nesse sentido, existem evidências que asseguram a presença de peptídeos catiônicos
nos sistemas de defesa, que agindo sinergisticamente com a LZ são capazes de uma ação
antimicrobiana em modelos animais (HANCOCK; SCOTT, 2000; MASSCHALCK;
MICHIELS, 2003), podendo induzir uma ação bactericida por mecanismo não enzimático
e/ou lítico (MINE et al., 2004).
Além disso, alguns peptídeos catiônicos antimicrobianos estão sendo isolados da própria
LZ. Foi observado por microscopia eletrônica que a LZ de galinha e de bacteriófago T4
contém um domínio, com uma seqüência de peptídeos, que pode ser liberada pela digestão
proteolítica da LZ nativa, a qual é capaz de atravessar a membrana da bactéria Gram-negativa.
Membrana externa
Membrana citoplasmática
31
Estudos têm demonstrado que esses peptídeos apresentam acentuada atividade
antibacteriana sobre E. coli e S. aureus, danificando a membrana celular de ambas as espécies
(PELLEGRINI et al., 1997; DURING et al., 1999; IBRAHIM et al., 2001; MINE et al.,
2004). Assim, foi observado também que tanto uma seqüência de 15 aminoácidos (98-112)
isolados da LZ da clara de ovo de galinha, como uma seqüência sintetizada idêntica a esse
peptídeo apresentou atividade antimicrobiana sem apresentar atividade catalítica
(PELLEGRINI et al., 1997). Isso abre possibilidade para que nos próximos anos a engenharia
de proteínas possa levar a otimização de fragmentos de peptídeos como agentes
antimicrobianos (DURING et al., 1999).
Para ampliar a ação bacteriana da LZ em relação a bactérias Gram-negativas e
patógenos de origem alimentar, os pesquisadores estão realizando diversos estudos com a LZ.
Como por exemplo, utilizando-a parcialmente desnaturada, ou mesmo totalmente desnaturada
(IBRAHIM et al., 1996a; IBRAHIM, 1996b); liofilizada e ligada a diferentes e extensas
cadeias de ácidos graxos (IBRAHIM et al.,1991; IBRAHIM et al., 1993; LIU et al., 2000) e,
com a inserção de peptídeos hidrofóbicos ou hidrofílicos no C-terminal da LZ por
modificação genética (IBRAHIM et al., 2001; ARIMA et al., 1997; XU et al., 2004).
Alguns trabalhos demonstraram que certas tentativas de ampliar o efeito antimicrobiano
da LZ, principalmente contra bactérias Gram-negativas, conservam completamente, ou com
uma pequena perda, a atividade da LZ contra bactérias Gram-positivas (MINE et al., 2004).
Além disso, o efeito sinérgico da LZ com outros conservantes, ou associados com outros
procedimentos que envolvem determinadas condições de pH e temperatura , tem resultado em
uma significante melhora no seu espectro de ação. Em muitos casos, a combinação de LZ com
alguns conservantes naturais tais como: nisina, lactoferina, glicina, ácidos orgânicos, tripsina,
aprotinina e gelatina, bem como, alta pressão e eletroporação, tem tido um desempenho
melhor em relação à enzima sozinha (JOHNSON, 1994; HAUBEN, 1996; SOFOS et al.,
32
1998; CHUNG; HANCOCK, 2000; MASSCHALCK et al., 2001; LIANG et al., 2002;
MASSCHALCK et al., 2003; MINE et al., 2004).
Outras estratégias que estão sendo aplicadas com a finalidade de aumentar a capacidade
antimicrobiana da LZ envolvem o uso de permeabilizadores de membrana tais como alguns
agentes quelantes como EDTA, que torna suscetível certas bactérias Gram-negativas à ação
da LZ (SAMUELSON et al., 1985); Tratamento de congelamento e descongelamento de
E.coli torna essa bactéria susceptível a LZ. O choque osmótico torna certas bactérias Gram-
negativas, incluindo Salmonella, susceptível a LZ (MINE et al., 2004). A conjugação da LZ
com dextrano tem mostrado aumentar sua atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, particularmente se a temperatura está elevada durante o tratamento (NAKAMURA
et al., 1991; NAKAMURA et al., 1992). Além disso, apesar de pouco explorado, existem
alguns estudos que evidenciam o aumento da atividade lítica da LZ após modificação química
com metoxipolietilenoglicol (mPEG) (NODAKE; YAMASAKI, 2000; NODAKE et al.,
2002).
1.1.4 Perfil mercadológico da Lisozima
O mercado mundial de enzimas é superior a cinco bilhões de dólares, desses, dois
bilhões correspondem ao mercado de enzimas industriais (enzimas técnicas, enzimas para
indústrias de alimentos e enzimas para ração animal) e três bilhões o de enzimas especiais
(enzimas terapêuticas, enzimas para diagnósticos e enzimas para química quiral). Por outro
lado, o mercado brasileiro, em 2005, foi avaliado em US$ 147,2 milhões (3% do mercado
internacional), sendo que 20,6 milhões em exportações e 126,6 milhões em importações,
considerando-se enzimas industriais e terapêuticas, medicamentos contendo enzimas e kits de
diagnóstico a base de enzimas. Assim, desse total de US$ 147,2 milhões, 86% correspondem
33
à importações, indicando grande desvantagem tecnológica e estratégica do Brasil
(BON, E.P.S., 2006).
Os dados de importação e exportação do mercado externo da enzima antibiótica
Lisozima (NCM é 3507.90.31) fornecidos pelo Ministério do Desenvolvimento, Indústria e
Comércio Exterior, apontam majoritariamente para importações em todo o período avaliado.
As quantidades importadas foram aproximadamente estáveis até 2003 (Figuras 5 e 6) entre 2 e
3 ton/ano, decaindo fortemente nos anos seguintes para 1 ton em 2004 e 0,16 ton em 2005,
correspondendo a uma faixa de importação anual entre US$ 141 mil a US$ 214 mil/ano até
2004 e caindo para US$ 26 mil/ano em 2005. Nesse ano, o Brasil importou a enzima
principalmente da Suíça, Alemanha e Itália, a um preço que variou entre US$ 158,00 a
US$ 247,00/kg.
Apesar de não produzir essa enzima, o Brasil exportou o produto para países como
Argentina, Chile e Costa Rica em 2003 e 2004. Não houve exportação para o ano de 2005
(http// www. aliceweb.desenvolvimento.gov.br).
Figura 5 – Dados de importação e exportação da lisozima e de seu cloridrato por
peso líquido (ton).
34
Figura 6 – Dados de importação e exportação da lisozima e seu cloridrato por valores
FOB (103 US$).
Dessa forma, a determinação de uma metodologia simples e direta capaz de obter
lisozima de uma maneira eficiente, seria uma ferramenta importante, uma vez que essa é uma
enzima de grande interesse econômico, tanto para o mercado interno quanto para o externo.
1.2 Modificação química de proteínas com polietilenoglicol (PEG) -“Pegylated proteins”
O uso de proteínas, enzimas e peptídeos como agentes terapêuticos tem-se expandido
nos últimos anos. Essa nova tendência deve-se principalmente a descoberta de novos
peptídeos e proteínas; ao melhor entendimento dos mecanismos de ação “in vivo”; ao
aperfeiçoamento de técnicas envolvidas na expressão ou síntese de proteínas e peptídeos
semelhantes às proteínas e peptídeos de humanos; e ao desenvolvimento de sistemas de
liberação de proteínas e peptídeos “in vivo”, visando melhorar suas propriedades
farmacocinéticas e farmacodinâmicas (ROBERTS et al., 2002).
35
Nesse sentido, surgiram estratégias para modificação de proteínas que não afetam
muito a sua atividade e ao mesmo tempo diminuindo ou mesmo suprimindo os problemas
típicos relacionados às proteínas e polipeptídeos terapêuticos. As principais limitações
apresentadas pelas proteínas terapêuticas envolvem o curto tempo de meia vida e sua
imunogenicidade, o que dificultam sua aplicação, principalmente na forma de terapia
injetável. A degradação protéica frente ao pH, temperatura e ação proteolítica associada à
baixa solubilidade, também são sérios fatores limitantes.
Assim, algumas estratégias estão sendo utilizadas para minimizarem esses fatores
limitantes como: a manipulação da seqüência de aminoácidos para diminuir a
imunogenicidade e a degradação proteolítica; fusão ou conjugação de imunoglobulinas e
proteínas do soro sanguíneo, como a albumina; incorporação de veículos para proteção e
liberação controlada; conjugação da proteína a polímeros naturais ou sintéticos; e técnicas
para alterar quimicamente as proteínas através de síntese orgânica (ABUCHOWSKI et al.,
1977a; COHEN et al., 1991; JANECEK, 1993; LYCZAK; MORRISON, 1994; HOLLE,
1997; SYED et al., 1997; MATSUMOTO et al., 1997; LONG; COMBES, 1999;
MOLINEAUX, 2003).
Diante dos bons resultados demonstrados com a aplicação de proteínas modificadas, a
atenção dos pesquisadores voltou-se para a conjugação de proteínas e peptídeos ao polímero
sintético polietilenoglicol (PEG). Atualmente, emprega-se para esses compostos e o
procedimento envolvido o nome de “Pegylated proteins” ou simplesmente peglação
“pegylation” (VERONESE et al., 1984; INADA et., 1994; ZHANG et al., 1999; ROBERTS
et al., 2002; MATSUMOTO et al., 2002; CALCETI; VERONESE, 2003; ZHANG et al.,
2004; HAAG; KRATZ, 2006).
36
A tecnologia de “PEGylation” pode ser definida como a modificação química de uma
proteína ou peptídeo, por meio de ligação covalente a uma ou mais cadeias de
polietilenoglicol (PEG). As propriedades que a proteína pode obter com a “PEGlação”
(Figura 7) incluem: a diminuição da imunogenicidade e antigenicidade, aumento no tempo de
meia vida, devido à redução da filtração renal e maior estabilidade, por isso, essa técnica
demonstrou resultados importantes para terapias com uso de proteínas, biocatálise orgânica e
uso em diagnósticos (INADA et al., 1994; VERONESE et al., 1996; ROBERTS; HARRIS,
1998; SO et al., 1999; HARRIS et al., 2001; GREENWALD et al., 2003; YANG et al., 2004;
YUN et al., 2005).
Figura 7 – Principais características da proteína “peglada” (adaptado de VERONESE; PAUST, 2005).
Aumento da solubidade devido à hidrofilicidade do
PEG
Diminuição da acessibilidade de
enzimas proteolíticas e
anticorpos
Aumento do tamanho para
reduzir a filtração renal
Proteína
37
A “PEGlação” teve início no laboratório do Professor Frank Davis na década de 70
(DAVIS, 2002) juntamente com Abuchowsky que modificou a albumina e a catalase
(ABUCHOWSKI et al., 1977a; ABUCHOWSKI et al,. 1977b). Até então, nenhuma enzima
havia sido modificada tão extensamente, mantendo a atividade enzimática. Naquela época, as
proteínas eram consideradas estruturas delicadas e somente modificações suaves e com
produtos de baixo peso molecular poderiam ser empregados (VERONESE; PAUST, 2005).
Desde então, a reação de “PEGlação” como foi inicialmente descrita tem se
desenvolvido e expandido, existindo atualmente uma ampla variedade de métodos químicos e
enzimáticos para conjugação de PEG a proteínas, enzimas ou peptídeos (HERSHFIELD et al.,
1991; MONFARDINI et al., 1995; BENTELEY et al., 1998; LEE et al., 1999; SCHIAVON
et al., 2000; TOPCHIEVA et al., 2000; VERENOSE et al., 2001; LEE et al., 2001;
KINSTLER et al., 2002; SATO, 2002; CAZALIS et al., 2004; GREENWALD et al., 2004;
LELE et al., 2005).
1.2.1 Aspectos químicos envolvidos na tecnologia de PEGlação
As principais variáveis estudadas na obtenção de um derivado protéico complexado ao
polietilenoglicol (PEG) são o grau de substituição nos resíduos dos aminoácidos alvo da
proteína, o comprimento e as características das cadeias de PEG. Assim, o efeito específico da
“PEGlação” sobre as propriedades físico-químicas e biológicas da proteína é determinado
pelas propriedades da proteína, do polímero, bem como, pela estratégia de “PEGlação”
(CALICETE; VERONESE, 2003).
38
1.2.2 Propriedades do polietilenoglicol - PEG
O PEG é comumente encontrado na forma linear ou poliéter ramificado, com grupos
hidroxil, tendo a seguinte estrutura geral:
HO-(CH2CH2O)n- CH2CH2-OH
O PEG mais utilizado para modificação de proteínas e polipeptídios é o
monometoxipolietilenoglicol, mPEG, que possui a seguinte estrutura geral:
CH3-(CH2CH2O)n- CH2CH2-OH
O PEG é um polímero sintético biocompatível podendo ser utilizado como aditivo de
medicamentos em xaropes, cremes, pomadas, comprimidos e como veículo de produtos
injetáveis, tanto de aplicação intramuscular como endovenosa. O PEG tem sido utilizado em
produtos farmacêuticos desde 1970 quando foi aprovado pelo F.D.A (Food and Drugs
Administration) devido à sua baixa toxicidade. Assim, o PEG não é tóxico com massa
molecular acima de 1.000 Da e polímeros de 4.000 Da ainda são seguros quando
administrados por via endovenosa. Esse polímero pode apresentar vários graus de
polimerização, como por exemplo temos o PEG 80 que é líquido e o PEG 5000 que é sólido
(DUCAN; SPREAFICO, 1994; WORKING et al., 1997).
Comparado com outros polímeros, o PEG apresenta uma estreita faixa de
polidispersão (Mw/Mn) de 1.01 para PEGs com pequena massa molecular (< 5 kDa) e de 1.1
para PEGs com elevada massa molecular (> 50 kDa). Esses valores de polidispersão
garantem uma maior homogeneidade do polímero (ROBERTS et al., 2002).
A mais importante propriedade do PEG é ser anfifílico, ou seja, solúvel em água,
tolueno,1,1,1-tricloroetano e benzeno. Isso permite que o PEG seja empregado na conjugação
de biomoléculas sob condições fisiológicas. Assim, quando o PEG é adequadamente ligado a
uma biomolécula, ele modifica muitas de suas características, enquanto suas principais
39
funções biológicas, tais como atividade enzimática ou reconhecimento de receptor são
mantidos. A conjugação ao PEG mascara a superfície das proteínas e aumenta o tamanho
molecular do composto; reduz sua filtragem renal; impede a aproximação de antígenos ou
anticorpos e reduz a degradação da mesma por enzimas proteolíticas. Por fim, o PEG
transfere suas propriedades físico-químicas para moléculas, modificando sua biodistribuição e
solubilidade de drogas peptídicas e não peptídicas. Essas propriedades permitem o surgimento
de novas técnicas na biocatálise e na tecnologia farmacêutica, onde muitas drogas insolúveis
são solubilizadas através da conjugação ao PEG, sendo dessa forma, mais facilmente
administradas (VERONESE et al., 2001).
1.2.3 A química da reação de PEGlação
A maioria das aplicações de conjugação de PEG envolve moléculas lábeis,
consequentemente, essa reação requer condições brandas de temperatura e pH (CALICETI et
al., 1999). Além disso, para conjugarmos o polímero (PEG) a cadeia da molécula de
proteínas, polipeptídios, enzimas ou pequenas moléculas orgânicas, é necessário ativar o PEG
pela preparação de um derivado de PEG que tenha pelo menos um grupo funcional reativo em
sua cadeia. Esse grupo funcional deve atuar como ponto de ligação para a proteína e deve ser
escolhido baseando-se no tipo de ligante que estará disponível na molécula protéica.
Assim, nas proteínas, os aminoácidos tipicamente reativos que se ligam ao mPEG
incluem: lisina, cisteína, treonina, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina
tirosina, N-terminal e o ácido carboxílico C-terminal. No caso de glicoproteínas, grupos
hidroxil vicinais podem ser oxidados (ROBERTS et al., 2002).
A rota mais comum para a conjugação de PEG às proteínas tem sido ativar o PEG com
grupos funcionais apropriados para reagirem com os radicais de lisinas e N-terminal. Isso
40
porque, a lisina é um dos mais prevalentes aminoácidos nas proteínas e pode até superar 10%
de todos os aminoácidos presentes em uma proteína (ROBERTS et al., 2002). Como exemplo,
podemos observar na Figura 8, os resíduos de lisina disponíveis na lisozima de clara de ovo
de galinha para a reação de “PEGlação”.
Figura 8 - Estrutura tridimensional da lisozima da clara de ovo de galinha: representação esquemática
da lisozima em duas diferentes orientações. (A) região correspondente ao sítio catalítico da
lisozima. (B) diferente posição de A, com giro de 180 graus sobre o eixo X. Os resíduos de
lisina (LYS) estão representados em azul; os grupos ε-aminos dos resíduos de lisina estão
em amarelo. Os resíduos catalíticos Glu35 e Asp52 estão representados em verde
(MASUDA et al., 2005).
Portanto, quando temos o PEG eletrofilicamente ativado, a reação de “PEGlação” vai
ocorrer entre o polímero ativado e os aminoácidos com caráter nucleofílico. Nesse caso, é
comum acontecer a substituição de vários resíduos de lisina. Essa heterogeneidade na
substituição dos resíduos de lisinas e a massa molecular do PEG ativo são responsáveis pelas
propriedades físico-químicas e biológicas do conjugado PEG-proteína, pois se o grau de
modificação for alto isso acarreta um aumento no tempo de meia vida e reduz a
antigenicidade da proteína (CLARK et al., 1996).
41
Os derivados de PEG mais utilizados para reagirem com aminoácidos de lisina e N-
terminal das proteínas estão representados na Figura 9. Eles possuem massa molecular
pequena, suas ligações são instáveis e apresentam pouca seletividade na modificação. Assim,
temos como exemplos de PEG derivados: PEG diclorotriazina; PEG tresilato; PEG
succinimidil carbonato; PEG benzotriazol; PEG p-nitrofenilcarbonato e PEG succinimidil
succinato (VERONESE, 2001; ROBERTS et al., 2002).
Figura 9 – Representação da reação de “PEGlação” de grupos H2N-R com alguns derivados de PEG. (a) ácidos
alquila ativados: compostos altamente reativos em direção ao grupos alcenos. (b1) PEG-p-
nitrofenilcarbonato; (b2) PEG-triclorofenilcarbonato; (c1) PEG-oxicarbonilimidazol e (c2) PEG-
benzotriazol carbonato (Adaptado de VERONESE, 2001).
42
Assim, com o desenvolvimento da técnica de “PEGlação”, é possível escolher quais
as melhores condições para o procedimento de “PEGlação” e qual PEG deve ser empregado.
Dependendo da escolha do PEG, pode-se realizar uma ligação sítio-específica, com
propriedades mais interessantes para o composto PEG-proteína (HERSHFIELD et al., 1991;
KINSTLER et al., 2001; VERONESE et al., 2001; CAZALIS et al., 2004; NA et al., 2005).
1.2.4 Caracterização do metoxipolietilenoglicol (mPEG) conjugado
O PEG solubilizado é transparente, sem características de fluorescência e não
detectável. Em função disso, muitos métodos estão sendo empregados para a caracterização
do grau de “PEGlação” de proteínas.
A técnica mais utilizada envolve a titulação colorimétrica de grupos amina não
conjugados. Essa técnica, contudo não permite o conhecimento exato dos números de cadeias
poliméricas ligadas ao peptídeo ou à proteína (HABEEB, 1965, BALLICO et al., 2005).
Existem outras técnicas, mas também apresentam algumas limitações como a iodinização
do PEG que é pouco sensível; a cromatografia de gel permeação, que possui o problema da
diferença hidrodinâmica entre o PEG e a proteína tornando-se difícil a caracterização, através
do tempo de retenção no processo cromatográfico; método colorimétrico pelo TNBS
(HABEEB, 1965; COOK et al., 1997) que determina a concentração de grupamentos aminas
livres na proteína e deve ser ajustado à concentração inicial na proteína.
Um método alternativo que tem sido empregado é a espectroscopia de massa, porém,
esse é um teste qualitativo e não indica o grau de substituição. Outros testes utilizados são
eletroforese capilar, cromatografia de alta performance (HPLC) e eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS). Esses métodos, apesar de serem frequentemente utilizados, apresentam
43
limitações em relação a carga, massa molecular e a hidrodinâmica da proteína “peglada”
(VERONESE, 2001).
1.2.5. Propriedades terapêuticas do metoxipolietilenoglicol (mPEG)
Devido à série de benefícios que a “PEGlação” assegura às proteínas ou enzimas
como: manter a atividade enzimática; reduzir a imunoreatividade; reduzir a imunogenicidade
e prolongar o tempo de eliminação, várias classes de proteínas terapêuticas como enzimas,
citoquinas e anticorpos estão sendo aplicadas no tratamento de certas doenças com melhor
desempenho após serem “pegladas”.
Além disso, proteínas modificadas também podem ser empregadas associadas com
outros agentes como imunossupressores em transplantes e estão sendo usadas com sucesso
como drogas anti-tumorais devido à ineficiência da quimioterapia e radioterapia tradicionais
as quais são inespecíficas (VERONESE; PAUST, 2005; HAAG; KRATZ, 2006).
Existe uma série de produtos aprovados pelo FDA (Tabela 1), como PEG-
asparaginase (Oncaspar®) disponível no mercado desde 1994 e MacugenTM disponível desde
2004, que demonstra a utilidade da tecnologia de “PEGylation” e sua significativa
contribuição, conferindo um melhor desempenho, viabilizando e ampliando o uso de
peptídeos e proteínas como drogas terapêuticas extremamente importantes.
44
Tabela 1 – Exemplos de proteínas terapêuticas conjugadas ao PEG utilizadas clinicamente.
Conjugado de PEG Tipo de “PEGlação” Doenças
Com proteínas
PEG-asparaginase ( Oncaspar®) Aleatória, PEG linear Leucemia linfoblástica aguda
PEG-adenosina deaminase
( Adagen®)
Aleatória, PEG linear Doenças severas associadas à
imunodeficiência (DSCI)
PEG-interferon α2a (Pegasys®) Aleatória, PEG 40 kDa
ramificado
Hepatite C
PEG-interferon α2b (PEG-Intron®) Aleatória, PEG 12 kDa linear Hepatite C e outras tentativas
de aplicação clínica em
Câncer, Esclerose múltipla,
HIV/AIDS.
PEG-G-CSF (Pegfilgrastim,
Neulasra®)
Específica, PEG 20 kDa linear Tratamento de neutropenia
durante quimioterapia
PEG-receptor antagonista do
hormônio de crescimento
(Pegvisomant, Somavert®)
Aleatória, PEG 5 kDa linear
(proteína modificada
geneticamente)
Acromegalia
Com oligonucleotídeos
PEG ramificado-antiVEGF
(Pegaptanib, MacugenTM)
Específica, PEG 40 kDa
ramificado.
Degeneração macular
(relacionada ao
envelhecimento)
(Adaptado de VERONESE; PAUST, 2005).
Assim, como foi descrito anteriormente, devido ao crescente potencial de uso da
lisozima nas áreas farmacêutica, cosmética e de alimentos, pretendemos nesse trabalho
estabelecer uma metodologia de extração e purificação da LZ simples e direta, além de
estudar sua modificação estrutural por “PEGlação” com PEG ativado de diferentes tamanhos
(5000 e 2000 Da), verificando suas propriedades físico-químicas como pH ótimo e
estabilidade da enzima “peglada”.
45
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
• Extrair e purificar a lisozima (LZ) a partir de clara de ovo de galinha, procurando
estabelecer um processo em que a extração seja seletiva.
• Analisar os efeitos decorrentes da “PEGlação” da LZ em relação à manutenção e/ou
alterações de propriedades físico-químicas tais como estabilidade e resistência à ação
de proteases.
2.2 Objetivos Específicos
• Estabelecer metodologia de extração e purificação da LZ em batelada “batch”, com
resinas de troca iônica, seguida por ultrafiltração a partir da clara “in natura”.
• Determinar a influência da proporção mPEG 5000, mPEG 2000, mPEG-pNP 5000/
proteína no grau de substituição e na atividade enzimática da LZ em relação aos
substratos M. lysodeikticus e Glicol Quitosana.
• Estudar a influência do tempo na reação de “PEGlação” da LZ com os diferentes
mPEG succinimidil succinato de 2 e 5 kDa e mPEG p-nitrofenil carbonato de 5 kDa.
• Verificar a atividade e a estabilidade da LZ modificada em diferentes tampões dentro
da faixa de pH de 4.0 a 12.
• Avaliar a estabilidade da LZ modificada perante a ação de diferentes proteases
bacteriana, fúngica, tripsina e quimotripsina, papaína.
• Avaliar a estabilidade da LZ modificada em soro humano.
• Verificar uma possível atividade antimicrobiana da LZ modificada contra bactéria
Gram-negativa E. coli.
46
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Enzimologia do Departamento
de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
(FCF/USP).
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Aparelhos
As determinações espectrofotométricas foram realizadas em espectrofotômetro
Genesys (modelo 5), acoplado a um banho circulante termostatizado, com uma variação de
temperatura de 1 ºC.
As centrifugações foram realizadas em centrífuga refrigerada Sorvall modelo RC-5C e
U-32 R, Boeco Germany. Quando pequenos volumes de solução foram centrifugados, por
curtos períodos de tempo, foi utilizada uma microcentrífuga Jouan. As determinações de pH
foram realizadas em potenciômetro Radelkis OP-213, munido de microeletrodo. A
condutividade foi determinada pelos condutivímetros CONMET 1 e Digimed DM31.
Na preparação de homogenados foi utilizado um homogeneizador Marconi modelo
T-120. As cromatografias foram realizadas com sistema Econo UV Monitor, Econo Pump
(Bio Rad) acoplado a um coletor de frações ISCO modelo Retriver II. A reação de
“PEGlação” foi realizada em estufa vertical B.O.D. TE (TECNAL).
47
3.1.2 Reagentes
Sephadex G-50, misturas de proteína e marcadores de peso molecular foram
fornecidos pela Amershan Pharmacia Biotec, Uppsala, Suécia. Material descartável: as
ponteiras de 10, 100, 200 microlitros, tubos tipo Eppendorf de 1.5; 0.2 ml, tubos de ensaio,
pipetas descartáveis, tubos tipo Falcon de 15 ml e 50 ml, foram obtidos da Labtrad do Brasil.
Placas descartáveis estéries da Bioplass. Membranas de ultrafiltração de porosidade 5 kDa,
30 kDa e 50 kDa NMWL Ultrafree® MC centrifugal da Amicon Biosepartions Millipore.
Membrana de diálise 12-16000 MW da Viskase Corporation. Padrão de massa molecular
(Prestained Protein MW Maker) da Fermentas, GELCODE Blue Stain Reagent da Pierce.
Resinas de troca iônica, cubetas plásticas descartáveis, albumina sérica bovina, lisozima, azul
brilhante G de Coomassie e metoxipolietilenoglicol (mPEG) ativado, Glicol Quitosana foram
fornecidos pela Sigma Chemical Company. Proteomix (quimotripsina, tripsina) da Biobrás;
Protex 6L (protease bacteriana) e Protease fúngica da Genecor International; Neutrase
(protease bacteriana) da Novo Industrial e papaína (Merck). Cepa de Escherichia coli ATCC
25922 e soro humano foram fornecidos pelo Departamento de Análises Clínicas da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas FCF/USP. Todos os outros reagentes e solventes da marca Merck,
grau analítico - Quimitra do Brasil, RJ, Brasil.
48
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Medida da concentração de proteína pelo método de Bradford
A quantificação de proteína foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD,
1976). O procedimento de Bradford é baseado na ligação do corante azul brilhante G-250, à
proteína que causa uma mudança no pico de absorbância do corante de 465 para 595 nm. A
mudança da cor se desenvolve em 2 minutos e se mantém por mais de uma hora. Dessa forma,
foi preparada uma curva padrão de lisozima, a 595 nm em espectrofotômetro. Quantidades
apropriadas das amostras, devidamente diluídas, foram adicionadas a água deionizada mais
200 µL de reagente corante azul brilhante G-250 perfazendo um volume final de 1 mL. Após
20 minutos foi realizada a leitura a 595 nm, e a partir da curva padrão de lisozima
determinou-se à quantidade de proteína presente em cada amostra.
3.2.2 Ensaios Enzimáticos
A medida da atividade enzimática foi determinada a partir do método turbidimétrico
(SHUGAR, 1952) que mede a velocidade de lise da parede das células de Micrococcus
lysodeikticus. Quantidades apropriadas das amostras, devidamente diluídas, foram
adicionadas à cubetas plásticas contendo 1 mL de suspensão de Micrococcus lysodeikticus
(0.5 mg/mL) em tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7.0, provocando a lise celular. A
taxa de lise foi acompanhada por espectrofotometria a 450 nm. Uma unidade (UI) é igual ao
decréscimo na absorbância de 0.001 por minuto nas condições do ensaio. A atividade
específica de cada amostra foi calculada a partir do quociente entre as unidades enzimáticas
totais (UI) e a quantidade de proteína (mg). Onde:
Aespecífica = Atividade x 1000_
Massa de Proteína (mg)
49
A medida da atividade enzimática da lisozima ou lisozima modificada também foi
determinada sobre o substrato Glicol Quitosana (IMOTO; YAGISHITA, 1971). Para 1 mL de
uma solução 0.05% de Glicol Quitosana em 100 mM de tampão acetato pH 5.5 foi adicionado
100 uL da solução 2 mg/mL de lisozima ou de seus derivados preparados em 100 mM de
tampão acetato pH 5.5. A mistura foi incubada por 30 minutos a 40 °C. Após a reação, foi
adicionado a mistura 2 mL da solução (0.5 g de ferricianeto de potássio em 1L de 0.5 M de
carbonato de sódio) e imediatamente foi aquecida em água fervente durante 15 minutos para
estimar o poder de redução resultante da hidrólise do Glicol Quitosana (foi preparada uma
solução controle, sem enzima, sob as mesmas condições). Em seguida, após serem resfriadas
durante 5 minutos, mediu-se a absorbância das amostras a 420 nm.
3.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970)
A eletroforese de proteínas pode fornecer várias informações a respeito de uma amostra,
como estimativa de massa molecular, impurezas de proteínas estranhas e degradação. Muitos
anos após o início de seu uso, o gel de poliacrilamida (PAGE) continua a ser o mais usado
experimentalmente para a análise proteínas puras ou misturas. Embora o gel de duas
dimensões apresente maior resolução, o gel de poliacrilamida unidimensional é o mais
utilizado pois apresenta suficiente resolução para a maioria dos experimentos e apresenta
relativa facilidade e pouca habilidade para seu manuseio.
O suporte utilizado na eletroforese foi o gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de
sódio (SDS). Os géis de empilhamento e de corrida foram preparados em tampão Tris-HCl
0.5 M pH 6.8 e em tampão Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, respectivamente. Para cada gel utilizou-se
proporções adequadas das soluções : acrilamida 30% N-N-metileno bis-acrilamida 0,8%, SDS
10% e como catalisadores tetrametilenodiamino (Temed C6H16N2) e persulfato de amônio
10%. Os géis foram preparados colocando-se as misturas entre duas placas de vidro, de
50
dimensões 8 x 10 cm, separadas por espaçadores de 1,0 mm de espessura e acopladas ao
suporte Mini-Protean® II Dual Slab Cell Bio Rad que contém eletrodos. Os poços, para
aplicação das amostras, foram confeccionados colocando-se um pente entre as placas de
vidro, o qual foi retirado após a polimerização à 37 °C durante 30 minutos. O suporte do
sistema Bio Rad com o gel polimerizado foi transferido para uma cuba de acrílico Mini-
Protean® II Dual Slab Cell Bio Rad, conectada a uma fonte de corrente contínua, com tampão
de corrida Tris-glicina (Bio Rad). As amostras em quantidades (µg) adequadas foram
adicionadas ao tampão de amostra “Sample Buffer” (Bio Rad) com 2-mercaptoetanol, para
reduzir as pontes dissulfeto e denaturá-las com aquecimento em banho de água fervente por 5
minutos, em seguida foram aplicadas no gel. Foi aplicado também no gel o padrão de massa
molecular molecular cujas massas moleculares compreendem: 118 kDa (β-galactosidase),
86 kDa (Albumina), 47 kDa (Ovoalbumina), 34 kDa (Anidrase carbônica),
26 kDa (β-Lactoglobulina) e 19 kDa (Lisozima). A voltagem empregada na eletroforese foi de
150 V por 100 minutos. As vantagens do gel de poliacrilamida são: é quimicamente inerte, é
transparente e estável em amplas faixas de temperatura, força iônica e pH e pode-se alterar a
porosidade do gel.
Revelação do gel com o corante GELCODE Blue Stain Reagent
Após o término da eletroforese o gel foi colocado em solução fixadora por 15
minutos. Após a fixação, o gel foi enxaguado com água por 8 minutos, sendo este
procedimento repetido 4 vezes. Finalmente foi mergulhado em solução corante. Quando as
bandas estão coradas na intensidade desejada, o gel foi colocado em um recipiente com água
para posterior visualização.
51
3.2.4 Extração e Purificação de Lisozima
3.2.4.1 Resina IRC-50
(a) - Preparação da resina: a resina IRC – 50 foi previamente hidratada por 24 horas
com água destilada. Em seguida, transferiu-se 45 mL da resina para um béquer de 250 mL,
onde foi ativada com 60 ml de HCl 0.5 N sob agitação durante 30 minutos. Após lavagens
sucessivas com água destilada até a neutralização do pH, adicionou-se 100 mL de Tris-HCl
0.5 M, pH 9.0, sob agitação por 30 minutos em temperatura de 8 °C.
(b) - Adsorção da clara à resina: após lavagens sucessivas com água destilada a 8 °C,
foi adicionada à resina, 90 mL de clara de ovos de galinha, previamente passada por peneira,
respeitando a proporção em volume 1:2 (v/v) de resina e clara respectivamente. Essa mistura
permaneceu sob agitação durante 1 hora a 8 °C. Em seguida, a clara sobrenadante foi
removida e a resina lavada com tampão Tris-HCl 50 mM pH 9.0 até a obtenção de uma
solução límpida.
(c) - Eluição: a eluição foi realizada através da adição de 90 mL de sulfato de amônio
1.0 M, sob agitação por 30 minutos a 8 °C. O eluído foi submetido à diálise a 8 oC, para
remoção de sulfato de amônio, em membrana de diálise pré-tratada de 12- 16000 MW por
16 horas na câmara fria a 8 oC sob agitação.
(d) - Ultrafiltração: após diálise a amostra foi submetida à ultrafiltração com
membrana de porosidade 50 kDa NMWL Ultrafree® MC centrifugal e centrifugada a
4000 x g em centrífuga refrigerada (U-32 R) a 5oC por 20 minutos. Obtendo-se, dessa maneira
o ultrafiltrado.
52
3.2.4.2 Resina IRP-88
(a) - Preparação da resina: a resina IRP-88 foi previamente hidratada por 24 horas
com água destilada. Em seguida, transferiu-se 40 mL da resina para um béquer de 250 mL,
onde foi lavada e ativada com 80 mL de KCl 0.5 M sob agitação por 30 minutos. Após
lavagens sucessivas com água destilada, mediu-se a condutividade da fase de lavagem com
condutivímetro até atingir 60 µS/cm. Adicionou-se 100 mL de tampão Tris-HCl 0.5 M pH 9.0
a 8 oC, deixando-se sob agitação por 30 minutos a 8 oC.
(b) - Adsorção da clara à resina: após lavagens sucessivas com água destilada a 8 oC,
foi adicionada à resina, 80 mL de clara de ovos de galinha, respeitando a proporção em 1 : 2
(v/v) de resina e clara respectivamente. Essa mistura permaneceu sob agitação durante 1 hora
a 8 °C. Em seguida a clara sobrenadante foi removida e a resina lavada com tampão Tris-HCl
50 mM, pH 9.0 a 8 oC.
(c) - Eluição: a eluição foi realizada através da adição de 90 mL de sulfato de amônio
1.0 M, sob agitação por 30 minutos a 8 °C. O eluído obtido foi submetido ao processo de
concentração com membrana de porosidade 5 kDa sendo adicionada água deionizada, para
remoção de sulfato de amônio. O processo foi realizado em centrífuga refrigerada (Sorvall®
RC5) 10 oC por 2 horas. Em seguida foi realizado o processo de ultrafiltração.
(d) - Ultrafiltração: a amostra concentrada foi ultrafiltrada em membrana de
porosidade 50 kDa NMWL Ultrafree® MC centrifugal, centrifugada a 4000 x g em centrífuga
refrigerada (U-32 R,) a 5oC por 20 minutos A amostra proveniente do processo de
concentração também foi submetida à uma ultraflitração com membrana de porosidade
30 kDa NMWL Ultrafree® MC centrifugal que foi centrifugada a 4000 x g em centrífuga
refrigerada (U-32 R) a 5oC por 20 minutos.
53
Clara de ovo
Para ambos procedimentos foram determinados a quantidade de proteína e a atividade
enzimática da clara (extrato bruto) e das amostras obtidas nas fases de eluição e ultrafiltração
como descrito em métodos. As etapas de extração e purificação da lisozima com as resinas
IRC-50; IRP-88 estão representadas no fluxograma a seguir (item 3.2.4.3).
3.2.4.3 Fluxograma de Extração e Purificação de Lisozima com resinas IRC-50 / IRP-88.
(c) Eluição
1.0 M (NH4) 2SO4 a 8 ºC por 30 min.
O eluído foi concentrado com membrana 5 kDa a 10 ºC por 2 horas.
O eluído foi submetido à diálise
(d) Ultrafiltração
(Membranas de 30 kDa ou 50 kDa a 4000 x g a 5 ºC por 20 min.)
Resina IRP-88 (a) Preparação da resina
(b) Adsorção da clara com resina em batelada “batch” sob agitação a 8 ºC por 1hora.
Lisozima purificada
Resina IRC-50 (a) Preparação da resina
(b) Adsorção da clara com resina em
batelada “batch” sob agitação a 8 ºC por 1hora.
54
3.2.5 Verificação da influência da proporção mPEG succinimidil succinato 5000, 2000
Da ou mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) 5000 Da no grau de substituição da
lisozima.
Para verificar a influência da proporção em massa mPEG 5000, mPEG 2000 ou
mPEG-pNP 5000 em relação ao grau substituição da lisozima foram preparados tubos de
reações nas proporções propostas segundo a Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4 respectivamente.
Tabela 2 - Proporção mPEG 5000 / lisozima
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Branco
Tampão (µL ) 486 719 865 930 1000
mPEG 5000 (mL) a 514 281 135 69.8 -
Lisozima (mg) 20 20 20 20 10
mPEG 5000 / lisozima (m/m)b 2 1 0.5 0.25 -
mPEG 5000 / NH2c 0.86 0.43 0.21 0.11 -
a: solução preparada com 81.7 mg de mPEG 5000 e 1 mL tampão fosfato salino pH 7.3.
b: proporção massa / massa
c: proporção molar entre o número de moléculas de mPEG 5000 e o número de amino grupos
disponíveis na enzima para reação. Cada molécula de lisozima possui 7 amino grupos (6 ε-lisinas e
1 N-terminal) disponíveis.
55
Tabela 3 - Proporção mPEG 2000 / lisozima
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Branco
Tampão (µL ) 466 733 866 933 1000
mPEG 2000 (µL) a 534 267 134 67 -
Lisozima (mg) 20 20 20 20 10
mPEG 2000 / lisozima (m/m)b 2 1 0.5 0.25 -
mPEG 2000 / NH2c 2.14 1.11 0.53 0.27 -
a: solução preparada com 75 mg de mPEG 2000 e 1mL de tampão Tris-HCl 100 mM pH 8.6.
b: proporção massa / massa
c: proporção molar entre o número de moléculas de mPEG 2000 e o número de amino grupos disponíveis na
enzima para reação. Cada molécula de lisozima possui 7 amino grupos (6 ε-lisinas e 1 N-terminal) disponíveis.
Tabela 4 - Proporção mPEG-pNP 5000 / lisozima
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Branco
Tampão (µL ) 466 733 866 933 1000
mPEG-pNP 5000 (µL) a 534 267 134 67 -
Lisozima (mg) 10 10 10 10 10
mPEG-pNP5000/lisozima (m/m)b 2 1 0.5 0.25 -
mPEG-pNP 5000 / NH2c 0.86 0.43 0.21 0.11 -
a: solução preparada com 37.5 mg de mPEG-pNP 5000 e 1mL de tampão Fosfato 100mMpH 8.0.
b: proporção massa / massa.
c: proporção molar entre o número de moléculas de mPEG-pNP 5000 e o número de amino grupos disponíveis na
enzima para reação. Cada molécula de lisozima possui 7 amino grupos (6 ε-lisinas e 1 N-terminal) disponíveis.
Os tubos foram previamente homogeneizados e incubados a 30 °C por 2 horas foram
retiradas alíquotas de 2 µL e adicionadas a 30 µL de Sample Buffer na presença de
2-mercaptoetanol e fervidas por 5 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10%.
56
Com o mPEG 2000 o grau de substituição da lisozima também foi determinado como
descrito na Tabela 5.
Tabela 5 - Proporção mPEG 2000 / lisozima
Tubo 1 Tubo 2
Tampão (µL)a 1000 1000
Mpeg 2000 (mg) 5.0 2.5
Lisozima (mg) 20 20
mPEG2000 / lisozima (m/m)b 0.25 0.125
mPEG 2000 / NH2c 0.27 0.134
a: Tampão fosfato salino pH 7.3.
b: proporção massa / massa
c: proporção molar entre o número de moléculas de mPEG 2000 e o
número de amino grupos disponíveis na enzima para reação. Cada
molécula de lisozima possui 7 amino grupos (6 ε-lisinas e 1 N-terminal)
disponíveis.
Os tubos foram previamente homogeneizados e incubados a 30 °C por 2 horas.
De cada tubo de reação, acondicionado em câmara fria, foram retiradas alíquotas de 2 µL nos
tempos 2 , 24 , 48 e 67 horas e adicionadas a 30 µL de “Sample Buffer” na presença de
2-mercaptoetanol e fervidas por 5 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10%.
Para cada uma das razões molares obtidas, com os diferentes mPEG ativados
empregados foi realizada a medida de atividade enzimática como descrito 3.2.2.
57
3.2.6 Verificação da influência do tempo no grau de substituição da lisozima utilizando
tampão Hepes pH 7.4.
A cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000, 2000 ou mPEG-pNP
5000 foi acompanhada em função do tempo. Intervalos de tempo foram estipulados para
permitir um acompanhamento gradual da substituição dos resíduos de lisinas, α-amino por
cada grupo funcional presente nos mPEG ativados. Portanto, como essa é uma característica
de cada grupo funcional, a reação de “PEGlação” da LZ foi desenvolvida com esses
polímeros, no mesmo intervalo de tempo de 1, 3, 5, 7, 10, 20, 30, 60 e 120 minutos e com a
mesma proporção mPEG/proteína. Assim, o ensaio foi desenvolvido de acordo com a
Tabela 6.
Tabela 6: Proporção dos diferentes mPEG/lisozima para verificar a cinética da reação de “PEGlação” da LZ.
Tubo de
reação
mPEG (µL)a Lisozima
(µL)b
mPEG/lisozima
(m/m)c
mPEG/NH2 d
1
mPEG 5000
200 µL
500 µL
2
0.86
2
mPEG 2000
320 µL
400 µL
0.8
0.86
3
mPEG-pNP 5000
200 µL
500 µL
2
0.86
a: volume de solução dos diferentes mPEG em tampão HEPES 100mM pH 7.4.
b: volume de solução de lisozima em tampão HEPES 100mM pH 7.4.
c: proporção em massa (mg) entre cada tipo de mPEG e a massa (mg) de LZ empregada na reação
d: proporção molar entre o número de moléculas de cada mPEG e o número de amino grupos
disponíveis na enzima para reação. Cada molécula de lisozima possui 7 amino grupos
(6 ε-lisinas e 1 N-terminal) disponíveis.
58
A reação de “PEGlação” para os diferentes mPEGs, de acordo com a Tabela 6, foi
conduzida a 30 oC durante 2 horas. Durante esse intervalo de tempo, foram retiradas alíquotas
de 14 µL nos tempos 1, 2, 3, 5, 7,10, 20, 30, 60 e 120 minutos, as quais foram adicionadas a
30 µL de “Sample Buffer” sem 2-mercaptoetanol, fervidas durante 5 minutos e aplicadas em
gel de poliacrilamida 10 %. Para os ensaios realizados com o mPEG 5000 também foram
retiradas alíquotas de 14 µL nos mesmos instantes porém, adicionadas a 30 µL de “Sample
Buffer” acrescidos de 2-mercaptoetanol.
Para verificar se a natureza química do tampão de reação empregado no processo de
“PEGlação” causava alguma interferência na cinética da reação, realizamos o mesmo
procedimento empregado anteriormente com mPEG 5000 de acordo com a Tabela 6, porém
utilizando como tampão de reação o tampão fosfato salino pH 7.3.
3.2.7 Isolamento da lisozima modificada
Em tubos de reação foram colocados 1 mL de solução de lisozima com concentração
de 20 mg / mL em tampão fosfato salino pH 7.3 (INADA et al., 1994) mais 5 mg de mPEG
5000 ou 2.5 mg de mPEG 2000 . Para a reação com mPEG-pNP 5000 foram colocados 1 mL
de solução de lisozima 10 mg/mL em tampão fosfato 100 mM pH 8.0 mais 2.5 mg de
mPEG-pNP 5000. As soluções foram homogeneizadas e colocadas para reagirem por duas
horas a 30 °C e em seguida foram transferidas para câmara resfriada a 8 °C durante 16 horas.
Após a reação, as amostras foram purificadas por cromatografia de Gel Filtração em
uma coluna (1.6 x 37 cm) de Sephadex G-50 a fim de separar a enzima modificada do
eventual excesso de mPEG 5000, mPEG 2000 ou mPEG-pNP 5000 . A coluna foi equilibrada
com tampão fosfato 100 mM pH 7.0 e eluída no mesmo tampão, sendo recolhidas frações em
volumes de 1 mL. Em seguida mediu-se a atividade enzimática (como descrito em 3.2.2) de
cada fração recolhida, sendo que as primeiras frações que apresentaram atividade enzimática,
59
foram escolhidas para serem submetidas à eletroforese SDS-PAGE. Dessa forma, somente as
frações que correspondiam a 9; 10; 11 e 12 mL do eluído da coluna foram submetidas à
eletroforese (SDS-PAGE) tanto para a LZ-mPEG 2000, LZ-mPEG 5000 quanto para mPEG-
pNP 5000. Para isso, foram retiradas alíquotas de 40 µL de cada fração que foram aplicadas
em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%.
Assim, após visualização das bandas, as frações que apresentaram apenas a banda
correspondente a lisozima modificada com uma quantidade mínima de LZ livre foram
“pooled” e concentradas com membranas de porosidade 5 kDa.
3.2.8 Verificação da atividade e da estabilidade biológica da lisozima modificada em
função do pH .
O comportamento da atividade da lisozima nativa ou modificada com mPEG 5000,
mPEG 2000 ou mPEG-pNP 5000 em diferentes tampões, variando o pH de 4 a 12, foi
determinado pela adição de quantidade conveniente de cada amostra a 1 mL de suspensão de
Micrococcus lysodeikticus 0.5 mg /mL preparada nos diferentes tampões (4.0-5.0 acetato 50
mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50mM) e imediatamente mediu-se a atividade
enzimática em espectrofotômetro a 450 nm. O pH no qual cada uma das enzimas, lisozima,
LZ-mPEG 5000, LZ-mPEG 2000, LZ-mPEG-pNP 5000 apresentou maior atividade foi
considerado 100%.
A estabilidade foi determinada pela incubação da lisozima nativa, lisozima-mPEG
5000, lisozima-mPEG 2000 e lisozima-mPEG-pNP 5000 nos diferentes tampões (4.0-5.0
acetato 50 mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50 mM) por 1 hora a 25 °C ou
50 °C. Ao final desse período foi medida a atividade enzimática das amostras em 1 mL
suspensão de Micrococcus lysodeikticus com concentração de 0.5 mg / mL em tampão fosfato
60
50 mM pH 7.0. A taxa de lise foi acompanhada por espectrofotometria a 450 nm. O pH no
qual cada uma das enzimas apresentou maior atividade foi considerado 100%.
3.2.9 Verificação da resistência à ação de proteases da lisozima modificada
Para verificar a ação de proteases sobre a lisozima nativa ou modificada foram
utilizadas 5 enzimas proteolíticas: Proteomix (quimotripsina e tripsina); Protex 6L (protease
bacterina); Neutrase (protease bacteriana); protease fúngica e papaína.
Primeiramente foram adicionados 0.5 UI das diferentes proteases em 100 µL da
solução de lisozima nativa (600 UI), preparada em tampão fosfato 100 mM pH 7.0. O volume
final de cada amostra foi de 1 mL em tampão fosfato 100 mM pH 7.0. As amostras foram
incubadas a 37 °C e foram retiradas alíquotas de 20 µL nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120
minutos e mediu-se a atividade enzimática das amostras em 1 mL suspensão de Micrococcus
lysodeikticus com concentração de 0.5 mg / mL em tampão fosfato 50 mM pH 7.0.
Posteriormente, foi utilizado um excesso das diferentes proteases para verificar a
resistência a proteólise da lisozima modificada. Para 100 µL da solução de lisozima nativa
(600 UI) ou 100 µL da lisozima modificada LZ-mPEG 5000 (450 UI), preparadas em tampão
fosfato 100 mM pH 7.0, foram adicionadas 20 UI das diferentes proteases. O volume final de
cada amostra era de 1 mL em tampão fosfato 100 mM pH 7.0 . As amostras foram incubadas
a 37 °C e foram retiradas alíquotas de 20 µL nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos e mediu-
se a atividade enzimática das amostras em 1 mL suspensão de Micrococcus lysodeikticus com
concentração de 0.5 mg / mL em tampão fosfato 50 mM pH 7.0. Foram retiradas de cada uma
das amostras alíquotas para serem aplicadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15%.
61
3.2.10 Verificação da estabilidade biológica da lisozima modificada em soro humano .
Para verificar a estabilidade biológica da lisozima nativa ou lisozima modificada em
soro humano foram adicionados a 1.5 mL de soro 500 µl de lisozima nativa (3000 UI) ou
500 µL de LZ-mPEG 5000 (2250 UI); 500 µL LZ-mPEG 2000 (2100 UI); 500 µL LZ-
mPEG-pNP 5000 (2350 UI). As amostras foram incubadas a 37 °C e foram retiradas alíquotas
de 50 µl de cada amostra nos intervalos de tempo 0, 15, 30, 60 e 120 minutos, mediu-se a
atividade enzimática das amostras em 1 mL suspensão de Micrococcus lysodeikticus com
concentração de 0.5 mg / mL em tampão fosfato 50 mM pH 7.0.
3.2.11 Determinação da atividade antimicrobiana da lisozima modificada contra
bactéria Gram-negativa E. coli.
Para avaliar a atividade antimicrobiana da lisozima nativa ou modificada LZ-mPEG
5000 contra bactéria Gram-negativa foi usada a cepa de E. coli ATCC 29255. As bactérias
foram mantidas em ¨slants¨ em meio LB, Luria-Broth (SOMASEGRAN et al.,1994). Foram
inoculados 50 µl de E. coli em 100 mL de meio LB e incubou-se a 37° C sob agitação de
150 rpm, “Shaker” (incubador rotativo), TE240 Tecnal por 18horas. Após esse período de
incubação, foram retirados 5 mL e transferidos para mais 100 ml de meio LB que foram
novamente incubados no “Shaker” a 37 °C e 150 rpm. O crescimento microbiano foi
acompanhado através da D.O. a 600 nm com espectrofotômetro. Após ter atingindo a fase
logarítmica de crescimento foi retirado 1 mL da suspensão de células. A suspensão de células
foi centrifugada em microcentrífuga, a 6000 rpm por 5 minutos. Em seguida as células foram
ressuspendidas em solução fisiológica tamponada e realizaram-se diluições seriadas até
105 células / ml em tampão fosfato 50 mM pH 7.0.
O ensaio de atividade antimicrobiana foi realizado essencialmente como descrito por
NODAKE et al. (2002), segundo a Tabela 7.
62
Tabela 7 – Ensaio de atividade antimicrobiana da lisozima nativa e modificada
LZ-mPEG 5000
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Controle
150 µl 105 cél. /mL 150 µl 105 cél. / mL 150 µl 105 cél. / mL 150 µl 105 cél. / mL
500 µl lisozima-mPEG 5000a 500 µl lisozimab 500 µl mPEG 5000c 500 µl tampãod
a:solução lisozima modificada com mPEG 5000 em tampão fosfato 100 mM pH 7.0.
b: solução de lisozima (20 mg / mL) em tampão fosfato 100 mM pH 7.0.
c:solução de mPEG 5000 (5 mg / mL) em tampão fosfato 100 mM pH 7.0.
d: solução tampão fosfato 50 mM pH 7.0.
Previamente foi medida a atividade enzimática da lisozima nativa (3000 UI) e da
modificada LZ-mPEG 5000 (2250 UI) para o volume empregado na reação. Em seguida os
tubos de reação foram incubados a 37 °C por duas horas. Foram retiradas alíquotas de 20 µL
de cada tubo e realizaram-se diluições seriada das amostras. De cada diluição foram retirados
100 µL para serem aplicados em placas descartáveis estéries com meio LB 2.5 % ágar. As
placas foram incubadas a 37 °C por 16 horas. Em seguida foi realizada manualmente a
contagem de unidades formadoras de colônias, sendo determinadas UFC / mL em cada
amostra. As UFC do controle foram consideradas 100 %.
63
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Extração e Purificação de Lisozima
A lisozima foi extraída a partir da clara de ovos de galinha de uma marca comercial
local (São Paulo, Brasil). O método de extração empregado foi troca iônica em batelada
“batch”, um método simples e direto que não requer nenhum pré-tratamento da clara, apenas
sua homogeneização com a resina de troca iônica, sob agitação e, em seguida realiza-se a
lavagem da resina e a eluição da enzima.
A separação de moléculas biológicas similares de uma mistura complexa é um dos
obstáculos encontrados para o isolamento de certas substâncias, necessitando de técnicas de
alta resolução. A cromatografia de troca iônica comprovou ser uma técnica adequada, sendo
considerada um dos mais importantes métodos de fracionamento de substâncias biológicas,
por isso, essa técnica tem sido empregada em 60%-75% de todos os processos de purificação
de proteínas (BOSCHETTI, 1994; WALSH; HEADON, 1994; JANSON; RYDEN, 1998).
Devido à sua alta resolução, a cromatografia de troca iônica tem sido amplamente
usada em escala laboratorial para a extração de proteínas da clara de ovo. É um processo que
não provoca a desnaturação das proteínas, fornecendo assim um produto sem alterações.
Além disso, a cromatografia de troca iônica é facilmente aplicável em escala industrial.
Atualmente, de acordo com os procedimentos descritos na literatura, a grande maioria das
proteínas presentes na clara de ovo é obtida por cromatografia de troca iônica com alta
pureza, sendo aplicadas em estudos biológicos, bioquímicos e biofísicos (GUERIN-
DUBIARD et al., 2005).
64
Levando-se em conta o pI da lisozima (pI = 11) foram testadas cinco resinas catiônicas
tipo Amberlit (IRP – 64; IRP – 88; IRC – 50; CG – 50 e Amberlit 15 da Merck). Dentre essas,
as que mostraram resultados preliminares de maior poder de retenção foram: a resina
Amberlite IRC - 50 e Amberlite IRP - 88. Essas resinas são do tipo trocadora de cátions,
fracamente ácidas, com “wet mesh” 16 - 50 e 100 - 500, respectivamente. Após o
procedimento de extração por troca iônica as amostras foram purificadas através de
ultrafiltração do eluído com membranas de porosidade 30 kDa ou 50 kDa , com objetivo de
eliminar proteínas indesejáveis (GHOSH; CUI, 2000; GHOSH et al., 2003).
Para estabelecermos as condições ótimas de extração e purificação de lisozima para
cada uma das resinas selecionadas, alguns procedimentos foram desenvolvidos visando à
padronização de parâmetros críticos dentro do processo de extração e purificação da enzima,
como: tipo de resina, tempo de cada etapa do processo, temperatura, pH, força iônica do sal
empregado e remoção de proteínas indesejáveis (WISEMAN, 1985; ATKINSON et al., 1987,
ABRAHAO NETO, 2001).
Para compararmos a recuperação da lisozima com os dois tipos de resinas utilizadas,
parâmetros como pH, força iônica do sal durante a eluição e ultrafiltração foram estudados.
Esses parâmetros foram analisados porque eles estão intimamente relacionados à eficiência da
cromatografia de troca iônica. A cromatografia de troca iônica basicamente consiste na
ligação da proteína de interesse a uma matriz inerte que possua grupos ionizáveis de cargas
opostas as da proteína, dessa forma a proteína interage eletrostaticamente com a matriz. Após
a ligação da proteína de interesse ela deve ser removida facilmente do material insolúvel de
maneira seletiva. Essa seletividade da eluição deve ser alcançada pela variação da
concentração do sal ou pela mudança do pH (WHITAKER, 1994).
65
Assim, para determinarmos as condições apropriadas de pH para a extração e
purificação da lisozima foi realizado previamente o perfil de atividade e estabilidade da LZ
comercial (Sigma) em diferentes pHs. A medida de atividade foi realizada nos diferentes
tampões, obtendo-se o pH ótimo de atividade (pH 7.0 – 8.0). A enzima também foi incubada
nos diferentes tampões a 25 oC por 1 hora. Depois desse período foi realizada a medida da
atividade enzimática segundo o item 3.2.2. Assim, foi obtido o seguinte perfil de atividade
(10A) e estabilidade (10B) como mostrado pela Figura 10.
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima
Ativ
idad
e (%
)
pH
Figura 10A- Perfil da atividade (%) de lisozima em diferentes tampões variando o pH de 4 a 12, ( 4.0-5.0 acetato 50 mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50 mM) a 25 °C. A atividade foi determinado pela adição de quantidade conveniente de lisozima a 1 mL de suspensão de Micrococcus lysodeikticus 0.5 mg/mL preparada nos diferentes tampões (4.0-5.0 acetato 50 mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50 mM) e imediatamente mediu-se a atividade enzimática em espectrofotômetro a 450 nm.
66
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima
Est
abili
dade
(%
)
pH
Figura 10B - Perfil da estabilidade (%) de lisozima em diferentes tampões variando o pH de 4 a 12, (4.0-5.0 acetato 50 mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50 mM) . A estabilidade foi determinada pela incubação após 1 hora de incubação a 25 °C em cada pH. Ao fim desse período foi medida a atividade enzimática em 1 mL de suspensão de Micrococcus
lysodeikticus 0.5 mg/mL preparada em tampão fosfato 50 mM pH 7.0 em espectrofotômetro a 450 nm.
A partir da Figura 10B podemos perceber que a lisozima é uma enzima estável, pois
mantém sua atividade enzimática acima de 80 %, numa ampla faixa de pH (4.0 a 12) a 25 °C,
esse resultado evidencia que o pH não será um fator relevante na perda da atividade
enzimática da lisozima, contudo, a escolha do pH é muito importante na etapa de eluição.
Para garantirmos também a atividade enzimática da lisozima, o processo de extração e
purificação foi desenvolvido a baixa temperatura (8°C-10°C).
A proposta da etapa de eluição é remover a proteína de interesse da resina de troca
iônica com alta resolução, separando-a dos componentes adjacentes (WHEELWRIGHT,
1991). Assim, dependendo do pH e do pI da enzima ela apresentará carga positiva ou
negativa, o que determina diretamente se a enzima irá se desprender mais facilmente da resina
ou ficará retida (WHITAKER, 1994).
67
Portanto, para obter as melhores condições de eluição da enzima, foram realizados
experimentos com o objetivo de se determinar qual a melhor condição de pH e concentração
de sulfato de amônio para etapa de eluição da lisozima de ambas as resinas. Apesar, do
sulfato de amônio ser um sal que apresenta a interessante capacidade de promover a
hidratação da proteína, garantindo sua estabilidade conformacional (ARAKWA;
TIMASHEFF, 1982) durante o processo, para que a eluição da proteína ocorra é
imprescindível que o sal esteja numa concentração adequada.
Para determinar condições apropriadas de concentração do sulfato de amônio para a
etapa de eluição, essa foi desenvolvida primeiramente, em coluna cromatográfica utilizando-
se um gradiente linear crescente de concentração de sulfato de amônio, monitorado pelo
aparelho Econo UV Monitor, Econo Pump (Bio Rad). Para essa etapa também determinamos
condições apropriadas de pH sendo que a solução de sulfato de amônio foi melhor tamponada
em pH 7.0. Dessa forma, realizamos o procedimento mantendo o pH em 7.0 durante a etapa
de eluição (fase c), com as resinas IRC-50 e IRP-88.
Para resina IRC – 50, a fase a (preparação da resina), foi realizada a 8 °C, a fase b
(adsorção da clara à resina) foi realizada em 1 hora com tampão Tris-HCl 50 mM, e a fase c
(eluição) foi desenvolvida em coluna cromatográfica (2.5 x 20 cm) a 8 oC com um
gradiente linear crescente de concentração de sulfato de amônio, monitorado pelo aparelho
Econo UV Monitor, Econo Pump (Bio Rad). O gradiente foi feito a partir da solução de
sulfato de amônio 0.9 M pH 7.0 a 8 °C e Tris-HCl 50 mM pH 7.0, a 8 oC mantendo-se assim
pH 7.0 durante todo processo. Durante a eluição pela coluna foram recolhidas frações em um
coletor de frações ISCO modelo Retriver II. O eluído da coluna foi recolhido em tubos de
ensaio (T) em volumes de 10 mL, na vazão de 1 mL / min. Em seguida mediu-se, em cada
tubo (T), a condutividade e realizou-se o doseamento de proteína e atividade enzimática
segundo métodos. A concentração de sulfato de amônio em cada tubo de ensaio (T) foi
68
determinada através de uma curva padrão de concentração molar (M) de sulfato de amônio
em função da condutividade (mS / cm) como representado pela Figura 11.
y = 0,0146x - 0,0611
R2 = 0,9909
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80
condutividade (mS/cm)
Co
ncen
tração
de s
ulf
ato
de a
mô
nio
(M)
Figura 11 - Curva padrão de concentração molar (M) de sulfato de amônio em função da condutividade (mS/cm).
A eluição com gradiente linear crescente de concentração de sulfato de amônio 0.9 M
pH 7.0 e Tris-HCl 50 mM pH 7 a 8 °C como descrito acima, foi realizado também para
resina IRP – 88 utilizando coluna de (1.5 x 30 cm).
Os resultados obtidos com a resina IRC-50 estão expressos na Tabela 8 e pelo perfil
cromatográfico representado na Figura 12. Os resultados obtidos com a resina IRP-88 estão
expressos na Tabela 9 e pelo perfil cromatográfico representado na Figura 13.
69
Tabela 8 - Medidas de atividade enzimática (UI), quantidade de proteína (mg), atividade específica (U/mg),
condutividade (mS/cm) e concentração de sulfato de amônio (M) para frações (T8,9, T10, T11, T12, T13, T14,T15)
que foram recolhidas durante o processo de eluição em coluna com gradiente linear crescente de concentração de
sulfato de amônio 0.9 M pH 7 e Tris-HCl 50 mM pH 7.0 com a resina IRC-50. A fração T11 foi a que apresentou
maior atividade enzimática (UI) e maior atividade específica (U/mg).
Amostras Unidades totais
(U)
Proteína total
(mg)
At. Espec.
(U/mg)
Condutividade
(mS/cm)
Conc. Sulfato de
amônio ( M)
Extrato Bruto 504000 8924 57 - -
T8 5500 51 108 6 0.0258
T9 23000 95 241 10 0.0842
T10 85000 144 589 11 0.1025
T11 155000 202 767 12 0.1173
T12 70000 77 914 13 0.1253
T13 20500 32 641 13 0.1331
T14 8500 12 702 14 0.1397
T15 5.000 7 720 15 0.1572
Figura 12 - Perfil cromatográfico obtido com frações de 10 mL recolhidas a partir da eluição com gradiente linear de concentração de sulfato de amônio 0.9 M pH 7 e Tris-HCl 50 mM pH 7.0 com resina IRC-50. (-•-) Atividade (UI), (-◦-) Condutividade (mS/cm).
60 80 100 120 140 160
0
5
10
15
Sulfato de Amônio 0,9 M pH 7,0 / Tris-HCl 0,05 M pH 7,0
Volume (mL)
Con
dutiv
idad
e (m
S/c
m)
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
Ativida
de (U)
70
Tabela 9 - Medidas de atividade enzimática (UI), quantidade de proteína (mg), atividade específica (U/mg),
condutividade (mS/cm) e concentração de sulfato de amônio (M) para frações (T6, T7, T8, T9) que foram recolhidas
durante o processo de eluição em coluna com gradiente linear crescente de concentração de sulfato de amônio 0.9 M pH
7.0 e Tris-HCl 50 mM pH 7.0 com a resina IRP-88. A amostra T7 foi a que apresentou maior atividade enzimática (UI)
e maior atividade específica (U/mg).
Amostras Unidades totais
(U)
Proteína total
(mg)
At. Espec.
(U/mg)
Condutividade
(mS/cm)
Conc. sulfato de
amônio (M)
Extrato Bruto 528000 5840 90 - -
T6 34500 55 633 6 0.2434
T7 290000 332 874 40 0.5178
T8 110000 118 932 67 0.9237
T9 16000 26 615 81 1.1208
Figura 13 - Perfil cromatográfico obtido com frações de 10 mL recolhidas a partir da eluição com gradiente linear crescente de concentração de sulfato de amônio 0.9 M pH 7.0 e Tris-HCl 50 mM pH 7.0 com resina IRP-88.(-•-) Atividade (UI), (-◦-) Condutividade (mS/cm).
40 60 80 100 120
0
50
100
150
Sulfato de Amônio 0,9 M pH 7,0 / Tris-HCl 0,05M pH 7,0
Volume (mL)
Con
dutiv
idad
e (m
S/c
m)
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
Ativida
de (U)
71
A partir dos resultados obtidos, notamos que o fato do pH ter sido mantido constante
em pH 7.0 influenciou significativamente na eluição da lisozima com gradiente linear de
concentração a partir de sulfato de amônio 0.9 M pH 7.0 e Tris-HCl 50 mM pH 7.0 para as
duas resinas. A eluição foi definida podendo ser demonstrada pelo perfil de atividade
enzimática, para as duas resinas. Com a resina IRC – 50 podemos observar pela Tabela 8 que
na fração 11 eluiu a maior quantidade de lisozima que está representada pelo pico de atividade
enzimática de 1,5 x 105 UI que corresponde ao volume de 110 mL no perfil cromatográfico
( Figura 12).
Para resina IRP-88, além da eluição ter sido definida, ela ocorreu em menor tempo,
pois logo na fração 7, Tabela 9, ocorreu o pico de atividade 3,0 x 105 UI que corresponde a
70 ml do perfil cromatográfico (Figura 13).
A concentração de sulfato de amônio para a resina IRC-50, como observamos pela
Tabela 8, ficou em torno de 0.12 M, e para a resina IRP-88 como observamos pela Tabela 9 a
concentração de sulfato de amônio ficou em torno de 0.5 M.
Assim, de acordo com os resultados obtidos podemos verificar que as melhores
condições para a realização da etapa de eluição realizada em coluna cromatográfica com a
resina IRC-50 consiste em utilizar sulfato de amônio com concentração em torno de 0.12 M e
manter o pH 7.0. Para resina IRP-88 a melhor condição para a etapa de eluição em coluna
cromatográfica consistiu em utilizar sulfato de amônio 0.5 M mantendo pH 7.0. Portanto, a
concentração de sulfato de amônio demonstrou ser um fator limitante para a eficiência da
cromatografia de troca iônica, pois quando se atinge a concentração adequada de sulfato de
amônio, os íons NH4+ provenientes da dissociação do (NH4)2 SO4 competem de forma efetiva
pelas cargas negativas da resina liberando a enzima e facilitando portanto o processo de
eluição, além disso, o pH 7.0 contribuiu para facilitar esse desprendimento da enzima das
resinas catiônicas.
72
As melhores condições de eluição em coluna cromatográfica obtidas com a resina
IRC-50 descritas anteriormente, não foram reprodutíveis para a eluição em batelada, pois não
ocorreu a eluição da proteína de forma satisfatória. Esses resultados sugeriram que a força
iônica do sal empregado para a eluição da lisozima em cromatografia de troca iônica em
coluna cromatográfica é menor do que quando realizamos a eluição em batelada.
Provavelmente, isso ocorra porque na eluição realizada em coluna a organização das
partículas da resina na coluna e o fluxo contínuo do eluente facilitariam o processo de eluição,
exigindo assim baixas concentrações de sulfato de amônio. Contudo, a influência da força
iônica, do tipo de resina e a viscosidade da amostra aplicada em batelada ou em coluna são
parâmetros continuamente investigados (WRIGHT et al., 1998; DZIENNIK et al., 2005),
evidenciando a complexidade desses sistemas quando são comparados.
Assim, novos testes foram necessários para se conhecer a concentração adequada de
sulfato de amônio que deve ser empregada para a eluição em batelada.
A partir disso, para esclarecermos qual a melhor concentração de sulfato de amônio
empregada para etapa de eluição em batelada o processo de extração de lisozima foi realizado
com as resinas IRC-50 e IRP-88, sendo que para etapa de eluição (fase c) testamos diferentes
concentrações de sulfato de amônio, a fim de estabelecermos nestas condições a concentração
deste sal que forneça melhor rendimento na extração.
O procedimento de extração de lisozima foi desenvolvido com a resina IRC – 50, da
seguinte maneira: A fase a (preparação da resina) foi realizada a 8 °C, a fase b (adsorção da
clara à resina) foi realizada em 1 hora com tampão Tris-HCl 50 mM pH 9.0 e a fase c
(eluição) foi realizada da seguinte forma: o complexo resina IRC – 50 e proteína resultante da
homogeneização, foi dividido em volumes iguais em dois béqueres e foram adicionados a
uma porção 45 mL de sulfato de amônio 0.5 M pH 7.0 e condutividade de 69.8 mS / cm e a
outra porção 45 mL de sulfato de amônio 1.0 M pH 7.0 e condutividade 109 mS / cm. As
73
porções foram agitadas por 30 minutos. Em seguida foi realizada a quantificação de proteína e
medida a atividade enzimática das amostras obtidas após a eluição com diferentes
concentrações de sulfato de amônio.
Com a resina IRP – 88 houve apenas alteração na fase c . O complexo resina IRP – 88
e proteína foi dividido em volumes iguais em três béqueres. A cada porção adicionou-se 30
mL de sulfato de amônio 0.33 M pH 7.0 e condutividade de 70 mS / cm, a outra porção 30
mL de sulfato de amônio 0.5 M pH 7.0 e condutividade 90 mS / cm e por fim adicionou-se 30
ml de sulfato de amônio 0.67 M pH 7.0 e condutividade 92 mS / cm. Todas as porções foram
agitadas por 30 minutos. Em seguida foi realizada a quantificação de proteína e medida a
atividade enzimática das amostras obtidas após a eluição com as diferentes concentrações de
sulfato de amônio. Os resultados estão expressos nas Tabelas 10 e 11.
Tabela 10 - Eluição em batelada com resina IRC-50. Foram obtidos 2 tipos de eluídos: eluído (1) com sulfato
de amônio 0.5 M pH 7.0 condutividade 69,8 mS / cm e eluído (2) com sulfato de amônio 1.0 M pH 7.0 e
condutividade 109 mS / cm.
Etapa Volume (mL) Unidades
totais (UI)
Proteína
total (mg)
At. Espec.
(UI / mg)
Condutividade
(mS / cm)
Rendimento
(%)
Extrato Bruto 90 1440000 12870 112 - -
Eluído (1) 55 572000 209 2737 27 79
Eluído (2) 55 594000 220 2700 43 82
74
Tabela 11 - Eluição em batelada com resina IRP – 88. Foram obtidos 3 tipos de eluídos: eluído (a) com sulfato
de amônio 0.33 M pH 7.0 e condutividade 70 mS / cm ; eluído (b) com sulfato de amônio 0.5 M pH 7.0 e
condutividade 90 mS / cm e eluído (c) com sulfato de amônio 0.67 M pH 7.0 e condutividade 92 mS / cm.
Etapa Volume
(mL)
Unidades
totais (UI)
Proteína
total (mg)
At. Espec.
(U/mg)
Condutividade
(mS / cm)
Rendimento
(%)
Extrato Bruto 80 1493360 13200 113 - -
Eluído (a) 30 372000 147 2548 41 75
Eluído (b) 30 354000 132 2681 52 71
Eluído (c) 30 342000 138 2478 67 68
Esses procedimentos experimentais permitiram avaliar a influência da concentração do
sulfato de amônio na fase de eluição em batelada levando em consideração a condutividade
do eluído. Como podemos observar pelos dados apresentados nas Tabelas 10 e 11 a
condutividade dos eluídos obtidos diminuiu aproximadamente pela metade em relação à
condutividade inicial das soluções de sulfato de amônio empregadas para a fase de eluição.
Estes dados indicam que no eluído ocorre uma diminuição de íons NH4+ livres presentes nas
soluções iniciais. Basicamente esse mesmo processo ocorreu tanto com a resina IRC-50 como
a IRP-88.
Com a resina IRC-50 percebemos que a condutividade inicial da solução do sulfato de
amônio 0.5 M pH 7.0 era de 69.8 mS/cm enquanto que a condutividade do eluído (1) caiu
para 26.8 mS/cm. Além disso, houve um aumento significativo de atividade específica,
ressaltando que o processo de eluição foi eficiente, pois ocorreu o desligamento da lisozima
da resina. Esses dados indicam que a competição dos íons NH4+ pelas cargas negativas da
resina foi efetiva com essa concentração de sulfato de amônio utilizada.
75
Por outro lado, quando aumentamos a concentração de sulfato de amônio para 1.0 M
pH 7.0 não ocorreu aumento da atividade específica e não houve aumento na quantidade de
proteína, sugerindo que a concentração de 1.0 M representa um excesso de sulfato de amônio.
Assim, como o volume total de resina IRC-50 correspondia ao dobro de volume de resina que
foi submetido a essas condições, o processo de extração (eluição, fase c) da lisozima foi
realizado novamente com 1.0 M de sulfato de amônio pH 7.0 para posterior purificação por
ultrafilitração.
Com a resina IRP-88 foram utilizadas três concentrações diferentes de sulfato de
amônio porque a adsorção da clara a resina IRP-88 ocorreu em uma superfície de contato
maior, pois essa resina possui “wet mesh” de 100-500, o que favoreceu a retenção e a
interação de outras proteínas da clara que interferiram no processo de eluição. A solução de
menor concentração molar 0.33 M pH 7.0 e condutividade 70 mS / cm foi suficiente para
provocar a eluição da lisozima, pois ocorreu um aumento significativo da atividade específica
e uma diminuição da condutividade para 41 mS / cm (Tabela 11). Portanto, da mesma forma
que ocorreu com a resina IRC-50, essa diminuição da condutividade deve estar relacionada
com a diminuição dos íons NH4+ livres no eluído, ressaltando que a competição dos íons NH4
+
pelas cargas negativas da resina foi efetiva, provocando a eluição da enzima. Por outro lado,
quando aumentamos a concentração de sulfato de amônio para 0.5 M pH 7 e 0.67 M pH 7.0
não ocorreu um aumento significativo da atividade específica e não houve aumento na
quantidade de proteína, sugerindo que a concentração de sulfato de amônio 0.33 M foi
suficiente, nestas condições, para realizar a eluição da lisozima. Assim, como o volume total
de resina IRP-88 correspondia ao triplo de volume de resina que foi submetido a essas
condições, o processo de extração (eluição, fase c) da lisozima foi realizado novamente com
1.0 M de sulfato de amônio pH 7.0 para posterior purificação por ultrafilitração. Como as
76
amostras obtidas da maneira acima descrita continham uma quantidade alta de sulfato de
amônio foi necessário retirar o sal antes de submetê-las a ultrafiltração.
Para a resina IRC – 50 a fase a (preparação da resina) foi realizada a 8 °C, a fase b
(adsorção da clara à resina) com 1 hora e tampão Tris-HCl 50 mM pH 9.0 e a fase c (eluição)
com sulfato de amônio 1.0 M pH 7. Em seguida, após 30 minutos de eluição, o eluído foi
submetido à diálise a 8 oC com membrana 12 –16.000 MW para remoção de sulfato de
amônio. Assim, 6 mL de eluído foram colocados na membrana de diálise pré-tratada. O tubo
de diálise permaneceu por 16 horas na câmara fria a 8 oC sob agitação. Após a diálise a
amostra foi transferida para tubo de ultrafiltração com membrana de porosidade 50 kDa e foi
centrifugada a 4000 x g em centrífuga refrigerada a 5oC por 20 minutos, obtendo-se o
ultrafiltrado.
Para a resina IRP – 88 foram mantidas as fases a (preparação da resina) e b (adsorção
da clara à resina). A fase c (eluição) foi realizada com sulfato de amônio 1.0 M pH 7.0. O
eluído obtido foi submetido primeiramente à diálise, mas nesse caso, a diálise não foi
eficiente, então o eluído da resina IRP-88 foi submetido ao processo de concentração com
membrana de porosidade 5 kDa sendo adicionada água deionizada, para remoção de sulfato
de amônio. O processo foi realizado em centrífuga refrigerada a 10 oC por 120 minutos. Em
seguida foi realizado o processo de ultrafiltração da amostra concentrada, com membrana de
porosidade 50 kDa centrifugada a 4000 x g em centrífuga refrigerada a 5oC por 20 minutos,
obtendo-se dessa forma o ultrafiltrado. A amostra proveniente do processo de concentração
também foi submetida à uma ultraflitração com membrana de porosidade 30 kDa que foi
centrifugada a 4000 x g em centrífuga refrigerada a 5oC por 20 minutos.
77
Para cada etapa desse processo foi determinada a quantidade de proteína e atividade
enzimática. Realizou-se uma eletroforese (SDS/PAGE) em gel de poliacrilamida 12 % para
verificar a pureza do ultrafiltrado obtido.
Para a extração e eluição realizadas acima com as resinas IRC-50 e IRP-88, foram
acompanhados o perfil de eluição da lisozima (fase c) em função do tempo. Os resultados
estão apresentados na Figura 14.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min.)
Ati
vid
ad
e (
%)
IRC-50
IRP-88
Figura 14 – Avaliação do perfil de eluição da lisozima das resinas IRC-50 e IRP-88 em função do tempo.
Segundo os dados apresentados na Figura 14, notamos que a lisozima apresentou
maior percentagem de atividade no eluído a partir de 10 minutos de agitação e esses valores
se mantém durante 1hora. Esses dados indicam que a eluição da lisozima tanto da resina
IRC-50 quanto da resina IRP-88 aconteceu rapidamente. Esse é um aspecto muito interessante
do método em batelada em relação à cromatografia de troca iônica em coluna, em que a
eluição da proteína de interesse pode ser um processo demorado, podendo levar horas.
Os resultados obtidos durante todo o processo descrito acima até a fase de
ultrafiltração estão apresentados na Tabela 12.
78
Tabela 12– Resumo das etapas de purificação da lisozima com as resinas IRC-50 e IRP-88.
Etapa Volume
(mL)
Unidades
totais (UI)
Proteína total
(mg)
At. Espec.
(U/mg)
Rendimento (%) Fator de
Purificação
Extrato Bruto 90 882000 7605 116 100 1
Eluído 100 680000 460 1478 77 12
Ultrafiltrado
IRC-50
100 540000 80 6750 61 58
Extrato Bruto 80 1088000 6997 155 100 1
Eluído 100 900000 527 1706 83 11
Ultrafiltrado
IRP-88
100 680000 122 5574 62 36
Quando comparamos o processo de extração e purificação de lisozima com a resina
IRC-50 em relação à resina IRP-88 notamos que a recuperação da enzima ocorre de forma
eficiente com ambas as resinas. Pois, segundo a Tabela 12, o ultrafiltrado obtido a partir da
resina IRC-50 apresentou um rendimento de 61% e o ultrafiltrado obtido a partir da resina
IRP-88, apresentou um rendimento de 62%. Esses resultados demonstraram que os
procedimentos adotados foram eficientes durante a ultrafiltração.
Um dos principais fatores responsáveis pelas dificuldades no processo de purificação
da lisozima está relacionado ao fato de existirem na clara do ovo várias outras proteínas além
da lisozima como a ovoalbumina (pI = 4.5), conalbumina (pI = 6.1) e ovomucina (pI = 4.7)
(GHOSH; CUI, 2000). Devido ao pI dessas proteínas, elas interagem eletrostaticamente com a
lisozima (pI = 11) sendo essa interação responsável pela consistência viscosa da clara do ovo.
Assim, para separarmos a lisozima das outras proteínas ainda contaminantes foi
utilizada a ultrafiltração. A ultrafiltração é uma técnica efetiva de concentração ou separação
de moléculas de diferentes tamanhos. Na ultrafiltração os poros da membrana são pequenos o
79
suficiente para impedir a passagem da proteína através da membrana enquanto não impede a
passagem de sal, tampões e água. A concentração da proteína em solução pode ser
aumentada pela passagem do solvente através da membrana enquanto a proteína fica retida.
A ultrafiltração também pode ser empregada como diafiltração, na qual ocorre um processo
como na diálise, entretanto o processo ocorre muito rapidamente e facilmente para grandes
volumes. Apesar da ultrafiltração, ser uma técnica eficiente e escalonável de bioseparação de
proteínas, sua alta resolução de separação é viável somente quando suas condições de uso
estão bem otimizadas. Parâmetros que devem ser otimizados incluem pH, concentração de
sal, concentração da amostra, permeabilidade de fluxo e hidrodinâmica da membrana
(SCOPES, 1982; WHEELWRIGHT, 1991; GHOSH et al., 2003). Uma das principais
dificuldades na ultrafiltração, parece estar relacionada com a amostra que dependendo das
condições (por exemplo altas concentrações salinas) pode formar agregados e também
apresentar formas poliméricas como dímeros e trímeros que dificultam a passagem pelos
poros. Outro fator relevante seria o pH, pois promoveria uma carga residual da membrana e
da proteína podendo aumentar a interação eletrostática entre elas (THOMAS, 1996; GHOSH
et al., 2003). Por outro lado, existem trabalhos anteriores mostrando que em concentrações de
sulfato de amônio de 1.2 M não haveria alterações significativas na estrutura da lisozima
(CHANG; FERNANDEZ, 1998). Por isso, para ocorrer a separação da lisozima de outras
proteínas contaminantes aplicando-se a ultrafiltração, numa segunda etapa, como processo
de purificação, foi necessário um pré-tratamento da amostra eluída, pois, apesar de ter sido
um método rápido, as interações da lisozima com a ovoalbumina, ovotransferina no eluído,
aliada a alta concentração do sulfato de amônio interferiram diretamente na ultrafiltração.
Assim, com a resina IRC-50, somente foi possível a realização da ultrafiltração, de
maneira eficiente, após a diálise do eluído para remoção do excesso de sulfato de amônio e
favorecimento da separação da lisozima das proteínas contaminantes. Dessa forma, foi obtido
80
o ultrafiltrado com membrana de porosidade 50 kDa para facilitar o fluxo da lisozima, que
possui massa molecular de 14.4 kDa, pelos poros da membrana durante a ultrafiltração. Esse
procedimento permitiu a obtenção de 0.8 mg/mL de enzima com um fator de purificação de
58 vezes, com um rendimento de 61 % (Tabela 12).
Através da análise do gel de eletroforese SDS-PAGE 12% (Figura 15), notamos a
grande prevalência da banda correspondente à lisozima no ultrafiltrado obtido com a resina
IRC-50 (poço 3) com massa molecular em torno de 14.4 kDa.
Com a resina IRP-88 a fase de ultrafiltração também exigiu alguns ajustes. Como o
eluído apresentava um aspecto heterogêneo, para realizarmos sua ultrafiltração tivemos
também que retirar previamente o excesso de sulfato de amônio. Por isso, concentramos o
eluído com membrana de 5 kDa e esse concentrado foi posteriormente ressuspendido com
água deionizada para promover a retirada do excesso de sulfato de amônio e também
favorecer o desprendimento da lisozima de proteínas ainda contaminantes do eluído. Após
esse tratamento foi realizada a ultrafiltração com membrana de porosidade 50 kDa com o
mesmo o objetivo de facilitar o fluxo da lisozima pelos poros da membrana durante a
ultrafiltração. Esse procedimento permitiu a obtenção de 1.22 mg/mL de enzima com a resina
IRP-88 apresentando um rendimento de 62% e fator de purificação de 36 vezes (Tabela 12).
Pelo gel de eletroforese SDS-PAGE 12 % (Figura 15), notamos a presença de duas bandas no
ultrafiltrado, (poço 5). Observamos uma banda sutil em torno de 46 kDa que corresponde à
massa molecular da ovoalbumina e outra banda em torno de 14.4 kDa correspondente a banda
de lisozima (indicada pela seta).
81
Figura 15 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS – PAGE 12% com resinas IRC-50 e IRP-88. P: Padrão de massa molecular; 1: extrato bruto (20 µg); 2: eluído obtido com resina IRC-50 (20 µg) 3: ultrafiltrado IRC-5 (20 µg); 4: eluído obtido com a resina IRP-88 (20 µg); 5: ultrafiltrado IRP-88 (20 µg); a seta indica Lisozima 14.4 kDa.
Na tentativa de eliminar a presença da ovoalbumina remanescente no ultrafiltrado da
IRP-88, novamente o eluído foi concentrado com membrana de 5 kDa e a ultrafiltração foi
realizada com membrana de porosidade 30 kDa com objetivo de impedir a passagem da
ovoalbumina de massa molecular de 46 kDa pela membrana. Os resultados estão expressos na
Tabela 13.
19 kDa
47 kDa
86 kDa
5 4 3 2 1 P
34 kDa
26 kDa
82
Tabela 13 – Resumo das etapas de purificação da lisozima com resina IRP-88.
Etapa Volume
(ml)
Unidades
totais (UI)
Proteína
total (mg)
At. Espec.
(U / mg)
Rendimento (%) Fator de
Purificação
Extrato Bruto 80 1088000 6997 155 100 1
Eluído 100 900000 527 1706 82 11
Ultrafiltrado
IRP-88
100 500000 106 4717 46 30
Como podemos notar nos dados apresentados na Tabela 13, o rendimento desse último
processo foi menor (46%), a quantidade de proteína obtida foi de 1.06 mg/mL, com fator de
purificação de 30 vezes. Esses dados indicam que a ultrafiltração com membrana de
porosidade 30 kDa ofereceu maior resistência ao fluxo de lisozima, causando um menor
rendimento. Por outro lado, quando visualizamos o ultrafiltrado no gel de eletroforese de
poliacrilamida SDS-PAGE 12% (Figura 16, poço 3) observamos uma melhor purificação da
lisozima (14.4 kDa).
83
Figura 16 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS – PAGE 12% com resina IRP-88. P: Padrão de massa molecular; 1: extrato bruto (20 µg); 2: eluído obtido com a resina IRP-88 (20 µg); 3: ultrafiltrado IRP-88 (20µg). Onde a seta indica Lisozima 14.4 kDa.
Dessa forma, podemos afirmar que as duas resinas proporcionaram a obtenção de
lisozima segundo a metodologia empregada nesse estudo. Em comparação a outros
procedimentos de extração e purificação de lisozima a partir da clara de ovo, notamos que a
percentagem de rendimento, fator de purificação e atividade específica de 5000 – 7000 U/mg,
obtidos com as resinas IRC-50 e IRP-88, foram semelhantes a trabalhos anteriores (OWEN;
CHASE, 1997; GHOSH; CUI, 2000; ROY et al., 2003).
Assim, as principais vantagens da extração da lisozima utilizando o método em
batelada estão relacionadas com a facilidade do processo, pois a lisozima foi obtida com duas
etapas de purificação sem nenhum pré-tratamento da clara. O método é relativamente rápido,
podendo ser aplicado em escala industrial. Outro aspecto muito interessante desse método é o
P 1 2 3
86 kDa
47 kDa
19 kDa
34 kDa
26 kDa
84
reaproveitamento do resíduo protéico da clara que tem sido utilizado como suplemento
alimentar para animais, em diversos gêneros alimentícios (PROCTOR; CUNNINGHAM,
1988; TUSGE et al., 1996).
Para verificarmos os efeitos decorrentes da complexação do mPEG a enzima, a
lisozima foi modificada por “PEGlação” com três tipos de derivados de polietilenoglicol
ativado: metoxipolietilenoglicol succinimidil succinato (mPEG) de massas moleculares 5 kDa
e 2 kDa e com metoxipolietilenoglicol p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) de 5 kDa.
4.2 Efeito da proporção mPEG succinimidil succinato 5000 e 2000 Da e
mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) 5000 Da no grau de substituição da
lisozima.
O grau de modificação da lisozima (LZ) foi determinado a partir do perfil
eletroforético dos conjugados LZ-mPEG obtidos em gel poliacrilamida SDS-PAGE. Dessa
maneira, foi possível avaliar o efeito da proporção dos mPEG 5000, 2000 Da ou mPEG-pNP
5000 Da no grau de substituição da LZ.
Apesar da eletroforese SDS-PAGE ser frequentemente utilizada para caracterização
dos conjugados obtidos com a “PEGlação”, essa técnica apresenta algumas limitações em
relação à carga, massa molecular, hidrodinâmica da proteína “peglada” e a identificação exata
dos sítios de “PEGlação” na seqüência de peptídeos ou proteína. Por isso, muitas outras
técnicas como métodos colorimétricos, espectroscopia de massa, cromatografia de alta
performance (HPLC) são empregadas para a caracterização desses conjugados. Assim, devido
às dificuldades enfrentadas para se caracterizar os conjugados mPEG-proteína, esse aspecto
da tecnologia de “PEGlação” tem sido alvo de muitos estudos. (HABEEB, 1965; COOK et
al., 1997; VERONESE, 2001; VERONOSE et al., 2001; BALLICO; DRIOLI; BONORA,
2005).
85
Trabalhos realizados anteriormente indicaram que a lisozima é preferencialmente
“peglada” nas lisinas (K) 33, 97 e 116, sendo que a perda de atividade enzimática estaria
condicionada ao grau de substituição obtida, ou seja, quanto mais substituída maior seria a
inativação (ROBERTS; HARRIS, 1998; LEE et al., 2001; LEE; PARK, 2003).
Assim, o efeito do grau de substituição da LZ foi determinado segundo as proporções
propostas como descrito no item 3.2.5. O perfil eletroforético obtido por eletroforese SDS-
PAGE dos conjugados de LZ com cada proporção molar referentes aos mPEG 5000, 2000 e o
mPEG-pNP 5000 estão representados nas Figuras 17, 18 e 19 respectivamente.
Figura 17 - Caracterização dos conjugados de lisozima modificada com mPEG 5000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. P: Padrão Massa Molecular; poço 1: LZ nativa; poço 2: LZ modificada razão mPEG 5000/NH2= 0.11; poço 3: LZ modificada razão mPEG 5000/NH2 = 0.21; poço 4: LZ modificada razão mPEG 5000/NH2 = 0.43; poço5: LZ modificada razão mPEG 5000/NH2=0.86.
P 1 2 3 4 5
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
Lisozima modificada
86 kDa
118 kDa
30 kDa
86
Figura 18-Caracterização dos conjugados de LZ modificada com mPEG 2000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. P: Padrão Massa Molecular; poço 1: LZ nativa; poço 2: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2 = 2.14; poço 3: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2 = 1.11; poço 4: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2 = 0.53; poço 5: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2=0.27.
118 kDa
86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
P 1 2 3 4 5
Lisozima livre: 14.4 kDa
Lisozima modificada
~ 19 kDa
~ 26 kDa
87
Figura 19 - Caracterização dos conjugados de LZ modificada com mPEG-pNP 5000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. P: Padrão Massa Molecular; poço 1: LZ nativa; poço 2: LZ modificada razão mPEG-pNP 5000/NH2 = 0.11; poço 3: LZ modificada razão mPEG-pPN 5000/NH2
= 0.21; poço 4: LZ modificada razão mPEG-pNP 5000/NH2 = 0.43; poço 5: LZ modificada razão mPEG-pNP 5000/NH2=0.86.
De acordo com perfil eletroforético das amostras, podemos visualizar bandas com
massas moleculares superiores a da (LZ) nativa 14.4 kDa. Essas bandas correspondem aos
conjugados de LZ com mPEG 5000 (Figura 17), mPEG 2000 (Figura 18) e mPEG-pNP 5000
(Figura 19).
Esse aumento na massa molecular dos conjugados ocorre devido à modificação
química da LZ pela ligação covalente com os derivados de mPEGs ativados. A reação de
“PEGlação” comumente envolve a ligação entre o PEG eletrofilicamente ativado a resíduos
nucleófilos de lisinas (K) e grupamento N-terminal. A rota mais comum para essa reação
ocorre com os resíduos de lisinas presentes na proteína (ROBERTS et al., 2002).
A LZ apresenta 6 resíduos de lisinas (K1, K13, K33, K96, K97 e K116) todos
localizados na superfície da molécula, e um N-amino terminal, disponíveis para reação
(MASUDA et al., 2005). Como foi verificado em trabalhos anteriores, a reatividade de cada
118 kDa
86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
Lisozima modificada
P 1 2 3 4 5
30 kDa
40 kDa
50 kDa
88
resíduo de lisina em direção ao reagente químico é diferente, porque a reatividade dos 6
resíduos está relacionada com a acessibilidade da superfície de cada ε-amino grupo
(LEE; RICHARDS, 1971; GERKEN et al., 1982). Portanto, na reação de “PEGlação” a
lisozima é preferencialmente “peglada” nas lisinas K33, K97 e K116. Dentre os 6 resíduos de
lisina disponíveis os resíduos K97 e K33 são os que possuem maior reatividade porque são
mais acessíveis para reagirem com os mPEGs ativados (VEERAPANDIAN et al., 1985;
YAMADA et al., 1986; LEE; PARK, 2003; MASUDA et al., 2005).
Dessa forma, a reação de “PEGlação” gera um aumento da massa molecular da
proteína nativa proporcional ao número de polímero que foi ligado covalentemente a ela.
Assim, apesar das limitações da eletroforese SDS-PAGE, observamos nas diferentes razões
molares empregadas com mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 / LZ ( Figura 17 e Figura 19)
uma banda nítida em torno de 30 kDa, indicando que a ligação dos mPEGs ativados aos
resíduos de amino grupos da LZ foi bem sucedida. Nesse caso, observamos que a LZ está tri-
substituída, pois provavelmente, pelo menos 3 moléculas de mPEG 5000 ou mPEP-pNP 5000
estão ligadas covalentemente aos seus grupos aminos mais reativos (K33, K97 e K116).
Esse aumento no tamanho aparente da enzima e de sua massa molecular são
características, propriedades do conjugado mPEG-proteína. Portanto, proteínas “pegladas”
apresentam alterações em suas propriedades físico-químicas quando comparadas à proteína
nativa. Podemos ressaltar entre elas: mudanças conformacionais, impedimento estérico,
alterações nas propriedades eletrostáticas, hidrofobicidade, e também alterações nas
propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas da proteína, que ampliam o potencial de
uso da maioria das proteínas (BAILON; BERTHOLD, 1998, ROBERTS et al., 2002).
É sabido que a “PEGlação” altera sistema de clearance, diminuindo o clearance renal.
Além disso, a ligação do mPEG à proteína forma um envoltório de proteção em torno da
proteína. Essa proteção está associada à hidratação favorecida pelo mPEG à proteína que
89
impede o reconhecimento imunogênico e aumenta a resistência à degradação por enzimas
proteolíticas (REDDY, 2000; HARRIS et al., 2001; GREENWALD, 2001; VERONESE,
2001; GREENWALD et al., 2003; CAZALIS et al., 2004; VERONESE; PAUST, 2005). Em
conseqüência do aumento da massa molecular, a lisozima modificada se move mais
lentamente durante a eletroforese em gel de poliacrilamida (SWANK; MUNKERS, 1971;
ABUCHOWSKI et al., 1977).
Outro aspecto relevante envolvido na reação de “PEGlação” é a extensão do grau de
modificação da proteína. Nos métodos tradicionais de “PEGlação”, que usam mPEG
derivados de primeira geração como mPEG 5000, 2000 ou mPEG-pNP 5000, a variação no
número, a localização dos resíduos de lisina na proteína, e a reação de conjugação são
aleatórias. Por isso, a estequiometria da conjugação mPEG-proteína e os sítios de ligação não
são controlados facilmente, sendo muitas vezes imprecisos (VERONESE, 2001; YUN, et al.,
2005). Assim, a reação de “PEGlação” pode levar a formação de misturas de compostos
diferentes quimicamente (KLINSTLER et al., 2002).
Portanto, dependendo da quantidade de mPEG ativado disponível para reagir com os
resíduos de K da proteína, varia-se o grau de modificação da proteína. Ou seja, quanto maior
for a quantidade de mPEG disponível maior será o grau de modificação. Portanto, múltiplos
resíduos de K podem ser substituídos na lisozima, isso depende diretamente da proporção
mPEG/NH2 empregado na reação. Quando múltiplos resíduos de K são modificados, uma
mistura heterogênea é produzida, composta de uma população de várias moléculas de mPEGs
ligadas por proteína variando de zero até 7 (6 ε-lisina e α-amino) amino grupos da LZ
(VERONESE, 2001; ROBERTS, et al., 2002).
Como podemos observar na Figura 17 (poço 5) e Figura 19 (poço 5), corresponde a
amostra com maior proporção de mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 / NH2 de 0.86. Essa
proporção provocou maior grau de substituição dos resíduos de K na lisozima. Sendo o grau
90
de modificação da LZ maior com o mPEG 5000, o que fica evidenciado devido à distorção
causada no gel, a intensidade do rastro da amostra, e pela diminuição da intensidade da banda
correspondente a LZ livre (14.4 kDa). Esse alto grau de substituição, provocou uma excessiva
“PEGlação” da LZ o que ocasionou a perda de sua atividade enzimática.
Com o mPEG-pNP 5000, nessa mesma proporção de 0.86 ocorreu também o maior
grau de substituição da LZ, porém é possível identificar que a LZ está tri-substituída com uma
banda nítida em torno de 30 kDa, penta-substituída com uma o banda em torno de 40 kDa, e
hepta-substituída com outra banda em torno de 50 kDa. Isso indica que nessa proporção o
mPEG-pNP 5000 provocou maior substituição dos resíduos de K, quando comparado ao
mPEG 5000 que demonstrou maior afinidade pelos 3 resíduos de lisina (K33, K97, K116),
produzindo com nitidez o conjugado de 30 kDa. Também notamos que o mPEG-pNP 5000
livre, presente em excesso, não interferiu na hidrodinâmica das amostras no gel de forma tão
prejudicial quanto o mPEG 5000. Assim, apesar de não haver muitos estudos que explorem a
reação de “PEGlação” da LZ com o mPEG-pNP 5000, os conjugados obtidos com esse mPEG
ativado com grupo p-nitrofenil carbonato teve um bom desempenho em nossos experimentos.
As outras proporções de mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 / NH2 também causaram
modificações na LZ porém, como as relações molares eram menores Figura 17 e Figura 19
(poços 4, 3, 2) o grau de substituição foi menor. Com o mPEG 5000 (Figura 19) observamos
que nas outras proporções mPEG 5000 / NH2 também foi obtida a banda de 30 kDa, sugerindo
a maior afinidade do mPEG succinimidil succinato 5000 Da aos resíduos de lisina (K33, K97,
K116) porém com as proporções de mPEG 5000/NH2 de 0.43 e 0.21 verificamos também a
distorção do gel, provocada por excesso de polímero livre (poços 4 e 3, respectivamente).
Com as mesmas proporções de mPEG-pNP 5000 / NH2 de 0.43 e 0.21 podemos
observar pelos dados da Figura 19 (poços 4 e 3, respectivamente) diferenças no grau de
substituição da LZ em relação ao mPEG 5000. Pois além da banda nítida em torno de 30 kDa
91
podemos observar uma banda nítida em torno de 40 kDa. Dessa forma, podemos verificar que
apesar desses derivados de mPEGs ativados apresentarem a mesma massa molecular de 5000
Da, a reação de “PEGlação” apresentou diferenças em relação ao grau de substituição na LZ.
Provavelmente, essas diferenças estejam relacionadas ao grupo funcional p-nitrofenil
carbonato e sua reatividade em relação aos resíduos de amino grupos; e também pelas
condições em que ocorreu a reação de “PEGlação”. A reação de “PEGlação” da LZ com
mPEG 5000 é incolor, ocorreu em pH em torno de 7.0, e preferencialmente com os resíduos
K33, K97 e K116 (ROBERTS; HARRIS, 1998; NODAKE; YAMASAKI, 2000; LEE et al.,
2001; LEE; PARK, 2003, MATSUDA, et al, 2005). Paralelamente, a reação de “PEGlação”
da LZ com mPEG-pNP 5000 ocorreu em pH 8.0, apresentando no início uma coloração
amarela clara que intensificou-se no decorrer da reação de conjugação. A partir das
diferenças de massas moleculares dos conjugados obtidos, podemos observar que a
substituição dos resíduos de amino grupos apresentou diferenças de reatividade em relação ao
grupo succinimidil succinato, pois após 2 horas observamos conjugados de massas
moleculares em torno de 40 kDa e 50 kDa (BEAUCHAMP et al., 1983; VERONESE et al.,
1985)
O menor grau de modificação da LZ foi obtido com a menor proporção de
mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 / NH2 de 0.11. Pelos dados da Figura 17 e Figura 19
(poço 2) observamos que essa proporção permitiu a obtenção de um conjugado mais
homogêneo, com massa molecular em torno de 30 kDa com ambos os polímeros. Assim, para
se evitar a formação de uma mistura heterogênea de compostos de LZ tri, tetra, multi
substituída a menor proporção de 0.11 foi a mais adequada para ser aplicada na obtenção de
conjugados LZ-mPEG 5000 ou LZ-mPEG-pNP 5000 por “PEGlação” .
92
Dependendo da proteína, enzima é interessante que ocorra a ligação de uma única
molécula de mPEG pois, assim é mais provável que se conserve sua atividade biológica,
evitando-se alterações em seu comportamento, especialmente quando a atividade da enzima
está associada com a interação com um substrato macromolecular, como ocorre com a
lisozima (GAERTNER; OFFORD, 1996).
Desde os primeiros trabalhos sobre modificação de proteínas com mPEG
frequentemente, utiliza-se mPEG de 5000 Da em grande parte dos estudos. Em função disso,
a maioria das drogas aprovadas pelo FDA (repartição do governo americano que testa,
controla e inspeciona alimentos e remédios) envolve proteínas modificadas com mPEG 5000
Da, como ADAGEN®, ONCASPAR®. Porém, existem trabalhos que empregaram diferentes
PEGs com diferentes massas moleculares como PEGs de 350, 750, 2000 Da para
modificação de tripsina (ZHANG et al., 1999), PEG 19000 Da para modificação da catalase e
albumina (ABUCHOWSKI, 1977) e PEG 13000 para modificação da lípase (INADA et al,
1994).
Em alguns estudos têm-se observado que a conjugação de somente uma ou duas
cadeias de PEG de elevada massa molecular é suficiente para produzir conjugados com
propriedades farmacológicas melhores e elevada atividade biológica. Assim, PEGs com
massa molecular na entre 10-60 kDa, com estrutura linear ou ramificada, tem sido a melhor
escolha na conjugação de proteínas de pequena massa molecular como citoquinas e certos
hormônios. Por isso, encontramos PEG-INTRON®, que possui PEG 12.000 e PEGASYS®,
com PEG de 40.000 Da (GREENWALD et al., 2003; CALICETI; VERONESE, 2003).
Assim, o tamanho da cadeia de mPEG empregado é um fator relevante na reação de
“PEGlação”, pois a massa molecular do mPEG exerce uma grande influência sobre as
propriedades biológicas dos conjugados mPEG-proteína (VERONESE, 2001).
93
Dessa forma, apesar do mPEG 2000 possuir o mesmo grupo funcional do mPEG 5000,
o succinimidil succinato, ele apresentou um comportamento distinto em relação ao grau de
substituição dos resíduos de amino grupos da LZ. De acordo com a Figura 18, podemos
observar que as proporções utilizadas de mPEG 2000/NH2, como descritas em métodos,
foram desfavoráveis para a obtenção dos conjugados LZ-mPEG 2000, pois as amostras
apresentaram um elevado grau de modificação, acarretando um aumento de massa molecular
dos conjugados obtidos que apresentaram distorções ao serem caracterizados no gel de
poliacrilamida, interferindo sobremaneira na caracterização dos conjugados obtidos. Apenas a
menor proporção molar mPEG 2000/NH2 de 0.27, Figura 18 (poço 5), permitiu visualizar
bandas com massa molecular, em torno de 19 kDa e 26 kDa.
As diferenças apresentadas por esse polímero estão intrinsecamente relacionadas ao
tamanho de sua cadeia que por ser um pouco menor, apresentou uma maior acessibilidade aos
resíduos de lisinas da LZ, e também ao fato desse polímero mPEG 2000 favorecer a
formação de uma mistura de conjugados “cross- linked”.
Alguns metoxipolietilenoglicóis (mPEGs) comercialmente disponíveis contém
considerável quantidade de PEG-diol devido à presença de uma pequena quantidade de água
durante a reação de polimerização. A quantidade de PEG-diol pode exceder 15% da
composição do mPEG. Quando o mPEG apresenta uma quantidade significativa de PEG-diol
isso é problemático porque a remoção de grupos diol e seus produtos reativos é extremamente
difícil. Além disso, devido à reatividade do PEG-diol ele pode se ligar também à proteína ou
polipepitídeo alvo durante a reação de “PEGlação”, resultando na formação de uma mistura
de produtos conjugados “cross-linked”. Essa mistura de conjugados contaminantes
produzidos interfere diretamente na pureza do derivado “peglado” desejado (VERONESE,
2001).
94
Uma outra conseqüência agravante desse polímero mPEG 2000, e das condições da
reação de “PEGlação” está relacionada com a considerável perda da atividade enzimática da
LZ após a ligação covalente ao mPEG 2000, indicando que o maior grau de modificação da
enzima ocasionou perda da atividade enzimática (ROBERTS; HARRIS, 1998; VERONESE,
2001).
Em função dos resultados obtidos com essa a modificação química da LZ com
mPEG 2000, a reação de “PEGlação” foi realizada sob diferentes condições e com menores
razões molares mPEG 2000/NH2 como discriminado na Tabela 5. O perfil eletroforético dos
conjugados obtidos está representado na Figura 20.
P 1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 20 –Caractrização dos conjugados de LZ modificada com mPEG 2000 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. P:Padrão massa molecular; poços 1, 2, 3, 4: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2 = 0.134 por 2, 24, 48 e 67 horas respectivamente. poços 5, 6, 7, 8: LZ modificada razão mPEG 2000/NH2 = 0.27 por 2; 24 , 48, 67 horas respectivamente.
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
86 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
19 kDa
26 kDa
Lisozima modificada
95
De acordo com o padrão de migração eletroforético das amostras (Figura 20),
observamos que ocorreu uma diferença considerável dos conjugados obtidos de LZ com
mPEG 2000, em relação ao mPEG 5000. Mesmo com as proporções molares de 0.134 ou
0.27, houve formação de conjugados heterogêneos LZ-mPEG 2000. Assim, é possível
identificar, na Figura 20, em todos os poços, duas bandas nítidas em torno de 19 kDa e
26 kDa, indicando que duas moléculas de mPEG 2000 (19 kDa) e aproximadamente 6
moléculas de mPEG 2000 (26 kDa) estão covalentemente ligadas a LZ (14.4 kDa).
O grau de modificação da LZ foi maior com a proporção mPEG 2000/NH2 de 0.27 o
que pode ser observado pela diminuição de intensidade da banda de LZ livre14.4 kDa.
Portanto, como essa proporção molar produziu uma mistura heterogênea de conjugados, e
afetou consideravelmente atividade enzimática da LZ, optamos assim, trabalhar com o
conjugado mPEG2000/NH2 de menor proporção molar de 0.134.
Dessa forma, como a LZ é uma enzima globular de pequena massa molecular
14.4 kDa, notamos pelos resultados obtidos que sua modificação química com mPEG 5000,
mPEG-pNP 5000 ou mPEG 2000 ocorreu de maneira adequada com pequenas quantidades
de polímero, ou seja, nas menores proporções molares 0.11 e 0.134, respectivamente.
Visto que a modificação química da LZ com mPEG 2000 apresentou características
diferenciadas em relação ao mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000 foi estudada a estabilidade da
ligação do mPEG 2000 aos resíduos de lisinas da LZ em função do tempo.
A estabilidade da ligação do mPEG 2000-LZ foi acompanhada nos tempos de 2, 24,
48 e 67 horas (Figura 20). A partir dessas amostras foi observado que o grau de modificação
da lisozima demonstrou ser estável, pois ao longo de todo esse intervalo de tempo não
ocorreu nenhuma alteração considerável no perfil das bandas eletroforéticas obtidas tanto
para razão de 0.134 como para a 0.27.
96
Assim, apesar de possuir algumas limitações, a reação de “PEGlacão” da LZ com
mPEG 2000, apresentou requisitos importantes para esse procedimento como estabilidade e
reprodutibilidade (VERONESE; PASUT, 2005).
Com a finalidade de determinarmos quantitativamente o efeito do grau da substituição
sobre atividade enzimática da LZ foram realizadas medidas de atividade enzimática da LZ
nativa e de seus derivados sobre o substrato Micrococcus lysodeikticus. Paralelamente,
também verificamos o efeito do grau da substituição da LZ sobre outro substrato, o Glicol
Quitosana (como descrito no item 3.2.2), dos conjugados obtidos com cada razão molar de
mPEG 5000/NH2 (Figura 21), mPEG-pNP 5000/NH2 (Figura 22) e com o substrato Glicol
Quitosana (Figura 23).
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,00
20
40
60
80
100
Ativ
idad
e en
zim
átic
a re
sidu
al (
%)
razão molar (mPEG 5000/NH2)
Figura 21 - Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG 5000 succinimidil succinato na razão molar mPEG 5000/ NH2 de 0.11, 0.21, 0.43 e 0.86. A atividade enzimática da LZ nativa era de 1.520 UI / mg de proteína.
97
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,00
20
40
60
80
100
Ativ
idad
e en
zim
átic
a re
sidu
al (
%)
razão molar (mPEG-pNP 5000/NH2)
Figura 22 - Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG 5000 p-nitrofenil carbonato na razão molar mPEG 5000/NH2 de 0.11, 0.21, 0.43 e 0.86. A atividade enzimática da LZ nativa era de 1.520 UI / mg de proteína.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00
20
40
60
80
100
mPEG5000 mPEG-pNP 5000
Ativ
idad
e en
zim
átic
a re
sidu
al (
%)
razão molar (mPEG/NH2)
Figura 23 - Atividade enzimática residual (%) em função do grau de modificação da LZ com mPEG 5000 succinimidil succinato (-■-) ou com mPEG 5000 p-nitrofenil carbonato (-●-) sobre o substrato Glicol Quitosana na razão molar mPEG / NH2 de 0.11, 0.21, 0.43 e 0.86. A atividade enzimática da LZ nativa foi considerado 100%.
98
Como o mPEG 2000 apresentou um comportamento diferente quanto ao grau de
substituição dos resíduos de lisina da LZ em comparação ao mPEG 5000 e ao
mPEG-pNP 5000, a reação de “PEGlação” da LZ foi realizada com apenas a razão molar de
0.27 e 0.134. Com a razão molar de 0.27 ocorreu um grau de modificação da enzima
excessivo, pois ocorreu a formação de conjugados “cross-linked”. Provavelmente, houve uma
perturbação na conformação da enzima, levando a uma considerável perda da atividade
enzimática (INADA et al., 1994). A menor relação mPEG 2000/ NH2 de 0.134 permitiu a
manutenção atividade enzimática em torno de 30%.
Diante dos resultados obtidos, podemos constatar que uma das limitações da
tecnologia de “PEGlação” envolve em muitos casos, uma perda da atividade biológica durante
a conjugação da proteína ao mPEG. Assim, o mesmo mecanismo que é excelente para
prevenir a degradação das proteínas por enzimas proteolíticas ou anticorpos, pode também
dificultar o acesso da proteína ao seu substrato. Isso ocorre principalmente com enzimas que
possuem um substrato de elevada massa molecular tais como peptídeos, proteínas,
polissacarídeos. Portanto, o aumento da massa molecular da enzima “peglada” pode causar
impedimento estérico que prejudica a ligação do sítio ativo da enzima ao seu substrato,
acarretando na perda de sua atividade biológica (KATRE, 1993; ROBERTS; HARRIS, 1998;
VERONESE, 2001, KINSTLER et al., 2002; CAZALIS et al., 2004).
Outra conseqüência da “PEGlação”, responsável pela perda de atividade biológica,
principalmente, no caso da lisozima, é a diminuição de cargas positivas da superfície da
enzima. Os resíduos de lisinas (K) são os responsáveis por grande parte das cargas positivas
da LZ e são importantes para sua atividade enzimática, pois são essenciais para a interação da
LZ com as cargas negativas da parede da célula bacteriana de Micrococcus lysodeikticus.
Portanto, a perda da atividade enzimática da LZ também está associada com a diminuição das
99
cargas positivas devido à ligação dos mPEGs ativados aos amino grupos (YAMASAKI et al.,
1968a; YAMASAKI et al.,1968b; NOKADE; YAMASAKI, 2000).
Por isso, a LZ que é uma enzima pequena (14.4 kDa) e possui como substrato o
polissacarídeo da parede de bactéria Gram-positiva Micrococcus lysodeikticus, ou seja, um
substrato de elevada massa molecular, quando foi altamente modificada com diferentes
mPEGs (mPEG 5000 ou mPEG-pNP 5000) apresentou uma mistura de conjugados de maior
massa molecular, em função da ligação desses polímeros, o que consequentemente ocasionou
além da diminuição de suas cargas positivas necessárias para interagirem com seu substrato,
provocou também o impedimento estérico, dificultando o acesso do sítio catalítico da enzima.
Logo, na proporção molar mPEG/NH2 de 0.86, a atividade enzimática da lisozima modificada
foi muito baixa como podemos observar pelas Figuras 21 e 22 onde a atividade enzimática
residual da LZ-mPEG 5000 é de 3% e da LZ-mPEG-pNP 5000 de 8% .
Diante dessas considerações, podemos verificar pelas Figuras 21 e 22 que à medida
que se diminuiu o grau de modificação da LZ, maior (%) de atividade enzimática residual.
Portanto, a razão molar de 0.11 com mPEG 5000/NH2 ou mPEG-pNP 5000 foi a mais
adequada, porque a atividade enzimática residual foi de 67% e 77% respectivamente.
Com o mPEG 2000 a proporção mais adequada foi de 0.134 que manteve 30% da
atividade enzimática em relação à enzima nativa .
Assim, o impedimento estérico provocado pela modificação da LZ com mPEG 5000,
mPEG 2000 ou mPEG-pNP 5000 interferiu diretamente sobre a atividade lítica da LZ em
direção a parede bacteriana do Micrococcus lysodeikticus, dificultando o acesso da enzima,
acarretando na perda da atividade enzimática.
Há uma série de estudos que demonstra a perda de atividade enzimática como
conseqüência da reação de “PEGlação”. Esse obstáculo não ocorre apenas com a lisozima da
clara de ovo de galinha, mas também ocorreu com a modificação da catalase
100
(ABUCHOWSKI et al., 1977), uricase (VERONESE et al., 1996), tripsina (ZHANG; GUAN,
1999), L-asparaginase (ASHIHARA et al, 1978; SOARES et al., 2002; ZHANG et al., 2004).
Por outro lado, quando utilizamos um substrato menor e menos complexo, o polímero
Glicol Quitosana, observamos que a modificação da LZ com mPEG 5000 ou
mPEG-pNP 5000 nas diferentes razões molares (Figura 23) não afetou a atividade lítica da
LZ. Esses resultados indicam que a modificação da LZ por “PEGlação” não ocasionou uma
alteração estrutural do sítio catalítico da enzima. Resultados semelhantes foram obtidos com a
acetilação da LZ (YAMASAKI et al., 1968), com a ligação de peptídeos hidrofóbicos
(ARIMA et al., 1997) e com a modificação química da LZ com mPEG-COONSu 5000
(NODAKE; YAMASAKI, 2000).
Dessa forma, o efeito específico da “PEGlação” sobre as propriedades físico-químicas e
biológicas da proteína é estritamente determinado pelas propriedades da proteína e do
polímero, bem como, pela estratégia de “PEGlação”adotada. Relevantes parâmetros devem
ser considerados para a obtenção do conjugado proteína-polímero como: estrutura, massa
molecular, composição da proteína e forma, pureza do polímero, número de ligantes na cadeia
do polímero, além da química da reação de conjugação, isso, porque dependendo do grau de
modificação sofrido pela proteína, pode-se ocasionar a perda de sua atividade biológica
(CALICETI; VERONESE, 2003).
101
4.3 Influência do tempo no grau de substituição de lisozima.
A cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000, 2000 ou mPEG-pNP 5000
foi acompanhada em função do tempo como descrito em 3.2.6. Os resultados obtidos da
cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 estão representados nas Figuras 24
e 25. A cinética da reação da LZ com mPEG 2000 está representa pela Figura 26 e o
resultado obtido com o mPEG-pNP 5000 está representado pela Figura 27.
Figura 24 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão Hepes pH 7.5 e as amostras foram preparadas na ausência de 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
P 1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 120’
34 kDa
30’ 60’
47 kDa
19 kDa
86 kDa Lisozima modificada
30 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
118 kDa
26 kDa
102
Figura 25 – Cinética da reação de“PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão Hepes pH 7.5 e as amostras foram preparadas com 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
Figura 26 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 2000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão Hepes pH 7.5 e as amostras foram preparadas com “Sample buffer” na ausência de 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 30’ 60’ 120’ P
86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
Lisozima modificada
Lisozima livre: 14.4 kDa
30 kDa
118 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
Lisozima modificada
P 1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 30’ 60’ 120’
118 kDa 86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
103
Figura 27 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG-pPN 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão Hepes pH 7.5 e as amostras foram preparadas na ausência de 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
O polietilenoglicol é tipicamente ligado a proteínas, polipeptídeos via α- e ε-amino
grupos e grupos terminais reativos, levando a formação de ligações covalentes estáveis como
ligações amina, amida ou uretano. Assim, uma série de derivados ativados de polietilenoglicol
tem sido usado como reagentes para tecnologia de “PEGlação”, incluindo o PEG
succinimidil succinato que é amplamente utilizado (ZALIPSKY, 1995; BULLOCK et al.,
1996) e o PEG-p-nitrofenil carbonato que perante a literatura especializada ainda encontra-se
com uma aplicação mais limitada (Figura 28).
Assim, o estudo da cinética da reação de “PEGlação” com o mPEG ativado com os
grupos funcionais succinimidil succinato ou p-nitrofenil carbonato é interessante para elucidar
diferentes aspectos da reação de “PEGlação”.
86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
30 kDa
40 kDa
Lisozima modificada
118 kDa
P 1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 30’ 120’ 60’
104
Figura 28 -Representação estrutural (a) PEG succinimidil succinato e (b) PEG-p-nitofenil carbonato (Adaptado de VERONESE; PASUT, 2005).
De acordo com os resultados obtidos com a reação de “PEGlação” da LZ com o
mPEG 5000 (Figura 24 e 25) e mPEG 2000 (Figura 26) podemos constatar que compostos
que possuem o grupo funcional succinimidil succinato são altamente reativos em direção aos
grupos aminos disponíveis na molécula de lisozima. Portanto, tanto a reação da LZ com
mPEG 5000 ou mPEG 2000 teve início quase que instantaneamente, 1 minuto após o início
da reação (VERONESE, 2001; VERONESE; PASUT, 2005).
Os conjugados obtidos LZ-mPEG 5000 apresentaram o mesmo perfil de substituição,
e conforme o aumento do tempo de reação aumentou-se intensidade da banda em torno de
30 kDa, no final de 2 horas. Esse resultado demonstra a maior afinidade do mPEG 5000 pelos
resíduos de K33, K97 e K116 como sugerido por LEE e PARK, (2003).
A reação de conjugação da LZ-mPEG 2000 apresentou uma cinética bem diferente em
relação ao mPEG 5000. Como podemos observar pelos dados da Figura 26, o mPEG 2000
também é altamente reativo, devido ao grupo succinimidil succinato, porém sua substituição
aparentemente é inespecífica, pois ocorre a substituição dos resíduos mais reativos na
molécula de LZ, os resíduos de lisina ( K33, K97, K116), mas como esse polímero está em
uma razão molar mPEG 2000/NH2 de 0.86 ocorreu um elevado grau de modificação da LZ, e
também a formação de conjugados “cross-linked” devido possivelmente, a presença de grupos
diol. Assim, primeiramente foram ligados mPEG 2000 nos resíduos mais reativos de lisinas
(b)
(a)
105
(bandas em torno de 19 kDa e 26 kDa) e em função do tempo de reação as bandas
aumentaram em número e em massa molecular, indicando que essa proporção mPEG
2000/lisozima ocasionou um inespecífico e elevado grau de modificação de LZ no final de 2
horas de reação.
A partir das Figuras 24 e 25 podemos observar que não ocorreram alterações
consideráveis no perfil eletroforético das amostras tratadas com 2-mercaptoetanol das
amostras que não foram tratadas. Esse reagente é um agente redutor empregado para romper
as pontes dissulfetos que participam da estrutura terciária da proteína e utilizado na
composição do “Sample buffer” para preparação das amostras a serem aplicadas na
eletroforese (LAEMMLI, 1970). Segundo esses resultados, é possível observar que o perfil
eletroforético da cinética de reação de “PEGlação” da LZ-mPEG 5000 obtido com as
amostras preparadas na ausência de 2-mercaptoetanol apresentou melhor nitidez (Figura 24).
Em função disso, a cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 2000 ou mPEG-pNP
5000 foi acompanhada com as amostras preparadas sem 2-mercaptoetanol.
A cinética de reação de “PEGlação” da LZ com mPEG-pNP 5000 (Figura 27) indica
uma cinética de substituição mais lenta quando comparada com a cinética do mPEG 5000 ou
mPEG 2000. Portanto, o fato do mPEG-pNP 5000 exibir uma velocidade de reação mais
lenta, permite explorar as diferenças de reatividade dos distintos grupos aminos das proteínas
ou polipepitídeos empregados na reação de “PEGlação”. Assim, esse composto (mPEG-pNP
5000) permite que se interrompa a reação em um determinado intervalo de tempo a fim de
obter um conjugado com o grau de modificação desejado (VERONESE et al., 2001;
VERONESE; PASUT, 2005).
Com o mPEG-pNP 5000 percebemos que sua ligação a LZ ocorreu preferencialmente
em direção aos amino grupos mais reativos da LZ ( K33, K97, K116), como observado com o
mPEG 5000 produzindo uma banda em torno de 30 kDa. O desenvolvimento da reação em
106
função do tempo, mostrou um aumento da intensidade da banda em torno de 30 kDa, e no
final de 2 horas verificamos a formação de 2 conjugados: um representado pela banda em
torno de 30 kDa e outro representado pela banda em torno de 40 kDa ( Figura 27).
Assim, a partir do padrão obtido em gel de poliacrilamida (Figura 27) podemos
constatar uma propriedade muito interessante desse composto, pois no instante de 30 minutos
após o início da reação, observamos nitidamente apenas a banda correspondente ao conjugado
de 30 kDa, sem a mistura heterogênea de outros conjugados, indicando que esse intervalo de
tempo seria o ideal para se obter um conjugado mais homogêneo de LZ-mPEG-pNP 5000 que
facilitaria sua purificação do excesso de polímero e da lisozima livre. Esse fato não aconteceu
com outros intervalos de tempo, sendo que nos instantes de 60 e 120 minutos já ocorre a
formação de uma mistura de conjugados que fica nítida após 120 minutos, representada pelas
bandas em torno de 40 kDa e 50 kDa (Figura 27).
Dessa forma, o conjugado LZ-mPEG-pNP 5000 foi um interessante derivado obtido,
pois esse tipo de conjugado não está extensivamente explorado, havendo portanto poucos
estudos envolvendo a modificação química da LZ com o mPEG-pNP 5000. Nesse sentido, o
estudo do conjugado LZ-mPEG-pNP 5000 contribuiu com informações detalhadas a respeito
do emprego desse polímero na tecnologia de “PEGlação”.
Com finalidade de verificarmos se a natureza química do tampão de reação empregado
no processo de “PEGlação” causava alguma interferência na cinética da reação, realizamos o
mesmo procedimento empregado com mPEG 5000 de acordo com o Tabela 6, porém
utilizando como tampão de reação o tampão fosfato salino pH 7.3. Os resultados estão
apresentados nas Figuras 29 e 30.
107
Figura 29 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão fosfato salino pH 7.3 e as amostras foram preparadas com “Sample buffer”na ausência de 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
Figura 30 – Cinética da reação de “PEGlação” da LZ com mPEG 5000 acompanhada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%. A reação foi realizada em tampão fosfato salino pH 7.3 e as amostras foram preparadas com “Sample buffer” acrescido de 2-mercaptoetanol. P: Padrão de massa molecular; 1’, 3’, 5’, 7’, 10’, 20’, 30’, 60’ e 120’ indicam o intervalo de tempo em minutos das amostras submetidas à eletroforese.
34 kDa
47 kDa
19 kDa
86 kDa
Lisozima modificada
30 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
26 kDa
118 kDa
1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 30’ 60’ 120’ P
P 1’ 3’ 5’ 7’ 10’ 20’ 30’ 60’ 120’
Lisozima modificada
30 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
19 kDa
26 kDa
34 kDa
47 kDa
86 kDa
118 kDa
108
A partir dos resultados apresentados notamos que o tipo do tampão empregado para
reação não teve uma interferência significativa, principalmente porque o pH tanto do tampão
HEPES como do tampão fosfato salino é próximo das condições fisiológicas, em torno de 7.0.
Assim, a principal diferença entre esses tampões está relacionada à natureza química, pois o
tampão fosfato salino apresenta maior número de íons em solução do que o tampão biológico
HEPES.
Nas duas condições testadas, os perfis eletroforéticos das amostras tratadas com ou
sem 2-mercaptoetanol foram similares. Por isso, é possível comparar os resultados obtidos
com tampão HEPES (Figuras 24 e 25) com tampão fosfato salino (Figuras 29 e 30). Isso fica
evidente devido à obtenção do conjugado com massa molecular em torno de 30 kDa, com a
mesma cinética de “PEGlação”.
4.4 Isolamento da lisozima modificada
A lisozima foi modificada com mPEG 5000, mPEG 2000 ou mPEG-pNP 5000 e
isolada segundo condições propostas no item 3.2.7. A Figura 31 representa a eletroforese em
gel de poliacrilamida 12% das frações recolhidas com o procedimento de purificação por Gel
Filtração dos conjugados lisozima-metoxipolietilenoglicol succinimidil succinado de 5000 Da
(LZ-mPEG 5000) e lisozima-metoxipolietilenoglicol succinimidil succinado de 2000 Da
(LZ-mPEG 2000). A Figura 32 representa a eletroforese em gel de poliacrilamida 12% das
frações recolhidas com procedimento de purificação por Gel Filtração dos conjugados
lisozima-metoxipolietilenoglicol p-nitrofenil carbonato de 5000 Da.
109
Figura 31 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% das frações obtidas por cromatografia de Gel Filtração. P: padrão de massa molecular; poços 1, 2, 3, 4: frações obtidas a partir da eluição com Gel Filtração da lisozima modificada com mPEG 2000. Poços: 5, 6, 7, 8 frações obtidas da eluição com gel filtração da lisozima modificada com mPEG5000.
Ao analisarmos o padrão de migração obtido em gel de poliacrilamida (Figura 31)
temos que a lisozima modificada com mPEG 2000 apresenta uma mistura de bandas em torno
de 19 kDa e 26 kDa mesmo após a Gel Filtração poços 1, 2, 3. Isso ocorreu, devido ao fato da
massa molecular desses conjugados obtidos serem próximas. Por outro lado, a lisozima
modificada com mPEG 5000 apresentou uma banda nítida em torno de 30 kDa (poço 5) que
corresponde a lisozima “peglada” sem a presença de LZ livre. As frações representadas nos
poços 1, 2 e 3 foram concentradas por ultrafiltração em membrana de porosidade 5 kDa e
dessa forma foi obtido 1 mL da amostra LZ-mPEG 2000. As frações representadas nos
poços 5, 6 e 7 também foram concentradas por ultrafiltração em membrana 5 kDa e dessa
forma foi obtido 1 mL do conjugado LZ-mPEG 5000.
1 2 3 4 5
34 kDa
26 kDa
19 kDa
P 6 7 8
47 kDa
86 kDa
118 kDa
Lisozima livre: 14.4 kDa
110
Esse mesmo procedimento de purificação por cromatografia de Gel filtração e
concentração das frações correspondentes a LZ modificada foi realizado com a “PEGlação”da
LZ com o mPEG-pNP 5000. O perfil de eluição da LZ modificada com o mPEG-pNP 5000
(Figura 32).
Figura 32 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% das frações obtidas por cromatografia de Gel Filtração. P: padrão de massa molecular; poços 1, 2, 3, 4: frações obtidas a partir da eluição com Gel Filtração da lisozima modificada com mPEG-pNP 5000.
Dessa forma, os conjugados LZ-mPEG foram obtidos após o procedimento de
purificação por cromatografia de Gel Filtração e concentração por ultrafiltração das frações
correspondente a LZ “peglada”. O conjugado obtido com o mPEG 2000 (Figura 33, poço 2)
corresponde à uma mistura de conjugados de massa molecular em torno de 19 kDa e 26 kDa.
Embora, seja comum a obtenção de um alto número de conjugados, em muitos casos,
nos quais, a reação de “PEGlação” envolve mPEGs que se liguem aos grupos aminos das
proteínas, essa é uma limitação da aplicação desses polímeros, pois cada vez mais, tem-se
exigido, principalmente pelo FDA, que os conjugados mPEG-proteína apresentem alta pureza
118 kDa 86 kDa
47 kDa
34 kDa
26 kDa
19 kDa
1 2 3 4 P
30 kDa
111
e que a metodologia empregada na “PEGlação” permita identificar o sítio de ligação da
molécula de mPEG na estrutura primária da proteína (VERONESE, 2001; KLINSTLER et al.,
2002; VERONESE; PASUT, 2005).
Assim, os conjugados obtidos com mPEG 5000 (Figura 33, poço 3) ou mPEG-pNP
5000 (Figura 33, poço 4) apresentaram uma banda nítida em torno de 30 kDa com ambos os
polímeros, enquanto que com o mPEG 2000 temos uma mistura de conjugados ((Figura 33,
poço 2).
Figura 33 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12 % dos conjugados
obtidos com a modificação da LZ por “PEGlação”. Poço 1: lisozima
nativa; poço 2: LZ-mPEG 2000; poço 3: LZ- mPEG 5000; poço 4:
LZ- mPEG-pNP 5000.
P
19 kDa
26 kDa
34 kDa
47 kDa
118 kDa
86 kDa
1 2 3 4
112
4.5 Verificação da atividade e estabilidade biológica da lisozima modificada em função
do pH .
Para verificarmos a atividade e a estabilidade biológica dos conjugados obtidos com a
modificação da lisozima com os diferentes mPEGs (mPEG 5000; 2000 ou mPEG-pNP 5000),
como descrito no item 4.4. foi estudado o comportamento da lisozima nativa e de cada de um
dos seus derivados (LZ-mPEG 5000; LZ-mPEG 2000; LZ-mPEG-pNP 5000) em função do
pH e da temperatura. Existem poucos trabalhos que verificaram esse comportamento da LZ e
de seus derivados “peglados” nessa faixa ampla de pH, principalmente em pH >10.
A atividade enzimática e a estabilidade da lisozima nativa e de seus derivados foi
determinada em diferentes tampões, variando o pH de 4 a 12 como descrito em 3.2.8. Os
resultados obtidos referente aos ensaios da determinação da atividade enzimática da LZ nativa
e de seus derivados LZ-mPEG 5000; LZ-mPEG 2000 ou LZ-mPEG-pNP 5000 estão
representados pela Figura 34.
113
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozimaA
tivid
ade
(%)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima lisozima-mPEG 5000
Ativ
idad
e (%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima lisozima-mPEG 2000
Ativ
idad
e (%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozima lisozima-mPEGp-NP
Ativ
idad
e (%
)
pH
Figura 34 – Efeitos do pH sobre a atividade enzimática (%) da lisozima nativa e seus derivados. Lisozima nativa (A), lisozima-mPEG 5000 (B), lisozima-mPEG 2000 (C), lisozima-mPEG-pNP 5000 (D) em diferentes tampões variando o pH de 4 a 12 (4.0-5.0 acetato 50 mM; 6.0-8.0 Hepes 50 mM e 9.0-12 Tris-HCl 50 mM) a 25°C.
(A) (B)
(C) (D)
114
A Figura 34 mostra o efeito do pH sobre a atividade enzimática da lisozima (A) e de
seus derivados “peglados” (B), (C) e (D). Assim, notamos que a reação de “PEGlação”
ocasionou alterações marcantes no perfil de ação da lisozima sobre substrato Micrococcus
lysodeikticus.
Nas condições do ensaio a lisozima nativa apresentou pH ótimo de ação entre 7 e 8
enquanto que para LZ-mPEG 5000 (B), LZ-mPEG 2000 (C)) o pH ótimo de ação foi 6.0, e
para o LZ-mPEG-pNP 5000 (D apresentou pH ótimo em 6.0 e 9.0, ou seja, ocorreu um
deslocamento do pH ótimo de atividade em relação ao da lisozima nativa. Em pH 7.0
observamos uma queda de atividade da LZ-mPEG 5000 em torno de 50%, LZ-mPEG 2000
em torno de 70% . Nesse mesmo pH o conjugado LZ-mPEG-pNP 5000 também apresentou
um perfil de ação sobre o Micrococcus lysodeikticus diferenciado, porém a perda de
atividade em relação à LZ nativa foi em torno de 20%.
Para pH acima de 8 a lisozima nativa apresentou uma queda significativa de atividade
enquanto que seus derivados LZ-mPEG 5000, LZ-mPEG 2000 ou LZ-mPEG-pNP 5000
apresentaram atividade em torno de 80%, 60% e 100% respectivamente, em pH 9.0. Em
extremos de pH, ou seja, 4 e 12 a lisozima nativa e seus derivados perdem atividade
enzimática significativamente. Como foi verificado por HOMCHAUDHURI, et al. (2006), a
exposição da LZ nativa a pH 12.2 a 25°C produz a formação de agregados o que
provavelmente, ocasiona a perda de atividade enzimática.
Assim, a estabilidade estrutural da enzima em relação a agentes desnaturantes, tais
como pH e temperatura, é responsável pela manutenção de sua atividade enzimática. Por isso,
a influência do pH e a da temperatura são parâmetros críticos que interferem na atividade
biológica das enzimas. Além disso, temos que o pH ótimo de uma enzima é dependente de
vários parâmetros experimentais, incluindo tempo de reação, temperatura, natureza e
concentração do substrato, natureza e concentração do tampão, força iônica do meio e pureza
115
da enzima (WHITAKER, 1994). Por outro lado, o efeito do pH da solução sobre a proteína
promove sua adsorção que interfere com sua atividade enzimática. Essa adsorção para estar
relacionada com as propriedades físico-química da proteína como: tamanho, dimensão, e
carga eletrostática (LEE et al., 2002).
A atividade enzimática da LZ tem sido tradicionalmente medida pela observação da
lise de células liofilizadas de Micrococcus lysodeikticus. A máxima atividade específica da
LZ a 25 °C usando Micrococcus lysodeikticus como substrato é de aproximadamente 50.000
UI/mg , mas pode ser menos de 20.000 UI/mg dependendo das condições (pH, natureza
química dos tampões) de tratamento da LZ e de seu substrato (JOHNSON; LARSON, 2005).
A atividade lítica da LZ vem sendo estudada há tempos, principalmente devido às
particularidades que essa enzima possui. A LZ pode ser inativa na ausência de sais, indicando
que atividade lítica dessa enzima apresenta uma dependência da concentração, da força iônica
e da natureza química dos íons (cátions) e dos tampões empregados no preparo da suspensão
de células de Micrococcus lysodeikticus. Em função disso, geralmente a atividade lítica da LZ
aumenta com o aumento da força iônica, contudo se a suspensão de células de Micrococcus
lysodeikticus estiver com uma elevada concentração de sais, força iônica, em dado pH pode
ocorrer a inibição da LZ (FLEMING; ALLISON, 1922; BOASSON, 1938; FEINER et al.,
1946; SMOLELIS; HARTSELL, 1952; JOHNSON; LARSON, 2005).
No centro catalítico da LZ encontramos dois aminoácidos ácidos. E a interação entre a
LZ e seu substrato se trata de uma catálise ácido-base que envolve os dois aminoácidos, o
glutamato 35 (Glu 35) e o ácido aspártico 52 (Asp 52). Esses aminoácidos se encontram em
lados opostos do ponto de ação da LZ no substrato, a ligação glicosídica β (1-4) característica
dos peptídeoglicanos bacterianos cujo dissacarídeo é constituído de N-acetil glucosamina
(NAG) e N-acetil murâmico (NAM). A região onde está cada um desses aminoácidos é
diferente. O Asp 52 se encontra rodeado de grupos polares e no pH próximo ao fisiológico,
116
ele fica ionizado. Por outro lado, o Glu 35 está em uma região apolar e próximo ao pH
fisiológico ele está protonado, não ionizado. Assim, o meio em que se encontra cada um dos
resíduos determina seu papel no processo catalítico sendo, o Glu 35 e Asp 52 fundamentais na
ação catalítica da LZ. Por isso, o pH influencia nesse mecanismo catalítico porque quando o
pH aumenta o Glu 35 se ioniza, e quando ocorre uma diminuição do pH é o Asp 52 que se
protona.
Trabalhos anteriores demonstraram que o pH ótimo para a lise do Micrococcus
lysodeikticus “in vitro” pela LZ da clara de ovo de galinha é aproximadamente 6.6
(PROCTOR; CUNNINGHAM, 1998). Sua atividade enzimática é observada numa faixa de
pH de 3.5 a 7.0 (WANG; SHELEF, 1992), entretanto, menor atividade tem sido observada em
pH abaixo de 3.5 ou acima de 7.0 (SMOLELIS; HARTSELL, 1952; YANG;
CUNNINGHAM, 1993). O pH ótimo de atividade da LZ é fortemente dependente da
concentração do sal (CHANG; CARR, 1971; DAVIES et al., 1969) e para valores de pH
abaixo de 5.3 o produto da reação pode inibir a enzima (JOHNSON; LARSON, 2005).
Assim, levando-se em consideração os fatores que interferem na atividade enzimática
da lisozima, podemos observar a partir dos resultados obtidos (Figura 34 A) que a LZ nativa
apresentou um comportamento similar ao que está descrito na literatura. Outro aspecto que foi
observado em relação à medida da atividade lítica da LZ é que quando se realizou a medida
da atividade enzimática com a suspensão de Micrococcus lysodeikticus em tampão fosfato
0.1 M, pH 7.0 a atividade lítica obtida foi menor do que quando mensurada em tampão fosfato
0.05 M pH 7.0 (valores não mostrados), apresentando, em baixas concentrações salinas, um
aumento não específico da atividade enzimática (DAVIES et al., 1969; SMOLELIS;
HARTSELL, 1952; CHANG; CARR, 1971; TRANTER, 1994; JOHNSON; LARSON, 2005).
Isso, confirma a influência da concentração do sal e a força iônica do tampão empregado,
sobre a atividade lítica da LZ.
117
A modificação química da lisozima com mPEG 5000 (Figura 34 B), mPEG 2000
(Figura 34 C) ou mPEG-pNP 5000 (Figura 34 D) causou um deslocamento no pH ótimo
(pH 6) em relação à enzima nativa (pH entre 7 e 8). Dessa forma, o perfil de atividade dos
conjugados obtidos sobre o Micrococcus lysodeikticus foi modificado, indicando que a
complexação da LZ com os diferentes polímeros empregados causou alterações
conformacionais na enzima que refletiram em mudanças no perfil de atividade de cada
derivado frente ao pH. A lisozima modificada apresentou uma queda de atividade em pH 7.0,
sendo essa queda mais significativa com os conjugados LZ-mPEG 5000, LZ-mPEG 2000.
Estudos de modificação química têm indicado, que as cargas positivas dos aminos
grupos da lisozima estão envolvidos na hidrólise catalítica do peptídeoglicano da parede das
bactérias Gram-positivas. Essas cargas positivas dos amino grupos são essenciais porque
interagem eletrostaticamente com a parede da bactéria Micrococcus lysodeikticus carregada
negativamente, auxiliando na lise celular (YAMASAKI et al., 1968a; YAMASAKI et al.,
1968b; MASUDA et al., 2005). Assim, quando ocorre a ligação covalente da lisozima aos
diferentes polímeros (mPEG 5000, mPEG 2000 ou mPEG-pNP 5000) ocorre uma diminuição
dos amino grupos livres da lisozima, o que pode estar diminuindo sua atividade catalítica.
Esse comportamento foi observado em pH 7.0, no qual ocorre uma diminuição de cargas no
meio externo, pH neutro, associada com a diminuição das cargas positivas presentes na
superfície da lisozima (IMOTO, 1983; NODAKE et al., 2002; LEE et al., 2002).
Entretanto, em 9 < pH < 12 os derivados LZ-mPEG 5000, LZ-mPEG 2000 ou
LZ-mPEG-pNP 5000 apresentaram maior atividade catalítica em relação à LZ nativa. Nessas
condições, percebemos que a reação de “PEGlação”conferiu uma maior resistência a
condições desnaturantes para a LZ nativa. Esses conjugados caracterizam-se por apresentar
uma superfície de hidrofobicidade maior do que a LZ nativa. Existem evidências, indicando
que ligação covalente de mPEGs aos resíduos de lisina 33 não altera a estrutura secundária ou
118
terciária da molécula de LZ (MALZERT et al., 2003) o que não prejudica sua atividade
enzimática sob certas condições.
Estudos de cristalografia de raio-X e modificação química têm sugerido que a lisina
33 é o mais exposto dentre os 6 resíduos de lisina da LZ e está mais distante da fenda do sítio
catalítico da LZ (BLAKE et al., 1967; YAMADA et al., 1986). Como foi sugerido por
NODAKE et al. (2002) a modificação química por “PEGlação” aparentemente, não envolve
completamente a molécula de LZ, porém contribui para criar uma região hidrofóbica em uma
parte específica da molécula de LZ. Essa propriedade da “PEGlação” promoveria a atividade
lítica da LZ em pH básicos.
A estabilidade biológica da lisozima, LZ-mPEG 5000, LZ-mPEG 2000 e
LZ- mPEG-pNP 5000 foi verificada em diferentes tampões, numa ampla faixa de pH de 4.0 a
12, sob temperaturas de 25 °C e 50 °C. Nessas condições foram obtidos os perfis de
estabilidade representados nas Figuras 35 e 36.
119
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima
Est
abili
dade
(%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozima lisozima-mPEG 5000
Est
abili
dae
(%)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
Lisozima Lisozima-mPEG 2000
Est
abili
dade
(%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozima lisozima-mPEG-pNP 5000
Est
abili
dade
(%
)
pH
Figura 35- Perfil de estabilidade (%) da lisozima nativa e de seus derivados. Lisozima nativa (A), lisozima-mPEG 5000 (B), lisozima-mPEG 2000 (C) e lisozima-mPEG-pNP 5000 (D) realizado pela incubação das amostras por 1 hora a 25 ºC em diferentes tampões variando o pH de 4 a 12 (4-5 acetato 50 mM; 6-8 Hepes 50 mM; 9-12 Tris-HCl 50mM).
(A) (B)
(D) (C)
120
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100 lisozima
Est
abili
dade
(%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozimalis-mPEG5000
Est
abili
dade
(%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozima lis-mPEG2000
Est
abili
dade
(%
)
pH
4 6 8 10 120
20
40
60
80
100
lisozima lis-mPEGpNP 5000
Est
abili
dade
(%
)
pH
(C)
(A) (B)
(D)
Figura 36 - Perfil de estabilidade (%) da lisozima nativa e de seus derivados. Lisozima nativa (A), lisozima-mPEG 5000 (B), lisozima-mPEG 2000 (C) e lisozima-mPEGpNP 5000 (D) realizado pela incubação das amostras por 1 hora a 50 ºC em diferentes tampões variando o pH de 4 a 12 (4-5 acetato 50 mM; 6-8 Hepes 50 mM; 9-12 Tris-HCl 50mM).
121
De acordo com os dados representados na Figura 35 podemos notar que lisozima
nativa (Figura 35 A) e seus derivados, LZ-mPEG 5000 (Figura 35 B), LZ-mPEG 2000
(Figura 35 C) e LZ-mPEG-pNP 5000 (Figura 35 D)) permaneceram estáveis em uma
ampla faixa de pH (4-12) a 25 °C. A LZ nativa apresentou uma estabilidade acima de
80% nos diferentes pHs enquanto que seus derivados lisozima mPEG 2000
(Figura 35 C), lisozima-mPEG-pNP 5000 (Figura 35 D) apresentaram pequenas
variações na estabilidade nos diferentes pHs. O conjugado lisozima-mPEG 5000
(Figura 35 B) apresentou estabilidade bem próxima a LZ nativa, sendo mais estável em
pH > 9.
Quando a temperatura foi dobrada para 50 °C (Figura 36), o derivado
LZ-mPEG 2000 (Figura 36 C) ficou menos estável em pH < 8, e apresentou estabilidade
semelhante em relação à LZ nativa em pH > 9 até 11. LZ-mPEG 5000 ( Figura 36 B),
LZ-mPEG-pNP 5000 (Figura 36 D) apresentaram perfis de estabilidade semelhantes LZ
nativa em função do pH. Em pH 12 os conjugados LZ-mPEG 5000 (Figura 36 B),
LZ- mPEG 2000 (Figura 36 C) e LZ-mPEG-pNP 5000 (Figura 36 D) apresentaram maior
estabilidade do que a LZ nativa.
Como as proteínas são moléculas anfifílicas constituídas por α- hélices e folhas β
sua superfície externa está diretamente envolvida com sua função e atividade. Assim,
propriedades moleculares das proteínas como interações eletrostáticas, superfície de
hidrofobicidade, estabilidade estrutural, massa molecular caracterizam sua função
(LEE, et al., 2002). Por isso, a estabilidade de uma proteína é principalmente dependente
das interações de sua cadeia de aminoácidos e elementos da estrutura secundária. Dentre
as ligações mais fortes, temos as interações eletrostáticas de longo alcance. Mas temos
122
também as ligações mais fracas tipo Van der Waals que contribuem para a estabilidade da
proteína. Pontes de hidrogênio, pontes salinas e pontes dissulfetos também contribuem
para a estabilidade da proteína. Outro fator que afeta a estabilidade da proteína é o
solvente em que proteína se encontra (PETERSEN et al., 2004).
Assim, a estabilização de uma enzima contra inativação irreversível em função de
extremos de pH, depende de vários fatores como temperatura, meio externo, força iônica,
e natureza química dos tampões (ZACCHIGNA et al., 1999). Contudo, podemos notar
que a lisozima nativa foi muito estável em uma ampla faixa de pH
(MASSCHALCK et al., 2003), sendo essa uma propriedade muito interessante da
lisozima.
A modificação química da LZ com mPEG 5000, mPEG 2000 ou mPEG-pNP
5000 não acarretou em uma alteração prejudicial no seu comportamento, pois a LZ é
uma proteína estável estruturalmente e sofre pouca ou nenhuma alteração conformacional
por modificações brandas (VAN DER VEEN, 2005). Assim, os derivados obtidos
apresentaram uma estabilidade interessante nessas condições de pH e temperatura, sendo
que as principais vantagens da modificação química da LZ com mPEG 5000, mPEG
2000 ou mPEG-pNP 5000 foi em relação à sua alta estabilidade em pH alcalino,
principalmente em pH 12.
A lisozima é dentre as enzimas, uma das mais estáveis ao aquecimento, podendo
resistir à ebulição por 1 ou 2 minutos em pH de 4 a 5, porém é desnaturada pelo
aquecimento em elevados pH (AHERN; KLIBANOV, 1985; SOFOS et al., 1998).
Irreversível desnaturação ocorre a 100°C muito mais lentamente a pH 4 do que em pH 8
(AHERN; KLIBANOV, 1985). Aquecimento da lisozima por 5 minutos a 100°C em
123
pH 9 resultou em uma significativa perda de atividade enzimática (MEYER et al., 1936).
A lisozima usualmente não é afetada por temperaturas acima de 55 °C, embora sua
estabilidade durante o aquecimento altere com as condições de pH, concentração de sal
(WANG; SHELEF, 1992). A estabilidade da LZ diminui em pH acima de 7.0
(SMOLELIS; HARTSELL, 1952; WANG; SHELEF, 1991), com muito maior
estabilidade em pH 7.0 do que em pH 9.0 na clara do ovo (CUNNINGHAM;
LINEWEAVER, 1965), provavelmente porque ocorre a redução de pelo menos uma das
ligações dissulfeto pelo grupo sulfidrila da ovoalbumina (CUNNINGHAM;
LINEWEAVER, 1967). Em pH 6.2 a lisozima perdeu somente 5% da atividade lítica
depois de aquecida a 80°C por 30 minutos e perdeu 25% da atividade depois de aquecida
a 100 °C por 20 minutos (SMOLELIS; HARTSELL, 1952). A estabilidade da LZ foi
maior entre 85°C e 95°C em pH 5.5 (BEYCHOK; WARNER, 1959).
Perante essas considerações, o desenvolvimento de formulações estáveis da lisozima,
principalmente para uso em alimentos, poderia ampliar de forma considerável o uso dessa
enzima. Assim, a modificação química da lisozima por “PEGlação” pode proteger a LZ
contra a desnaturação em função da temperatura e pH, possivelmente como um resultado
de um aumento de interações hidrofóbicas (JOHNSON; LARSON, 2005).
124
4.6 Verificação da resistência à ação de proteases da lisozima modificada
Para verificarmos a resistência à ação de proteases dos conjugados obtidos com a
modificação da lisozima como descrito no item 4.3, foi estudado a ação de diferentes
proteases sobre lisozima nativa e modificada como descrito no item 3.2.9. Nesse ensaio
foram utilizadas proteases de origem bacteriana (Neutrase e Protex 6L), origem vegetal,
(Papaína), Protease Fúngica e protease de origem animal, Proteomix (quimotripsina e
tripsina). Essas proteases apresentam pH ótimo no intervalo (6.0-8.0) e podem atuar
inespecificamente, sendo a Proteomix mais específica em direção aos aminoácidos
tirosina, fenilalanina e triptofano. Os resultados obtidos estão expressos nas Figuras 37 e
38.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
Ati
vid
ad
e (
%)
Proteomix Protease Fúngica Neutrase Papaína Protex 6L
Figura 37 – Comportamento da lisozima nativa frente a ação de diferentes proteases. Foram adicionados a 100 µL de lisozima nativa (600 UI) diferentes proteases: Proteomix, Protease Fúngica, Neutrase, Papaína e Protex 6L como descrito em métodos.
125
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
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Lisozima LZ-mPEG 5000
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20
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Tempo (min)
Ati
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ad
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Lisozima LZ-mPEG 5000
0
20
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100
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0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
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ad
e (
%)
Lisozima LZ-mPEG 5000
0
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0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
Ati
vid
ad
e (
%)
Lisozima LZ-mPEG 5000
0
20
40
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0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
Ati
vid
ad
e (
%)
Lisozima LZ-mPEG 5000
Figura 38 - Comportamento da lisozima nativa, lisozima modificada (LZ-mPEG5000) perante a ação de
diferentes proteases. Foram adicionados a 100 µL de lisozima nativa (600 UI) ou a 100 µL modificada LZ-mPEG 5000 (450 UI), preparadas em tampão fosfato 100 mM pH 7.0, em excesso das diferentes proteases (20 UI). (A) Proteomix, (B) Protease Fúngica, (C) Protex 6L, (D) Neutrase, (E) Papaína.
A B
C D
E
126
A partir dos resultados apresentados na Figura 37 notamos que a lisozima nativa é uma
enzima resistente a degradação proteolítica, pois em contato com 5 diferentes proteases a
enzima permaneceu com considerável atividade enzimática (98%) por 2 horas a 37°C. Essa
resistência à degradação proteolítica pode ser explicada devido à estrutura globular, bem
empacotada e rígida da molécula de lisozima (POLVERINO DE LAURETO et al., 1995).
Estudos anteriores verificaram a resistência a degradação proteolítica da LZ com papaína,
tripsina, quimotripsina (MINE et al., 2004) e outras proteases (IMOTO et al., 1974, 1986;
POLVERINO DE LAURETO et al., 1995). Essa limitada proteólise da LZ é uma interessante
propriedade, que tem contribuído para análise estrutural e dinâmica das proteínas
(POLVERINO DE LAURETO et al., 2002).
Com objetivo de verificarmos se a lisozima modificada apresentava resistência à ação
de proteases, trabalhamos com um excesso de protease (proporção em massa LZ / protease
1:25). Como podemos observar pela Figura 38 a LZ nativa apresentou uma queda de atividade
enzimática em torno 40% na presença de 20 UI de Proteomix (A), Protease Fúngica (B) e
Protex 6L (C). Com a Neutrase (D) e a Papaína (E) a LZ manteve atividade enzimática em
torno de 80%. Simultaneamente, observamos que ocorreu um aumento da resistência a
degradação proteolítica da lisozima modificada, LZ-mPEG 5000, em relação a nativa nas
condições do ensaio. Essa resistência enzimática pode está relacionada à ligação da LZ ao
mPEG o que promoveu o aumento da massa molecular da enzima causando impedimento
estérico, evitando assim o contato com as proteases (VERONESE, 2001; ROBERTS et al.,
2002; LEE; PARK, 2003). Resultados semelhantes foram obtidos com os derivados LZ-
mPEG 2000 e LZ-mPEG-pNP 5000.
127
Dentre outros trabalhos SO et al. (1996), demonstrou que a susceptibilidade da
lisozima à proteases (tripsina, pronase P, catepsina B e D) foi maior do que a modificada com
mPEG, indicando que a modificação química da lisozima por “PEGlação” pode aumentar a
resistência a degradação proteolítica.
Outras enzimas como Ribonuclease, Catalase, Tripsina, L-asparaginase
(MONFARDINI et al., 1995) e Uricase (SCHIAVON et al., 2000) após serem modificadas
por “PEGlação” também apresentaram maior resistência a degradação proteolítica.
Figura 39 - Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS–PAGE 15%. Lisozima incubada a 37 ºC após 2 horas em tampão fosfato 0.1 M pH 7.0 com proteases: P: padrão de massa molecular: poço 1: lisozima nativa; poço 2: Papaína; poço 3: Protease Fúngica; poço 4: Neutrase; poço 5: Protex 6L. A seta indica lisozima com 14.4 kDa.
P 1 2 3 4 5
47 kDa
26 kDa
128
Figura 40 - Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS–PAGE 15%. LZ-mPEG 5000 incubada a 37 ºC após 2 horas em tampão fosfato 0.1 M pH 7.0 com proteases. P: padrão de massa molecular: poço 1: Lisozima nativa; poço 2: Papaína; poço 3: Protease Fúngica: poço 4: Neutrase; poço 5: Protex 6L. A seta indica Lisozima com 14.4 kDa.
A partir dos géis de poliacrilamida 15% (Figuras 39 e 40) foi verificado o perfil
protéico das amostras submetidas à degradação proteolítica com diferentes proteases. Como
as proteases estavam em excesso, foi possível observar bandas correspondentes às proteases.
A presença de banda correspondente a LZ-mPEG 5000 (30 kDa) indica a resistência
proteolítica dessa amostra.
P
47 kDa
26 kDa LZ-mPEG 5000
1 2 3 4 5
129
0
20
40
60
80
100
120
0 15 30 45 60 75 90 105 120
Tempo (min.)
Ati
vid
ad
e (
%)
Lisozima LZ-mPEG 2000
LZ-mPEG 5000 LZ-mPEG-pNP 5000
Figura 41 - Estabilidade da lisozima nativa, LZ-mPEG 2000, LZ-mPEG 5000 e LZ-mPEG-pNP 5000 em soro humano a 37 °C por 2 horas.
Quando amostras de lisozima nativa ou lisozima modificada foram submetidas à
incubação em soro humano “in vitro” como descrito 3.2.10 notamos que as amostras
permaneceram estáveis, com atividade enzimática acima de 90% (Figura 41), indicando que
não ocorreu alterações em relação ao reconhecimento imunogênico, bem como, à degradação
proteolítica inespecífica entre a lisozima nativa e seus derivados.
Esses resultados obtidos permitem observar que a lisozima apresenta algumas
propriedades físico-químicas e biológicas peculiares e que a sua “PEGlação” favoreceu a
proteção contra digestão enzimática. Assim, a conjugação ao mPEG foi interessante pois,
mascarou a superfície da enzima, aumentou o seu tamanho molecular, impedindo a
aproximação de antígenos ou anticorpos e evitando a degradação da mesma por enzimas
proteolíticas (ROBERTS et al., 2002).
130
4.7 Avaliação da atividade antimicrobiana da lisozima modificada contra bactéria
Gram-negativa E. coli.
Os testes de atividade antimicrobiana da lisozima, LZ-mPEG 5000 foram realizados
com descrito no item 3.2.11. Os resultados estão apresentados na Tabela 14 e na Figura 42.
Tabela 14 – Avaliação da atividade antimicrobiana da lisozima nativa, lisozima-mPEG
5000, mPEG 5000 em relação à UFC / mL, Log UFC / mL e colônias sobreviventes (%).
Amostra UFC / mL Log UFC / mL Sobreviventes (%)
Controle 2.4 x 104 4.38 100
Lisozima 2.2 x 104 4.34 92
LZ-mPEG 5000 1.0 x 104 4.0 42
mPEG 5000 2.3 x 104 4.36 96
0
5000
10000
15000
20000
25000
UF
C/
mL
controle Lisozima LZ-mPEG 5000 mPEG 5000
Figura 42 – Avaliação da atividade antimicrobiana da Lisozima, LZ–mPEG 5000 comparadas com o controle e mPEG 5000 em relação à UFC / mL.
131
De acordo com a Tabela 14, percebemos que a atividade antimicrobiana do conjugado
LZ-mPEG 5000 foi maior quando comparada a lisozima nativa, pois a percentagem de
colônias sobreviventes de E. coli foi de 42% enquanto que a percentagem de colônias
sobreviventes com a lisozima nativa foi de 92 %. Em relação ao mPEG 5000 livre nenhum
efeito antimicrobiano foi observado como podemos observar pela percentagem de colônias
sobreviventes bem próxima ao do controle. Os dados representados na Figura 42 permitem
visualizar o comportamento da lisozima e da LZ-mPEG 5000 em relação à atividade
antimicrobiana contra bactéria Gram-negativa em relação às unidades formadoras de colônias
(UFC), indicando uma queda de unidades formadoras de colônias nas amostras tratadas com
LZ-mPEG 5000.
As bactérias Gram-negativas são geralmente mais resistentes à LZ do que bactérias
Gram-positivas, principalmente devido à proteção conferida membrana externa da parede
celular dessas bactérias. Alguns microrganismos resistentes incluem importantes patógenos
como espécies de Samonella e Escherichia coli O157:H7. Entretanto, sob certas condições
fisiológicas, ou com tratamentos químicos e físicos que rompem ou alteram a membrana
externa dessas bactérias, pode-se aumentar a atividade lítica da LZ contra bactérias Gram-
negativas. Estudos recentes (NAKIMBUGWE et al., 2006a; NAKIMBUGWE et al., 2006b)
compararam a atividade antimicrobiana de lisozimas de origens diferentes, incluindo a LZ da
clara de ovo de galinha, sob pressão ambiente e sob elevada pressão hidrostática contra
espécies de Yersinia enterocolítica, Shigella flexneri, Escherichia coli O157:H7,
Pseudomonas aeruginosa e Samonella typhimurium. A pressão ambiente, nenhuma bactéria
Gram-negativa foi sensível aos diferentes tipos de lisozima, sugerindo assim, que a lisozima
nativa não apresenta atividade antimicrobiana em relação a cepas de bactérias Gram-negativa.
Portanto, uma avaliação do potencial de uso da LZ nativa, por meio de propostas que possam
ampliar sua eficácia antimicrobiana, ou pelo menos, promover a inibição do crescimento de
132
algumas cepas resistentes à enzima nativa pode ser muito vantajoso (JOHNSON; LARSON,
2005).
Nesse sentido, verificamos a atividade antimicrobiana da lisozima modificada,
LZ-mPEG 5000 perante a E. coli. Assim, foi possível observar que o conjugado
LZ-mPEG 5000 apresentou maior atividade lítica quando comparada a lisozima nativa. Essa
atividade antimicrobiana pode estar principalmente relacionada com a capacidade da LZ
modificada interagir com membrana externa da parede bacteriana da E. coli. Como a
LZ-mPEG 5000 pode ser caracterizada como um conjugado de maior superfície de
hidrofobicidade do que a enzima nativa, essas regiões de maior hidrofobicidade interagem
com a camada de LPS, presente nas bactérias Gram-negativas, facilitando a lise bacteriana
(NODAKE; YAMASAKI, 2000; NODAKE et al., 2002; VANNINI et al., 2004), pois permite
o acesso da lisozima modificada a camada interna de peptídeoglicano.
Assim, essa diminuição de 42% do número de colônias sobreviventes sugere que a
lisozima quando modificada por “PEGlação” pode ter seu espectro de ação ampliado a
bactérias Gram-negativas como E. coli. Portanto, a modificação da LZ com mPEG produz
conjugados que podem ser considerados candidatos promissores a novos agentes
antimicrobianos, principalmente, como preservativos para vários alimentos, formulações
farmacêuticas e cosméticas. Além disso, estudos anteriores já demonstraram que o espectro de
ação da lisozima pode ser ampliado (MINE et al., 2004; JOHNSON; LARSON, 2005)
ressaltando, dessa forma, a importância da lisozima com um agente antimicrobiano.
Contudo, esse é um tópico não muito bem esclarecido na literatura o que implica na
realização de novos testes para elucidar o mecanismo de ação proposto para a lisozima
modificada com mPEG e estratégias de “PEGlação” que possam garantir uma atuação mais
efetiva da LZ modificada contra bactérias Gram-negativas.
133
5. CONCLUSÕES
As principais conclusões obtidas nesse trabalho foram:
� A metodologia desenvolvida com o método direto em batelada a partir da clara “in
natura” mostrou-se reprodutível, de boa resolução, permitindo a obtenção de LZ com
rendimento em torno de 60% e com elevado grau de purificação.
� O mPEG de 2 e 5 kDa ativado com grupo funcional succinimidil succinato é
altamente reativo, enquanto que o mPEG de 5 kDa ativado com grupo p-nitrofenil
carbonato liga-se lentamente a LZ, produzindo conjugados com uma cinética de
reação de “PEGlação” lenta.
� Os dados de atividade enzimática da LZ modificada sobre o substrato Glicol
Quitosana indicam que a modificação da LZ por “PEGlação” não ocasionou alteração
estrutural do sítio catalítico da enzima.
� O perfil de atividade da LZ “peglada” sobre o substrato biológico M. lysodeiktcus em
diferentes pH foi modificado, sugerindo que a “PEGlação” promove alterações no
balanço de cargas na superfície da enzima e a formação de regiões de maior
hidrofobicidade que refletiram em mudanças no pH ótimo de atividade em relação a
enzima nativa.
� A LZ “peglada” apresentou uma establidade equivalente a enzima nativa em diferentes
pH (4.0-12), indicando modificação química da LZ por “PEGlação” não causou
alterações na estabilidade dos conjugados.
� A LZ “peglada” foi resistente à ação de diferentes proteases e manteve-se estável em
soro humano, indicando que “PEGlação” favoreceu na resistência a degradação
proteolítica em relação a LZ nativa.
134
� A LZ “peglada” apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli, sugerindo que a
“PEGlação” pode ser uma estratégia empregada para ampliar a ação da LZ contra
bactéria Gram-negativa.
135
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ANEXOS
ANEXO A – Curva padrão de lisozima e equação da reta, quantificação de proteína pela metodologia de Bradford (1976).
y = 18,263x + 0,1996
R2 = 0,9982
0
2
4
6
8
10
12
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Abs (nm)
Co
ncen
tração
lis
ozim
a (
ug
)
ANEXO B – Curva de determinação da atividade enzimática da lisozima sobre substrato
Glicol Quitosana pela metodologia de Imoto e Yagishita (1971).
Atividade enzimática da Lisozima sobre Glicol Quitosana
y = 0,0021x + 0,0704
R2 = 0,9504
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 50 100 150 200 250 300
Lisozima (ug)
Dif
ere
nç
a A
bs
(4
20
nm
)
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